KR102062624B1 - 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents

약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102062624B1
KR102062624B1 KR1020180115006A KR20180115006A KR102062624B1 KR 102062624 B1 KR102062624 B1 KR 102062624B1 KR 1020180115006 A KR1020180115006 A KR 1020180115006A KR 20180115006 A KR20180115006 A KR 20180115006A KR 102062624 B1 KR102062624 B1 KR 102062624B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
avian influenza
salmonella gallinarum
vaccine
antigen
Prior art date
Application number
KR1020180115006A
Other languages
English (en)
Inventor
이존화
일샤드 하잠
김제형
강재구
Original Assignee
전북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전북대학교 산학협력단 filed Critical 전북대학교 산학협력단
Priority to KR1020180115006A priority Critical patent/KR102062624B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102062624B1 publication Critical patent/KR102062624B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

본 발명은 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 HA1, HA2 및 M2e 항원으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 포함하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물{Vaccine composition for preventing or treating avian influenza and fowl typhoid simultaneouly comprising attenuated Salmonella gallinarum mutant as effective component}
본 발명은 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 호흡기 질환을 야기하는 대표적인 바이러스로 A, B 및 C 타입의 3가지 속으로 나뉘는 RNA (-) 바이러스이다. 이중 조류 인플루엔자 바이러스는 A 타입에 속하고, A형 인플루엔자 바이러스는 표면항원으로 16종의 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 서브타입과 9종의 뉴라미니데이즈(neuraminidase, NA) 서브타입으로 구분된다. A형 인플루엔자 바이러스 속에서도 상이한 서브타입간 교차반응이나 교차 면역은 쉽게 이루어지지 않고 동일한 서브타입 내에도 대변이 또는 소변이가 빈번하게 발생하여 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 계발은 어려움이 있다. 인플루엔자 바이러스의 변이는 숙주역의 확대 및 병원성의 다양화를 가져와 인플루엔자 바이러스의 통제는 더욱 어려워지는 추세이다.
인플루엔자 바이러스 중 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 H9N2 바이러스는 가금류에 감염이 이루어지면 감염된 가금류에서 경미한 호흡기 및 소화기 증상이 나타나 병원성은 낮은 것으로 보이나, 산란계에 감염이 이루어지면 산란율이 10 ~ 40% 저하되고, 병원성 박테리아에 의해 합병증이 동반되는 경우 폐사에 이르러, 작게는 농가 규모의 손실에서 크게는 국가 경제적인 손실을 야기한다. 현재 가금류를 대상으로 시판되는 H9형 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 백신은 불활성화된 바이러스 균주 또는 인플루엔자 바이러스 외 다양한 감염성 박테리아와 바이러스들에 대한 면역원성을 유도할 수 있는 조성물 형태로 시판되고 있다. 그러나 상기에 기술된 바와 같이 인플루엔자 바이러스는 항원성의 변이가 빈번하여 과거에 분리된 균주나 개발이 이루어진 균주로 생산된 바이러스 백신은 최근 유행하는 인플루엔자 바이러스에 대한 효과적인 면역력을 제공하지 못하는 경우가 있다. 따라서 최근 유행하는 균주를 포함하여 앞으로 유행이 잠정적으로 예상되는 신규 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 방어가 가능한 면역원성을 제공하는 제제 및 백신의 개발이 필요한 실정이다. 인플루엔자 바이러스의 경우, 기존에 유행한 인플루엔자 바이러스를 포함 다양한 유전적 정보 및 아미노산 서열에 대한 정보가 보고되어 있고 이를 통해 최근 유행하는 바이러스에서 안정적으로 보존되는 서열을 사용하여 효과적인 면역원성 제제 및 백신을 생산할 수 있다. 따라서 위와 같은 형태로 개발이 이루어진 새로운 면역원성 제제 및 백신 후보물질을 전달해 주는 전달자가 중요한 핵심이 될 수 있다.
가금 티푸스(fowl typhoid)는 병아리부터 성계에 이르기까지 급성 또는 만성 폐혈증을 유발하는 전염병으로 높은 폐사율을 나타내는 병원균인 살모넬라 갈리라룸(Salmonella gallinarum)의 감염에 의해 이루어진다. 축사내 전염은 감염이 이루어진 가금류의 분변에 오염된 사료 또는 음수를 섭취하여 일반적인 전염이 이루어지며, 감염이 이루어진 어미닭의 생식기관이나 달걀을 통해 수직감염이 이루어진다. 이러한 가금티푸스의 한국에서 공식적인 발병 보고는 1992년을 시작으로 전국적으로 보고가 이루어지며 지속적인 경제적 손실을 야기한다. 해당 질병을 유발하는 균은 세포내 기생하는 박테리아로 대식세포내에서 죽지 않고 증식이 이루어지기 때문에 항생제를 사용한 치료가 어렵다. 즉 항생제를 지속적으로 사용함에 따라 혈중 일정 이상의 항생제가 잔존하면 감염의 증상은 억제할 수 있으나 혈중 항생제 농도가 떨어지게 되면 잔존하고 있는 균주의 증식으로 증상이 지속적으로 나타난다. 또한 지속적인 항생제의 사용은 항생제 내성 균주의 출현을 불러올 수도 있다. 따라 가금티푸스에 가장 효과적인 방제 방법은 백신을 사용 해당 숙주로 하여금 해당 균주에 대해 생성된 면역시스템을 사용하여 예방하는 방법이다. 가금티푸스에 대한 상용화된 생균백신은 2001년 산란계를 대상으로 허가된 생균 백신주 살모넬라 갈리나룸9R(SG9R)이 대표적이다. 현재까지 상용화가 이루어진 예방 백신은 경구를 통한 면역화 진행시 야생균주에 대한 방어력이 상당히 떨어지는 한계성이 지적이 되어왔고 대부분의 백신은 근육접종을 권장하고 있다. 이러한 근육접종의 한계성은 가금시장에서 경제적, 상황적으로 제한성을 지닌다.
한편, 한국등록특허 제1267416호에는 'H9 조류 인플루엔자 바이러스 유사입자 백신 및 그 응용'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1146372호에는 '살모넬라 변이균주를 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물에 대해서는 기재된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 경구용 가금티푸스 생균백신과 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스에 동시 방어가 가능한 백신을 개발하고자 살모넬라 갈리나룸 균주에 유전적으로 독성 유전자를 결실시켜 약독화시킨 균주에 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스의 항원을 발현시켜 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스와 가금티푸스 동시 방어가 가능한 백신후보균주를 이용한 경구용 백신조성물을 제작하였고 이를 산란계에 적용하여 충분한 면역 유도와 효과적인 방어능력을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 HA1(transmembrane subunit of hemagglutinin; subunit 1 of hemagglutinin), HA2 및 M2e(matrix protein 2 extracellular domain) 항원으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 포함하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 중 둘 이상을 포함하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주의 혼합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 또는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 또는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명은 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 항원을 발현하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주의 혼합물을 이용한 백신으로, 가금티푸스와 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 동시 방어가 가능한 백신이다. 또한, 본 발명의 백신은 H9N2 항원을 발현 분비하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주를 배양하는 방법으로 간단하게 준비할 수 있어, 기존 사용되는 불활성화 백신의 생산보다 경제적이고 간편하게 제조할 수 있어 가금티푸스와 저병원성 조류인플루엔자 H9N2의 동시 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 항원을 발현하는 백신후보 균주를 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 유세포분석기(FACS)를 통해 확인한 결과이다.
도 2는 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 항원을 발현하는 백신후보 균주를 항원 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 형광현미경 하에서 확인한 결과이다.
도 3은 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 항원을 발현하는 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물로부터 혈청 IgG, 장 IgA 및 폐 IgA 역가를 측정한 결과이다. SG: 살모넬라 갈리나룸, SG-M2e+pcDNAM2e: M2e 항원을 발현하며 동시에 M2e 항원 코딩 서열을 숙주세포내 발현이 가능한 플라스미드를 포함하는 재조합 벡터를 가진 살모넬라 갈리나룸, SG-M2e: M2e 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸.
도 4는 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물로부터 분비되는 항체에 따른 인플루엔자 중화역가를 측정한 결과이다.
도 5는 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물로부터 CD3+ CD4+ T 세포를 유세포분석기를 통해 분석한 결과이다.
도 6은 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물에 야생형 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스로 도전감염한 후, 각 그룹에서 일자별 분비되는 바이러스의 수를 Real-time PCR을 사용하여 측정한 결과이다.
도 7 및 도 8은 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물에 야생형 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스로 도전감염한 3일 또는 7일 후 각 그룹별 폐 조직의 염색 사진으로, 염증 정도를 확인한 결과이다.
도 9는 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물에 야생형 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스를 사용하여 도전감염한 7일 후 각 그룹별 폐 사진으로, 폐 비대화 정도를 측정한 결과이다.
도 10은 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물에 야생형 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스를 사용하여 도전감염시킨 후 그에 따른 식욕부진을 확인한 결과이다.
도 11은 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물로부터 살모넬라 특이적으로 반응하는 IgG와 IgA의 항체역가를 확인한 결과이다.
도 12는 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물에서 살모넬라 항원 특이적으로 분화되는 림프구를 확인한 결과이다.
도 13은 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물에서 살모넬라 항원 특이적으로 분화되는 CD3+ CD4+ T 세포와 CD3+ CD8+ T 세포를 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과이다.
도 14는 백신후보 균주로 면역화가 이루어진 실험동물에서 살모넬라 항원 특이적으로 분비되는 사이토카인의 전사체를 Real-time PCR을 통해 분석한 결과이다.
도 15는 상업화된 백신과 본 발명의 백신후보 균주 단독 또는 이들의 혼합물간의 면역화 효과를 비교한 결과로, 도전감염 후 3 또는 4일자에 실험동물로부터 분비되는 바이러스의 입자 수를 확인한 결과이다. SG: 약독화된 살모넬라 갈리나룸, Commercial vaccine: PRO-VACTM AIK(코미팜), SG-HA1: HA1 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸, SG-HA2: HA2 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸, SG-M2e: M2e 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸, SG-HA2-M2e: SG-HA2와 SG-M2e의 혼합물, SG-3Mix: SG-HA1, SG-HA2 및 SG-M2e의 혼합물.
도 16은 상업화된 백신과 본 발명의 백신후보 균주 단독 또는 이들의 혼합물간의 면역화 효과를 비교한 결과로, 도전감염 7일 후 각 그룹별 폐 조직의 염색 사진이다. uninfected control: 바이러스 무감염 대조구, infected control: 약독화된 살모넬라 갈리나룸 면역 후 바이러스 감염 대조구.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 HA1(transmembrane subunit of hemagglutinin; subunit 1 of hemagglutinin), HA2 및 M2e(matrix protein 2 extracellular domain) 항원으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 포함하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 변이주를 제공한다.
본 발명의 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스의 항원을 선정하기 위하여, 2013년도부터 아시아 지역 조류에서 유행한 H9N2의 아미노산 서열 데이터베이스(NCBI Influenza Virus Database)를 기반으로 547개 H9N2 바이러스의 M2 단백질의 아미노산 서열 중 가장 안정적으로 보존이 이루어지고, 항원성이 유지되는 지역을 선택한 후 유전자 합성을 진행하였고, 면역활성보조인자인 CD154(CD40 ligand 또는 CD40L)를 동시 발현이 가능하도록 제작하였다. 또한 상기 데이터베이스(NCBI Influenza Virus Database)를 기반으로 674개 H9N2 바이러스의 HA2 단백질의 아미노산 서열 중 가장 안정적으로 보존이 이루어지고 항원성이 유지되는 지역을 선택 후, 박테리아에서 발현이 가능하도록 코돈 최적화시킨 유전자를 합성하였다. 또한, 상기 674개 H9N2 바이러스의 HA1 단백질의 아미노산 서열 중 항원성이 높아 생성되는 항체의 결합이 유리하고 H9N2와 작용이 가능한 대표 서열을 도출한 후, 박테리아에서 발현이 가능하도록 코돈 최적화시킨 유전자를 합성하였다.
본 발명에 따른 HA1 항원의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 조류 인플루엔자 백신 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 HA1 항원의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
본 발명에 따른 HA2 항원의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. 단백질의 기능적 동등물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 또한 HA2의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
본 발명에 따른 M2e 항원의 범위는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. 단백질의 기능적 동등물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 또한 M2e의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
본 발명의 상기 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)을 구성하는 HA1, HA2 항원은 이온채널인 M2 및 뉴라미니다아제와 함께 인플루엔자 바이러스의 외막을 구성하는 단백질이다. HA는 바이러스가 세포내로 침입하는 과정을 도와주는 역할을 하고 pH에 따라 HA의 구조가 변경되며 작용을 한다.
또한, 본 발명의 상기 M2e 항원은 인플루엔자 바이러스의 HA와 뉴라미니다아제와 함께 막을 구성하는 이온채널로, M2는 4량체 단백질로 구성되어 있어, 단량체 형태로 발현이 이루어지는 M2e의 면역원성을 높이기 위하여 면역활성보조인자를 동시 발현하여 면역화가 이루어진 숙주의 면역원성을 유도하도록 디자인하였다. 상기 면역활성보조인자는 바람직하게는 CD154(CD40 ligand 또는 CD40L)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CD154는 면역세포를 자극하는 리간드로, 대식세포에서는 상기 리간드와 상호작용으로 CD40과 TNF와 작용하는 수용체를 세포 표면에 발현 및 배치하여 면역세포에서 발현, 분비되는 사이토카인에 의해 활성화되는 정도를 증가시킨다. 이렇게 활성화된 대식세포는 식세포작용으로 흡수된 항원을 분해하여 더 다양한 항원을 제시하고 사이토카인을 분비하게 된다.
본 발명의 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주는 asd 유전자가 결실된 것일 수 있다. 바람직하게는 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸 변이주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "약독화(attenuation)"란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역체계만을 자극해서 면역원성을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 살모넬라 갈리나룸 변이주에 있어서, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸 변이주(Δlon ΔcpxR Δasd Salmonella gallinarum, JOL967)는 asd 유전자가 결실된 DAP(diaminopimellic acid) 요구주로서 항생제 없이 항원 재조합 균주를 선택할 수 있도록 제작되었을 뿐만 아니라, cpxR을 결실시킴으로써 림프조직 침투력이 증가되어 면역원성을 높이고, lon 유전자를 결실하여 병원성이 약독화될 수 있다. 상기 균주는 항원으로 작용할 수 있는 EPS(extracellular polysaccharide)의 생산에는 아무 영향을 주지 않아 그 자체로 항원의 역할을 하여 안정성을 지니면서 충분한 체액성 점막성 세포성 면역 반응을 일으킨다고 알려져 있다.
본 발명의 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주는 Bla(β-lactamse) 신호 서열, 이에 연결된 HA1, HA2 및 M2e 항원을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자; 및 asd 유전자;를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현 예에서, 상기 재조합 벡터는 Bla 신호 서열을 기초로 한 분비 시스템을 지닌 pJHL65(asd+ vector, pBR ori, 6xHis) 또는 pJHL80(asd+ vector, p15A ori, 6xHis)일 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 HA1, HA2 및 M2e 항원을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 유전자를 asd 유전자를 가진 재조합 벡터에 클로닝하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 클로닝된 플라스미드를 약독화된 살모넬라 갈리나룸 균주에 형질전환시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 형질전환된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 약독화된 살모넬라 갈리나룸 균주는 이종 항원을 발현하여 살모넬라 균 자체를 포함하여 이종항원에 대한 면역원성을 효과적으로 유도하는 것으로, 기존 인플루엔자 백신에 사용되는 인플루엔자 백신 균주의 배양에 사용되는 유정란을 사용하는 종란법이나 매딘-다비 개 신장세포(Madin-Darby Canine Kidney; MDCK)를 사용하는 세포성 배양보다 경제적이며 빠른 생산이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 변이주 중 둘 이상을 포함하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주의 혼합물을 제공한다.
본 발명의 상기 살모넬라 갈리나룸 변이주 혼합물은 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸 변이주가, HA1, HA2 및 M2e 항원으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 세포외막 또는 세포 밖에 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 둘 이상 포함하고 있는 혼합물이다.
바람직하게는, 상기 살모넬라 갈리나룸 변이주 혼합물은 HA2를 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주 및 M2e를 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 M2e를 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주는 추가로 면역활성보조인자 CD154(CD40 ligand 또는 CD40L)를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 백신 조성물은 유전자 결실에 의해 약독화된 살모넬라 갈리나룸에 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 HA1, HA2 및 M2e 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 하나 이상 포함하는 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 상기 백신 조성물을 조류에 처리하여 조류 인플루엔자 및 가금티푸스를 동시에 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 매추리, 물새, 비둘기, 카나리아 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 경구, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여될 수 있다. 특히 가금티푸스의 경우 대량의 조류에 대하여 백신을 투여하여야 하므로, 경구 투여용이 유용하게 이용될 수 있으나, 경구 투여의 경우 점막에 의하여 백신의 흡수가 저해되는 문제가 있으나, 본 발명의 백신 조성물의 이러한 문제를 해결하여 경구 투여에 의하여도 우수한 면역 효과를 가질 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 유전자 결실에 의해 약독화된 살모넬라 갈리나룸에 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 HA1, HA2 및 M2e 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 하나 이상 포함하는 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 조류 인플루엔자 및 가금티푸스에 대한 보호 효과뿐만 아니라, 동물의 세포성 및 체액성 면역반응을 효과적으로 유도하므로, 이를 사료 첨가제로 사용할 경우 조류 인플루엔자 및 가금티푸스의 동시예방 및 면역증강에 기여할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 살모넬라 갈리나룸 변이주 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스의 외부 항원과 면역활성보조인자를 발현하는 살모넬라 갈리나룸( Salmonella gallinarum ) 균주의 제작
라이브 살모넬라 시스템은 Bla 신호 서열(signal sequence)에 의하여 플라스미드내 도입된 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 항원과 면역활성보조인자를 발현 및 분비한다. H9N2 바이러스 유래 항원과 면역활성보조인자를 발현하는 살모넬라 갈리나룸(S. gallinarum) 균주는 대식세포로 침습하여, 살모넬라 내로 도입된 외부 항원을 발현 및 분비하여 대식세포로 하여금 림프구를 포함한 다양한 면역세포들에게 외부 항원과 면역활성보조인자를 제시하게 한다.
항원으로 선별된 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 유래 HA1, HA2 및 M2e 항원은 미국 국립생물정보센터(NCBI)에 보고된 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스의 아미노산 서열을 바탕으로 가장 보전이 잘 이루어져있고 항원성이 있는 부분을 선별한 후 각각의 항원을 코딩하는 DNA를 박테리아의 코돈에 최적화하여 합성하였다. 또한, 면역활성보조인자인 CD154를 코딩하는 서열을 링커를 통해 M2e 항원 코딩 서열과 연결하여 발현 및 분비되도록 디자인하였다.
각각의 항원을 발현하는 라이브 살모넬라 갈리나룸을 만들기 위해, lon(Lon protease), cpxR(Transcriptional regulatory protein CpxR) 및 asd(aspartate-semialdehyde dehydrogenase) 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸 균주를(실험실 보유; Vet Immunol Immunopathol. 2012 Dec 15;150(3-4):149-60) 사용하였다.
H9N2 바이러스 유래 항원을 코딩하도록 만들어진 DNA 절편은 단백질 발현 플라스미드인 pET28a로 클로닝하여 pET28a-M2e, pET28a-HA2 및 pET28a-HA1을 제조하였다. 제조된 플라스미드는 단백질 발현에 사용되는 E.coli 균주인 BL21으로 형질전환하여 M2e, HA2 그리고 HA1 단백질을 발현시킨 후 정제하였다. 발현 및 정제가 이루어진 H9N2 바이러스 유래 항원은 동물실험을 통해 분리된 항체의 역가(titer)를 측정하기 위한 ELISA에 항원으로 또는 동물실험에 의해 항원 특이적으로 분화가 이루어지는 림프구 분화반응의 분석에 림프구 자극물질로 사용하기 위해 -80℃에 보관하며 사용하였다.
2. 형광현미경(fluorescent microscope)을 이용한 후보 항원의 백신 세포에서의 발현 여부 확인
제작된 백신 후보 균주에서 H9N2 바이러스 유래 항원의 발현 여부를 확인하기 위해 백신 후보균주를 LB 액체배지를 이용 37℃에서 하룻밤 진탕배양하여 항원 단백질인 M2e와 면역활성보조인자인 CD154, 또는 HA2 또는 HA1을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 배양 시료를 준비하였다. 준비된 시료는 4,000rpm으로 원심분리한 후 멸균 PBS로 3차례 세척을 진행하였고, 각각의 항원에 특이적으로 결합하는 항체(MyBioSource, 미국)를 1차로 사용하여, 백신 후보균주에서 발현된 각각의 항원과 결합시켰다. 그 후 4,000rpm으로 원심분리 후, 멸균 PBS로 3차례 세척을 진행 하였고 1차 항체에 특이적으로 결합하는 로다민(rhodamine) 형광체가 결합된 2차 항체를 처리하고 반응시켰다. 그 후, 4,000rpm으로 원심분리하고 멸균 PBS로 3차례 세척을 진행한 후, 100㎕의 멸균 PBS로 재부유 후 형광현미경을 사용하여 관찰하였다.
3. 유세포분석기(FASC)를 이용한 후보 항원 단백질의 백신 후보균주에서의 발현여부 확인
제작된 백신 후보균주가 각각의 항원 단백질을 발현하는지 확인하기 위해 백신후보균주를 LB 액체배지를 이용하여 37℃에서 하룻밤 진탕배양한 후, 배양액을 4,000rpm으로 원심분리한 후 FACS running buffer(Miltenyi Biotec, 독일)로 3회 세척하고, 각각의 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를(MyBioSource, 미국) 1차 항체로 사용하여 반응시켰다. 그 후 4,000rpm으로 원심분리 후 FACS running buffer로 3회 세척하고, 1차 항체와 특이적으로 결합하는 PE(polyetylene) 형광체가 결합된 2차 항체를 처리하여 반응시킨 후, 4,000rpm으로 원심분리하고 FACS running buffer로 3회 세척 후 100㎕의 FACS running buffer로 재부유 시켜주었다. 재부유시킨 균주를 유세포분석기(Fluorescence activated cell sorter, FACS)를 통해 분석하였다.
4. 백신 후보균주로의 가능성 및 실험동물에서의 면역원성 확인
유세포분석 및 형광현미경을 통해 H9N2 바이러스의 유래 항원 단백질의 발현이 확인된 백신 후보균주를 5주령 암컷 산란계(브라운 닉 품종)에 접종하여 면역원성을 분석하였다. 실험군은 PBS를 사용하여 면역화를 진행한 그룹, 클로닝이 이루어지지 않은 공여의 플라스미드로 형질전환된 살모넬라 갈리나룸으로 면역화를 진행한 그룹(이하, SG), H9N2 바이러스 유래 항원 단백질을 발현 및 분비하는 플라스미드로 형질전환이 이루어진 살모넬라 갈리나룸으로 면역화가 이루어진 그룹(이하, SG-항원명), 및 H9N2 바이러스 유래 항원 단백질과 면역활성조보물질을 발현 및 분비하는 플라스미드로 형질전환이 이루어진 살모넬라 갈리나룸으로 면역화가 이루어진 그룹(이하, SG-항원명+pCDNA154)으로 구성되었다(n=40, 면역화는 각각의 후보균주를 1 × 108 투여).
경구투여를 통해 면역화를 진행하였고, 최초 면역화 3주 후, 2차 면역화를 진행하였다. 2차 면역화 후 4주째 각 그룹의 실험동물로부터 혈청을 채취하였다. 혈청은 목 정맥을 통해 혈액을 채취한 후 4,000xg에서 5분간 원심분리한 후, 상층액인 혈청을 분리하여 -20℃에 보관하며 분석에 사용하였다. 장으로 분비되는 sIgA의 측정을 위해 다음과 같은 방법으로 장 세척액을 준비하였다. 각 실험동물에 Lavage 용액(48.5mM PEG [polyethylene glycol 3350], 40mM Na2SO4, 20mM NaHCO3, 10mM KCl, 25mM NaCl)을 경구로 12㎖/㎏BW(body weight)씩 투여하고, 30분 후 필로카르핀(pilocarpine)을 13mg/kgBW (BW<300g의 경우 20mg/kgBW)의 용량으로 근육 주사하였다. 그 후, 실험동물을 한 마리씩 깨끗한 용기에 수용하고 용기에는 STI/EDTA 용액(0.1mg soybean trypsin inhibitor in 50 mM EDTA, pH 8.0)을 5㎖ 씩 놓고 배출물과 잘 혼합하도록 하였다. 30분 후 배출물을 회수하고 100mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 1㎖당 10㎕씩 첨가한 다음 원심분리(13,000rpm, 2분, 4℃)하여 투명한 상층액을 얻었다. 상층액에 다시 100mM PMSF, 1% 아지드화나트륨(sodium azide), 5% BSA(bovine serum albumin)를 각각 1㎖당 10㎕씩 첨가하고 -20℃에 보관하여 ELISA의 시료로 사용하였다. 폐로 분비되는 sIgA를 확인하기 위하여 면역화가 이루어진 실험동물로부터 분리된 폐에 멸균된 PBS 1㎖을 사용하여 세척을 진행하고 1% 아지드화나트륨 및 5% BSA를 각각 1㎖당 10㎕씩 첨가하고 -20℃에 보관하여 ELISA 분석에 사용하였다.
5. 면역화된 산란계의 체액성 면역 반응 확인
H9N2 바이러스 단백질인 M2e 또는 HA2 단백질에 특이적으로 반응하는 혈청 내 항체(IgG) 역가, 장내로 분비된 항체(sIgA) 역가 그리고 폐로 분비된 항체(sIgA)역가를 측정하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 수행 방법은 각 샘플별 항원 특이적으로 결합하는 항체역가를 확인하기 위하여 ELISA 플레이트의 각 웰(well)에 분리 정제된 각각의 항원 단백질 500ng을 분주하여 4℃에서 하룻밤 코팅을 진행하였고, 각각의 항원으로 코팅이 이루어진 ELISA 플레이트는 Tween-20이 0.05% 함유된 PBS(PBST)로 3번 세척한 후 PBS로 만든 3% 탈지분유 용액으로 블록킹한 후, 면역화가 이루어진 실험동물로부터 분리된 혈청을 PBST를 사용하여 1 : 100으로, 장 세척액과 폐 세척액은 1 : 4로 희석하여 각 웰당 100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 각각의 항원과 결합하는 항체에 특이적으로 결합하는 항체인 HRP-conjugated goat anti-Chicken IgG를 1 : 10,000으로 희석하여 각 웰당 100㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 장 세척액과 폐 세척액은 HRP-conjugated goat anti-Chicken IgA를 사용하였다. HRP와 반응하는 기질인 OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride) 용액을 웰당 100㎕씩 첨가하여 발색을 유도한 후, 3M 황산으로 발색 반응을 정지시키고 492nm에서 흡광도를 측정하였다.
6. 혈중 항체의 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 중화 역가 측정
백신 후보균주로 면역화가 이루어진 실험동물의 혈액으로부터 분리된 혈청에 존재하는 항체의 역가를 확인하기 위해, 바이러스 중화능 실험을 진행하였다. 바이러스 중화에 앞서 유정란을 사용하는 종란법을 통해 배양된 H9N2 바이러스에 의해 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포에서 감염이 이루어지는 세포감염 농도를 확인 후 100 TCDI50값을 사용 중화능 실험에 사용하였다. 바이러스 중화능 수행방법은 열처리되어 불활성화된 혈청을 96웰 세포배양 플레이트 A열에 분주 후 B열부터 H열까지 각 열을 지날때마다 1/2 희석이 되도록 단계별 희석을 진행하였다. 희석된 혈청에 100 TCID50값을 나타내는 H9N2 바이러스를 1시간 동안 반응시킨 후, 각 웰당 1.5 × 104 세포를 접종 후 37℃에서 반응을 진행 후 MTT를 사용하여 중화가 진행되는 항체 역가를 측정하였다.
7. 면역화가 이루어진 산란계에서의 세포성 면역반응 측정
백신 후보 균주로 면역화 2주 후 각 그룹의 산란계의 목 정맥으로부터 혈액을 채취한 후 potassium-EDTA를 처리하여 혈액이 응고되는 것을 방지하였고, 상기혈액은 Histopaque-1119(Sigma-Aldrich, 미국)를 혼합하고 원심분리를 이용하여 비중에 따라 세포들을 분리하였다. 비중에 따라 분리된 세포층에서 림프구를 포함한 면역세포가 위치한 중간층의 세포층을 수집하였다. 수집된 세포(PBMC)들은 멸균 PBS를 사용하여 세척하고 이와 같은 과정을 두 차례 반복한 뒤 열-불활성화 소태아혈청(heat-inactivated fetal bovine serum), 100 IU/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 RPMI-1640 배지로 부유시켜 96웰 플레이트의 각 웰 당 1 × 108 세포로 분주하고, 각 세포를 항원 단백질로 자극하였다. 그 후, 면역반응에 의해 유도된 사이토카인의 분비 수준을 확인하기 위해, 각 사이토카인의 mRNA 수준을 Real-time PCR로 분석하였다. 백신 후보균주로 면역반응을 진행한 그룹에 있어서 CD4+ 또는 CD8+ 림프구의 증식을 확인하기 위하여 유세포분석(FACS)을 통해 림프구의 증식 여부를 확인하였고, 항원단백질에 대한 특이적인 분화 여부를 확인하기 위하여 MTT를 사용 LPA(line probe assay)를 실시하였다.
7-1. Real-time PCR
GeneAll Hybrid-R 키트(GeneAll, 한국)를 사용하여 각각의 실험동물들로부터 분리된 PBMC를 조류인플루엔자 바이러스 항원을 사용하여 자극을 진행 하였다. 재 자극된 PBMC들로부터 총 RNA를 추출하고 농도와 품질을 NanoDrop을 이용하여 측정한 뒤 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix cDNA 합성 키트(TOYOBO, 일본)를 사용하여 cDNA를 합성하고, SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)를 사용하여 인터페론-γ(Interferon-γ, IFN-γ), 인터루킨-4(Interleukin-4, IL-4), 인터루킨-10(IL-10) 및 GAPDH mRNA의 수준을 Step One plus Real Time PCR system(Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 증폭되는 결과를 실시간으로 확인 및 분석하였다.
7-2. T 세포 분화 확인을 위한 FACS 분석
각 그룹의 실험동물 군으로부터 채취한 혈액으로부터 분리된 PBMC 세포는 H9N2 유래 항원을 사용하여 자극시키고, 72시간 동안 조류 인플루엔자 항원에 특이적으로 분열(분화)하는 림프구 분열반응을 유도하였다. 재자극된 PBMC로부터 분열된 T 림프구를 확인하기 위하여 FACS 분석을 진행하였다. 즉 분열된 세포는 FACS running buffer로 3회 세척 후, CD3e-FITC, CD4-AF700, CD8a-PE로 각각 형광 라벨링한 후 MACS Quant 유세포분석기(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포군의 분화 정도를 음성 대조구와 비교하였다.
7-3. MTT를 이용한 LPA 분석
면역화가 이루어진 각 그룹의 실험동물 혈액 샘플로부터 분리된 PBMC를 면역화가 진행된 항원 단백질 500ng/웰로 자극시킨 후, 72시간 동안 37℃에서 재 자극을 수행하였다. 세포를 현미경으로 확인한 후 사용된 배지의 15%의 MTT 용액을 각 웰에 추가로 넣어준 후 37℃에서 4시간 반응시켜 결정(crystal)을 확인하였다. 생성된 결정은 배지를 제거한 후 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 100㎕를 첨가하여 녹여주었다. 살아있는 세포수에 따라 형성된 결정으로 다른 흡광도를 나타내는 플레이트를 OD540nm의 파장을 이용하여 흡광도를 측정한 후 자극지수(stimulation index)를 도출하였다.
자극지수=항원으로 자극된 세포의 540nm 흡광도/음성 대조구의 540nm 흡광도
8. 백신 후보균주로 면역화가 진행된 실험동물에서의 야생형 조류 인플루엔자 H9N2 도전감염시 면역화에 따른 방어능 확인
백신 후보균주를 포함한 면역화 실험이 진행된 실험군과 대조군들에서 면역화 4주 후 실험동물을 대상으로 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스를 사용 도전감염을 실시하였다. 도전감염에 사용된 바이러스 균주는 EID50(50 percent Embryo Infectious Dose)값을 기준으로 비강을 통해 접종하였다. 저병원성 조류인플루엔자 H9N2 바이러스에 감염된 실험동물의 분변으로 분비되는 바이러스 수를 확인하기 위하여 도전감염 후 1, 3 및 6일째에 샘플링을 진행한 cloacal swab 시료로부터 바이러스 RNA를 분리한 후 cDNA를 합성하고, WHO(World Health Organization)에서 제시하는 A형 인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머를 사용하여 확인하였다. 바이러스의 증감량의 분석은 표준 Ct값을 이용한 수식을 통해 계수하였다.
저병원성 조류인플루엔자 H9N2 바이러스 감염에 의해 실험동물의 조직으로부터 유도되는 염증반응 및 조직학적 증상을 확인하기 위해 도전감염이 이루어진 실험동물의 폐 조직을 각 일령별 샘플링 후 조직염색을 통해 확인하였다.
9. 백신 후보균주로 면역화가 이루어진 실험동물에서 야생형 살모넬라 도전감염시 면역화에 따른 방어능 확인
저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 백신 후보균주로 2차례의 면역화를 진행한 2주 후, 실험실에서 보유중인 야생형 살모넬라 갈리나룸(수의과학 검역원에서 분양)을 사용하여 도전감염하였다. 도전감염 시 살모넬라 갈리나리움은 1.6 × 106 CFU를 사용하였다. 도전감염이 진행된 각 그룹의 실험동물로부터 비장과 간을 분리 후 각 장기에 잔존하는 야생형 살모넬라 갈리나룸의 수를 확인하였다.
10. 상업용 백신과 백신 후보균주로 각각 면역화가 이루어진 실험동물에서의 야생형 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스(H9N2)에 대한 방어능 확인
유세포분석 및 형광현미경을 통해 H9N2 바이러스의 유래 항원 단백질의 발현이 확인된 백신 후보균주 및 시판되는 상업용 백신을 5주령 암컷 산란계(브라운 닉 품종)에 접종하여 면역원성을 분석하였다. 실험군은 PBS를 사용하여 면역화를 진행한 그룹, 클로닝이 이루어지지 않은 공여의 플라스미드로 형질전환된 살모넬라 갈리나룸으로 면역화를 진행한 그룹(이하, SG), H9N2 바이러스 유래 항원 단백질을 발현 및 분비하는 플라스미드로 형질전환이 이루어진 살모넬라 갈리나룸으로 면역화가 이루어진 그룹(이하, SG-항원명), 및 상업적으로 판매가 이루어지고 있는 H9N2 백신으로 면역화를 진행한 그룹으로 구성되었다(n=30, 면역화는 각각의 후보균주를 1 × 108 투여, 상업용 백신은 권장 용량 및 경로를 사용).
면역화 4주 후 실험동물을 대상으로 야생형 H9N2 바이러스를 사용하여 도전감염을 실시하였다. 도전감염에 사용된 바이러스 균주는 EID50값을 기준으로 비강을 통해 접종하였다. H9N2 바이러스에 감염된 실험동물의 분변으로 분비되는 바이러스수를 확인하기 위하여 공격 접종 3, 4일 후 샘플링을 진행한 cloacal swab 시료를 이용하여 Real-time PCR을 수행하여 바이러스 수를 계수하였다. 또한 면역화 후 도전감염시킨 실험동물의 야생형 H9N2 바이러스에 의해 유도되는 염증 반응 및 조직학적 증상을 확인하기 위하여 각 그룹의 실험동물로부터 폐 조직을 샘플링한 후 조직염색을 수행하였다.
실시예 1. 후보 항원 단백질을 발현하는 균주 확인
후보 백신균주들은 각각 H9N2 바이러스의 항원인 M2e 단백질과 면역보조활성인자인 CD154를 발현하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸과 H9N2 바이러스 항원인 M2e단백질과 CD154를 발현하는 살모넬라 갈리나룸에 진핵세포에서 상기 M2e 단백질과 CD154의 발현이 가능하도록 만들어진 pCDNA::M2e-CD154를 탑재한 살모넬라 갈리나룸 균주이다. 또한 후보 백신균주는 H9N2 바이러스의 항원인 HA2 단백질을 발현하는 약독화 살모넬라 갈리나리움과, HA2 단백질을 살모넬라 갈리나룸과 숙주세포에서의 발현이 가능하도록 만들어진 pCDNA::HA2를 탑재한 살모넬라 갈리나룸 균주이다. 또한 후보 백신균주는 H9N2 바이러스의 항원인 HA1 단백질을 발현하는 약독화 살모넬라 갈리나룸과 HA1 항원을 살모넬라 갈리나룸과 숙주세포에서의 발현이 가능하도록 만들어진 pCDNA::HA1를 탑재한 살모넬라 갈리나룸 균주이다. 항원을 발현하지 않는 백터를 포함하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 균주를 음성 대조군으로 사용하였다. 각 백신균주에서 항원 단백질의 발현 여부를 확인하기 위해 수행된 유세포 분석 결과와 형광현미경 결과 도 1 및 2와 같이 각각의 균주는 항원 단백질을 발현하고 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 체액성 면역 반응 분석 - 후보 백신균주로 면역화 후 인플루엔자 항원 특이적으로 반응하는 IgG 및 sIgA 역가 분석
3주 간격으로 2차례 면역화를 진행하고 4주 후 실험동물로부터 형성된 혈청내 IgG와 장관내로 분비된 sIgA 그리고 폐로 분비된 sIgA 역가를 비교하였다. 그 결과, 각 항원 특이적인 IgG 역가가 대조군에 비하여 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었고, 백신 후보균주로 면역화가 이루어진 실험동물들에서 H9N2 바이러스를 중화시킬 수 있는 항체를 생성하였음을 확인할 수 있었다. 또한, 폐와 장 조직에 있어서, 점막 면역에 관련된 sIgA(secretory IgA)의 역가가 백신 후보균주로 면역화가 이루어진 그룹의 실험동물에서 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 살모넬라 균주에서만 항원이 발현되는 백신 후보균주로 면역화가 이루어진 그룹의 실험동물보다 진핵세포 내에서 H9N2 바이러스 항원과 CD154를 발현하는 벡터를 포함하는 백신 후보균주로 면역화가 이루어진 그룹의 실험동물에서 IgG 및 sIgA 역가가 유의적으로 높게 나타남을 확인할 수 있다(도 3).
실시예 3. 형성된 인플루엔자 항원에 특이적인 항체에 따른 바이러스 중화역가 분석
3주 간격으로 2차례 면역화를 진행하고 4주 후 실험동물의 혈청내 형성된 IgG 항체가 실제 H9N2 바이러스를 중화시킬 수 있는지 분석하였다. 각 항원 특이적으로 분비된 IgG 역가에 따른 중화정도는 항원을 발현하지 않는 균주로 면역화된 음성 대조군에 비교하여 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 4. 후보 백신균주 투여에 따른 인플루엔자 항원 특이적으로 분화되는 T 세포 분석
3주 간격으로 2차례 면역화를 진행하고 2주 후, 각 실험동물로부터 샘플링이 이루어진 혈액을 이용하여 인플루엔자 바이러스 유래 항원 특이적으로 분화되는 T 세포를 FACS를 통해 분석하였다. T 림프구 전체적으로 발현되는 CD3에 특이적 항체를 사용하여 결합을 진행하였고, 이 중 증가되는 CD3+ CD4+ T 림프구를 확인하기 위하여 CD4에 특이적인 항체를 사용하였다. 그 결과, H9N2 유래 항원과 면역활성보조인자를 발현하는 균주로 면역화가 이루어진 그룹의 실험동물들로부터 분리된 면역세포가 음성 대조군과 비교하여 유의적으로 높을 CD3+ CD4+ T 림프구의 분화를 보여주었다. 또한 살모넬라 균주뿐만 아니라 진핵세포에서 H9N2 바이러스 유래 항원과 면역활성보조인자를 발현할 수 있는 벡터를 지닌 균주로 면역화가 이루어진 실험동물 그룹에서 CD3+ CD4+ T 림프구가 유의적으로 높게 확인되었다(도 5).
실시예 5. 야생형 저병원성 조류인플루엔자 H9N2로 도전감염 시 백신 효과 분석
실험동물에 실제 감염이 충분히 이루어질 수 있으며 임상증상을 유발하는 감염량을 사용하여 도전감염을 수행하고 실험동물의 변화를 확인하였다. 104 TCID50 값을 실험동물에 도전 감염 후 일주일간 임상증상과 감염이 이루어진 각 그룹의 실험동물들로부터 분비되는 분변으로부터 H9N2 바이러스 수를 Real Time PCR을 사용하여 확인하였고, 각 그룹의 실험동물로부터 조직을 분리하고 조직 염색을 수행하여 염증반응을 확인하였다.
그 결과, 도전감염 후 2, 4 및 7일자에 음성 대조군 그룹보다 H9N2 바이러스 항원과 면역활성보조인자를 발현 및 분비하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 균주로 면역화가 이루어진 그룹에 있어서 유의적으로 낮은 바이러스 파티클이 분비되는 것을 확인할 수 있었고, 진핵세포에서 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 균주로 면역화된 그룹에 있어서 유의적으로 더 낮은 바이러스 파티클의 분비를 확인할 수 있었다(도 6). 또한, 폐 조직의 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색 결과 음성 대조군에 대비하여 후보 백신균주로 면역화된 폐에서 염증세포가 현저히 적은 것을 확인할 수 있었다(도 7 및 8).
또한 도전감염 7일 후 각 그룹으로부터 분리된 전체적인 폐의 크기를 통해 알 수 있듯이 후보 백신균주로 면역화가 이루어진 그룹은 음성 대조군 실험동물의 비대화된 폐에 비해 크기가 작은 것을 알 수 있었고, 이를 통해 염증반응이 음성 대조군에 비해 적게 유발된 것을 유추할 수 있었다(도 9). 또한 후보 백신균주로 면역화가 이루어진 그룹은 식욕부진(도 10)과 설사 증상이 약한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 체액성 면역 반응 분석 - 후보 백신균주로 면역화 후 살모넬라 갈리나룸 특이적으로 반응하는 IgG 및 sIgA 역가 분석
저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스와 가금티푸스 동시 방어가 가능한 후보 백신균주로 면역화가 이루어진 실험동물 그룹, 약독화된 살모넬라 갈리나룸으로 면역화가 이루어진 실험동물 그룹 및 PBS 실험동물 그룹으로부터 분리된 혈청 내 존재하는 살모넬라 갈리나룸과 특이적으로 반응하는 IgG의 역가와 장세척을 통해 분리된 sIgA 역가를 확인하였다. 그 결과, 약독화된 살모넬라 갈리나룸 균주로 면역화가 이루어진 그룹 및 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스와 가금티푸스 동시 방어가 가능한 후보 백신균주로 면역화가 이루어진 실험동물 그룹 모두에 있어서 PBS대조군과 비교하여 IgG와 sIgA 역가가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다(도 11).
실시예 7. 후보 백신균주 투여에 따른 살모넬라 갈리나룸 특이적으로 분화되는 림프구 분석(LPA)
면역화가 이루어진 각 그룹의 실험동물 혈액 샘플로부터 분리된 PBMC를 대상으로 항원 단백질 처리에 따른 재자극 후 측정한 자극지수(stimulation index)를 분석한 결과, H9N2 바이러스 항원을 발현 및 분비하는 균주로 면역화된 그룹과 공여의 벡터를 포함하는 살모넬라 균주로 면역화가 이루어진 그룹에 있어서 PBS와 비교시 M2e 항원에 특이적으로 면역세포가 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 12).
실시예 8. 후보 백신균주 투여에 따른 살모넬라 갈리나룸 특이적으로 분화되는 T 세포 분석
PBS 그룹과 비교하여, 공여의 벡터가 들어간 살모넬라 갈리나룸 균주로 면역화된 그룹과 바이러스 유래 항원과 면역보조인자를 발현 및 분비하는 살모넬라 균주로 면역화가 이루어진 그룹의 면역세포들에 있어서 살모넬라 갈리나룸 M2e 항원에 특이적으로 증가되는 T 림프구를 확인할 수 있었다. 또한 CD3+ CD4+ T 림프구는 공여의 벡터를 지닌 살모넬라 갈리나룸 균주로 면역화가 이루어진 그룹과 비교하여 인플루엔자 바이러스 유래 항원과 면역활성보조인가를 발현하는 살모넬라 균주로 면역화가 이루어진 그룹이 유의적으로 높은 분열 수준을 보임을 알 수 있었다. 반면 CD3+ CD8+ T 림프구는 공여의 플라스미드를 지니는 살모넬라로 면역화가 이루어진 그룹에 있어서 다른 그룹에 비하여 유의적으로 살모넬라 갈리나룸 M2e 항원에 특이적으로 많은 분열이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다(도 13).
실시예 9. 후보 백신균주 투여에 따른 살모넬라 갈리나룸 특이적으로 분비되는 사이토카인 분석
살모넬라 갈리나룸 항원인 M2e와 반응한 면역세포에서 특이적으로 분비되는 INF-γ, IL-4 및 IL-10의 전사체 수준을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Th1 면역 반응을 유도하고 CD8+ T 세포의 이펙터(effector) 역할을 하는 INF-γ는 대조군으로 사용된 PBS 그룹과 비교하여 3배 이상의 높은 분비수준을 보여주었고, Th2 면역반응을 유도하여 체액성 면역반응을 유도하는 IL-4와 IL-10은 대조군인 PBS 그룹과 비교하여 각각 3~4 및 4~5배 이상의 높은 수준을 보여주었다(도 14). 상기의 결과를 통해 본 발명에 사용된 후보 백신균주는 실험동물로 하여금 전반적인 면역체계를 자극하여 체액성 및 세포성 면역을 동시에 유발할 수 있는 능력이 있음을 유추할 수 있었다.
실시예 10. 반수치사량(lethal dose 50)의 야생형 살모넬라 갈리나룸 균주의 도전감염 시 백신 효과 분석
면역화가 이루어진 실험동물에 1.6 × 106 CFU의 반수치사량으로 야생형 살모넬라 갈리나룸을 도전감염시킨 후 12일 동안 임상증상과 생존율 그리고 도전 감염 12일 후 간과 비장에 잔존하는 도전감염 균주인 야생형 살모넬라 갈리나룸의 수준을 확인하였다. 야생형 살모넬라 갈리나룸을 통한 도전감염은 각 그룹 당 8마리의 면역화가 이루어진 실험동물을 사용하여 진행되었다.
그 결과 PBS로 면역화가 이루어진 그룹에 있어서는 25%의 생존율을 보여준 반면, H9N2 유래 항원과 면역활성보조인자를 발현하는 약독화된 살모넬라로 면역화가 이루어진 그룹에 있어서는 87.5%의 생존율을 확인할 수 있었다. 또한 H9N2 바이러스 유래 항원과 면역활성보조인자를 박테리아와 숙주세포인 진핵세포 모두에서 발현이 가능한 시스템을 지닌 약독화된 살모넬라 갈리나룸으로 면역화가 이루어진 그룹은 87.5%의 생존율을 보여주었다. 또한 공여의 벡터를 지닌 약독화된 살모넬라 갈리나룸으로 면역화가 이루어진 실험동물 그룹에 있어서도 87.5%의 생존율을 보여주어, H9N2 바이러스의 항원을 발현하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸 균주가 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스를 포함한 가금티루스균(살모넬라 갈리나룸)의 동시 방어가 가능함을 확인할 수 있었다(표 1).
Figure 112018095469635-pat00001
또한 대조군과 비교하여 면역화가 이루어진 실험동물의 간과 비장은 도전감염 후 장기내 잔존하는 야생형 박테리아의 수가 확연하게 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 H9N2 바이러스와 가금티푸스균 동시 방어가 가능한 후보 백신균주로 면역화가 이루어진 실험동물은 야생형 살모넬라균의 제거에 충분한 면역원성을 제공하고 있음을 알 수 있었다.
실시예 11. 상업적으로 판매되는 H9N2 백신과 후보 백신균주로 각각 유도되는 면역원성에 따른 야생형 H9N2 도전감염 시 백신 효과 분석
104 TCID50 값의 야생형 H9N2 바이러스를 실험동물에 도전감염시킨 후 일주일간 임상증상과 실험동물로부터 분비되는 H9N2 바이러스 수를 분석하였다. 또한 감염이 이루어진 각 그룹의 실험동물로부터 조직을 분리한 후 조직 염색을 통해 염증반응을 확인하였다.
그 결과, 공여의 벡터가 들어간 약독화 살모넬라 갈리나룸으로 면역화가 진행된 그룹과 비교하여 상업적으로 시판되는 H9N2 백신 또는 H9N2 바이러스 유래 항원을 발현하는 약독화된 살모넬라 갈리나룸으로 면역화가 이루어진 그룹들에 있어서 유의적으로 낮은 바이러스 수가 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 상업용 H9N2 바이러스 백신, H9N2 바이러스 유래 HA1, HA2 또는 M2e 항원을 각각 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주의 단독, 및 H9N2 바이러스 유래 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주의 혼합물(3Mix; HA1+HA2+M2e) 처리구에 비해, HA2 또는 M2e항원을 각각 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주의 혼합물로 면역화한 그룹에서 도전감염 4일 후에 야생형 조류 인플루엔자 H9N2의 바이러스 수가 현저히 낮은 것을 알 수 있었고(도 15), 도전감염 7일 후 각 그룹으로부터 분리된 폐 조직에서 알 수 있듯, 후보 백신균주로 면역화가 이루어진 실험동물은 상업용 H9N2 백신 면역화 그룹과 같이 폐 염증이 비면역화 그룹에 비해 유의적으로 적거나 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 16).
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Vaccine composition for preventing or treating avian influenza and fowl typhoid simultaneouly comprising attenuated Salmonella gallinarum mutant as effective component <130> PN18299 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 237 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Met Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu Thr Val Asp 1 5 10 15 Thr Leu Val Glu Thr Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys Glu Leu Leu 20 25 30 His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Gln Gly His Pro 35 40 45 Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Val Glu Gly Leu Val Tyr Gly Asn Pro 50 55 60 Ala Cys Asp Ser Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu 65 70 75 80 Arg Ser Ser Ala Val His Gly Met Cys Tyr Pro Gly Arg Val Glu Asn 85 90 95 Leu Glu Glu Leu Arg Ser Phe Phe Ser Ser Trp Asn Val Thr Phe Thr 100 105 110 Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg Trp 115 120 125 Leu Thr His Lys Ser Asn Ser Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr Thr 130 135 140 Asn Asp Trp Gly Lys Asn Ile Leu Phe Val Trp Gly Ile His His Pro 145 150 155 160 Pro Thr Asp Thr Glu Gln Met Asn Leu Tyr Lys Lys Ala Asp Thr Thr 165 170 175 Thr Ser Ile Thr Thr Glu Asp Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Val Ile 180 185 190 Gly Pro Arg Pro Ile Val Asn Gly Gln Gln Gly Arg Ile Asp Tyr Tyr 195 200 205 Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asn Gly 210 215 220 Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly 225 230 235 <210> 2 <211> 280 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Gly Leu Phe Gly Ala Ala Gly Phe Glu Gly Gly Trp Ser Gly Leu Val 1 5 10 15 Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val Gly Met 20 25 30 Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Asp Lys Thr Ser Lys Val 35 40 45 Asn Asn Val Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu Asp His Glu Phe Ser 50 55 60 Glu Asp Glu Thr Arg Leu Asn Met Asn Asn Lys Asp Asp Gln Gln Asp 65 70 75 80 Trp Ala Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr 85 90 95 Leu Asp Glu His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys 100 105 110 Arg Ala Leu Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu 115 120 125 Leu Tyr His Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Arg Asn Gly Thr 130 135 140 Tyr Asn Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys 145 150 155 160 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Asp Lys Cys Gly Tyr Gln Ser Thr Asn 165 170 175 Ser Thr Glu Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr 180 185 190 His Ala Lys Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala 195 200 205 Thr Ser Leu Gly His Pro Leu Leu Asp Thr Cys Thr Glu Gly Leu Tyr 210 215 220 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Thr Val Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly 225 230 235 240 Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly 245 250 255 Asn Cys Ser Lys Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg 260 265 270 Asn Val Pro Ser Arg Ser Ser Arg 275 280 <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 3 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp Gly Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala 20 25 30 Pro Thr Ser Ser 35

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실되고, Bla(β-lactamse) 신호 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 HA2(transmembrane subunit of hemagglutinin; subunit 2 of hemagglutinin) 항원을 코딩하는 유전자; 및 asd 유전자;를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 약독화된 살모넬라 갈리라룸(Salmonella gallinarum) 변이주를 유효성분으로 포함하는 H9 아형의 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 백신 조성물은 경구 또는 피하 투여하는 것을 특징으로 하는 H9 아형의 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  9. lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실되고, Bla(β-lactamse) 신호 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 저병원성 조류 인플루엔자 H9N2 바이러스 유래 HA2(transmembrane subunit of hemagglutinin; subunit 2 of hemagglutinin) 항원을 코딩하는 유전자; 및 asd 유전자;를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 약독화된 살모넬라 갈리라룸(Salmonella gallinarum)변이주를 유효성분으로 포함하는 H9 아형의 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방용 사료 첨가제.
KR1020180115006A 2018-09-27 2018-09-27 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물 KR102062624B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180115006A KR102062624B1 (ko) 2018-09-27 2018-09-27 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180115006A KR102062624B1 (ko) 2018-09-27 2018-09-27 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102062624B1 true KR102062624B1 (ko) 2020-01-06

Family

ID=69158903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180115006A KR102062624B1 (ko) 2018-09-27 2018-09-27 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102062624B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220167577A (ko) * 2021-06-14 2022-12-21 전북대학교산학협력단 FliC-FimA-CD40L 융합 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 및 살모넬라증 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
John Hwa Lee et al., FRONT MICROBIOL, VOL.8, PP.872*
John Hwa Lee et al., VET MICROBIOL, VOL.205, PP.117-123*
John Hwa Lee et al., VET RES, VOL.48, NO. 1, PP.40*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220167577A (ko) * 2021-06-14 2022-12-21 전북대학교산학협력단 FliC-FimA-CD40L 융합 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 및 살모넬라증 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물
KR102588101B1 (ko) 2021-06-14 2023-10-11 전북대학교 산학협력단 FliC-FimA-CD40L 융합 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 및 살모넬라증 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230257425A1 (en) Vaccine composition for preventing or treating infection of sars-cov-2
Chhabra et al. Immune responses to virulent and vaccine strains of infectious bronchitis viruses in chickens
TWI421091B (zh) 包含以聚肌苷酸-聚胞苷酸為主之佐劑的黏膜免疫物質
CN107250353B (zh) 二价猪流感病毒疫苗
CN113454102A (zh) 非洲猪瘟疫苗
US20100150958A1 (en) Methods and Compositions for Use of a Coccidiosis Vaccine
KR20080072719A (ko) 약독화된 소 바이러스성 설사 바이러스를 포함하는 복합백신
IL227554A (en) Vaccines and Compounds against the Streptococcus Pneumoniae Bacteria
CN105142653A (zh) 增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法
KR20220157969A (ko) 코로나바이러스 백신 및 사용 방법
JP7046607B2 (ja) 先天性振戦に対するペスチウイルスワクチン
JP2019520338A (ja) ウマインフルエンザウイルス弱毒生ワクチン
KR102062624B1 (ko) 약독화된 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 및 가금티푸스 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물
US20150037370A1 (en) Diatom-based vaccines
Shi et al. The expression of membrane protein augments the specific responses induced by SARS-CoV nucleocapsid DNA immunization
JP2020529408A (ja) ストレプトコッカス・スイスに対する防御のためのワクチン
CA2890466A1 (en) Attenuated mannheimia haemolytica vaccines and methods of making and use
Nouri-Shirazi et al. TLR3 and TLR7/8 agonists improve immunization outcome in nicotine exposed mice through different mechanisms
EP2729158B1 (en) Vaccines for chlamydia
AU711915B2 (en) Plasmid vaccine against pseudorabies virus
US8465748B2 (en) Vaccine compositions and methods containing an immunogen derived from equine arteritis virus
JP7350864B2 (ja) 異種スパイクタンパク質を有するｈ５２ ｉｂｖワクチン
KR102588101B1 (ko) FliC-FimA-CD40L 융합 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 및 살모넬라증 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물
KR20120131725A (ko) 고병원성 조류인플루엔자 ａ ｈ５ｎ１ 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 가금용 백신
SAHİN et al. Assessment of the immunogenicity and protective aspects of a DNA vaccine targeting Crimean Congo hemorrhagic fever virus glycoprotein Gc

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant