KR20220170779A - YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 살모넬라 백신 조성물 - Google Patents
YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 살모넬라 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규 살모넬라 티피뮤리움 균주; 및 이를 포함하는 백신 조성물, 면역원성 조성물 및 사료 조성물;에 관한 것이다. 본 발명에 따른 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주는 살모넬라균 감염을 효과적으로 예방하여, 개체의 생존율을 현저히 높일 수 있음을 확인하였다. 이는 본 발명의 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주를 백신으로 이용할 경우 살모넬라균 감염 관련 질병을 효과적으로 예방할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주는 가축 질병 제어 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규 살모넬라 티피뮤리움 균주; 및 이를 포함하는 백신 조성물, 면역원성 조성물 및 사료 조성물;에 관한 것이다.
살모넬라(Salmonella)는 장내세균과에 속하는 그람음성의 통성 혐기성 세균으로, 아포를 형성하지 않는 간균이다. 살모넬라균은 사람뿐만 아니라 돼지, 소, 닭 등을 비롯한 다양한 가축에 감염되어 질병을 유발하는데, 사람에게 감염되어 식중독을 유발하고 동물에게 있어서는 다양한 살모넬라증(Salmonellosis)을 유발하는 병원성 미생물이다. 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)는 혈청학적 구분에 의해 장티푸스를 일으키는 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi), 쥐티푸스의 원인균인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 장염균인 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteriditis), 가금티푸스의 원인균인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum), 추백리 원인균인 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum) 등의 혈청종을 포함한다. 살모넬라균은 혈청형에 따라 인간뿐만 아니라 가축에게도 질병을 일으킬 수 있는 인수공통 감염원을 포함한다. 살모넬라 티피뮤리움과 살모넬라 엔테리티디스는 인수공통 감염원으로 사람에게 있어서는 식중독의 원인이 되며, 소, 닭, 돼지 등의 가축에 있어서는 살모넬라증(salmonellosis)을 일으켜 급성 또는 만성 장염과 패혈증, 더 나아가 폐렴, 관절염, 유산 등을 발생시킨다. 살모넬라 갈리나룸과 살모넬라 플로럼은 가금 특이적 감염균으로 가금티푸스와 추백리를 일으켜 가금류의 대량 폐사를 유발할 수 있다. 살모넬라 플로럼은 성계에서는 감염되어도 임상 증상이 없으나 부화된 후대 병아리에게 난계대 전염되어 추백리를 일으키며, 생후 1-2주령에서 가장 높은 폐사율이 나타난다. 주로 회백색의 설사 증세를 보이면서 항문을 막아 배분 곤란을 일으켜 복부가 팽창하고, 그로 인한 패혈증으로 폐사한다. 추백리와 같은 경우 상업화된 예방책이 없으며, 감염된 개체의 색출 및 도태를 통해서만 질병의 예방이 가능하다.
현재 살모넬라 감염증을 예방 및 치료하기 위해 항생제를 주로 사용하고 있으나 살모넬라는 동물에 감염 시 세포내에 침투하여 증식하고 감염하는 경우가 많아 항생제나 약제, 기타 생균제가 침투하여 작용하기는 어려우며, 최근 많은 분야에서 항생제 감수성에 대한 문제가 발생되고 있어 이에 대한 원인을 항생제 오남용으로 규명하고 항생제를 충분히 사용하지 못하게 되었다. 이에 따라 산업동물의 배합 사료 내에 성장촉진제로 사용하는 항생제를 금지하기 시작하였고, 유럽연합에서는 2006년부터, 우리나라에서는 2011년 하반기부터 항생제 사용을 규제하기 시작하였다. 또한 항생제가 없는 안전한 먹거리에 대한 소비자의 요구가 증대되고 있어 점차 항생제 사용이 줄어들고 있다. 세균을 제어하는 항생제의 사용이 줄어듦에 따라 세균성 질병의 발생이 증가하고 있어 항생제를 사용하지 않고 세균성 질병을 제어하는 방법에 대한 요구가 늘어나고 있다.
이에 본 발명자들은 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주를 개발하고, 이의 현저한 살모넬라균 감염 예방 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 살모넬라증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라증(Salmonellosis) 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라균에 대한 면역원성 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라증 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라증 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 살모넬라증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주는 살모넬라균 감염을 효과적으로 예방하여, 개체의 생존율을 현저히 높일 수 있음을 확인하였다. 이는 본 발명의 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주를 백신으로 이용할 경우 살모넬라균 감염 관련 질병을 효과적으로 예방할 수 있음을 의미하는바, 본 발명의 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주는 가축 질병 제어 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 성장을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 운동성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 리포폴리사카라이드 및 외막 단백질 프로파일 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 1D는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 항생제 감수성을 나타낸 도이다.
도 2A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 세포 침윤 및 대식 세포 내 생존능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 SPI-1 및 SPI-2 T3SS와 관련된 유잔자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장 무게를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장 내 박테리아 수를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 감염된 마우스의 혈청 항체 IgG의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 혈청 항체 IgM의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 IgG2a/IgG1 비율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장세포에서 사이토카인 IFN-γ의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장세포에서 사이토카인 IL-6의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장세포에서 사이토카인 TNF-α의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 면역 실험 일정을 나타낸 도이다.
도 6B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 간 무게 및 간 내 박테리아 수를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6D는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장 무게 및 비장 내 박테리아 수를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6E는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 생존 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 1B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 운동성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 리포폴리사카라이드 및 외막 단백질 프로파일 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 1D는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 항생제 감수성을 나타낸 도이다.
도 2A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 세포 침윤 및 대식 세포 내 생존능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주의 SPI-1 및 SPI-2 T3SS와 관련된 유잔자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장 무게를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장 내 박테리아 수를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 감염된 마우스의 혈청 항체 IgG의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 혈청 항체 IgM의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 IgG2a/IgG1 비율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장세포에서 사이토카인 IFN-γ의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장세포에서 사이토카인 IL-6의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장세포에서 사이토카인 TNF-α의 수준을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6A는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 면역 실험 일정을 나타낸 도이다.
도 6B는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6C는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 간 무게 및 간 내 박테리아 수를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6D는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 비장 무게 및 비장 내 박테리아 수를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6E는 본 발명에 따른 Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주로 면역된 마우스의 생존 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주를 제공한다.
본 발명의 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주는 λ red 재조합 방법을 통해 한국에서 분리된 살모넬라 티피뮤리움 ST1120(Kim et al., 2017)의 yjeK 유전자에서 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드를 결실시킨 것이다.
본 발명의 범위에는 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 YjeK 유전자의 변이체가 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 아르기닌 디하이드롤라제(arginine dihydrolase) 및 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylation)와 관련된 생화학적 활성을 차단하는 것이 바람직하나, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 AMC(amoxicillin/clavulanic acid), 암피실린(ampicillin, AM), 세팔로틴(cephalothin, CF), 겐타마이신(gentamicin, GM), 카나마이신(kanamycin, K), 네오마이신(neomycin, N) 및 SAM(ampicillin/sulbactam)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항생제에 대해 항생제 감수성을 나타내는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 flagellin FliC의 발현이 야생형 균주보다 감소되고, porin OmpD의 발현이 야생형 균주보다 증가된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 숙주 내에서 비장종대(splenomegaly)를 유도하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 비장종대는 비장의 용적이나 중량이 정상 범위를 넘어 증가된 것을 의미한다. 비장은 생체의 림프조직 중에서 최대의 것이기 때문에, 조혈장기의 계통적 질환이 있을때에는 생체내의 다른 조혈장기와 함께 반응하여 종대한다. 비장종대는 (1) 감염증(말라리아, 아급성심내막염, 살모넬라증 등), (2) 혈액질환(백혈병, 빈혈 등), (3) 대사이상에서 주로 나타난다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 살모넬라증(Salmonellosis) 예방 또는 치료용 백신 조성물; 살모넬라균에 대한 면역원성 조성물;을 제공한다.
상기 배양물은 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주를 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하고, 상기 배양물은 상기 균주를 포함하는 배양물이다. 상기 배양물 또는 배양 농축물은 그 제형이 한정되지 않고, 일 예로 상기 제형은 액체 또는 고체일 수 있다.
상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여, 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것 일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 할 수 있고, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 배양한 배지로부터 분리하여 얻은 것 일 수 있고, 상기 배지는 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주가 성장할 수 있는 것이라면 한정되지 않고 이용할 수 있다.
상기 배지는 일 예로, 보통 한천배지(또는 영양 한천배지; Nutrient agar), TSA(tryptic soy agar) 배지, 표준한천배지(Standard Methods Agar; Plate Count Agar), 유당배지(lactose Broth), BGlB 배지(Brilliant Green lactose Bile Broth), 2배 농도 BGlB 배지, Endo 한천배지(Endo Agar), EMB 한천배지(Eosin methylene blue agar), 보통 배지(또는 영양 배지; Nutrient Broth), 데스옥시콜레이트 유당 한천배지(Desoxycholate lactose Agar), LB 배지(Luria-bertani Broth) 또는 EC 배지(EC Broth)일 수 있다.
상기 조성물은 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주의 안정적인 제제화를 목적으로, 수화제, 입제 또는 캡슐제로 제제화하여 사용할 수 있고, 상기 종류에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 수화제는 균주를 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제 또는 영양제를 첨가하여 혼합하여 제조할 수 있다. 상기 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 디알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린 (dextrin), 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 입제는 균주를 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량체 및 영양제는 상기 기재된 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 입제는 균주의 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것을 추가로 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 용어 “예방”이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 “치료”란 조성물의 투여로 상기 질병의 증세가 호전되거나 상기 질병의 억제 또는 경감 및 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 관절내(intra-articular) 투여, 활액내(intra-synovial) 투여, 수막강내 투여, 간내(intrahepatic) 투여, 병변내(intralesional) 투여 또는 두개강내(intracranial) 투여되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 복강내 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 백신은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, 살모넬라균에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다. 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 살모넬라균 감염을 효과적으로 방어한다는 것을 확인한바, 살모넬라증의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주가 관련된 질병의 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 유효 성분인 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주 이외에도 백신 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역 증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판(Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라증 예방 또는 개선용 사료 조성물; 또는 살모넬라증 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물;일 수 있다.
본 발명에 있어서, 사료는 동물이 먹는 임의의 천연 또는 인공 구성식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미하며, 본 발명에 따른 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주를 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계에 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 바람직하게는 농후 사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 사료 첨가제는 동물에 있어 질병 증상의 완화, 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 의미한다.
본 발명의 사료 조성물 및 사료 첨가제 조성물은 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 라이신 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 사료 중 농후사료로는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분, 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류가 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 사료 중 조사료로는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등 의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실 등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 특수사료에는 굴껍데기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제가 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 살모넬라증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주는 정맥내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 관절내(intra-articular) 투여, 활액내(intra-synovial) 투여, 수막강내 투여, 간내(intrahepatic) 투여, 병변내(intralesional) 투여 또는 두개강내(intracranial) 투여되는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 근육내 또는 비강내 투여되는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 살모넬라증의 예방 또는 치료방법은 YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주의 투여로 인해 생체 내 면역 반응을 증가시키는 것이 바람직하며, 보다 상세하게는 항체가, 면역반응 관련 인자의 발현을 조절하는 것이 바람직하다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실험예]
실험예 1. 박테리아 균주, 플라스미드 및 성장 조건
이 연구에 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드는 표 1과 같다.
| Strains | Relevant characteristics | References |
| ST1120 | Wild-type S. Typhimurium isolated in Korea | Kim et al., 2017 |
| ST2160 | ST1120 derivative(ΔyjeK::FRT, CmR) | 본 발명 |
| ST2161 | ST2160 derivative(ΔyjeK) | 본 발명 |
| ST14028 | ATCC14028 | ATCC |
| ST2173 | ST14028 with plasmid pBBR1-MCS4(AMR) | 본 발명 |
| Plasmids | Characteristics | |
| pTP233 | λ-Red recombinase, temperature sensitive replication(TER) | Poteete and Fenton, 1984 |
| pKD3 | FRT-Cm-FRT cassette(CbRCmR) | Datsenko and Wanner, 2000 |
| pCP20 | FLP recombinase, temperature sensitive replication(AMR) | Cherepanov and Wackernagel, 1995 |
| pBBR1-MCS4 | Broad-host-range cloning vector(AMR) | Truong, et al. 2014 |
모든 실험에서 대조군으로 국내에서 분리된 야생형 Salmonella enterica serovar Typhimurium 1120(ST1120)을 사용하였다. 동물 챌린지 실험에서 플라스미드 pBBR1-MCS4로 형질전환된 S. Typhimurium 14028 균주(ST2173)를 사용하였다. 상기 ST2173 균주는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 박테리아 균주는 달리 명시되지 않는 한 필요한 경우 150μg/ml의 암피실린(Duchefa)과 함께 37°C의 Luria-Bertani(LB) broth(Duchefa, Haarlem, 네덜란드)에서 배양되었다. 모든 항생제는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. API 20E 키트(bioMerieux, Inc., Durham, NC, USA)를 사용하여 박테리아의 생화학적 특성을 확인했다.
yjeK 유전자가 결실된 Δ yjeK 돌연변이 균주는 플라스미드 pTP233, pKD3 및 pCP20을 사용한 λ red 재조합 방법을 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 생성되었다. 구체적으로, pTP233을 포함하는 ST1120은 yjeK 유전자와 상동인 서열이 측면에 있는 클로람페니콜 내성 유전자 카세트로 형질전환하여 ST2160 균주를 제조하였다. ST2160 균주에서 염색체 yjeK 및 CM 내성 카세트 사이의 상동 재조합은 40 μg/mL 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천에 플레이팅한 후 진단 중합효소 연쇄 반응을 통해 확인하였다. pCP20 플라스미드 도입 후 클로람페니콜 감수성 균주를 선택하고, 염색체의 클로람페니콜 저항성 유전자를 제거하여 ST2161 균주를 얻었다. 마지막으로, 42℃에서 클로람페니콜-감수성 균주를 배양하여 pCP20 플라스미드를 제거하고, yjeK 및 CM 카세트의 결실을 진단 PCR을 사용하여 추가로 검증하였다.
균주 구성 및 검증에 사용된 모든 프라이머는 표 2와 같다.
| Primers | Sequence(5’-3’) |
| yjeK_long F | TTAGCACTGCCGAAGCTGTAAATCCAGCGGTGTTTTGCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAG |
| yjeK_long R | GATGAAAACCTCCGGGCAGGACAGGACGCCAGGCGCTTGTTCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCT |
| yjeK_com F | ATTAGCACTGCCGAAGCTGTA |
| yjeK_com R | CGAGAAGATTGGTTAGCGCAAC |
| hilA qPCR F | GCTGCACCAGGAAAGCATTAAG |
| hilA qPCR R | CGAAGTCCGGGAATACATCTGA |
| hilC qPCR F | GCCGCTGAAGAGGTGAGTTTTA |
| hilC qPCR R | AATATTTCCAGCCCCCATACG |
| hilD qPCR F | GCTGTTCCTGCTTACTGCTTTTC |
| hilD qPCR R | AATGTTGTAAACGCGCTCCTTT |
| invA qPCR F | ACAAAACATATGCTGGACCAACTG |
| invA qPCR R | ACGCTGCAAAACTTCAGATATACG |
| invF qPCR F | GCGGAAAAGCGAAGAGTGAA |
| invF qPCR R | AACGGCTAATTGGGTGATGTTC |
| sipC qPCR F | CGAAGGGATGAATGCGTTGT |
| sipC qPCR R | GCAGCCCCTTATATTCCAGTTTG |
| sopA qPCR F | TACGTCACAAAGCCAACCTCTCT |
| sopA qPCR R | GTGGCATTTGCAGCCAGATA |
| sopB qPCR F | GCAATGATTTACGCCCTGAAG |
| sopB qPCR R | TGGCGCGCTAATGTATTGAC |
| sopE2 qPCR F | CGGAGAAGGACATTTTTGCAA |
| sopE2 qPCR R | TGGGTAGTCGGTATGTCTGTTTGT |
| sptP qPCR F | GGCGATACAAAAGTGGCAGAA |
| sptP qPCR R | CGCAGGCTATTTCCATCCAT |
| ssaD qPCR F | GGTGGAATGGGTGTCCTGTTAA |
| ssaD qPCR R | CGCCCGCACATAATGAATATT |
| ssaK qPCR F | GAGGCATTGATGCGAGAAACT |
| ssaK qPCR R | CGGCATATCGTGTTGAGGAA |
| ssaQ qPCR F | CATCCTGCAGTAATCTACCACATCA |
| ssaQ qPCR R | AAACCCGTTGGCCATGTAAA |
| sseD qPCR F | ATGCGCAGCTATAACGTAGAAAAA |
| sseD qPCR R | TGCTCTAAACGCTTCATCAATTG |
| sseF qPCR F | GGTTGCTGCAGCGGTAATTT |
| sseF qPCR R | CACAGCAAGCATCCCCAATA |
| ssrA qPCR F | GGTTCAGAAACGGCAGCATATAA |
| ssrA qPCR R | GTTCAGCTTCTTCAAACCGTTGA |
| ssrB qPCR F | TCTGTTAGCGGCATTGCAAA |
| ssrB qPCR R | GGTCGTGTCAGCGTTTAATTCA |
| yjeK qPCR F | ACTGGTCGCCCGCTTTG |
| yjeK qPCR R | CGCCTCGTCCACTTCATTAG |
| efp qPCR F | CGATTTTCGTTCCGGTCTTAA |
| efp qPCR R | CCTGGCCTTTACCCGGTTT |
| yjeA qPCR F | AAAACGTGCGGCGATTATG |
| yjeA qPCR R | ACTCATGCAGGGCGTCTCA |
| gyrB qPCR F | TCGCTCAGCAGTTCGTTCAT |
| gyrB qPCR R | GATTGCGGTGGTTTCCGTAA |
실험예 2. 항생제 감수성 검사
Mueller-Hinton agar(Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)에 대한 디스크 확산 테스트를 사용하여 박테리아 항생제 감수성을 평가했다. 박테리아 세포는 LB broth를 이용하여 온도 37°C 16-18시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 600 nm에서 광학 밀도(OD600)가 0.6-0.7이었으며, 배양된 세포는 5 × 107 cells 에 해당했다. 집락 형성 단위(colony forming units, CFU)/mL를 항생제 디스크(BBL™ Sensi-Disc™, Becton Dickinson)를 배치하기 전에 멸균 면봉을 사용하여 Mueller-Hinton(MH) 한천에 도말했다. 상기 항생체 디스크를 이용하여, 항생제인 AMC(amoxicillin/clavulanic acid) 30μg, 암피실린(ampicillin, AM) 10μg, 세팔로틴(cephalothin, CF) 30μg, 겐타마이신(gentamicin, GM) 10μg, 카나마이신(kanamycin, K) 30μg, 날리딕산(nalidixic acid, NA) 30μg, 네오마이신(neomycin, N) 30μg, SAM(ampicillin/sulbactam) 20μg, SXT(sulfamethoxazole/trimethoprim) 25μg 및 테트라사이클린(tetracyclineTE) 30μg에 대한 항생제 감수성을 확인하였으며, 성장 억제 구역의 직경은 항생제 감수성을 결정하는 데 사용되었다.
실험예 3. 운동성 테스트
박테리아 수영 운동성은 이전에 자세히 설명된 대로 37°C에서 반고체-한천 플레이트(0.3% 한천)에서 평가하였다. OD 600이 0.6-0.7인 각 균주를 반고체 한천에 스팟팅하고 37°C에서 배양했다. 수영 후광(swimming halo)의 직경은 각각 4시간 및 12시간에 측정되었다. 모든 실험은 세 번 반복하였다.
실험예 4. 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS) 프로파일 분석
살모넬라 균주는 LB borth 배지에서 16시간 동안 배양하였고, LPS는 hot phenol-water method에 따라 추출하였다. 박테리아 세포를 10,000 xg에서 20분 동안 원심분리하여 수확했다. 박테리아 세포 펠렛을 용해 용액(0.1 M sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris base, 0.128 M NaOH)에 현탁하고 5분 동안 배양하고 P/C/I 용액(phenol:chloroform:isoamyl alcohol=25:24:1)로 처리했다. 65°C에서 15분 동안 가열한 후, 분리된 수성상을 새 바이알로 옮기고, 0.5mL의 3M Na-acetate(pH 5.6) 및 17mL의 95% 얼음처럼 차가운 에탄올과 혼합했다. LPS 분획을 -20°C에서 밤새 침전시키고, 10,000 xg로 원심분리했다. 20분 동안 침전된 LPS를 멸균수에 재현탁하고 DNase(Sigma-Aldrich) 및 RNase(Promega, Madison, WI, USA)로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. LPS 정제를 위해 LPS 용액을 P/C/I 용액과 혼합하고 10,000 xg에서 20분 동안 원심분리하였다. 정제된 LPS를 멸균수에 현탁하고 Pierce LAL 발색 내독소 정량 키트(Thermo Scientific Inc., IL, USA)를 사용하여 정량화했다. 5 μg의 LPS 샘플을 12% DOC-PAGE(deoxycholate-polyacrylamide gel electrophoresis) 겔에 로딩하고 LPS 프로파일을 시각화했다.
실험예 5. 외막 단백질(Outer Membrane Protein, OMPs) 분석
박테리아 OMP를 분리하여 이를 분석하였다. 구체적으로, LB broth에서 배양된 박테리아 세포를 2,500 xg 에서 20분 동안 원심분리하여 수확했다. 박테리아 세포 펠렛을 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine N′-2-ethanesulfonic acid에 현탁시키고, Vibra-cell 초음파 액체 처리기(Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA)로 초음파 처리했다. 세포 용해물의 박테리아 막 분획은 100,000 xg에서 45 Ti 회전자(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 초원심분리에 의해 수집되었다. 4°C에서 1시간 동안 초원심분리 후, 막 분획을 1% N-lauroylsarcosine solution(Sarkosyl, Sigma-Aldrich)을 함유하는 완충액에 재현탁하여 내막 단백질을 가용화하고 제거하였다. 사르코실 처리된 OMP 분획을 위에서 설명한 대로 초원심분리를 사용하여 정제하고 마지막으로 인산완충식염수에 재현탁했다. OMP의 농도는 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific Inc.)를 사용하여 측정하였다. 10 μg의 OMP를 12% SDS-PAGE를 사용하여 분석하고 Coomassie Brilliant Blue로 염색하여 시각화했다.
관심있는 단백질 밴드는 펩타이드 질량 핑거프린팅 방법으로 분석하였다. 간단히 말해서, SDS-PAGE 젤의 단백질을 추출한 후 트립신(Promega)으로 소화시켰다. 소화된 펩타이드; 및 50% acetonitrile/0.1% trifluoroacetic acid(Sigma-Aldrich) 중 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid과 혼합하고 펩타이드 혼합물을 matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry(Microflex LRF 20, Bruker Daltonics, MA, USA)를 사용하여 분석했다. 질량 스펙트럼은 600-3,000의 m/z 범위에서 수집되었으며 trypsin autodigestion peak(m/z 842.510, 2211.1046)에 의해 내부적으로 보정되었다. MASCOT 서버 2.3 버전(Matrix Science, 런던, 영국)을 사용하여 질량 스펙트럼을 분석했다. MASCOT 점수가 >73인 단백질은 표적 단백질과 유의하게 일치하는 것으로 간주되었다(P < 0.05).
실험예 6. RNA 추출 및 정량적 실시간 역전사(qRT-PCR)
RNA 분해를 방지하기 위해 LB broth에서 배양된 박테리아 세포 또는 살모넬라에 감염된 동물 세포를 제조사의 지침에 따라 RNA protect Bacteria Reagent(Qiagen, Hilden, Germany) 또는 RNAlater 안정화 용액(Ambion, Austin, TX, USA)으로 처리하였다. RNeasy mini kit(Qiagen)를 사용하여 박테리아의 총 RNA를 분리하고 TURBO DNA-free 키트(Ambion)를 사용하여 잔류 염색체 DNA를 제거했다. RNA to cDNA EcoDry Premix with random hexamers(Clontech Laboratory, CA, USA)를 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사하였고, 10 ng의 input RNA에 해당하는 cDNA를 각 qPCR에서 주형으로 사용했다. Primer는 Primer Express Software 3.0 버전(Applied Biosystems, MA, USA)을 사용하여 설계하였고, 설계된 프라이머 서열은 상기 표 2와 같다.
증폭된 PCR 산물을 검출하기 위해 SYBR 녹색 시약(Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems)과 함께 StepOnePlus 실시간 PCR 기기(Applied Biosystems)를 사용하여 qPCR을 수행했다. 각 유전자의 상대적 발현 수준은 gyrB의 수준으로 정규화되었으며, 독립적으로 추출된 RNA 샘플을 사용하여 세 가지 테스트의 평균으로 표시하였다.
실험예 7. 침습(invasion) 및 생존(survival) 분석
HeLa 인간 상피 세포 및 RAW264.7 쥐 대식세포를 10% FBS(fetal bovine serum)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 성장시키고, 1×105 및 2×105 세포/웰의 밀도로 24웰 배양 플레이트에 각각 접종했다. 밤새도록 LB broth에서 배양한 살모넬라 세포를 감염 다중도(multiplicity of infection) 100으로 동물 세포에 첨가하였다. 박테리아 감염 30분 후 세포를 PBS로 3회 세척하고, 젠타마이신(100 μg/mL)을 함유하는 새로운 DMEM으로 1.5시간 동안 보충했다. 세포외 박테리아를 제거하기 위해 나머지 감염 기간 동안 배지를 10μg/mL 젠타마이신을 함유하는 새로운 DMEM으로 교체하였다.
침습 분석을 위해 감염된 HeLa 세포를 감염 후 2시간에 1% Triton X-100을 사용하여 용해시켰고, 세포 용해물을 희석하고 LB 한천에 플레이팅했다. 생존 분석에서 감염된 RAW264.7 세포는 감염 후 10시간에 용해시켰고, 세포 내 박테리아는 침입 분석에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 계수하였다.
실험예 8. 동물 윤리
모든 동물 실험은 국제법 및 정책 지침(실험동물 보호 및 이용에 관한 지침, 국립 아카데미 출판부, 8판)에 따라 수행되었으며, 강원대학교 동물연구소 동물관리위원회의 승인을 받았다. 승인번호 KW-160201-1).
실험예 9. 마우스 감염 실험
마우스 감염 실험을 위하여, LD50(half-maximal lethal dose)를 계산하였다. 6주령 암컷 BALB/c 마우스(Orient Bio Inc., Seongnam, Korea)에 102 내지 107 CFU/mouse로 연속 희석된 박테리아 세포를 복강 내 주사하였다. 감염 후 2주 동안 마우스를 모니터링하고 죽은 마우스의 수를 기록하여 LD50 값을 추정하였다. 아프고 빈사 징후가 있는 마우스는 인도적 차원에서 안락사시켰다. LD50 값은 다음의 계산식으로 계산하였다.
log10[50% end point]=A+(BXC)
* A = log 10[감염량 다음으로 사망률이 50% 미만인 감염선량]
* B = 로그의 차이 = [50% -(감염량에서 사망률 다음으로 50% 미만)]/[(다음으로 사망률이 50% 이상) -(다음으로 사망률이 50% 미만) ]
* C = log 10 [시험처리 연구에 사용된 연속 감염 용량 간의 차이]
생체 내 독성 테스트는 104 CFU/dose에서 박테리아 세포로 복강 내 감염된 4마리의 BALB/c 마우스 그룹을 사용하여 수행하였다. 감염 후 14일(dpi)에 마우스를 희생시키고 신체 및 비장의 무게를 측정했다. 비장은 후속적으로 TissueLyser II(Qiagen, USA)를 사용하여 30Hz에서 1분 동안 균질화하였고, 용해물을 연속적으로 희석하였다. 박테리아 세포를 계수하기 위하여, 연속 희석액을 Salmonella-Shigella(SS) 한천(Difco, Becton Dickinson, MD, USA)에 플레이팅했다.
실험예 10. 마우스 예방 접종 및 도전 실험
암컷 BALB/c 마우스를 각각 6마리의 마우스 그룹으로 나누고 각각 103 CFU/dose 및 104 CFU/dose로 복강 내 주사하여 야생형 및 ΔyjeK 돌연변이 균주로 면역화시켰다. 음성 대조군은(N control)은 균주 대신 PBS를 접종하였다. 마우스 면역 후 0, 7, 14, 28 및 35일에 혈액을 수집하고 혈청을 사용할 때까지 -20°C에서 보관하였다. 28일 후, 마우스에 ST2173 균주 108 CFU/dose(보호 분석) 또는 1010 CFU/dose(생존 분석)를 경구 투여하였다. 양성 대조군(P control)은 PBS를 투여한 다음 동일한 용량의 ST2173으로 챌린지했다.
마우스 보호 분석에서, 항원-공격된 마우스는 면역화 후 35일에 희생시켰다. 희생된 마우스로부터 간 및 비장을 포함한 장기를 수집하였고, SS 한천에 도말하였다. 마우스 생존 분석에서, 항원-공격된 마우스를 추가로 24일 동안 모니터링하고 사망률을 기록했다.
실험예 11. ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
혈청 내 특정 IgG 및 IgM 항체 반응은 이전에 설명한 대로 ELISA를 사용하여 측정되었다. 혈청 및 효소 접합체의 최적 농도는 면역화된 마우스 및 면역화되지 않은 마우스의 3중 혈청을 사용 하는 체커보드 테스트를 통해 결정하였다. 혈청과 효소 접합체 간의 최상의 결합 비율을 선택하여 S. Typhimurium에 특이적인 IgG, IgM 및 IgG 서브클래스(IgG1 및 IgG2a) 항체 반응을 측정했다. 야생형 S. Typhimurium로부터 제조된 OMP을 마이크로플레이트(Thermo Scientific Inc.)에 0.5 μg/well로 첨가하고 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 면역화된 마우스의 혈청을 1:200으로 희석하고 코팅된 웰에 첨가하였다. 1시간 배양 후, 마이크로플레이트를 Tween 20을 함유하는 PBS(TBST)로 세척하고, horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG(1:30,000 희석; Bethyl Laboratories, TX, USA), anti-mouse IgM(1 :35,000 희석, Bethyl Laboratories), anti-mouse IgG1(1:25,000 희석, Bethyl Laboratories) 또는 anti-mouse IgG2a(1:30,000 희석, Bethyl Laboratories) 2차 항체를 처리하였다. 결합되지 않은 2차 항체를 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 그 후 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine(Surmodics Inc., MN, USA) 기질을 각 웰에 첨가하고, 5분 동안 배양했다. 효소 반응은 H2SO4(0.5M) 100 ml를 첨가하여 정지시켰다. 항체 수준을 정량하기 위하여, Epoch 플레이트 판독기(BioTek, GA, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
사이토카인 측정을 위하여, 비장 세포를 비장에서 분리한 후 계수하였다. RPMI-1640(GenDEPOT, TX, USA), 10mM HEPES(Duchefa) 및 10% FBS로 구성된 완전 배지에서 2X105 cells/well로 플레이팅했다. 플레이팅된 세포에 LPS(5 μg/mL, Sigma-Aldrich) 또는 가열로 인해 사멸된 S. Typhimurium 세포(HKC; 108 CFU/0.1 mL)를 처리하였고, 37°C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 상등액을 수집하여, 사이토카인을 측정하였다. 상기 상등액은 사이토카인 측정 시까지 -20℃에서 보관하였다.
IFN-γ, IL-6 및 TNF-α의 농도는 제조사의 지침에 따라 사이토카인 ELISA 키트(MAX™ Standard, BioLegend, Inc., CA, USA)를 사용하여 결정하였다. 사이토카인의 농도는 Four Parameter Logistic Curve 소프트웨어(MyAssays Ltd., https://www.myassays.com/ )를 사용하여 계산하였다.
실험예 12. 통계 분석
모든 값은 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. P 값은 Tukey’s multiple comparison test로 분산의 일원 또는 이원 분석을 사용하여 계산되었다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 통계 테스트는 GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc., CA, USA)로 수행하였다.
[실시예]
실시예 1. ΔyjeK 돌연변이 균주의 생리학적 변화 분석
yjeK(1,029 bp) 및 efp(567 bp)의 인접한 두 유전자는 시작 코돈 사이에 40bp의 거리를 두고 서로 반대 방향으로 전사된다. 야생형 균주 ST1120의 yjek 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되며, λ red 재조합 방법을 사용하여 상기 야생형 yjek 유전자에서 서열번호 1의 뉴클레오티드를 결실시켰다. 즉, Δ yjeK 돌연변이 균주는 서열번호 1의 뉴틀레오티드가 결실된 yjek 유전자를 포함한다. efp 유전자는 결실 부위 근처에 있기 때문에 efp의 발현을 야생형과 결실 균주 사이에서 비교하였다. efp의 전사는 1yjeK 돌연변이 균주에서 결실에 의해 거의 영향을 받지 않아 Δ yjeK 돌연변이 균주에서 EF-P 활성에 대한 극성 효과의 가능성을 배제했다.
Δ yjeK 돌연변이 균주의 성장 및 운동성을 분석한 결과는 각각 도 1A 및 B에 나타내었다.
도 1A 및 B에 나타낸 바와 같이, Δ yjeK 돌연변이 균주는 야생형 균주에 비해 성장 및 운동성이 현저히 감소한 것을 확인하였다.
또한, 분석 프로필 지수(analytical profile index, API) 테스트 결과, Δ yjeK 돌연변이 균주는 아르기닌 디하이드롤라제(arginine dihydrolase) 및 라이신 디카르복실라제와 관련된 생화학적 활성을 차단하여 돌연변이 균주에서 아르기닌 및 라이신 디카르복실화의 변경된 대사 경로를 나타내는 것을 확인하였다.
LPS 및 OMP 프로파일 분석 결과는 도 1C에 나타내었다.
도 1C에 나타낸 바와 같이, Δ yjeK 돌연변이 균주가 긴 O-항원 부분에서 증가된 풍부함을 나타내고 다중 단백질의 수준을 변화시키는 것을 확인하였다. 또한 야생형 및 ΔyjeK 돌연변이 균주 사이의 차등 생산을 나타내는 6개의 OMP가 질량 분석법에 의해 확인되었다(도 1C의 화살표). 상기 OMP 6개에 대한 정보는 표 3에 나타내었다.
| Spots | Identified proteins | Gene symbols | Protein sequence coverage [%] |
| a | flagellin FliC | fliC | 73 |
| b | porin OmpD | ompD | 80 |
| c | OmpA | ompA | 47 |
| d | flagellin FljB | fljB | 47 |
| e | flagellin FliC | fliC | 42 |
| f | porin OmpD | ompD | 69 |
한천 플레이트에서 Δ yjeK 균주의 운동성 감소에 따라 Δ yjeK 돌연변이 균주에서 flagellin FliC flagellin FliC의 발현이 야생형 균주보다 감소되고, porin OmpD의 발현이 야생형 균주보다 증가되었다. 또한, 가장 풍부한 OMP 중 두 가지인 OmpA와 OmpD는 Δ yjeK 균주에서 발현의 변화를 보일 것으로 예측되었다.
상기 OmpA는 살모넬라 감염에서 강력한 면역원성을 유도하고, 포린 OmpD는 덜 생성되어 산화 분자에 대한 박테리아 투과성을 감소시키고 숙주에서 박테리아 생존을 촉진한다. 포린과 유출 펌프를 형성하는 박테리아 OMP는 투과성을 감소시키거나(포린) 약물 수출을 증가(유출 펌프)함으로써 항생제에 대한 박테리아 내성에 영향을 준다. 따라서 Δ yjeK 돌연변이 균주에서 porin OmpD의 증가가 관찰된바, 항생제에 대한 내성을 추가로 확인하였다. 항생제에 대한 내성을 확인한 결과는 도 1D에 나타내었다.
도 1D에 나타낸 바와 같이, Δ yjeK 돌연변이 균주는 NA, SXT 및 TE를 제외한 다른 항생제에 감수성이 있었다. 특히, Δ yjeK 돌연변이 균주 처리군에서 GM, N, K 및 AMC의 억제 영역은 각각 최대 77%(21.0 ± 0.0 mm), 45%(18.9 ± 0.5 mm), 36%(21.8 ± 1.1 mm), 34%(27.5 ± 0.7 mm)임을 확인하였다.
상기 결과는 Δ yjeK 균주가 성장, 운동성, 대사 및 항생제 감수성에서 상당한 변화를 나타내었음을 의미한다.
실시예 2. ΔyjeK 돌연변이 균주의 약독화 특성 확인
박테리아가 상피 세포를 침범하고 대식세포 내부에서 생존하는 능력을 추가로 조사했으며 그 결과는 도 2A에 나타내었다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, Δ yjeK 돌연변이 균주는 감염 후 2시간에 야생형 박테리아보다 3.73배 빠른 속도로 숙주 상피세포에 들어갔으나, 감염 10시간 후 대식세포 내에서 완전히 증식하지 못하는 것을 확인하였다.
야생형 및 Δ yjeK 돌연변이 균주 사이의 SPI-1 및 SPI-2 T3SS와 관련된 유전자 발현을 분석하였으며, 그 결과는 도 2B에 나타내었다.
도 2B에 나타낸 바와 같이, 대식세포 내부에서 Δ yjeK 돌연변이 균주는 야생형 균주에 비해 SPI-1 수준이 증가되고, SPI-2 수준이 감소된 것을 확인하였다(도 2B, 0h). 이는 SPI-1/SPI-2 T3SS 관련 유전자의 발현이 변경되었음을 의미한다. 그러나 Δ yjeK 돌연변이 균주에서 이러한 차등 발현은 박테리아가 세포 내 환경에 적응하는 동안 완화되는 것을 확인하였다(도 2B, 10h).
감염 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 Δ yjeK 돌연변이의 독성을 추가로 평가했으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타낸 바와 같이, ip 경로를 통해 BALB/c 마우스에 접종된 ΔyjeK 돌연변이 균주는 LD50 값이 106.5 CFU로, 야생형 ST1120(103.2 CFU)보다 약 100배 감소된 것을 확인하였다.
Δ yjeK 돌연변이 균주에 감염된 마우스를 희생시킨 후 비장 및 신체의 무게를 측정하였다. 또한 분리된 비장 내 박테리아 수를 계수하였다. 마우스 비장의 무게 및 비장 내 박테리아 수를 확인한 결과는 각각 도 3A 및 B에 나타내었다. 또한 희생된 마우스의 신체 무게를 측정한 결과는 도 3C에 나타내었다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, Δ yjeK 돌연변이 균주에 감염된 마우스의 임상 징후 및 박테리아 부담도 야생형 감염 그룹의 임상 징후와 명확하게 달랐다. Δ yjeK 돌연변이 균주 감염 후 비장의 무게가 유의하게 감소한 반면(Δ yjeK, 0.34 ± 0.05 g vs. wild-type, 0.72 ± 0.12 g), 야생형 균주 감염에서는 살모넬라 균주에 의한 비장종대(splenomegaly)가 관찰되었다.
도 3B에 나타낸 바와 같이, Δ yjeK 돌연변이 균주 처리군의 비장 내 박테리아 수는 4.6X104 CFU/g이며, 이는 야생형 균주 처리군(2.6X105 CFU/g)에 비해 현저히 낮은 것을 확인하였다.
도 3C에 나타낸 바와 같이, Δ yjeK 돌연변이 균주 및 야생형 균주 처리군은 모두 체중에 유의한 변화가 없는 것을 확인하였다.
상기 결과는 Δ yjeK 돌연변이 균주에 감염된 마우스의 비장에서 관찰된 비장종대 및 박테리아 수 감소는 상기 균주가 생체 내에서 약독화되었음을 의미한다.
실시예 3. ΔyjeK 돌연변이 균주로 면역화된 마우스에서 면역 반응 분석
3-1. 혈청 항체 분석
ΔyjeK 돌연변이체의 면역학적 효과는 BALB/c 마우스에서 감염 후 생성된 혈청 항체(IgG 및 IgM)의 수준을 측정하였다. IgG 및 IgM의 발현 수준을 분석한 결과는 각각 도 4A 및 B에 나타내었다.
도 4A 및 B에 나타낸 바와 같이, IgG 및 IgM 항체의 수준은 14 dpi까지 야생형 및 Δ yjeK 돌연변이 균주로 감염된 그룹은 유사하였다. 28 dpi에서 Δ yjeK 돌연변이 균주에 의한 면역화로 인해 IgG 및 IgM 항체의 수준은 14 dpi에 비해 각각 1.7 및 1.5배 증가했다.
IgG2a/IgG1 비율은 미생물 감염에 대한 T 헬퍼(Th)1과 Th2 반응 사이의 면역 균형을 위한 대리 마커로 일반적으로 사용된다. 면역된 마우스의 IgG2a/IgG1 비율을 측정하였으며, 그 결과는 도 4C에 나타내었다.
도 4C에 나타낸 바와 같이, ΔyjeK 돌연변이 균주로 면역된 마우스의 IgG2a/IgG1 비율은 2.32(28 dpi) 내지 3.66(14 dpi) 범위에 있고, 야생형 균주로 감염된 그룹의 IgG2a/IgG1 비율은 5.16(28 dpi) 내지 5.65(14 dpi)임을 확인하였다.
상기 결과는 야생형 및 ΔyjeK 돌연변이 균주 모두 BALB/c 마우스에서 Th2 매개 면역 반응보다 Th1 매개 면역 반응을 더 강력하게 자극했음을 의미한다. ΔyjeK 돌연변이 균주가 야생형 균주보다 더 높은 수준의 IgG를 유도하지만 더 낮은 IgG2a/IgG1 비율을 유도한다는 점을 고려할 때, ΔyjeK 돌연변이 균주를 이용한 면역화는 야생형 살모넬라균보다 더 강력하게 IgG2a 및 IgG1 관련 보호도 부여한다는 것을 의미한다.
3-2. 사이토카인 분석
면역 후 마우스의 비장을 28dpi로 채취하고 비장에서 분리한 비장세포를 S. Typhimurium LPS 및 HKC로 처리하여 살모넬라 면역원에 대한 사이토카인 생산 수준을 추정하였다. 면역화된 마우스 비장세포에서 사이토카인 IFN-γ, IL-6 및 TNF-α를 분석한 결과는 각각 도 5A 내지 C에 나타내었다.
도 5A 내지 C에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 IFN-γ, IL-6 및 TNF-α는 면역화에 사용된 박테리아 균주에 관계없이 LPS 또는 HKC에 대한 반응으로 모두 증가했다. 흥미롭게도, Δ yjeK 돌연변이 균주를 사용한 면역은 야생형 살모넬라 에서 관찰된 것보다 LPS(2.24배) 및 HKC(1.5배)에 대한 IFN-γ 생산을 더 크게 촉진했다(도 5A). 그러나 전염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 생성은 LPS 및 HKC 처리 둘 다에 대해 ΔyjeK 돌연변이 균주로 면역화한 후 더 낮은 정도로 유도되었다(도 5B 및 C).
상기 결과는 Δ yjeK 돌연변이 균주로 면역화된 마우스는 숙주 기관에서 전신 감염 징후 없이 IgG 및 IgM 항체를 유도하고, 동시에 살모넬라의 면역원성 항원에 대한 챌린지에 대해 사이토카인 생산을 조절한다는 것을 시사한다.
실시예 4. Δ yjeK 돌연변이 균주로 면역된 마우스에서 살모넬라증 예방 효과 확인
도 6A와 같은 실험 일정으로, ΔyjeK 돌연변이 균주를 이용한 면역화에 의한 예방 효과를 BALB/c 마우스에서 평가하였다. 구체적으로, 후보 백신인 ΔyjeK 돌연변이 균주를 마우스에 복강 내 투여하여 면역화시켰다. 면역화된 마우스(28 dpi)에 야생형 S. Typhimurium 2173(ST2173) 균주를 경구 감염시켰다. 상기 야생형 S. Typhimurium 2173(ST2173) 균주가 감염된 마우스의 살모넬라 감염 예방 효과를 분석하였다.
4-1. 임상증상 관찰
야생형 S. Typhimurium 2173(ST2173) 균주가 감염된 마우스의 임상증상을 관찰하였다. 그 결과, 사전 예방접종 없이 ST2173에 감염된 생쥐에서 거친 털, 딱딱하고 감긴 눈, 식욕 부진, 구부린 자세, 떨림, 체중 감소 및 사망을 포함한 살모넬라 감염의 전형적인 임상 증상이 관찰되었다.
4-2 체중 측정
상기 야생형 S. Typhimurium 2173(ST2173) 균주가 감염된 마우스의 체중을 측정하였으며, 그 결과는 도 6B에 나타내었다.
도 6B에 나타낸 바와 같이, 35 dpi에서 야생형 S. Typhimurium 2173(ST2173) 균주가 감염된 마우스의 체중은 ST2173 감염에 의해 약 77%로 감소한 것을 확인하였다. 그러나 Δ yjeK 돌연변이 균주로 면역된 마우스는 ST2173 감염 후 7일 동안 체중 증가를 나타내어 살모넬라 균주를 주사하지 않은 건강한 마우스와 유사한 체중을 나타냈다.
4-3. 간 및 비장의 박테리아 수 분석
상기 야생형 S. Typhimurium 2173(ST2173) 균주가 감염된 마우스를 희생시킨 후 간 및 비장의 무게를 측정하였고, 간 및 비장 내의 박테리아 수를 분석하였다. 간의 무게 및 박테리아 수를 분석한 결과는 도 6C에 나타내었고, 비장의 무게 및 박테리아 수를 분석한 결과는 도 6D에 나타내었다.
도 6B 및 C에 나타낸 바와 같이, 후보 백신으로 면역된 마우스(Δ yjeK 돌연변이 균주 접종 그룹)에서는 간과 비장의 비대의 징후가 없었지만, 사전 예방접종을 하지 않은 공격받은 마우스는 간 및 비장이 비대했다. 또한 후보 백신으로 면역된 마우스(3.0 X 103 CFU/g liver 및 4.8 X 103 CFU/g spleen)의 간 및 비장의 세균 부담은 야생형 살모넬라로 면역된 마우스(2.3 X 104 CFU/g liver 및 7.5 × 104 CFU/g spleen) 및 면역되지 않은 마우스(positive challenge control: 3.9 X 105 CFU/g liver 및 2.5 X 106 CFU/g spleen)에 비해 유의하게 완화되었다.
4-4. 생존 분석
100 LD50의 박테리아 용량으로 ST2173의 경구 감염 후 면역화된 마우스의 생존율을 모니터링하여 후보 백신의 예방 효과를 평가하였다. 평가 결과는 도 6E에 나타내었다.
도 6E에 나타낸 바와 같이, 살모넬라 균주로 면역화되지 않은 양성 대조군(P control)의 대부분은 ST2173 감염 후 1주 이내에 사망했다. 그러나 후보 백신으로 면역된 마우스(Δ yjeK)는 모니터링 기간 동안 ST2173 감염에서 살아남았다. 야생형 살모넬라균에 미리 감염된 마우스(WT)는 24dpi에서 독성 균주에 대한 공격에 대해 75% 생존했다.
상기 결과는 후보 백신인 Δ yjeK 돌연변이 균주가 살모넬라균에 대한 완전한 보호를 제공할 수 있음을 의미한다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Innovac
<120> YjeK gene deleted Salmonella typhimurium strain and Salmonella
vaccine composition comprising the same
<130> 1.9P-1
<150> 10-2021-0081428
<151> 2021-06-23
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> deleted_yjek
<400> 1
attagcactg ccgaagctgt aaatccagcg gtgttttgct tgtgtaggct ggagctgctt 60
cgaagttcct atactttcta gagaatagga acttcggaat aggaactaag gaggatattc 120
atatgaacaa gcgcctggcg tcctgtcctg cccggaggtt ttcatcagct tcaatctgta 180
aaagatgcag cagttcgtcg ggattggtca caacatcggc aagttgcgct aaccaatctt 240
ctcgagatct ggatcccctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttg 289
<210> 2
<211> 1016
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<400> 2
attagcactg ccgaagctgt aaatccagcg gtgttttgct cggttcgccg ccgatttcac 60
gcgccagtct tggcaccata tagccggata ccagcgtgag cagttcgcgc atgatttgcc 120
gggcttcgtc atcggtgacc ataaaatgcg cggcgccctg cactttatcc agcacatgca 180
ggtaataggg catcacgccg gcgtcaaata gcgcgttgct cagattcgcc agcgttcgcg 240
cgttatcatt cacgccacgc agcaggacgc tctggttgag aagcgtgacg cccacgtggc 300
gcagtttctt catcgccagg ccgaacgcct cgtccacttc attagcgtgg ttgatatggt 360
tcaccaacaa aatttgcaga cgtgactggt caaagcgagc gaccagttcg tcagtaatgc 420
gtgccgggat gacgataggc aaccgactgt ggatgcgtag ccgcttgacg tgcttaatgg 480
cttccagttg cgtgagcagc cagtccagct catgatcttt cgccatcagc ggatcgccgc 540
cggaaaagat gatctcatcc agttccgggt gtgcggcgat atactccagc gcgactgtcc 600
agttgcgctt attgccttga ttctctgcat acgggaagtg acgacggaaa cagtagcggc 660
aatttaccgc acatccgcct tttaccagca atagcgcccg gttttggtat ttatgcaata 720
atcctggcac cacgctgtgt tgctcttcca gcgggtcggt ggagaaaccg ggggcgacaa 780
taaattcatc ccgggacgtc agcacttgac gtaaaagagg atcgtcaggg ttgcccttct 840
ccatgcgcgc aataaaagcg cgcggcacgc ggagggcaaa caagcgcctg gcgtcctgtc 900
ctgcccggag gttttcatca gcttcaatct gtaaagatgc agcagttcgt cgggattggt 960
cacaacatcg gcaagttgcg ctaaccaatc ttctcgaagc ttggaattcg cccggg 1016
Claims (9)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 아르기닌 디하이드롤라제(arginine dihydrolase) 및 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylation)와 관련된 생화학적 활성을 차단하는 것인, 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 AMC(amoxicillin/clavulanic acid), 암피실린(ampicillin, AM), 세팔로틴(cephalothin, CF), 겐타마이신(gentamicin, GM), 카나마이신(kanamycin, K), 네오마이신(neomycin, N) 및 SAM(ampicillin/sulbactam)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항생제에 대해 항생제 감수성을 나타내는 것인, 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 flagellin FliC의 발현이 야생형 균주보다 감소되고, porin OmpD의 발현이 야생형 균주보다 증가된 것인, 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 숙주 내에서 비장종대(splenomegaly)를 유도하지 않는 것인, 균주.
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라증(Salmonellosis) 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라균에 대한 면역원성 조성물.
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라증 예방 또는 개선용 사료 조성물.
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오티드가 결실된 YjeK 유전자를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 살모넬라증 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| KR1020210081428 | 2021-06-23 |
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Family Applications (1)
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| KR1020220076981A KR20220170779A (ko) | 2021-06-23 | 2022-06-23 | YjeK 유전자가 결실된 살모넬라 티피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 살모넬라 백신 조성물 |
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| Publication number | Publication date |
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| WO2022270953A1 (ko) | 2022-12-29 |
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