CN105142653A - 增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了能够激发对肠细菌免疫应答的疫苗载体，以及使用这种疫苗载体的方法。疫苗载体包含编码PAL多肽的多核苷酸。PAL多肽可表达在疫苗载体的表面。疫苗载体还可包含编码免疫刺激多肽的第二多肽，所述免疫刺激多肽如CD154多肽或HMGB1多肽。

Description

增强对肠病原体免疫应答的组合物和方法
相关申请的交叉参考
本专利申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/790,301的优先权，该临时专利申请的全部内容在此通过引用并入此处。
序列表
本申请是电子提交的，并且包含电子提交的txt格式的序列表。该txt文件包含题目为“2014-03-14_5658-00203_ST25.txt”的序列表，其创建于2014年3月14日，大小是31093字节。这个txt文件中包含的序列表是说明书的一部分，因此通过引用其全部并入此处。
引言
细菌感染仍然给人类以及农业和家养动物造成显著的健康危害。抗生素抗性的增长提高了对在农业中避免使用抗生素的需要，以及开发替代方法来控制细菌感染和人类食品供应的细菌污染的需要。沙门氏菌属(Salmonella)和大肠杆菌(E.coli)通常被报道是世界范围内人类食物传播的感染的细菌原因，流行病学证据表明包括家禽和家禽产品在内的肉制品是人类感染的主要来源。在美国，每年报告估计一百四十万例的人类沙门氏菌病。在这些病例中，虽然有一些其它血清变种也显示在人类中导致肠炎，但最常分离的是肠炎沙门氏菌血清变种(S.entericaserovarsEnteritidis)(SE)和鼠伤寒沙门氏菌(Typhimurium)(ST)。和重大感染率有关的其它革兰氏阴性细菌包括志贺氏菌属(Shigellaspp)、弧菌属(Vibriospp)、欧文氏菌属(Erwiniaspp)、克雷伯菌属(Kebsiellaspp)、枸橼酸杆菌属(Citrobacterspp)、耶尔森氏菌属(Yersiniaspp)、普罗维登斯菌属(Providenciaspp)及类似细菌。需要控制这些细菌感染的新方式。
发明内容
公开了一种疫苗载体，其包含编码PAL多肽的第一多核苷酸序列。PAL多肽是疫苗载体中异源的、非天然表达的重组多肽。PAL多肽选自：SEQIDNO：1、和SEQIDNO：1具有90％同一性的序列，比如SEQIDNO：6、或其至少6个氨基酸长的免疫原性片段。多肽可表达在疫苗载体的表面上。SEQIDNO：1的免疫原性片段可以包含SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：36或SEQIDNO：37。疫苗载体还可以包含编码免疫刺激多肽的第二多肽序列。免疫刺激多肽也可以表达在疫苗载体的表面上。免疫刺激多肽可以是能够与CD40结合的CD154多肽或HMGB1多肽。CD154多肽包含少于50个氨基酸，并且包含氨基酸140-149或其同源物。
根据本发明的疫苗可以包含在载体内，载体如病毒、酵母、细菌、或脂质体。一方面，所述疫苗包含多核苷酸，其编码SEQIDNO：42、44或46的多肽，或者和这些序列之一具有90％同一性的序列。药物组合物可以由此处所述的疫苗载体和药学上可接受的载体组成。
又一个方面，提供了通过向受试者施用此处所述的疫苗载体而增强受试者对革兰氏阴性细菌免疫应答的方法。增强的免疫应答可以是增强的抗体应答、增强的T细胞应答或两者皆有。
又一个方面，提供了通过向受试者施用此处所述的疫苗载体而降低受试者和革兰氏阴性细菌感染相关的发病率或死亡率的方法。与对照相比，在施用疫苗载体的受试者中，疫苗载体能够降低与继发革兰氏阴性细菌感染相关的发病率和死亡率。
附图说明
图1的图显示，以108cfu/鸡通过盐水、或芽孢杆菌属骨架(BSBB)或PAL-载体化BS疫苗(BSPAL)候选物的口服灌胃所进行的接种后第17天，用合成PAL-BSA作为包被抗原，通过ELISA确定PAL序列特异性血清IgG抗体水平。结果表示为S/P比的平均值±SEM(n＝10)。使用ANOVA，不同大写字母的组显著不同(P<0.05)。
图2的图显示，以108cfu/鸡通过盐水、或芽孢杆菌属骨架(BSBB)或PAL-载体化BS疫苗候选物(BSNNP)的口服灌胃所进行的接种后第17天，用合成PAL-BSA作为包被抗原，通过ELISA确定PAL序列特异性回肠sIgA抗体水平。结果表示为S/P比的平均值±SEM(n＝10)。使用ANOVA，不同大写字母的组显著不同(P<0.05)。
图3的图中，在接受了108cfu/鸡的盐水、BSBB或PAL-BS构建体载体化疫苗(BSNNP)的鸡中，在孵化后第17天和第21天使用常规微生物学铺板计数法来计算鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)。所有组在孵化后的第11天接受1×108cfu/mlST挑战剂量。结果表示为盲肠含量的平均log10cfu/克+SEM(n＝10)。通过ANOVA，不同大写字母的组显著不同(P<0.05)。
图4的图显示，与对照(PBST)相比，两个单克隆抗体(2B5和1B2)对指定的PAL六肽的亲和性。
图5的图显示，接种指定的疫苗株或对照之后，从21日龄雏鸡盲肠中分离的海德堡沙门氏菌(SalmonellaHeidelberg)的每克菌落形成单位(cfu)。通过ANOVA，不同大写字母的组显著不同(P<0.05)。
图6的图显示，接种指定的疫苗株或对照之后，从21日龄和33日龄雏鸡盲肠中分离的海德堡沙门氏菌的每克菌落形成单位(cfu)。通过ANOVA，带星号的组显著不同(P<0.05)。
图7的图显示，接种指定的疫苗株或对照之后，来自28日龄雏鸡盲肠中的海德堡沙门氏菌的阳性回收百分比。通过ANOVA，不同大写字母的组显著不同(P<0.05)。
图8的图显示，指定疫苗株的小鼠巨噬细胞的吞噬百分比。通过ANOVA，不同大写字母的组显著不同(P<0.05)。
具体实施方式
抗革兰氏阴性细菌的常规疫苗通常基于活的/减毒的细菌，其常常以受控数目通过注射进行递送。革兰氏阴性细菌非常多样，不同物种的细菌之间、甚至是相同物种内的不同株之间的抗原多样性已经使得针对一种以上的单株或血清变种的接种变得困难。已经开发了重组疫苗，但由于抗原的多样性，重组疫苗一般只限于增强对单一物种或甚至细菌的单一株的免疫应答。能够保护免受多个血清变种以及确实免受一种以上革兰氏阴性细菌物种的疫苗将是最佳的。此外，可以口服的疫苗会使施用更便宜，更具顺应性(compliance)。提供了一种疫苗，其包含PAL的高度保守区域，PAL是一种广泛发现于革兰氏阴性生物中的肽聚糖相关脂蛋白。
重组DNA技术使操作许多酵母、细菌和病毒物种变得相对容易。一些微生物是轻度致病性的或非致病性的，但是能够产生强烈的免疫应答。这些微生物成为有吸引力的疫苗载体，用于激发对载体中所重组表达的抗原的免疫应答。以微生物作为载体的疫苗可以模拟天然感染，有助于产生强且持久的粘膜免疫，而且生产和施用相对便宜。许多这些疫苗载体可口服施用，降低了成本和对专业施用人员的需要，并降低了施用抗性。此外，这样的载体经常携带一种以上的抗原，并具有提供保护以免受多重感染原(infectiousagent)的潜能。
一种疫苗，包含任何含有编码抗原性多肽的多核苷酸的组合物，其中抗原性多肽能够激发对多肽的免疫应答。疫苗载体是可被工程改造成携带抗原和任选其它免疫刺激多肽的组合物，并且还可以包含佐剂、或与佐剂一起施用以进一步提高对寄生虫的免疫应答，并提供更好的保护免受继发感染相关的发病率和死亡率。此处公开了载体如细菌、病毒或酵母载体用于接种和产生对肠病原体的免疫应答的用途。肠病原体可以包括，但不限于大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)以及实施例表1中公开的其它肠微生物。施用此处所述疫苗载体后的免疫应答不需要是完全保护性的，但可降低肠病原体继发感染相关的发病率或死亡率百分比(即，死亡的概率)。
一方面，提供了一种疫苗载体，其包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码SEQIDNO：1-6、32、36或37中的至少一个，或编码这些序列中任何一个的至少6个氨基酸长的免疫原性片段。提供了疫苗载体，其也可包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码免疫刺激多肽。适当地，PAL多肽或其免疫原性片段以及免疫刺激多肽表达在疫苗载体的表面上。SEQIDNO：1多肽的免疫原性片段可包含SEQIDNO：2-5或36-40中的任意一个或其组合、或者至少六个氨基酸的任何其它片段。例如，抗原性多肽可包含、基本上由以下组成或由以下组成：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：32、SEQIDNO：36、SEQIDNO：37、或任意这些SEQIDNO的免疫原性片段或组合。
抗原性多肽的免疫原性片段可以是至少6、8、10、12、14、16、18或20个氨基酸长，并和此处所提供的SEQIDNO具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％百分比同一性的序列。一种疫苗，包含任何含有编码抗原性多肽的多核苷酸的组合物，所述抗原性多肽能够在施用该疫苗的受试者中激发对多肽的免疫应答。公开了载体如细菌载体用于接种和产生对肠细菌的免疫应答的用途，肠细菌包括但不限于沙门氏菌属(Salmonellaspp)、埃希氏菌属(Escherichiaspp)、志贺氏菌属(Shigellaspp)、弧菌属(Vibriospp)、欧文氏菌属(Erwiniaspp)、克雷伯菌属(Kebsiellaspp)、枸橼酸杆菌属(Citrobacterspp)、耶尔森氏菌属(Yersiniaspp)、普罗维登斯菌属(Providenciaspp)或类似细菌，比如表1中列出的那些。
编码此处提供的抗原性多肽或者编码来自任何数目致病性生物的其它抗原的多核苷酸可插入到载体中，并在载体中表达。在载体中表达这些多核苷酸将允许在免疫受试者之后产生对抗原性多肽的免疫应答。多核苷酸可以插入到载体的染色体中或者编码在质粒或其它染色体外DNA上。本领域技术人员将理解，存在多种用于在载体(如沙门氏菌属或芽孢杆菌属)中获得多核苷酸表达的方法。通过本领域技术人员已知的方法，多核苷酸可以可操作地连接到启动子(例如，组成型启动子、诱导型启动子等)。适当地，编码抗原性多肽的多核苷酸被插入到载体中，例如细菌载体，从而表达该多核苷酸。
编码PAL或其它抗原性多肽的多核苷酸可在阅读框内(inframe)被插入编码跨膜蛋白的多核苷酸中。编码抗原性多肽的多核苷酸可以插入到载体多核苷酸序列中，以允许在载体的表面上表达该抗原性多肽。例如，编码抗原性多肽的多核苷酸可在阅读框内被插入在载体多核苷酸的编码跨膜蛋白外环区域的区域中，从而载体的多核苷酸序列保持在阅读框中。在一个实施方式中，如实施例中所描述的，编码抗原性多肽的第一多核苷酸插入到沙门氏菌lamB基因的环9中。或者，多核苷酸可插入至例如芽孢杆菌cotB基因的多核苷酸中。
在另一个实施方式中，第一多核苷酸插入或者在蛋白的表面露出端，所述蛋白附着至细胞壁，但不是跨膜蛋白。该蛋白可以是通过蛋白或脂质锚而锚定或附着至细胞壁的分泌蛋白。例如，多核苷酸可插入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)纤连蛋白结合蛋白(FbpB)的3'端。或者，编码抗原性多肽的第一多核苷酸可插入编码分泌多肽的多核苷酸。
本领域技术人员将理解，编码抗原性多肽的多核苷酸可插入各种载体多核苷酸中，以提供抗原性多肽的表达并递呈给疫苗所治疗的受试者的免疫细胞。可包含单拷贝或一个以上拷贝的编码抗原性多肽的多核苷酸。多个拷贝可插入在疫苗载体染色体中或染色体外的单个位置或一个以上位置。
适当地，第一多核苷酸编码SEQIDNO：1、SEQIDNO：6或其至少六个或更多氨基酸的免疫原性片段，例如SEQIDNO：2-5或36-40。载体可以包含一个以上拷贝的第一多核苷酸，或者可以包含靶向相同或不同病原体的多个抗原性多核苷酸。在实施例中，SEQIDNO：1-6、32、36和37被证明是免疫原性的。SEQIDNO：1(EGHADERGTPEYNISLGER)和8(TVEGHADERGTPEYNISLG)在实施例中并入芽孢杆菌属或沙门氏菌属的载体。尤其考虑来自单一病原体或靶标的一个以上多肽的表位的组合、或者来自不同病原体或靶标的表位的组合。多核苷酸可以单独地插入到载体中，或者可作为包含一个以上表位的融合蛋白得以插入。在实施例中，SEQIDNO：1(PAL)和31(CJ0113)被并入芽孢杆菌属的载体(见SEQIDNO：42、44和46以及实施例)。适当地，插入载体的抗原性多肽的部分是免疫原性的。免疫原性片段是能够激发细胞或体液免疫应答或者能够降低靶标病原体或相关病原体继发感染相关的发病率或死亡率的肽或多肽。
抗原性多肽包含任何免疫原性的多肽。抗原性多肽包括但不限于病原体相关、过敏原相关、肿瘤相关或疾病相关的抗原。病原体包括病毒、寄生虫、真菌和细菌病原体以及蛋白质病原体如朊病毒。抗原性多肽可以是全长蛋白或其部分。已知免疫系统对许多蛋白的识别是基于相对小数目的氨基酸，通常被称为表位。表位可以是仅4-8个氨基酸。因此，此处所述的抗原性多肽可以是全长序列、4个氨基酸长的表位或这两端之间的任何部分。事实上，抗原性多肽可包含来自单一病原体或蛋白的一个以上的表位。抗原性多肽和此处所提供的SEQIDNO具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的百分比同一性。适当地，多肽的抗原片段可以是SEQIDNO：1-6、32、36或37的四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十二个、十五个、十七个或更多个连续氨基酸。
相同表位的多个拷贝或来自不同蛋白的多个表位可以被包含在疫苗载体中。疫苗载体中的表位可以是相关且同源的，从而允许用单一疫苗载体靶向多个相关病原体。可以想象，来自相同或不同病原体或疾病的几个表位或抗原可在单一疫苗载体中组合施用以产生针对多种抗原增强的免疫应答。重组疫苗载体可以编码来自多个致病性微生物、病毒或肿瘤相关抗原的抗原。施用能够表达多种抗原的疫苗载体具有以下优点：同时诱导针对两种或更多种疾病的免疫、提供更广泛的针对单一病原体的多个株的保护或者对单一病原体更强烈的免疫应答。在实施例中，所述疫苗载体包含SEQIDNO：1的PAL抗原性多肽和SEQIDNO：31的弯曲杆菌属(Campylobacter)抗原性多肽，这在国际专利公开号WO2011/156619中已经证明该抗原性多肽能够有效增强对弯曲杆菌属的免疫应答。
本领域技术人员将理解，来自其它病原体的抗原性多肽可用在疫苗载体中，通过单一疫苗来增强对一种以上病原体的免疫应答。施用针对多种病原体的单一疫苗是有利的。设计能够激发对肠病原体(如大肠杆菌)以及流感、沙门氏菌属、弯曲杆菌属或其它病原体的免疫应答的疫苗。例如，第二抗原性多肽可以是流感多肽，适当地它是流感H5N1多肽或与流感病毒的多个株相关的多肽，如流感M2蛋白的多肽。A型流感病毒M2蛋白的胞外域，被称为M2e，突出于病毒的表面上。M2蛋白的M2e部分包含大约24个氨基酸。在流感中，M2e多肽在一种分离株和另一种分离株之间变化很小。事实上，自1918年流感流行以来，从受感染的人当中仅分离出少数几个M2e自然发生的突变。此外，从禽和猪宿主体内分离出来的流感病毒含有不同但仍是保守的M2e序列。有关从人类、禽和猪宿主体内分离的M2e多肽序列的综述，可参阅Liu等人MicrobesandInfection7:171-177(2005)和Reid等人J.Virol.76:10717-10723(2002)，各论文的全部内容在此通过引用并入此处。适合地，可将整个M2e多肽插入疫苗载体，或仅使用一部分。将8氨基酸多肽(具有氨基酸序列EVETPIRN,SEQIDNO:9的LM2，或其具有氨基酸序列EVETPTRN,SEQIDNO:10的其变体M2eA)并入疫苗载体，并证明了将其施用到鸡之后能够产生抗体应答。参见美国公开号2011/0027309，通过引用将其全部并入此处。
用于并入疫苗载体内以增强对A型流感免疫应答的其它适当表位包括但不限于A型流感的血凝素(HA)或核蛋白(NP)的多肽。例如，SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13或SEQIDNO：14的肽可包含在疫苗载体中。本领域技术人员将理解，任何这些序列可以和任何其它表位组合使用，包括源自其它病原体或抗原的表位。
例如，此处提供的PAL抗原性多肽可以和来自革兰氏阴性细菌的其它抗原性多肽组合，例如美国专利公开号US2011/0159026或国际公开号WO2011/156619中所提供的那些，两者都通过引用其全部并入此处。多个抗原性多肽的组合可提供更卓越的保护免受继发感染，所述多个抗原性多肽中的一个提供对多种革兰氏阴性细菌的广泛免疫，而其它的更特异于具体的革兰氏阴性细菌。
所包含的作为疫苗载体一部分的免疫刺激分子可潜在激活免疫系统的一部分，这对持久保护是关键的。免疫刺激多肽可以是能够刺激初始或适应性免疫应答的多肽。免疫刺激多肽不与疫苗载体天然地相关，而是和脊椎动物的免疫系统天然相关的多肽，如待施用疫苗的受试者的免疫系统。此处描述两个免疫刺激多肽，即CD154和高迁移率族蛋白1(HMGB1)多肽，但本领域技术人员之一将理解，其它免疫刺激多肽可以使用或者可以和此处所述的那些组合使用。
编码参与触发免疫系统的多肽的其它多核苷酸也可包含在疫苗载体中。多核苷酸可以编码已知其刺激效应的免疫系统分子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素或参与免疫调节的另一多核苷酸。疫苗也可包含编码已知刺激免疫应答的肽(如此处描述的CD154或HMGB1多肽)的多核苷酸。
HMGB1由激活的巨噬细胞和受损细胞分泌，并充当炎症的细胞因子介导子，影响固有免疫应答。在实施例中，部分HMGB1序列已被包含在所述疫苗载体中。HMGB1(高迁移率族蛋白-1)蛋白是第一个被鉴定为对DNA结构和稳定性至关重要的DNA结合蛋白。它是广泛表达的核蛋白，其对DNA的结合没有序列特异性。蛋白高度保守并见于植物到哺乳动物中。斑马鱼、鸡和人HMGB1的氨基酸序列分别提供于SEQIDNO：23、SEQIDNO：15和SEQIDNO：22中。在整个哺乳动物中序列是高度保守的，具有98％的氨基酸同一性并且氨基酸改变是保守的。因此，来自一个物种的HMGB1蛋白可能在功能上取代来自另一个物种的HMGB1蛋白。全长HMGB1蛋白或其一部分可以被用作此处所述疫苗载体中的HMGB1多肽。HMGB1具有两个DNA结合区，称为A盒，其显示于SEQIDNO：16和17，以及B盒，其显示于SEQIDNO：18和19。参见Andersson和Tracey，Annu.Rev.Immunol.2011,29:139-162，通过引用全部并入此处。
HMGB1是炎症的介导子，并作为核损伤的信号，如来自坏死细胞的核损伤。在要求蛋白乙酰化、跨核易位以及分泌的过程中，HMGB1也可以由单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞主动分泌。通过经由晚期糖基化终产物受体(RAGE)以及经由Toll样受体家族(TLR)的成员(尤其是TLR4)的信号传导，细胞外HMGB1作为炎症的强效介导子发挥作用。RAGE结合活性已被鉴定，并且需要SEQIDNO：20的多肽。TLR4结合需要SEQIDNO：15的位置106的半胱氨酸，其见于HMGB1的B盒区。
HMGB1的炎症活性不需要全长蛋白，并且功能性片段已经得以鉴定。B盒已被证明足以介导HMGB1的促炎效应，从而在本发明的上下文中SEQIDNO：18和19是HMGB1多肽或其功能性片段。此外，RAGE结合位点和促炎细胞因子活性已经被分别测绘至SEQIDNO：20和SEQIDNO：21。因此，在本发明上下文中这些多肽是HMGB1多肽的功能性片段。
使用例如国际公开号WO02092004中的那些方法，本领域技术人员能够鉴定HMGB1多肽及其能够刺激促炎细胞因子活性的片段，国际公开号WO02092004通过引用全部并入此处。适当地，HMGB1多肽包含SEQIDNO：15的氨基酸150-183位置的RAGE结合结构域(SEQIDNO：20或其同源物)和SEQIDNO：15的氨基酸89-109之间的促炎细胞因子活性结构域(SEQIDNO：21或其同源物)。特别是，HMGB1多肽及其功能性片段或同源物包含和SEQIDNO：15或16-23的HMGB1多肽相同的、或者至少99％相同、至少98％相同、至少95％相同、至少90％相同、至少85％相同、或至少80％相同的多肽。
如下面更详细描述的，疫苗载体可以包含CD154多肽，CD154多肽能够在受试者中结合CD40并刺激受试者对载体及其相关抗原产生应答。树突细胞(DC)的参与对启动强大的免疫应答是必要的，因为它们具有独特的激活初始T细胞的能力，引起T细胞扩增并分化为效应细胞。DC的作用是捕获抗原，将它们递送到相关的淋巴组织，然后将它们递呈给初始T细胞，其中DC是一种在身体几乎所有组织中发现的抗原递呈细胞(APC)。一旦被DC激活，T细胞便扩增，分化为效应细胞，离开次级免疫器官，并进入外周组织。激活的细胞毒性T细胞(CTL)能破坏病毒感染的细胞、肿瘤细胞或者甚至感染有细胞内寄生虫(例如，沙门氏菌属)的APC，并且已被证明在保护免受病毒感染中是关键的。CD40是TNF-受体分子家族的成员，并且表达于多种细胞类型，包括专职抗原递呈细胞(APC)，例如DC和B细胞。CD40与其配体CD154的相互作用是极其重要的，并且刺激体液和细胞免疫。由表达在DC表面的CD40对DC的刺激可以通过抗CD40的抗体进行模拟。然而，在人体中，这是通过与表达在激活T细胞表面上的CD40天然配体(即CD154)相互作用而发生的。有趣的是，CD154的CD40结合区也已得以鉴定。如此处提供的实施例中以及美国专利公开号2011/0027309所示的，CD154的CD40结合区可表达在载体如沙门氏菌或芽孢杆菌载体的表面上，并且导致对共提呈的肽序列增强的免疫应答，美国专利公开号2011/0027309通过引用全部并入此处。CD154多肽可以是CD154全长蛋白的一部分或整个CD154蛋白。适当地，CD154多肽能够与CD40结合。
如上所讨论的，在疫苗中可包含编码CD154多肽的CD154多核苷酸，CD154多肽能够增强对抗原的免疫应答。适当地，CD154多肽是少于50个氨基酸长，更适当地长度少于40，少于30或少于20个氨基酸。多肽可以是10个和15个氨基酸之间，10和20个氨基酸之间或10和25个氨基酸之间的长度。在各种物种间，CD154序列和CD40结合区不是高度保守的。鸡和人的CD154序列分别提供于SEQIDNO：24和SEQIDNO：25。
对于若干物种，包括人、鸡、鸭、小鼠和牛，已经确定了CD154的CD40结合区，并分别显示于SEQIDNO：26、SEQIDNO：27、SEQIDNO：28、SEQIDNO：29和SEQIDNO：30中。虽然在物种之间CD40结合区的序列有变异，人CD154多肽能够增强鸡的免疫应答。因此，人们可以使用物种特异性CD154多肽或异源CD154多肽来实施本发明。因而，SEQIDNO：24-30的CD154多肽可包含在疫苗载体中，或与SEQIDNO：24-30的序列至少99、98、97、96、95、93、90或85％相同的多肽可包含在疫苗载体中。
来自CD154的多肽通过与其受体CD40结合至少部分地刺激免疫应答。多肽与在受试者免疫细胞上表达的、并且能够与巨噬细胞和其它抗原递呈细胞上的CD40受体结合的CD154多肽同源。这种配体-受体复合物的结合刺激巨噬细胞(和巨噬细胞谱系细胞，如树突细胞)以增强吞噬作用和抗原递呈，并同时促进已知能够激活其它局部免疫细胞(如B淋巴细胞)的细胞因子的分泌。因此，CD154肽相关分子是免疫应答及扩大的抗体生产的优选靶标。
抗原性多肽和免疫刺激多肽经由疫苗载体递送。疫苗载体可以是细菌、酵母、病毒或基于脂质体的载体。潜在的疫苗载体包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、沙门氏菌属(Salmonella)(肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis))、志贺氏菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)(大肠杆菌(E.coli))、耶尔森氏菌属(Yersinia)、博德特氏菌属(Bordetella)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)(霍乱弧菌(Vibriocholerae))、李斯特菌属(Listeria)、酵母如酵母属(Saccharomyces)、或毕赤酵母属(Pichia)、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、甲病毒和腺相关病毒。活的细菌、酵母或病毒疫苗载体可能仍然对免疫力低下的个体构成风险，并需要额外的监管审查。从而，希望使用灭活的、或失活的、或被食品和药品监督管理局(FDA)认为有资格作为公认安全(GRAS)的生物。问题是使用这种载体产生强烈的免疫应答。使细菌、酵母或病毒疫苗载体失活或灭活的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于例如福尔马林失活、基于抗生素的失活、热处理和乙醇处理的方法。通过将免疫刺激多肽如HMGB1(高迁移率族蛋白1)多肽包含在疫苗载体表面上，使用芽孢杆菌载体或其它GRAS载体，我们能够产生针对抗原性多肽的强烈免疫应答。事实上，这样的载体可被失活使其不能复制，并且施用后仍然激发强烈的免疫应答。疫苗载体可以是非致病性的野生型细菌、酵母或病毒。或者，载体可以是减毒的，使得载体在宿主中具有有限的复制能力或在缺乏补充介质的情况下不能生长超过数代。本领域技术人员将理解，有多种方式使载体减毒以及这样做的装置。
至少部分抗原性多肽和至少部分免疫刺激多肽存在于或表达在疫苗载体的表面上。存在于疫苗载体表面上，包括包含在跨膜蛋白外环之内的多肽，所述多肽和跨膜蛋白、膜脂或膜锚定的碳水化合物或多肽相互作用，例如共价或化学交联到跨膜蛋白、膜脂或膜锚定的碳水化合物或多肽。通过肽键将包含多肽的氨基酸连接至跨膜蛋白内的N端、C端或任何位置(即插入跨膜蛋白的两个氨基酸之间或取代跨膜蛋白的一个或更多个氨基酸(即缺失-插入))，多肽可被包含在跨膜蛋白之内。适当地，多肽可插入跨膜蛋白的外环。适当地，跨膜蛋白是srtA、cotB和lamB，但本领域的技术人员将了解许多适当的跨膜蛋白是可用的。多肽可连接到膜或细胞壁锚定蛋白或脂质，使得抗原性多肽和免疫刺激多肽表达在疫苗载体的表面上。
如上所述，编码抗原性或免疫刺激多肽的多核苷酸可插入载体的染色体中或保持在染色体外(例如，在质粒、BAC或YAC上)。本领域技术人员将理解，这些多核苷酸可在阅读框内插入各种多核苷酸中，并表达在载体的不同部分，或者可以被分泌。编码能够增强对抗原性多肽免疫应答的免疫刺激多肽的多核苷酸，也可编码抗原性多肽。编码抗原性多肽的多核苷酸可连接至编码免疫刺激多肽的多核苷酸，从而在载体中两个多肽是同一多肽的部分。在实施例中，编码抗原性多肽的多核苷酸还编码免疫刺激多肽。在一个实施方式中，两个编码多肽的多核苷酸都在阅读框内插入肠炎沙门氏菌lamB基因环9或另一疫苗载体中。本领域技术人员将理解，也可以使用编码其它跨膜蛋白和lamB基因其它环的细菌多核苷酸。
或者，编码抗原性多肽和/或免疫刺激多肽的多核苷酸可插入分泌多肽，分泌多肽通过和疫苗载体表面上的蛋白、脂质或碳水化合物相关联而展示或存在于疫苗载体的表面上。本领域技术人员将理解，编码抗原性多肽和/或免疫刺激多肽的多核苷酸可插入各种疫苗载体的多核苷酸中，以便提供抗原性多肽和/或免疫刺激多肽的表达并递呈给疫苗载体所治疗的受试者的免疫细胞。PAL抗原性多肽和免疫刺激多肽的编码区可以融合到含有来自李斯特菌属的分选酶分选基序的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)纤连蛋白结合蛋白的C端。这允许将分泌蛋白锚定于革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属的细胞壁。见Nguyen和Schumann,JBiotechnol(2006)122:473-482，通过引用全部并入此处。其它类似的方法也可以使用。
或者，如果通过本领域技术人员可用的方法使用病毒载体，多肽可以共价或化学连接到膜、细胞壁、或衣壳中的蛋白、脂质或碳水化合物。例如，二硫键或生物素-抗生物素蛋白的交联可以用来在疫苗载体的表面上呈现抗原性多肽和免疫刺激多肽。适当地，抗原性多肽和免疫刺激多肽是融合蛋白的部分。两个多肽可以通过肽键直接连接，或者可以通过接头、间隔(spacer)、或第三蛋白的区段(section)隔开，其中所述第三蛋白中插入两个多肽。在实施例中，氨基酸间隔用在多肽之间。间隔可以是2至20个氨基酸之间，适当地3至10个氨基酸之间，适当地6至8个氨基酸之间。适当地，间隔中的氨基酸具有小侧链，且不带电，例如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。间隔可具有氨基酸残基的组合。
在实施例中，疫苗载体具有编码在同一多核苷酸上的并且彼此在阅读框中的抗原性多肽(SEQIDNO：1和SEQIDNO：31(CampyCj0113))和免疫刺激多肽(HMGB1)。参见SEQIDNO：42、44和46。值得注意的是，在各多肽片段之间使用三氨基酸间隔的实施例中，其中的HMGB1多肽位于疫苗载体插入的N或C端的疫苗载体，导致最佳的保护免受继发感染。表现最好的疫苗载体具有CJ0113，CJ0113后接着PAL，PAL后接着HMGB1(从N至C端或SEQIDNO：42)。因此，抗原和免疫刺激多肽在疫苗载体表面上的顺序或展示可影响免疫应答。在替代实施例中，免疫刺激多肽和抗原性多肽可由不同的多核苷酸编码。本领域技术人员将理解，有多种方法可以被用于获得抗原性多肽和HMGB1多肽在疫苗载体表面上的表达。这样的方法是本领域技术人员所熟知的。
还提供了组合物，其包含疫苗载体和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是适合于体内施用的任何载体。适当地，药学上可接受的载体是口服、经鼻或粘膜递送可以接受的。药学上可接受的载体可包括水、缓冲溶液、葡萄糖溶液或细菌培养液。组合物的附加组分可以适当地包含赋形剂，如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂和润滑剂。药学上可接受的载体或稀释剂的示例包括稳定剂，如碳水化合物(例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)，蛋白如白蛋白或酪蛋白，含蛋白试剂例如牛血清或脱脂乳和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。特别是当这样的稳定剂加入到组合物中时，组合物适合冷冻干燥或喷雾干燥。在组合物中的疫苗载体可能不能够复制，适当地，疫苗载体在加入组合物之前是失活或灭活的。
还提供了通过施用疫苗载体增强受试者免疫应答的方法。疫苗载体可以含有编码SEQIDNO：1-6、32、36、37的抗原性PAL多肽或其免疫原性片段的第一多核苷酸。疫苗载体也可包含编码免疫刺激多肽的第二多核苷酸。适当地，免疫刺激多肽是与脊椎动物免疫系统天然相关的并参与刺激免疫应答的多肽。免疫刺激多肽可刺激受试者的固有或适应性免疫应答。适当的，以上更充分地描述的HMGB1多肽或CD154多肽可以用作免疫刺激多肽。在此处提供的方法中，以增强/影响受试者对疫苗载体免疫应答，尤其是对抗原性多肽的免疫应答，特别是对革兰氏阴性细菌如沙门氏菌属和大肠杆菌的免疫应答的有效量，将含有抗原性PAL多肽和任选免疫刺激多肽的疫苗载体施用至受试者。
增强的免疫应答可包括抗体或T细胞应答。适当地，免疫应答是保护性免疫应答，但免疫应答可以不是完全的保护，但能够降低与感染相关的发病率或死亡率。免疫刺激多肽可以用于增强受试者对除了抗原性PAL多肽以外的任何外源抗原或存在于疫苗载体上的抗原性多肽的免疫应答。本领域技术人员将理解，免疫刺激多肽可用于增强对存在于疫苗载体的一个以上的抗原性多肽的免疫应答。增强免疫应答包括但不限于诱导由受试者的免疫系统介导的治疗或预防效果。尤其是，增强免疫应答可包括但不限于增强的抗体产生、增强的抗体重链的类别转换、抗原递呈细胞的成熟、辅助性T细胞的刺激、刺激细胞毒性T细胞或诱导T和B细胞记忆。
适当地，所述疫苗载体包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括HMGB1多肽(SEQIDNO：15)的氨基酸150-183和89-109或其同源物。在实施例中，使用HMGB1的190个氨基酸的多肽。适当地，多核苷酸编码和受试者相同物种的HMGB1多肽。HMGB1多肽和受试者(例如，人HMGB1多肽用于鸡疫苗)的异源组合可用在本发明的方法中，这是因为HMGB1在各物种之间是高度保守的。HMGB1多肽可用于增强受试者对任何外源抗原、抗原性多肽或存在于疫苗载体中或疫苗载体上的一个以上多肽的免疫应答。本领域技术人员将理解，HMGB1多肽可用于增强对存在于疫苗载体中一个以上的抗原性多肽的免疫应答。来自HMGB1的多肽至少部分地通过激活树突细胞和巨噬细胞刺激免疫应答，从而刺激产生细胞因子如IL-1、IL-6、IFN-γ和TNF-α。在实施例中，HMGB1的多肽表达在疫苗载体的表面上。
适当地，疫苗载体可以含有能够结合CD40并激活CD40的CD154多肽。以增强或影响受试者对疫苗免疫应答的有效量，将包含编码能够结合CD40的CD154多肽的多核苷酸的疫苗施用至受试者。适当地，疫苗包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含人CD154多肽(SEQIDNO：25)的氨基酸140-149或其同源物。如上所述，源自一个物种的氨基酸140-149的同源物可用于刺激不同物种中的免疫应答。适当地，多核苷酸编码来自和受试者相同物种的CD154多肽。适当地，编码SEQIDNO：26的多肽的多核苷酸用在人受试者中，编码SEQIDNO：27的多肽的多核苷酸用在鸡中，编码SEQIDNO：28的多肽的多核苷酸用在鸭中，编码SEQIDNO：29的多肽的多核苷酸用在小鼠中，以及编码SEQIDNO：30的多肽的多核苷酸用在牛中。人CD154多肽(SEQIDNO：26)已被用在鸡疫苗中并被证明增强对外源抗原的免疫应答。从而，CD154多肽和受试者的其它异源组合可用于本发明的方法中。
此外，公开了增强对革兰氏阴性细菌免疫应答的方法以及降低与革兰氏阴性细菌继发感染相关的发病率的方法，其中革兰氏阴性细菌选自沙门氏菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、弧菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属、耶尔森氏菌属、普罗维登斯菌属和类似的细菌。简单地说，方法包括以有效量向受试者施用疫苗载体，所述疫苗载体包含编码抗原性PAL多肽的第一多核苷酸序列和任选编码免疫刺激多肽的第二多核苷酸。抗原性PAL多肽可以包括SEQIDNO：1-6。可以通过本领域技术人员已知的多种方式将抗原性PAL多肽插入到载体中，包括但不限于通过引用全部并入此处的BMCBiotechnol.2007九月17:7(1):59ScarlessandSite-directedMutagenesisinSalmonellaEnteritidischromosome中所述的无痕(scarless)定点突变系统，以及如通过引用全部并入此处的Nguyen和SchumannJBiotechnol2006122:473-482中所述此处所用的方法。载体也可经工程化改造而表达抗原性PAL多肽以及来自其它病原体的其它抗原性多肽，所述其它病原体包括病毒如流感M2e或细菌如沙门氏菌属、弯曲杆菌属或大肠杆菌。特别是，能与CD40结合的CD154或HMGB1的多肽可由载体表达，以增强受试者对抗原性PAL多肽的免疫应答。
也可以使用含抗原性多肽的组合物以降低与革兰氏阴性细菌继发感染相关的发病率。组合物可以在施用有此处所述组合物或疫苗载体的受试者中防止细菌引起疾病或可能会限制或降低任何相关的发病率。此处所述的组合物和疫苗载体，可以通过降低疾病的时间长短、体重减少、疾病症状的严重程度、降低疾病相关的发病率或死亡率或者降低感染疾病的可能性，而降低继发疾病的严重程度。组合物还可以通过抑制传递而减少病原体的传播。施用此处描述的疫苗载体后，和没有给予疫苗载体的相似受试者相比，疾病相关的发病率或死亡率可以降低25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％。
为了施用至动物或人，可以通过各种方式包括但不限于经鼻、粘膜、通过喷雾、皮内、肠胃外、皮下、腹腔内、静脉内、颅内、口服、通过气雾或肌内施用组合物。另外适当的是滴眼施用、口服灌胃或此外饮水或进食。对于禽，组合物可以卵内施用。
本发明的一些实施方式提供增强受试者中免疫应答的方法。适当的受试者包括但不限于脊椎动物，适当地哺乳动物，适当地人，以及鸟，适当地禽，如鸡或火鸡。也可以使用其它动物如牛、猫、狗或猪。适当地，受试者是非人，也可以是农业动物。
待施用的疫苗的有用剂量将根据受试者年龄、体重和物种、施用方式和途径以及免疫应答所针对的病原体类型的不同而不同。可按照足以引起免疫应答的任何剂量施用组合物。可以设计，适当的是剂量范围从103至1010载体拷贝(即，菌落形成单位或噬斑形成单位)，从104至109载体拷贝，或从105至107载体拷贝。
组合物可以仅仅施用一次或可以施用两次或更多次以增强免疫应答。例如，组合物可以隔1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长时间施用两次或更多次。疫苗载体在施用之前可以包含活的微生物，但在一些实施方式中载体可在施用前灭活。在一些实施方式中，载体能在受试者中复制，而在另一些实施方式中，载体不能在受试者中复制，例如灭活的疫苗载体或脂质体。失活用作载体的微生物的方法是技术人员已知的。例如，可以使用福尔马林、乙醇、热暴露、或抗生素失活细菌疫苗载体。本领域的技术人员也可以使用其它方法。
可以涉及，来自相同或不同病原体的几个表位或抗原可组合在单一疫苗中施用以产生针对多个抗原的增强的免疫应答。重组疫苗可以编码来自多个致病性微生物、病毒或肿瘤相关抗原的抗原。施用能够表达多个抗原的疫苗具有同时诱导对两种或更多种疾病的免疫的优点。例如，活的减毒细菌提供适当的载体用于激发对来自单一病原体的多个抗原(例如来自沙门氏菌属的FliC和PAL)或针对来自不同病原体(例如，流感和沙门氏菌属)的多个抗原的免疫应答。
使用本领域公知的方法，可以使用编码抗原的外源多核苷酸构建疫苗载体，所述抗原可插入疫苗载体的任何非必需位点，或者可携带在质粒上或其它染色体外载体上(如BAC或YAC)。一个适于多核苷酸插入的位点在跨膜蛋白外部部分内，或者偶联至靶向外源多核苷酸的序列，以便分泌途径和/或允许附着到细胞壁。一个适当的用于插入多核苷酸的跨膜蛋白的示例是lamB基因。细胞壁附着的一种适当方法在实施例中提供。
外源多核苷酸包括但不限于编码来自致病性微生物或病毒的抗原多核苷酸，并包括以产生有效免疫应答的方式而得以表达的多核苷酸。这种多核苷酸可源自致病性病毒，如流感(例如，M2e、血凝素、或神经氨酸苷酶)、疱疹病毒(例如，编码疱疹病毒结构蛋白的基因)、逆转录病毒(例如，gp160包膜蛋白)、腺病毒、副粘病毒、冠状病毒等。外源多核苷酸也可以获自致病性细菌，例如编码细菌蛋白(如毒素、外膜蛋白或其它高度保守蛋白)的基因。此外，来自寄生虫如顶复门寄生虫的外源多核苷酸是用于载体疫苗的有吸引力的候选者。
本公开不限于此处所述的结构、组分的安排、或方法步骤的具体细节。此处公开的组合物和方法能够以各种方式得以制造、操作、使用、实施和/或形成，根据以下的公开，这对于本领域技术人员将是显而易见的。此处所使用的措辞和术语仅是为了描述的目的，而不应被认为是限制权利要求的范围。在说明书和权利要求书中所用的顺序指代如第一、第二和第三，是指各种结构或方法步骤，并不意图解释为表明任何特定的结构或步骤，或这种结构或步骤的任何特定顺序或构造。除非此处另有指明或与上下文明显矛盾，否则此处所描述的所有方法可以按照任何适当的顺序进行。除非另有声明，否则此处所提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“如”)的使用，仅仅是为了便于公开，并不暗示着对公开范围的任何限制。说明书中的语言以及附图中所示的结构，不应解释为表示任何未要求的元素对实施所公开的主题是必不可少的。此处术语“包括”、“包含”或“具有”及其变型的使用，是指包括其后所列出的元素及其等同物，以及其它元素。记载为“包括”、“包含”或“具有”某些元素的实施方式也被认为是“基本上由这些特定元素组成”和“由这些特定元素组成”。除非明确指明，否则术语“一”、“一个”和“该”可表示一个或一个以上。
除非此处另有指明，否则此处对值的范围的描述仅仅旨在作为一种速记方法，从而单独指代落在范围之内各独立的值，并且各个独立的值并入说明书，就好像它在此处单独列举一样。例如，如果浓度范围表示为1％至50％，这意味着，如2％至40％、10％至30％、或1％至3％等值在本说明书中得以明确列举。这些示例仅仅是所具体意图的，之间所有可能的数值组合并且包括所列举的最低值和最高值被认为在本公开中得以明确描述。用来描述具体记载的量或量的范围的字眼“约”，其意图表示非常接近所记载的量的值包括在该量的范围内，例如由于制造公差(manufacturingtolerance)、形成测量中仪器和人为的误差等，而可能地或天然地将考虑在内的值。除非另有指明，否则所有百分数是指按重量计的量。
以下实施例仅是说明性的，并且不意味着作为对本发明或所附权利要求的范围的限制。此处引用的所有参考文献，包括专利、专利公开和非专利文献，通过引用其全部并入此处。参考文献中的陈述和此处所做的那些陈述之间的任何冲突，应当以有利于此处所含陈述的方式来解决。
实施例
我们选择来自大肠杆菌的Pal多肽作为高度保守的多肽，其包含在革兰氏阴性致病性细菌之间高度保守的并且免疫原性的多肽。我们通过从Pal的氨基酸106-124(P0A912)中选择大肠杆菌序列来开始。使用针对见于EMBL和NCBI数据库中所公开序列的网络蛋白序列分析(NetworkProteinSequenceAnalysis)程序(Combet,C.,C.Blanchet,C.Geourjon和G.Deleage.2000.NPS:networkproteinsequenceanalysis.TrendsBiochemSci25:147-50)来证实所选序列的抗原性潜力。然后，使用瑞士生物信息研究所的Blast搜索引擎在EXPASY服务器上，将序列用于搜索序列同源性。Blast搜索发现了与我们最初选择的Pal序列(TVEGHADERGTPEYNISLG(SEQIDNO：8))具有相同序列的一些蛋白(Pal)。具有相同序列的Pal蛋白列表包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)和副伤寒菌属(paratyphispp)、志贺菌属、肠杆菌属(Enterobacterspp)、枸橼酸杆菌属、阪崎肠杆菌属(Cronobacterspp)。此外，具有大于94％同源性(仅一个氨基酸不同，有或没有第二个氨基酸的相似取代)的Pal蛋白是具有100％覆盖率(coverage)的弧菌属、Sodalis菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、Dickeya属、沙雷菌属(Serratiaspp)、变形杆菌属(Proteusspp)、异短杆菌属(Xenorhabdusspp)、果胶杆菌属(Pectobacteriumspp)和泛菌属(Pantoeaspp)。
为了优化用于其它病原体物种的抗原，第17个氨基酸将被从丝氨酸变为丙氨酸。新的序列将是TVEGHADERGTPEYNIALG(SEQIDNO：32)。预期这个序列为具有100％覆盖率和相同或相似氨基酸序列的弧菌属、Sodalis菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、Dickeya属、沙雷菌属、变形杆菌属、异短杆菌属、果胶杆菌属和泛菌属提供最佳的免疫刺激。预期接种之后免疫系统将靶向这些物种的蛋白，并提供针对这些生物的保护。
Pal表位(TVEGHADERGTPEYNISLG(SEQIDNO：8))插入枯草芽孢杆菌(BS)载体并进行表达。随后，在孵化当天通过口服灌胃108cfu/鸡对鸡进行接种，将Pal芽孢杆菌构建体作为疫苗载体针对沙门氏菌属进行测试，并且与用芽孢杆菌属骨架(BSBB)或盐水相似处理的鸡进行比较。在孵化后第11天用相同的处理对鸟进行加强。在第17天，收集样本用于特异性免疫应答。通过测量血清IgG(图1)和分泌型回肠IgA(图2)评价对疫苗的免疫应答。与对照组相比，接种表达在芽孢杆菌上的所选Pal序列后，出现特异性针对Pal序列的显著血清和分泌免疫应答(图1和2)。
通过计数孵化后第17天和21天(或挑战后第6和10天)经过接种的鸡的盲肠中沙门氏菌的菌落，评估潜在的针对在接种后第11天的鼠伤寒沙门氏菌(ST)挑战的芽孢杆菌载体化的疫苗候选者。使用常规的微生物学技术测量盲肠中ST的水平。接种有表达在芽孢杆菌载体上的所选Pal序列的鸡，具有显著降低的盲肠沙门氏菌属水平。如图3所示，和接种盐水或BSBB的鸡相比，在接种BS-PAL(BSNNP)的鸡中沙门氏菌属在盲肠中的水平降低了超过41/2log。这是针对沙门氏菌属第一个有效的疫苗，它被食品和药品监督管理局(FDA)认为有资格作为公认安全(GRAS)的生物如枯草芽孢杆菌所载体化。
在旨在优化免疫原序列的研究中，所述免疫原序列称为上述PAL(TVEGHADERGTPEYNISLG(SEQIDNO：8))，设计表位测绘实验来评价这种19-mer寡肽PAL各部分的相对抗原性。序列分成7个六肽，彼此重叠3个氨基酸。例如，TVEGHA(SEQIDNO：39)、GHADER(SEQIDNO：2)和DERGTP(SEQIDNO：3)，各个肽在序列的最左侧(朝向氨基端)和最右侧(朝向羧基端)部分共享三个氨基酸。为了这个目的，合成了跨越氨基酸残基1-3、4-6、7-9等的七个六肽，并偶联至牛血清白蛋白(BSA)。选择与PAL19-mer肽和沙门氏菌(以及相关物种)细胞壁展示的天然表位发生强烈反应的两个单克隆抗体(mAb，指定为2B5和1B2)，并且测试它们对PAL各个区段的相对亲和性(图4)。
结果表明，试验的7个肽当中，PAL1(3个残基的前-PAL(pre-PAL)“YKV”，以及PAL氨基端残基“TVE”；SEQIDNO：38)对于两个mAb是抗原性最弱的。通过观察这可以解释为，苏氨酸是不带电的氨基酸而缬氨酸是脂肪族残基，两者都是相对疏水的，因此不太可能在原始免疫原PAL中被接近。少被接近的残基不太可能诱导强的免疫应答。此外，大多数抗体表位天然上是亲水性的。与此相反，两个反应性最好的mAb对PAL6(SEQIDNO：4)和PAL7(SEQIDNO：6)有更高的亲和性(相比PAL1，对于PAL6的ELISA吸收水平是两倍高，以及对于PAL7是>50％更高)。这些结果清楚地表明PAL在C端的一半可能更加暴露并且是免疫原容易接近的部分以及对于产生抗体群而言是免疫原最关键的部分，该抗体群与沙门氏菌和相关细菌物种上呈现的天然蛋白强烈地交叉反应。有趣的是，为了产生PAL7六肽，加入了不是原始19-merPAL一部分的且在天然细菌蛋白中位于PAL两侧的2个残基：E(谷氨酸)和R(精氨酸)。两者都是带电荷的残基，因此具有高的暴露于我们细菌靶标物种的概率。
基于上述理由，生成了新的19-mer，其指定为PALbis(SEQIDNO：1)。PALbis不同于原来的PAL19-mer：在于(1)它不再包含两个N端氨基酸T(苏氨酸)和V(缬氨酸)，以及(2)它的C端延长了两个额外的残基，即E(谷氨酸)和R(精氨酸)。因此，改进的氨基酸序列PALbis是EGHADERGTPEYNISLGER(SEQIDNO：1)。将PALbis和细菌的多个属进行比较，以确保保留跨物种的反应性(BLAST结果示于表1)。大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和和副伤寒菌属、志贺菌属、肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和阪崎肠杆菌属之间的序列同源性仍然有100％同源性。弧菌属、Sodalis菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、Dickeya属、沙雷菌属、变形杆菌属、异短杆菌属、果胶杆菌属和泛菌属间的序列同源性为95％同源性，具有单个氨基酸取代S15A(SEQIDNO：6)。相关的空肠弯曲杆菌序列示为SEQIDNO：7，并且和SEQIDNO：1的序列具有65％的同一性。因此，我们选择使用表达SEQIDNO：1的疫苗载体来获得单个疫苗载体的跨-株的免疫反应。
表1：细菌之间的PALbis(SEQIDNO：1)序列比较
PALbis序列:
EGHADERGTPEYNISLGER大肠杆菌(SEQIDNO:1)
EGHADERGTPEYNIALGER弧菌属(SEQIDNO:6)
EGNCDEWGTDEYNQALG__弯曲杆菌属(SEQIDNO:7)
为了测试PALbis(SEQIDNO：1)在跨-株挑战实验中发挥作用的能力，产生几个候选疫苗。基本上如国际公开号WO2008/036675和国际公开号WO2011/091255所描述的，产生此处所用的疫苗载体。产生三个单独的构建体，并入两个独立的疫苗载体，肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌。所用的插入包括编码CJ0113表位的多核苷酸(此处描述为SEQIDNO：31，最初描述于国际公开号WO2011/156619)、编码SEQIDNO：24的HMGB1多肽(最初描述于国际公开号WO2011/091255)的多核苷酸以及此处鉴定并描述的SEQIDNO：1的PALbis序列。三个多核苷酸被丝氨酸间隔隔开(插入三个丝氨酸残基以避免空间位阻问题)并在阅读框内以各种顺序插入沙门氏菌跨膜蛋白lamB的外环9。所得插入的核酸和氨基酸序列显示于SEQIDNO：41-46，SEQIDNO：41和42分别是CJ0113-PAL-HMGB1插入的核酸和氨基酸序列。SEQIDNO：43和44分别是CJ0113-HMGB1-PAL插入的核酸和氨基酸序列。SEQIDNO：45和46分别是HMGB1-CJ0113-PAL插入的核酸和氨基酸序列。产生三个以各种顺序带有相同插入的疫苗载体的目的是控制多肽的任何位置或空间位阻影响，其和未经测绘的载体试剂上的表面基团(moiety)相互作用，从而使得HMGB1结合结构域不易被宿主细胞上的受体所接近，或者可能使得表面所呈现的抗原不易被宿主免疫细胞所接近。
肠炎沙门氏菌载体化的疫苗降低了挑战后海德堡沙门氏菌的回收。当和海德堡沙门氏菌挑战株比较时，给鸡接种属于异源沙门氏菌血清群的肠炎沙门氏菌载体化的疫苗以确定PAL抗原是否会产生跨沙门氏菌血清群的免疫应答。在1日龄的鸡中，以4x108cfu/鸡，口服灌胃活的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1、活的肠炎沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL(其之后被确定在HMGB1中含有两个点突变以及在PAL中有移框突变，而产生SEQIDNO：35的PAL表位)以及活的肠炎沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL(其之后被确定在HMGB1中含有点突变)疫苗。在第7天以7x106cfu/鸡用海德堡沙门氏菌通过口服灌胃对鸡进行挑战。确定分离自21日龄雏鸡盲肠的海德堡沙门氏菌的每克菌落形成单位(cfu)。活的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1所接种的鸡在挑战后14天，回收自盲肠的海德堡沙门氏菌cfu/g显著低于来自活肠炎沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL所接种的鸡(在HMGB1中带有两个点突变以及在PAL中有移框突变)、活的肠炎沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL(在HMGB1中带有点突变)所接种的鸡以及未接种的对照鸡(图5，P＝0.003)。
当和海德堡沙门氏菌挑战比较时，鸡还接种有属于异源沙门氏菌血清群的戊二醛失活的肠炎沙门氏菌载体化的疫苗以确定PAL抗原是否会产生跨沙门氏菌血清群的免疫应答。戊二醛失活的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1、肠炎沙门氏菌-CJ0113-mHMGB1-mPAL(在HMGB1中带有点突变以及在PAL中有移框突变)、肠炎沙门氏菌-mHMGB1-CJ0113-PAL(在HMGB1中带有点突变)疫苗以甘露糖化壳多糖为佐剂(如国际申请号PCT/US13/67212中描述的)。以1×109cfu/鸡，将所制备的疫苗用于口服灌胃1日龄的鸡。在第17天以8.5x106cfu/鸡用海德堡沙门氏菌通过口服灌胃对鸡进行挑战。挑战后五天，在雏鸡中的戊二醛失活的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1接种和肠炎沙门氏菌-mHMGB1-CJ0113-PAL接种，显著降低来自盲肠的海德堡沙门氏菌的回收(图6；P<0.05)，并且挑战后十七天，在肠炎沙门氏菌-mHMGB1-CJ0113-PAL和肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1接种的鸡中海德堡沙门氏菌的回收仍很低(P＝0.033)。鉴于疫苗骨架源自沙门氏菌血清群D株而保护了免受沙门氏菌血清群B的挑战，这些数据表明这些疫苗中的PAL表位提供了对跨血清群的沙门氏菌挑战的保护。
值得注意的是，这些实验不能用于确定疫苗载体中三个多肽的相对定向或位置是否有任何作用，因为在插入中发现了突变。突变对于PAL多肽的保护性或免疫原性部分是有信息意义的。单个核苷酸缺失见于肠炎沙门氏菌-CJ0113-mHMGB1-mPAL疫苗的PAL多核苷酸。野生型的PAL核苷酸序列是5'-GAAGGTCACGCGGACGAACGTGGTACCCCGGAATACAACATCTCTCTGGGTGAACGT-3'(SEQIDNO：33；在突变序列中缺失的鸟嘌呤以下划线表示)以及见于肠炎沙门氏菌-CJ0113-mHMGB1-mPAL的突变PAL序列是5'-GAAGGTCACGCGGACGAACGTGGTACCCCGAATACAACATCTCTCTGGGTGAACGT-3'(SEQIDNO：34)。在PAL核苷酸序列中，鸟嘌呤缺失(野生型序列中下划线表示)31个碱基对导致移框突变，而改变了PAL肽序列最后的8个氨基酸。SEQIDNO：1的野生型PAL变成SEQIDNO：35(EGHADERGTPNTTSLWVN；最后8个氨基酸下划线表示，并且不同于SEQIDNO：1中发现的那些)。这种突变体的PAL不能发展出有效的免疫应答可能是由于PAL最后9个氨基酸的丢失，在上图4中这证明对于发展抗体应答是重要的。因此，最小的PAL表位是SEQIDNO：36(EYNISLGER)或其弧菌属的对应物SEQIDNO：37(EYNIALGER)。
重新制备疫苗以纠正上面提到的突变。一旦突变得以纠正，在雏鸡中接种活的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1、活的肠炎沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL、和活的鼠伤寒沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL，显著降低在用四硫磺酸盐富集24小时之后的收集自挑战后10天的雏鸡盲肠中海德堡沙门氏菌的回收(图7；P<0.05)。通过口服灌胃，给孵化当日的鸡接种107cfu的活肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1、肠炎沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL、肠炎沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL、鼠伤寒沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1、鼠伤寒沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL、或鼠伤寒沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL。通过口服灌胃，另外一组孵化当日的鸡接种106cfu的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1。在14日龄，用107cfu相应的疫苗，给肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1、肠炎沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL、肠炎沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL、鼠伤寒沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1、鼠伤寒沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL、或鼠伤寒沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL接种的鸡进行加强。在孵化当日接受106cfu的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1所接种的鸡，用108cfu的肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1进行加强。在第17天用6×106cfu/鸡通过口服灌胃对鸡进行挑战，结果在图7中显示为挑战细菌的回收百分比。结果表明，疫苗载体中各插入的位置可影响由疫苗提供的保护水平。
在肠炎沙门氏菌细菌细胞表面上表达的PAL将直接与B淋巴细胞相互作用，从而刺激抗体产生。在肠炎沙门氏菌细胞表面上表达的HMGB1影响摄取到鼠巨噬细胞中的吞噬百分比(图8)。来自Raw264细胞系的鼠巨噬细胞和活肠炎沙门氏菌疫苗载体、肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1、肠炎沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL或肠炎沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL共培养一小时。大肠杆菌pHrodo红色生物粒子加入到各培养物中并孵育2小时。生物粒子和细菌被巨噬细胞吞噬后，产生一个吞噬体。吞噬体和溶酶体融合，酸化吞噬溶酶体的内部。生物粒子的荧光强度随着pH变酸而增加；因此吞噬溶酶体内的生物粒子将具有更高的荧光强度。肠炎沙门氏菌-CJ0113-PAL-HMGB1的吞噬摄取百分比高于肠炎沙门氏菌-HMGB1-CJ0113-PAL，而后者又高于肠炎沙门氏菌-CJ0113-HMGB1-PAL，表明在插入末端的HMGB1与细胞表面进行有利的相互作用，并增强吞噬摄取。
根据这些数据，嵌合DNA的线性展示改变蛋白折叠，而蛋白折叠依赖于带电荷的氨基酸的位置。抗原和免疫刺激分子的不同线性组合将影响各抗原和免疫刺激在细菌细胞表面上的空间排布。对于每个细菌物种而言，这些线性组合的蛋白表达可能不同，因为细菌细胞表面上的通道蛋白产生与周围通道蛋白的空间位阻。降低的疫苗功效可能是因为空间位阻所导致的不利的PAL或HMGB1蛋白表达。

Claims (28)

1.一种疫苗载体，其包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码SEQIDNO：1的PAL多肽、与SEQIDNO：1具有90％或更高同源性的氨基酸序列、或其至少六个氨基酸长的免疫原性片段，其中所述PAL多肽表达在疫苗载体的表面上。
2.根据权利要求1所述的疫苗载体，其还包含编码免疫刺激多肽的第二多核苷酸序列，其中所述免疫刺激多肽表达在疫苗载体的表面上。
3.根据权利要求2所述的疫苗载体，其中所述免疫刺激多肽是HMGB1多肽或能够与CD40结合的CD154多肽。
4.根据权利要求3所述的疫苗载体，其中所述HMGB1多肽包含选自SEQIDNO：15-23中至少一个的多肽或SEQIDNO：15-23中至少一个的片段。
5.根据权利要求3所述的疫苗载体，其中所述CD154多肽具有少于50个的氨基酸，并包含SEQIDNO：24、SEQIDNO：25的氨基酸140-149或其同源物。
6.根据权利要求5所述的疫苗载体，其中所述CD154多肽包含SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29或SEQIDNO:30。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的疫苗载体，其中所述PAL多肽是SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:32、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37或其组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的疫苗载体，其中所述载体包含一个以上拷贝的第一多核苷酸和/或一个以上拷贝的第二多核苷酸序列。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的疫苗载体，其中所述第一多核苷酸序列在阅读框内连接至第二多核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的疫苗载体，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸通过间隔核苷酸连接。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的疫苗载体，其中所述载体选自病毒、细菌、酵母和脂质体。
12.根据权利要求11所述的疫苗载体，其中所述疫苗载体是芽孢杆菌属Bacillusspp.、沙门氏菌属Salmonellaspp.、乳杆菌属Lactobacillusspp.或埃希氏菌属Escherichiaspp。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的疫苗载体，还包含编码第二抗原性多肽的第三多核苷酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的疫苗载体，其中所述第二抗原性多肽是选自SEQIDNO:7或SEQIDNO:31的多肽。
15.一种疫苗载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQIDNO：42、44或46中至少一个的多肽，或者和SEQIDNO：42、44或46具有90％同一性的多肽。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项所述的疫苗载体以及药学上可接受的载体。
17.一种增强受试者对革兰氏阴性细菌免疫应答的方法，其包括以增强受试者对革兰氏阴性细菌免疫应答的有效量向受试者施用权利要求1-15中任一项所述的疫苗载体或者权利要求16所述的药物组合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中增强的免疫应答包括增强的抗体应答、增强的T细胞应答或两者皆有。
19.一种降低受试者与革兰氏阴性细菌感染相关的发病率的方法，所述方法包括，和未施用所述疫苗载体的对照受试者相比，以降低受试者与革兰氏阴性细菌继发感染相关的发病率的有效量向受试者施用权利要求1-15中任一项所述的疫苗载体或者权利要求16所述的药物组合物。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中通过选自以下的途径施用所述疫苗载体：口服、粘膜、肠胃外、皮下、肌肉内、眼内和卵内。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述受试者是禽物种的成员。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述禽物种是鸡或火鸡。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者是人类。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的方法，其中向受试者施用约104至约109载体拷贝的疫苗。
26.根据权利要求17-24中任一项所述的方法，其中向受试者施用约105至约107载体拷贝的疫苗。
27.根据权利要求17-26中任一项所述的方法，其中所述疫苗载体在施用至受试者之前是灭活的或者不能在受试者中复制。
28.根据权利要求17-27中任一项所述的方法，其中革兰氏阴性细菌选自：沙门氏菌属Salmonellaspp、埃希氏菌属Escherichiaspp、志贺氏菌属Shigellaspp、弧菌属Vibriospp、欧文氏菌属Erwiniaspp、克雷伯菌属Kebsiellaspp、枸橼酸杆菌属Citrobacterspp、耶尔森氏菌属Yersiniaspp和普罗维登斯菌属Providenciaspp。
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