KR20180105945A - 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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KR20180105945A
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정옥미
최병국
임춘태
윤소윤
이희수
권용국
송창선
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Abstract

본 발명은 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 살모넬라 타이피뮤리움 감염증의 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 수탁번호 KCTC13198BP로 수탁된 살모넬라 타이피뮤리움 균주 ST26, 이를 포함하는 살모넬라 타이피뮤리움 감염증의 예방용 백신 조성물, 백신 조성물의 제조방법 및 상기 백신 조성물을 개체에 투여하여 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하는 방법에 관한 것이다. 가금류로부터 분리된 본 발명의 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주는 병원성이 높은 균주로서, 높은 안전성, 면역원성 및 방어능을 가지고 있는 바, 본 발명의 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 포함하는 백신 조성물은 가금류 농가의 생산 안정성뿐만 아니라 인간에서의 살모넬라 타이피뮤리움 감염증 발생을 예방하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 백신 조성물{Novel Salmonella Typhimurium strain and vaccine composition comprising the same}
본 발명은 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 이를 포함하는 살모넬라 타이피뮤리움 감염증의 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 수탁번호 KCTC13198BP로 수탁된 살모넬라 타이피뮤리움 균주 ST26, 이를 포함하는 살모넬라 타이피뮤리움 감염증의 예방용 백신 조성물, 백신 조성물의 제조방법 및 상기 백신 조성물을 개체에 투여하여 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하는 방법에 관한 것이다.
살모넬라는 형태학적 또는 생리학적으로 대장균과 유사하지만 의학상의 편의를 위해 K. Kauffmann 등의 제창에 의해 독립된 속 (genus)으로 분류되었다. 살모넬라는 1885년 Salmon과 Smith가 돈콜레라로 죽은 돼지에서 살모넬라 코레라에수이스(Salmonella choleraesuis)를 최초로 분리 보고한 이래, 장염과 위장염 환자 및 각종 질병을 가진 동물로부터 분리되었다. 또한 닭을 비롯한 소, 돼지, 염소, 개, 고양이 등의 건강한 동물과 환경물에서도 분리되었는데, 살모넬라 속 균은 현재까지 2,500여종 이상의 혈청형이 보고된 실정이며 동물에 따른 숙주 특이성이 있는 균종(예를 들면 사람에서의 S. Typhi, 소에서 S. Dublin, 돼지에서의 S. Choleraesuis, 닭에서의 S. Pullorum, S. Gallinarum)과 숙주 특이성이 없는 균종(S. Typhimurim, S. Enteriditis, S. Newprot 등)으로 크게 구분 지을 수 있고, 이 중 축산물을 통해 사람의 식중독을 일으키는 혈청형은 후자에 해당한다.
살모넬라는 국내에서는 이질을 일으키는 쉬겔라(Shigella)와 함께 가장 많은 환자수를 발병하게 하는 병원균으로, 살모넬라에 오염된 양식 동물의 유통을 통해 인체에 전염될 수 있는 매우 위험한 세균이다. 살모넬라는 그람음성 간균으로 포자는 형성하지 않으며, 다양한 동물에서 기생균으로 발견되고 있다.
살모넬라 감염증은 몇 가지 형태로 발생하지만 식중독 및 장염 형태가 가장 일반적인 증상이다. 과거 국내의 식중독 원인은 쉬겔라(Shigella)에 의한 것이 주를 이루었으나, 최근에는 살모넬라에 의한 식중독 발생율이 점차 증가하고 있는 추세이며, 단체 급식의 증가로 그 심각성이 계속 커지고 있다. 2000년도 식중독 환자의 원인균을 조사한 보고에 의하면, 2,500여 건 이상이 살모넬라에 의한 식중독으로 조사되었는데, 이는 포도상 구균(약 1,000여건), 비브리오(약 200여건) 등 다른 식중독 원인균에 비교하여서도 월등히 높은 비율을 차지하고 있는 것이다.
또한, 질병관리본부에서 조사한 사람에서 발견된 살모넬라 혈청형의 전국적 분포를 보면 살모넬라 엔테리티디스가 가장 높고 그 다음으로는 살모넬라 타이피뮤리움이 차지하는 것으로 나타나 서울지역과 동일한 분포양상을 보이고 있다.
한편, 축산물에서의 살모넬라 혈청형 검출율은 축종에 따라 차이가 있는데, 국내의 경우 축종에 대한 살모넬라 혈청형의 체계적인 분포율은 아직 보고된 바 없다. 네덜란드의 경우 사람에서는 예전에는 장티푸스의 원인체인 살모넬라 타이피가 가장 많이 분리되었으나 1980년대부터는 살모넬라 타이피뮤리움 또는 살모넬라 엔테리티디스가 가장 많이 분리되고 있다.
또한, 돼지에서는 살모넬라 타이피뮤리움이 가장 많이 분리되고 있고, 소에서도 숙주특이성이 높은 살모넬라 타이피뮤리움과 살모넬라 두블린이 가장 많이 분리되며 살모넬라 엔테리티디스는 검출율이 비교적 낮다. 닭의 경우는 살모넬라 엔테리티디스가 가장 많이 분리되고 살모넬라 타이피뮤리움의 경우 분리율이 6번째를 차지하고 있다고 한다. 흥미로운 것은 사람에서는 살모넬라 엔테리티디스의 검출율이 살모넬라 혈청형 중 수위를 차지하나 닭에서 가장 높은 검출율을 보이고, 소와 돼지에서는 살모넬라 타이피뮤리움이 수위를 차지하고 있다는 것이고, 이러한 결과는 나라별로 유사한 양상을 보이고 있다.
세계보건기구(WHO)에서는 1988년부터 축산물 유래 살모넬라에 대한 식중독 발생을 억제시키기 위해서는 효과적인 백신을 대상 동물에 접종할 것을 권장하고 있다. 특히 살모넬라 타이피뮤리움은 축종에 관계없이 분리율이 수위를 차지하고 있어, 살모넬라 엔테리티디스와 더불어 축산물에 전파되어 사람에게 식중독을 일으키는 가장 빈번하고 중요한 살모넬라 혈청형이므로, 이에 대한 효과적인 백신을 개발할 필요성이 있다.
아울러, 국내에서 2012년부터 축종에 관계없이 성장촉진용 항생제를 사료에 첨가하는 것이 전면 금지됨에 따라 살모넬라를 비롯한 세균성 질병의 발생 증가가 예상되고 있다. 특히, 살모넬라 타이피뮤리움은 오리산업에서 경제적공중보건학적인 측면에서 매우 중요한 문제로 부각되고 있으므로 오리용 살모넬라 백신의 개발 및 적용이 필요한 상황이다.
이에 따라 본 발명자들은 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하기 위한 백신에 대한 연구를 진행하던 중, 병원성이 높은 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 ST26을 발견하였고, 이를 불활화하여 제조한 백신이 현저한 면역원성 및 방어능을 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
한국 공개특허공보 제10-2012-0059889호 한국 공개특허공보 제10-2015-0099469호
본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC13198BP로 수탁된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 균주 ST26, 이를 포함하는 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC13198BP로 수탁된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 균주 ST26를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 상기 균주를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 균주를 불활성화시키는 단계;를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하는 방법을 제공한다.
가금류로부터 분리된 본 발명의 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주는 병원성이 높은 균주로서, 높은 안전성, 면역원성 및 방어능을 가지고 있는 바, 본 발명의 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 포함하는 백신 조성물은 가금류 농가의 생산 안정성뿐만 아니라 인간에서의 살모넬라 타이피뮤리움 감염증 발생을 예방하는 데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 오리에서 분리한 살모넬라 타이피뮤리움 균주에 대한 PFGE 분석을 수행하여 살모넬라 타이피뮤리움 균주의 유전자형을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 12주의 백신 후보 균주에 대하여 마이크로어래이를 이용하여 각 균주의 병원성 유전자 함유 정보를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 1일령 육용오리에 백신을 1차 접종한 후 주별 항체가(3a), 1차 접종 후 4주령에 백신을 2차 접종한 후 주별 항체가(3b)를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 백신 조성물의 제조방법을 모식화한 도이다.
도 5는 본 발명의 균주를 이용하여 제조한 백신의 안전성을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 균주를 이용하여 제조한 백신의 면역원성 및 방어능을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 일례로 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 균주 ST26 및 이를 포함하는 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물을 제공한다.
아울러 또 다른 예로 본 발명은 (1) 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 균주 ST26를 배양하는 단계; 및 (2) 상기 균주를 불활성화시키는 단계;를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 살모넬라 타이피뮤리움 균주 ST26은 가금류인 오리에서 분리한 균주로, 본 발명자들이 신규하게 분리한 균주로서, 2017년 02월 07일자로 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC13198BP로 수탁된 것을 특징으로 한다.
상기 균주는 국내 가금에서 유행하는 살모넬라 타이피뮤리움 중 가장 빈번하게 나타나는 유전자형 그룹에 속하고 살모넬라균을 대표할 수 있는 병원성 유전자를 다수 함유하고 있는 것으로, 백신으로서 활용도가 높고, 높은 면역원성 및 방어능을 가지는 것을 특징으로 한다. 특히 상기 균주는 국내 오리에서 신규하게 분리한 균주로서, 이를 백신으로 활용하는 경우 기존에 공지되어 있는 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 이용한 백신에 비하여 국내 가금에서 보다 우수한 백신 활성을 가진다.
본 발명에 있어서, 용어 '예방'이란 조성물의 투여에 의해 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 살모넬라 타이피뮤리움 감염증은 살모넬라 타이피뮤리움에 의하여 발생할 수 있는 모든 질병을 다 포함하는 것으로, 구체적으로는 식중독, 살모넬라증, 장염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 질환일 수 있으며, 바람직하게는 장염 또는 패혈증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어 '백신'은 감염증의 예방으로 사람이나 동물을 자동적으로 면역하기 위하여 쓰이는 항원을 지칭하는 것으로, 본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신, 불활화 백신, 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 불활화 백신인 것이 바람직하다. 생균 백신의 경우 백신 내 균주의 병원성 복귀와 같은 부작용의 염려가 존재하는 바, 불활화 백신을 이용하는 것이 상기와 같은 부작용의 염려가 없어 보다 안전하게 백신으로 활용될 수 있다는 이점이 있다.
상기 불활화 백신을 제조하기 위하여 본 발명의 ST26 균주를 불활성화한 형태를 제조하는 것이 필요한데, 본 발명의 균주는 통상적인 불활성화 방법, 예를 들어, 포르말린 처리 또는 열처리 방법으로 불활성화 될 수 있으며, 바람직하게는 포르말린 처리를 통하여 불활성화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 보조제(adjuvant)를 더 포함할 수 있다. 보조제는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 본 발명의 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 보조제는 임의의 다양한 보조제를 포함한다. 상기 보조제는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서, 보조제로 ISA70, 수산화알루미늄겔, 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 ISA70 또는 수산화알루미늄겔을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 보조제 외에도 추가적으로 용매 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질이라면, 본 발명의 백신의 작용을 억제하지 않는 한, 제한 없이 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 비강, 경막외(eidural) 또는 다른 적절한 경로를 통하여 투여를 수행할 수 있으며, 바람직하게는 근육 주사용으로 제조되어 근육내 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 ST26 자체 또는 상기 ST26과 담체가 결합된 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 있어서 상기 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다.
상기 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 백신은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판 (Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 예로 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하기 위하여 백신 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 '약학적으로 유효한 양'으로 '투여'할 수 있으며, 상기 개체는 동물, 바람직하게는 가축류를 말하며, 보다 바람직하게는 가금류를 말하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 가축류는 인간에 의하여 순화, 개량되어 사람과 함께 공동생활을 하는 유용한 동물을 지칭는 개념으로, 조류(가금류), 어류, 곤충류, 포유류를 모두 포함하는 개념으로, 상기 가축류는 돼지, 소, 닭, 말, 오리 및 개로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 가금류는, 가축 중 조류에 속하는 동물을 총칭하여 이르는 개념이며, 상기 가금류는 닭, 오리, 꿩, 메추리, 타조, 거위 및 칠면조로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물 내 포함되는 살모넬라 타이피뮤리움 균주 ST26는 높은 면역원성 및 방어능을 나타내는 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 구체적인 수치로는 107 내지 1010 CFU/ml일 수 있으며, 바람직하게는 108 내지 109 CFU/ml일 수 있으며, 가장 바람직하게는 108 CFU/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제제예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주 선별 및 병원성 분석
1-1. PFGE 분석을 통한 1차 균주 선별
동물, 특히 가금류에서 발생하는 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 탁월한 백신을 제조하기 위하여, 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 선별하였다. 먼저, 2009년부터 2013년까지 대한민국 오리에서 분리한 살모넬라 타이피뮤리움 79가지 균주에 Xba Ⅰ을 처리한 후 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법으로 PFGE(pulsed field gel electrophoresis)를 수행하여 상기 분리한 살모넬라 타이피뮤리움들의 유전자형을 분석하였다. 상기 분리된 모든 균주들은 트립티케이스 소이 아가 또는 브로스(TSB; tryoticase soy agar or broth)에서 37 ℃로 반복적으로 배양시켰다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 그 결과 총 16가지 유형의 살모넬라 타이피뮤리움이 존재함을 확인하였으며, 특히 10가지의 PFGE 유전자형은 하나의 큰 유전자형 그룹을 형성하고, 총 70개의 균주가 이 그룹에 해당함을 확인하였다. 이에 따라 주요 PFGE 유형별로 대표 균주인 9주(ST01, ST26, ST56, ST76, ST77, ST79, ST80, ST83, ST88)를 1차 선별하였다.
1-2. 백신으로 이용할 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주 선별
상기 실시예 1-1을 통해 1차 선별한 균주 중 발생빈도가 높은 유전자형에 속하는 균주인 ST26 및 ST76을 2차 선별한 후, 기존에 알려진 214개의 대표적인 살모넬라 병원성 유전자로 제작한 마이크로어레이를 이용하여 각 균주의 병원성 유전자 유무의 분포를 분석하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
상기 마이크로어레이는 살모넬라 균의 혈청형인 엔테리티디스 균주 P125109와 타이피뮤리움 LT2의 전체 염기서열, 및 살모넬라 독성 인자의 데이터베이스(VFDB, http://www.mgc.ac.cn/VFs)로부터 살모넬라의 특징으로 판단되는 214개의 유전자를 선택하여 제작하였고, 상기 유전자 중 66개는 가장자리 부착 결정인자를 암호화하는 유전자, 112개는 유형 Ⅲ 및 Ⅳ 분비 시스템을 암호화하는 유전자, 15개는 독성 유전자를 암호화하는 플라스미드, 및 21개는 항존유전자 및 플라스미드 골격 유전자이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, ST26 및 ST76에 포함된 보유 유전자 비율이 각각 65.4% 및 69.6%임을 확인하였다. 이 후 ST26 및 ST76의 백신으로서의 방어능 비교를 통해 더 우수한 균주인 ST26을 확인(실시예 4 참고)하고, 이를 본 발명의 신규한 백신 후보 균주로 선별하였으며, 2017년 02월 07일자로 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC13198BP로 수탁하였다.
실시예 2. 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 이용한 백신 균주 제조
2-1. 백신 균주 제조
상기 실시예 1에서 선별한 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주 ST26을 이용하여 백신을 제조하였다. 먼저, 실시예 1에서 선별한 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 혈액배지(6% 농도의 피브린을 제거한 면양혈액 함유 기본혈액 한천배지)에 접종하여 단일 콜로니를 얻었다. 이 후 상기 콜로니를 500 mL의 TSB 배지(tryptic soy broth medium)에 37℃의 온도에서 8시간 동안 180 rpm으로 교반하면서 배양하였고, 이 후 PBS로 희석시켰다.
그리고 나서 상기 배양된 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 원심 분리하여 이로부터 세포를 수득하였으며, 이를 0.005 (v/v) 37% 포름알데히드에서 하룻밤 동안 200 rpm으로 교반해주면서 불활성화시킨 후 PBS를 이용한 세척 단계를 거친 후, 이를 백신 균주로 사용하였다. 한편, 상기 균주의 불활성화 여부를 확인하기 위하여 상기 균주의 배양액 일부를 상기 혈액배지에 접종하여 하룻밤 동안 배양하여 콜로니를 생성하는지 여부를 확인하였다.
2-2. 백신 균주의 접종 농도 결정
상기 실시예 2-1에서 제조한 백신 균주와의 시너지 효과를 위하여 다양한 백신 보조제를 이용하였으며, 이에 따른 적절한 접종 농도를 결정하기 위하여 면역 증강 효능을 실험하였다. 보다 구체적으로 실시예 2-1에서 수득한 불활화된 ST26으로부터 분리한 세포를 수산화알루미늄겔(Al gel)과 85:15(v/v) 비율로 혼합하거나 ISA 70과 3:7(wt/wt)의 비율로 혼합하여, 최종 균주 농도가 107 CFU/수 ~ 109 CFU/수가 되도록 하여 1차 및 2차 백신, 즉 2 종류의 불활화 백신을 제조하였다.
이 후 상기 백신 균주의 접종 농도를 결정하기 위하여 대한민국 충청북도 소재 ㈜모란식품의 살모넬라 음성 오리농장으로부터 구입한 흰 페킨 육용오리(Pekin broiler duck)를 그룹당 10수씩 나눈 후, 겔상인 수산화알루미늄겔을 보조제로 이용한 불활화 백신을 용량별(107 CFU/수 ~ 109 CFU/수)로 1일령의 상기 흰 페킨 육용오리에 근육주사(1차 접종)하여 투여하고, 4주령 후에 유상인 ISA 70을 보조제로 이용한 불활화 백신을 근육주사(2차 접종)하여 투여하였다. 상기 백신 접종으로 인한 면역 증강 효능의 확인을 위해 최초 백신접종 후 부터 매주 닭 살모넬라 항체 시험 키트(chicken salmonella antibody test kit, ELISA, BioChek사)를 이용하여 혈청항체 역가를 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 겔상인 수산화알루미늄겔을 보조제로 이용한 1차 백신을 접종한 후 유상인 Seppic ISA70를 보조제로 이용한 2차 백신을 접종하는 경우에 107 CFU/수 내지 108 CFU/수를 IM 접종한 경우 높은 항체가(the value)를 나타내었으며, 그 중에서도 108 CFU/수 및 109 CFU/수에서 현저한 항체가를 나타냄을 확인하였다. 이에 따라 가장 효율적인 백신 효율을 나타내는 농도를 108 CFU/수로 하고 백신 조성물을 완성하였다. 한편, 상기에 기재한 백신의 제조방법에 대한 모식도를 도 4에 나타내었다.
실시예 3. 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 이용하여 제조한 백신의 안전성 검증
제조된 백신 균주를 이를 필요로 하는 개체에 투여한 경우 안전한지 여부를 확인하기 위하여 1일령 육용오리에 상기 실시예 2-1에서 수득한 불활화된 ST26으로부터 분리한 세포를 수산화알루미늄겔(Al gel)과 85:15(v/v) 비율로 혼합하여 최종 균주 농도가 107 CFU/수 ~ 109 CFU/수가 되도록 제조한 백신(G4~G6)으로 1차 접종을 수행하였으며, 4주령에 상기 실시예 2-1에서 수득한 불활화된 ST26으로부터 분리한 세포를 ISA 70과 3:7(wt/wt)의 비율로 혼합하여 최종 균주 농도가 107 CFU/수 ~ 109 CFU/수가 되도록 제조한 백신의 2차 접종을 실시하여 증체량을 비교하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 1차 접종과 2차 접종을 수행한 후에도 대조군과 증체량에 유의한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다. 이는 본 발명의 백신이 안전함을 나타낸다.
실시예 4. 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 이용하여 제조한 백신의 면역원성 및 방어능 확인
본 발명의 백신이 우수한 살모넬라 타이피뮤리움 감염증 예방 효과, 즉 면역원성 및 방어능을 가지는 지 여부를 확인하였다. 먼저, 66 마리의 2주령의 흰 페킨 육용오리(Pekin broiler duck)와 45 마리의 2주령의 흰 페킨 종오리(Pekin breeder duck)를 대한민국 충청북도에 위치한 살모넬라 음성인 오리 농장에서 공급받았다. 첫 실험에서는 5 그룹의 2주령 흰 페킨 오리(그룹 당 11마리)에 실시예 2에서 제조한 수산화알루미늄겔과 혼합된 백신 조성물을 근육 주사를 통해 투여하였다. 대조군에는 상기 백신 조성물 대신에 PBS를 근육 주사하였고, 다른 실험군에는 ST76 또는 상업적으로 판매되는 백신인 Norbilis　 Salenvac T(MSD Animal Health, Boxmeer, Netherlands)를 근육 주사하였다. 각 그룹에 대한 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
상기 접종 후 2주가 경과한 후에 상기 백신 처리 또는 PBS 처리한 오리에 109 CFU/수 농도로 강병원성 균주인 살모넬라 타이피뮤리움 DST005(Salmonella Typhimurium DST005)의 경구 투여를 수행하였다. 상기 경구 투여 이 후 3일, 7일 및 14일이 경과했을 때마다 무작위로 오리를 희생시켜 상기 살모넬라 타이피뮤리움 DST005에 의한 감염증 발병 여부를 확인하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었으며, 이를 수치화한 것을 표 2에 나타내었다.
DS005
처리 후
경과일수		 Recovery of Salmonella (cfu/g) Fecal shedding of Salmonella (%)
Liver Spleen Cecal contents Cloacal swab
대조군 3 3/3 (18.7) 3/3 (26.7) 3/3 (1186.7) 11/11 (100.0)
7 3/4 (30.5) 1/4 (3.5) 2/4 (60.0) 3/8 (37.5)
14 0/4 (0.0) 0/4 (0.0) 0/4 (0.0) 1/3 (33.3)
ST26
(108 CFU/수)		 3 1/3 (22.0) 1/3 (3.3) 1/3 (13.3) 7/11 (63.6)
7 0/4 (0.0) 2/4 (5.0) 1/4 (5.0) 1/8 (12.5)
14 0/4 (0.0) 0/4 (0.0) 0/4 (0.0) 0/3 (0.0)
ST76
(108 CFU/수)		 3 1/3 (1.3) 1/3 (1.3) 1/3 (100.0) 9/11 (81.8)
7 4/4 (4.5) 2/4 (24.5) 2/4 (100.0) 3/8 (37.5)
14 0/4 (0.0) 0/4 (0.0) 1/4 (6.7) 1/3 (33.3)
Norbilis
Salenvac T
(109 CFU/수)		 3 1/3 (0.7) 0/3 (0.0) 1/3 (26.7) 10/11 (90.9)
7 1/4 (2.5) 0/4 (0.0) 3/4 (11.0) 1/8 (12.5)
14 0/4 (0.0) 0/4 (0.0) 0/4 (0.0) 0/3 (0.0)
표 2에 나타낸 바와 같이, 강병원성 균주를 이용한 공격접종을 수행한 결과, 공격접종 3일이 경과한 후에 총 배설강 표본 내 균배출 비율이 백신 비접종 대조군에 비하여 본 발명의 백신 처리군(ST26, 108 CFU/수)에서 현저히 낮아졌음을 확인하였고, 그 외 장기 내 균분리율 역시 백신 비접종 대조군에 비하여 본 발명의 백신 처리군에서 현저히 낮아지는 것을 관찰하였다.
아울러, 도 6에 나타낸 바와 같이, 국내 수입 시판백신과 비교하였을때 공격접종 수행 14일이 경과한 후에 균분리율과 총배설강 표본에서의 균배출 비율은 동일하였으나, 항체가 측면에서 본 발명의 백신을 접종한 오리에서 상대적으로 높음을 확인하였다.
이를 통해 본 발명의 백신은 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 있어서 현저한 면역원성 및 방어능을 가져 우수한 예방 효과를 가짐을 확인하였다.
종합적으로, 높은 안전성, 면역원성 및 방어능을 가지는 본 발명의 신규한 살모넬라 타이피뮤리움 균주는 불활화하여 백신 조성물로 이용될 경우 가금류 농가의 생산 안정성뿐만 아니라 인간에서의 살모넬라 타이피뮤리움 감염증 발생을 예방할 수 있다는 점에서 우수한 효과를 가짐을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC13198BP 20170207

Claims (11)

  1. 수탁번호 KCTC13198BP로 수탁된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 균주 ST26.
  2. 제1항의 균주를 유효성분으로 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 균주는 불활화된 것을 특징으로 하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 보조제(adjuvant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 보조제는 ISA70 또는 수산화알루미늄겔인 것을 특징으로 하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 근육 주사용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 살모넬라 타이피뮤리움 감염증은 식중독, 살모넬라증, 장염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물.
  8. (1) 제1항의 균주를 배양하는 단계; 및
    (2) 상기 균주를 불활성화시키는 단계;를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증에 대한 예방용 백신 조성물의 제조방법.
  9. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계;를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 살모넬라 타이피뮤리움 감염증은 식중독, 살모넬라증, 장염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하는 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 107 내지 1010 CFU/ml의 살모넬라 타이피뮤리움 균주 ST26을 포함하는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 타이피뮤리움 감염증을 예방하는 방법.
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