MXPA03010507A

MXPA03010507A - Activacion ex vivo para generar linfocitos c citotoxicos espedificos para antigenos no tumorales para tratar enfermedades autoinmunes y alergicas.

Info

Publication number: MXPA03010507A
Application number: MXPA03010507A
Authority: MX
Inventors: Kong Yan
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2001-05-15
Filing date: 2002-05-13
Publication date: 2005-07-25
Also published as: US20070098734A1; ATE438710T1; EP2330187A2; PT1407004E; US20030170212A1; US8133728B2; EP2330187A3; CA2447593A1; ES2329453T3; US20110065187A1; JP5247547B2; EP1407004B1; EP2687593A1; US20110021747A1; US8133972B2; US20110065186A1; US8084253B2; US8084256B2; EP1407004A4; DE60233231D1

Abstract

Estimulando celulas T CD8 intactas en reposo con peptidos de IgE presentados por celulas presentadoras de antigeno artificiales, se pueden generar in vitro linfocitos T citotoxicos, CTLs, especificos para peptidos antigenicos derivados de moleculas de IgE; los CTLs especificos de IgE producen lisis de las celulas blanco cargadas con peptidos de IgE in vitro, e inhiben la respuesta de IgE especifica de antigeno in vivo; ademas, la transferencia adoptiva de los CTLs especificos de IgE a un modelo de raton asmatico puede inhibir el desarrollo de la inflamacion del pulmon y la hipersensibilidad de las vias respiratorias; los CTLs especificos de IgE ofrecen un tratamiento para el asma alergica y otras enfermedades alergicas mediadas por lg E; los peptidos antigenicos identificados de autoantigenos no tumorales inducen in vitro linfocitos T citotoxicos especificos; los CTLs inducidos por los peptidos identificados de CD40L pueden destruir celulas T CD4; los CTLs especificos para CD4OL generados in vitro inhiben in vivo las respuestas de anticuerpo dependientes de CD4 de todos los isotipos; en contraste, los CTLs inducidos por peptidos antigenicos derivados de IgE inhiben especificamente las respuestas de IgE, y la transferencia adoptiva de CTLs especificos de CD4OL a ratones NOD en una edad temprana, retrasan el desarrollo de diabetes en los ratones NOD; los CTLs generados in vitro, especificos de autoantigenos no tumorales expresados sobre celulas T CD4 activadas, regulan respuestas inmunes in vivo.

Description

ACTIVACION EX VIVO PARA GENERAR LINFOCITOS C CIT0TOX1COS ESPECIFICOS PARA ANTIGENOS NO TUMORALES PARA TRATAR ENFERMEDADES AUTOINMUNES Y ALERGICAS INTERREFERENCIA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos de América No. de serie 60/291 ,300, presentada el 15 de mayo de 2001 , cuyo contenido se incorpora aquí como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las respuestas inmunes a antígenos extraños como los que se encuentran en bacterias y virus protegen de las infecciones y las eliminan. Sin embargo, las respuestas inmunes aberrantes pueden ocasionar enfermedades alérgicas y enfermedades autoinmunes. Las respuestas inmunes a sustancias extrañas algunas veces inocuas, tales como polen, ácaros del polvo, antígenos de alimentos y picaduras de abeja, pueden dar como resultado enfermedades alérgicas tales como fiebre del heno, asma y anafilaxia sístémica. Las respuestas inmunes a autoantígenos como los antígenos de la isleta pancreática y los antígenos de cartílago pueden llevar a diabetes y artritis, respectivamente. El sello distintivo de las enfermedades alérgicas es la activación de células T CD4 y la alta producción de IgE por parte de las células B, mientras que la característica sobresaliente de las enfermedades autoinmunes es la activación de células T CD4 y la sobreproducción de citocinas de inflamación. Las terapias actuales se han enfocado al tratamiento de los síntomas de la alergia y las enfermedades autoinmunes, y no previenen el desarrollo ni el avance de las enfermedades. Los CTLs derivan de células T CD8 intactas en reposo y reconocen péptidos antigénicos presentados por las moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I . Cuando las células T CD8 en reposo encuentran péptidos antigénicos/complejo MHC presentados por células presentadoras de antígeno profesionales, las células T CD8 serán activadas y se diferenciarán en CTL armados. Tras el reconocimiento del póptido/complejo MHC sobre las células blanco, los CTL específicos de antígeno liberarán un golpe letal y producirán lisis de las células blanco que expresan el antígeno, tales como células blanco infectadas con virus o células de tumor. La activación de células T intactas in vivo es controlada por múltiples interacciones receptor-ligando entre células T y APC profesionales tales como las células dendríticas (R. M. Steinman, Annu. Rev. Immunol. (1991 ) 9:271 -296). Se acepta generalmente que se requieren dos señales para la activación de células T intactas (C. A. Janeway y K. Bottomly, Cell (1994) 76:275-285). La señal I es inducida por la interacción entre TCR y los complejos MHC/péptido (R. N. Germain, Cell (1994) 76:287-299), y es ayudada por la unión de correceptores de CD4/CD8 a regiones no polimórficas de moléculas de MHC de clase \\/\ , respectivamente (M. C. Miceli y J. R. Pames, Adv. Immunol. (1993) 53:59-122). La señal 2 es cualitativamente diferente de la señal I y es liberada por medio de moléculas coestimuladoras de células T que interaccionan con ligandos complementarios sobre APC, por ejemplo a través de la interacción de CD28 con B7 (P. S. Linsley y J. A. Ledbetter, Annu. Rev. Immunol. (1993) 1 1 :191 -212; Lenschow y otros, Annu. Rev. Immunol. (1996) 14:233-258). Las señales 1 y 2 funcionan sinergísticamente y activan una serie de eventos de señalización que finalmente inducen la proliferación de células T, producen citocinas y se diferencian en células efectoras (Mueller y otros, Annu. Rev. Immunol. (1989) 7:445-480; A. Weiss y D. R. Littman, Cell ( 994) 76:263-274). Sin embargo, la relación entre las señales 1 y 2 no está muy clara. Aunque se ha reportado que varias moléculas tienen función coestimuladora, se ha enfocado particular atención sobre la coestimulación provista por la interacción CD28-B7 (R. H. Schwartz, Cell (1992) 71 :1065- 068). CD28 es una molécula con una sola Ig como dominio y es expresada constitutivamente como un homodímero sobre células T (P. S. Linsley y J. A. Ledbetter, (1993) arriba citados). Mediante su interacción con moléculas B7-1 o B7-2 sobre APCs, se piensa que las moléculas de CD28 traducen señales únicas que inducen a las células T a producir citocinas promotoras de crecimiento tales como IL-2 (June y otros, Immunol. Today (1994) 15:321 -331 ) para regular positivamente la expresión de factores de supervivencia tales como BCI-XL (Boise y otros, Immunity (1995) 3:87-98), y para prevenir la anergia inducida por la señal 1 sola (R. H. Schwartz, Curr. Opin. Immunol. (1997) 9:351 -357). Otras dos moléculas que tienen una función importante en la activación de células T son LFA-1/ICAM-1 (Van Seventer y otros, J. Immunol, (1990) 144:4579-4586). La ICAM-1 pertenece a la superfamilia de genes de Ig y tiene cinco dominios de tipo Ig C en las regiones extracelulares; es expresada en células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. El receptor de ICAM-1 sobre las células T es LFA-1 (CD1 1/CD18), que pertenece a la familia de integrinas b2 (T. A. Springer, Cell (1994) 76:301 -314). La interacción de LFA-1 con ICAM-1 tiene una potente función coestimuladora sobre las células T (Shimizu y otros, Immunol. Rev. (1990) 1 14: 109-143), aunque las opiniones varían sobre si su función refleja rutas de señalización separadas o adhesión incrementada entre células T y APC (Damle y otros, J. Immunol. (1993) 1 51 :2368-2379; Bachmann y otros, Immunity (1997) 7:549-557). Además de las moléculas B7 y ICAM-1 , otras moléculas sobre APCs, incluyendo CD70 (Hintzen y otros, J. Immunol. (1995) 154:2612-2623) y antígeno termoestable (HSA) (Liu y otros, J. Exp. Med. (1992) 175:437-445), pueden ejercer una función coestimuladora muy potente mediante su interacción con sus ligandos respectivos sobre células T. La implicación es que la interacción T-APC es altamente compleja e implica múltiples interacciones entre grupos complementarios de moléculas sobre células T y APCs. La interacción de cada grupo de moléculas podría activar señales específicas que inducen eventos celulares diferentes. La combinación de las diferentes señales puede actuar sinergísticamente para una activación óptima de células T y para determinar el destino final de las células T. Alternativamente, la función de las moléculas de coestimulación puede ser redundante y las señales inducidas por cada grupo de moléculas de coestimulación son aditivas. El requerimiento de cada grupo de moléculas de coestimulación será afectado por la fuerza y las características de la señal 1 . Al considerar estas dos posibilidades, es importante entender los requerimientos mínimos para estimular células T intactas. Estudios con ratones CD28"'" indicaron que la interacción CD28-B7 es muy importante en algunas situaciones pero no en otras (Shahinian y otros, Science (1993) 261 :609-612). Igualmente, el requerimiento para la interacción LFA-1/ICAM en respuestas primarias es un hallazgo variable (Shier y otros, J. Immunol. (1996) 157:5375-5386). Las células T CD8 reconocen póptidos antigénicos derivados principalmente de proteínas de virus y proteínas expresadas sobre células de tumor. Sin embargo, recientemente se ha reportado que proteínas sintetizadas de nuevo son procesadas preferentemente por maquinaria procesadora de antígeno (Schubert y otros, Nature, (2000) 404:770-774). Tras la activación, las células inmunes han adquirido la capacidad de sintetizar varias proteínas nuevas; es posible que células productoras de IgE y células T CD4 activadas presenten unos grupos de complejos péptido/MHC diferentes que las células no productoras de IgE y las células T CD4 en reposo. Estos complejos péptidos/MHC presentados sobre células B productoras de IgE y células T CD4 activadas podrían ser reconocidos por células T CD8. De esta manera, con CTL específicos para estos complejos de póptidos/MHC se podrían tratar la alergia y las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, varios mecanismos de tolerancia han podido impedir la activación de las células T CD8 hacía autoantígenos ¡n vivo. Los linfocitos de CD8 (CTLs) son el arma de la inmunidad adaptativa responsable del reconocimiento y eliminación de células infectadas, células de tumor y células alogénicas. Una vez activados, los CTL pueden reconocer su antígeno blanco sobre una amplia variedad de células y realizar su función produciendo lisis de la célula blanco o segregando cítocinas como TNF-alfa o IFN-gamma. La presentación del antígeno a CTL de CD8+ (linfocitos T citotóxicos) ocurre en el contexto de moléculas de MHC de clase I (MHC-I), mientras que la presentación del antígeno a HTL CD4+ (linfocitos T auxiliares) ocurre en el contexto de moléculas de MHC de clase II. La inducción eficiente de células T CD4+ requiere que las células T interaccionen con células presentadoras de antígeno (APC), esto es, células que expresan moléculas de MHC de clase II y moléculas coestimuladoras. Las APC son células dendríticas, macrófagos y células B activadas, Aunque casi todas las células nucleadas expresan MHC-I, los CTL intactos también requieren la presentación de antígeno (Ag) por APC derivadas de médula ósea para activación eficiente (Dalyot-Herman y otros, J. Immunol., 165(12):6731 -6737). Las células dendríticas son inductoras altamente potentes de respuestas de CTL (J. Bancherean y R. M. Steinman, Nature, (1998) 392:245-252) y se cree que son las principales APCs involucradas en la activación de CTL. Una vez activados, los CTL pueden reconocer sus Ags cognados sobre una amplia variedad de células y responden provocando lisis de la célula blanco o secretando citocinas. Aunque se requieren APC derivadas de médula ósea para activar eficientemente las respuestas de CTL (P. J. Fink y M. J. Bevan, Exp. Med. (1978) 148:755-766), los CTL activados reconocen y responden fácilmente al Ag presentado por una amplia variedad de células. Se ha mostrado que la inducción in vivo de respuestas inmunes de CTL, especificas de tumor o específicas de virus, es dependiente de las células presentadoras de antígeno derivadas de la médula ósea (Paglia y otros, J. Exp. Med. (1996) 183(1 ):317-322; Labeur y otros, J, Immunol. (1999) 162(1 ):168-175). Se acepta generalmente que las APC derivadas de médula ósea, por medio de mecanismos únicos para estas células, toman antígenos celulares ya sea en forma de antígeno soluble, asociados con moléculas chaperonas, o por fagocitosis. Por mucho tiempo se ha demostrado que las respuestas a antígenos celulares son dependientes de ayuda provista por células T CD4+. También se ha mostrado que el antígeno celular tiene que ser presentado sobre la misma APC para su reconocimiento por el CTL y el HTL. La naturaleza de esta ayuda ha sido interpretada como una necesidad de IL-2 para la expansión de CTL. Estudios recientes han mostrado que esta ayuda resulta de la activación de células dendríticas por HTL y es mediada por interacción CD40-CD40L (S. R. Clarke, J. Leukocyte Bio. (2000) 67(5):607-614). Por lo tanto, un probable escenario para la inducción de una respuesta inmune mediada por CD8 a un antígeno celular (derivado de una célula de tumor o una célula infectada), es el siguiente: células dendríticas adquieren antígenos derivados de células de tumor o células infectadas. La interacción de DC-antígeno con células CD4 permite a las DC activar las células CD8.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Las células inmunes tales como las células B productoras de IgE y las células T CD4 activadas, desempeñan una función central en la patogénesis de enfermedades alérgicas y enfermedades autoinmunes. La presente invención utiliza linfocitos T citotóxicos (CTLs) para eliminar o inhibir las células inmunes que ocasionan la alergia o las enfermedades autoinmunes. Así, el desarrollo y avance de enfermedades puede ser prevenido o interrumpido con los métodos de la presente invención. La presente invención provee un método para producir CTL específicos para uno o más epítopes autoantigénicos no tumorales de células T, que comprende: a. aislar células T CD8+ de un sujeto; b. cargar células presentadoras de antigeno (APC's) que tienen moléculas de MHC de clase I con los epítopes de células T; c. cultivar las células T CD8+ con las APC's cargadas con antígeno durante un período suficiente para la activación de células T CD8+ precursoras específicas para los epítopes de células T; d. expandir en cultivo las células T CD8+ activadas en presencia de los componentes requeridos para la proliferación de las células T CD8* activadas; y e. recoger las células T CD8+ del cultivo. La presente invención también provee células T CD8+ que son específicamente citotóxicas para una célula blanco que ocasiona enfermedad, en donde la célula blanco tiene sobre su superficie uno o más epítopes autoantigénicos no tumorales de células T asociados con moléculas de MHC de clase I, y en donde las células T CD8+ han sido activadas selectivamente por interacción con moléculas MHC de clase I asociadas con los epítopes autoantigénicos no tumorales de células T. La presente invención también provee un método para tratar una enfermedad mediada por una célula blanco causante de enfermedad, en donde la célula blanco tiene sobre su superficie uno o más epítopes autoantigénicos no tumorales de células T asociados con moléculas de MHC de clase I, que comprende administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento células T CD8+ activadas, en donde las células T CD8+ han sido activadas selectivamente por interacción con moléculas de MHC de clase I asociadas con los epltopes autoantigénicos no tumorales de células T. La presente invención demuestra que haciendo y usando células presentadoras de antígeno artificiales se destruyó la tolerancia de células T CD8 a los autoantfgenos, y se generaron CTLs específicos para póptidos antigénicos identificados de IgE o proteínas CD40L. La transferencia adoptiva de los CTLs específicos para CD40L generados in vitro a ratones NOD retrasó dramáticamente el desarrollo de diabetes, y CTLs específicos para póptidos de IgE inhibieron la producción de IgE y redujeron la inflamación del pulmón en un modelo de ratón asmático. El sistema antes mencionado es potencialmente aplicable a enfermedades humanas que son causadas por células T CD4 y por células B productoras de IgE. Las enfermedades autoinmunes que son causadas por células T CD4 son diabetes, artritis reumatoide, SLE, esclerosis múltiple y soriasis. Mientras que las enfermedades alérgicas mediadas por IgE son anafilaxia sistómica causada por fármacos, venenos y cacahuates, rinitis alérgica, alergia a alimentos y asma alérgica. Además, también se pueden usar otros autoantígenos que son expresados sobre células inmunes para generar CTLs in vitro e in vivo para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y enfermedades alérgicas. Los póptidos antigénicos, proteínas o ARN y ADN que codifican los antigenos no tumorales expresados en células no tumorales, también se pueden usar para desarrollar vacunas para el tratamiento o prevención de alergia y enfermedades autoinmunes.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Las secuencias de aminoácidos de lgEa SEO. ID NO: 14 e lgEb SEQ ID NO: 50; las regiones constantes se alinearon con software NTI de vector. Las diferencias de secuencia entre los dos alelos están en negritas y subrayadas. Figuras 2A, 2B, 2C y 2D: Se purificaron células T CD8+ de ganglios linfáticos de ratones CBF1/J (A, B y C) o de ratones B6 deficientes en interferón ? (IFNy_ ) o ratones deficientes en perforina (PF ''") (C). Las células T CD8 purificadas se cultivaron con los péptidos de IgE indicados presentados por células SC2 transfectadas con moléculas de MHC D de clase I B7-1 (CD80) e ICAM-1 (CD54). Se agregó una dosis baja de IL-2 recombinante (20 unidades/ml) al cultivo el día 3 y después cada tercer día. El día 9 se midió la actividad de CTL contra células RMAS marcadas con 5 Cr cargadas con o sin los péptidos de IgE indicados. En la figura 2D, se agregó mAb anti-Db (20 pg/ml) al comienzo de la prueba de CTL. Figura 3: Ratones CBF1/J adultos (8-12 semanas) se inmunizaron intraperitonealmente con 50 pg de ovoalbúmina (OVA) precipitada con hidróxido de aluminio el día 1 y 14, respectivamente. El día 28 se midieron IgE, lgG1 e lgG2a en suero por medio de ELISA. Dos semanas después de la segunda inmunización se inoculó intranasalmente OVA a los ratones cada tercer día por tres tratamientos. Un día después de cada inoculación se les dio intravenosamente CTLs específicos de IgE o CTLs de control (5 x 106). Dos semanas después de la última terapia con CTL se midieron nuevamente IgG e IgE en suero. Figuras 4A, 4B, 4C y 4D: Ratones CBF1/J se inmunizaron como se indica en la figura 3. Dos semanas después de la segunda inmunización se les dieron intravenosamente dos dosis diferentes de CTLs anti-lgE (5x106 y 10x106) tres veces cada tercer día. Tres semanas después del tratamiento con CTL se midieron IgE e IgE específica de OVA, y se les inoculó intranasalmente OVA cada tercer día por tres tratamientos. Después de la última inoculación, se recolectó lavado alveolar bronquial (BAL) y se contaron las células totales en el BAL. Se midió eotaxina en el BAL por medio de ELISA, y las células eosinófilas en el BAL se diferenciaron por medio de marcación HE. Figuras 5A y 5B: Ratones CBF1/J se inmunizaron con OV A/aluminio el día 1 y 14, Dos semanas después de la segunda inmunización se inyectó a los ratones, cada tercer día por tres tratamientos, con PBS, CTL anti-lgE o un CTL de control (CTL anti-influenza) como se indica. Tres semanas después del último tratamiento se inoculó intranasalmente OVA a los ratones cada tercer día por tres tratamientos. Un día después de la última inoculación de OVA se midió la sensibilidad de las vías respiratorias a la metacolina de cada ratón por medio de pletografía de cuerpo completo. En las figuras 5A y 5B se muestran dos experimentos independientes, respectivamente. Figuras 6A y 6B: Ratones CBF1/J adultos (8 a 12 semanas) se inmunizaron intraperitonealmente con 50 pg de ovoalbúmina (OVA) precipitada con hidróxido de aluminio el día 1 y 14, respectivamente. Dos semanas después de la segunda inmunización se administraron intravenosamente CTLs específicos de IgE (5x106) o PBS a los ratones. Tres semanas después del último tratamiento se les inoculó intranasalmente OVA cada tercer día por tres tratamientos. Un día después de la última inoculación de OVA se preparó el BAL de cada ratón y el pulmón de cada uno se fijó y marcó con HE. Se muestra una marcación de HE representativa del tejido de pulmón de los ratones que recibieron PBS (figura 6A) o de los ratones que recibieron CTL anti-lgE (figura 6B). Figura 7: La secuencia de aminoácidos deducida de ADNc que codifica la región constante de IgE humana. Se preparó ARN total de la línea celular U266, que produce IgE humana. El ARN total se transcribió inversamente y se amplificó por PCR con dos oligonucleótidos que codifican la región constante 5' y 3' de IgE humana, respectivamente. El ADNc se clonó en el vector pcDNA3 y se determinó su secuencia. Figura 8: Células de Drosophila transfectadas con ADNc de HLA-A2 clase I se cultivaron con una concentración titulada de los péptidos de IgE indicados o péptido de control (H690) durante la noche a temperatura ambiente, y se cultivaron adicionalmente a 37°C por dos horas más. Las células se lavaron, se marcaron con mAb anti-HLA-A2 y se analizaron por citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia media se indica en el eje Y y la concentración de péptido se indica en el eje X.

Figuras 9A, 9B, 9C y 9D: Células T CD8 se purificaron de donadores individuales y se cultivaron con células de Drosophila transfectadas con moléculas de HLA-A2, hB7-1 , hB7-2, hlCAM-1 y hLFA-3 en presencia de los péptidos indicados. Después de ser cultivadas seis días se agregaron al cultivo dosis bajas de hlL-2 y se volvieron a estimular con células adherentes autólogas cargadas con péptidos durante siete días más. Después se cosecharon los CTLs y por medio de una prueba estándar de liberación de cromo se probaron las actividades destructoras específicas con células T2 marcadas con 51Cr que se cargaron con los péptidos indicados. Figura 10: La secuencia de aminoácidos de la IgE humana se derivó como se describe en las figuras 6. Los péptidos antigénicos que contienen nueve aminoácidos están subrayados y los péptidos antigénicos que contienen diez aminoácidos se muestran en negrita. Figuras 1 1A y 1 B: Células RMA.S deficientes en TAP 2 (figura 1 B) o células RMA.S transfectadas con Ld (figura 1 A) se incubaron con la concentración indicada de péptidos a 28°C durante la noche y después se incubaron de dos a cuatro horas a 37°C. Las células se cosecharon y se marcaron con mAb específico para Ld (figura 1 1 B) o para Db (figura 1 1A) y se analizaron con FACScan. Figuras 12A y 12B: Células T CD8+ se purificaron de LN de ratones B10.D2 y se cultivaron con células de Drosophila transfectadas con Ld, B7-1 e ICAM-1 en presencia de péptido CD40L.186 (figura 12A) o péptido QL9 (figura 12B). Se agregó al cultivo IL-2 (20 U/ml) los días 3 y 5. El día 7 se midió la actividad de CTL contra células blanco RMAS.Ld marcadas con 51Cr en presencia de los póptidos indicados. Figuras 13A y 13B: Células T CD8+ purificadas de ratones B6 se cultivaron con células de Drosophila transfectadas con Db, B7-1 e ICAM-1 en presencia de péptido lgE.44 (figura 13A) o péptido lgE.366 (figura 13B). Se agregó IL-2 (20 U/ml) al cultivo los días 3 y 5. El día 7 se cosecharon CTL y se midió su actividad específica contra células blanco RMA.S marcadas con 51Cr en presencia de los péptidos indicados. Figuras 14A y 14B: Células T CD4 o CD8 se activaron con anti-CD3 y anti-CD28 enlazados en placa durante cuarenta horas (figura 14A) o durante el tiempo indicado (figura 14B), y se marcaron con el mAb.1 indicado. Figura 15: Se generaron CTL específicos de CD40L como se describe en la figura 2. Células CD4 usadas como blanco se purificaron de ratones de tipo silvestre, CD40L''" o p2m" ", y se activaron con anti-CD3 y anti-CD28 durante cuarenta horas. Figuras 16A y 16B: Se inmunizaron ratones B10.D2 (figura 16A) o B6 (figura 16B) con OVA + CFA y se trataron con Ab o CTL como se indica. Las células de bazo se analizaron para determinar las células B productoras de OVA por medio de manchado de ELISA el día 21 después de la inmunización. Figuras 17A, 17B, 17C, 17D y 17E: Se inmunizaron ratones B10.D2 con OVA + CFA el día 1. Los días 1 , 3, 5 se les administró CTL anti-CD40L o Ab anti-CD40L. Se les extrajo suero el día 14 y se midieron las inmunoglobulínas específicas de OVA por medio de ELISA. Figuras 18A, 18B y 18C: Se purificaron células T CD8 de ratones C57BL/6 y se cultivaron con células de Drosophila transfectadas con Db, B7-1 e ICAM-1 , en presencia de péptido lgE.44 (A), péptido lgE.366 (B) e lgE.125 (C). Los días 3 y 5 se le agregó al cultivo IL-2 (20 unidades/ml). El día 7 se cosecharon CTLs y se determinó su actividad destructora específica contra células blanco RMA.S marcadas con 51Cr en presencia o ausencia de los péptidos indicados. Figura 19: Se purificaron células T CD8 de ratones C57BL/6 (B6), ratones deficientes en perforina (pf _) y ratones deficientes en IFNy (IFNy" '"), y se cultivaron con células de Drosophila transfectadas con D , B7-1 e ICAM-1 en presencia de péptido lgE.44. Los días 3 y 5 se agregó IL-2 (20 unídades/ml) al cultivo. El día 7 se probaron los CTLs y se midió su actividad destructora específica contra células blanco RMA.S marcadas con 51 Cr, en presencia o ausencia de péptido lgE.44. En la figura 19A, la actividad de CTL se midió en presencia o ausencia de 10 9/?t?? de anticuerpo monoclonal anti-Db. Figura 20: Se purificaron células B CD19+ de PBMC de humano y se cultivaron con IL-4 (100 ng/ml) y mAb anti-CD40 (5 mg/ml). Se generaron CTLs anti-lgE como se describe en la figura 9, en presencia de los péptidos de IgE indicados (B) lgE47 y 96, (C) IgE 884 y 890. Los CTLs se agregaron el día 4 al cultivo B y C. El día 6 se recolectó el sobrenadante del cultivo y se midió la IgE humana por medio de ELISA. En el cultivo A no se agregaron CTLs y en el cultivo D no se agregaron células B.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En una modalidad, la presente Invención provee un método de tratamiento de un sujeto con epítopes autoantigénicos no tumorales de células T, que comprende: a. preparar una célula natural presentadora de antígeno (APC) o una línea de células no naturales presentadoras de antígeno (nnAPC), en donde dichas APC o nnAPC son capaces de presentar aproximadamente hasta quince moléculas de péptido diferentes que están asociadas con enfermedades alérgicas o autoinmunes, de preferencia aproximadamente diez moléculas de péptido-epítope diferentes de forma simultánea, en donde cada péptido es de aproximadamente seis a doce aminoácidos de longitud, de preferencia de aproximadamente ocho a diez aminoácidos de longitud, y en una escala de concentración de aproximadamente 10 nM a 100 µ?; b. cosechar células CD8+ de dicho sujeto o un donador adecuado; c. estimular dichas células CD8+ con dicha APC o dicha línea de células nnAPC; agregar dichas células CD8+ a medio que contiene una citocina tal como IL-2, IL-7 o CG , de preferencia IL-2 o IL-2 e IL-7 en combinación; mezclar monocitos no suspendidos de sangre periférica, o alternativamente monocitos de sangre periférica agotados en CD8, recolectados de dicho sujeto o un donador adecuado con aproximadamente 10 a 50 pg/ml de un péptido; irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica con una dosis suficiente de radiación ? necesaria para esterilizar todos los componentes de la suspensión, excepto los monocitos de sangre periférica deseados, por ejemplo una dosis en la escala de aproximadamente 3,000 a 7,000 rad, de preferencia aproximadamente 5,000 rad; aislar monocitos adherentes de sangre periférica; cargar dichos monocitos adherentes de sangre periférica con aproximadamente 10 ng/ml a 10 pg/ml de dicho péptido; combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos adherentes de sangre periférica, en una relación de aproximadamente diez células CD8+ a un monocito de sangre periférica; j. opcionalmente estimular dicha suspensión combinada de células CD8+ y monocitos de sangre periférica durante alrededor de seis a siete días; k. opcionalmente estimular dicha suspensión de células CD8+ y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en un medio; I. opcionalmente determinar la actividad de CTL de la suspensión de CD8+, y opcionalmente determinar la pureza, esterilidad y contenido de endotoxina del CTL; y m. inocular dicha suspensión de CD8+ a dicho sujeto. Otra modalidad de la presente invención provee un método de tratamiento de un sujeto, que comprende: a. preparar una célula natural presentadora de antígeno (APC) o una línea de células no naturales presentadoras de antígeno (nnAPC), en donde dichas APC o nnAPC son capaces de presentar aproximadamente hasta quince moléculas de péptido-epítope diferentes que están asociadas con enfermedades alérgicas o autoinmunes, de preferencia aproximadamente diez péptidos de forma simultánea, en donde cada péptido es de ocho a diez aminoácidos de longitud; b. cosechar células CD8+ de dicho sujeto; c. estimular dichas células CD8+ con dicha APC o dicha línea de células nnAPC durante aproximadamente seis a siete días; estimular dichas células CD8+ con IL-2 e IL-7 en un medio; mezclar monocitos de sangre periférica recolectados de dicho sujeto con aproximadamente 20 pg/ml de cada péptido; irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica agotados en CD8 con aproximadamente 5,000 rad de radiación ?; aislar monocitos adherentes de sangre periférica; cargar dichos monocitos adherentes de sangre periférica con aproximadamente 100 ng/ml de dicho epítope; combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos adherentes de sangre periférica, en una relación de aproximadamente diez células CD8+ a un monocito de sangre periférica; estimular dicha suspensión combinada de células CD8+ y monocitos de sangre periférica durante alrededor de seis a siete días; estimular dicha suspensión de células CD8+ y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en un medio; determinar la actividad, pureza, esterilidad y contenido de endotoxina de CTL de la suspensión de CD8+, y m. inocular dicha suspensión de CD8+ a dicho sujeto. Otra modalidad de la presente invención provee un método de tratamiento de un sujeto con una enfermedad autoinmune que incluye, sin limitación, artritis reumatoide, lupus, soriasis, nefritis autoinmune, esclerosis múltiple, diabetes dependiente de insulina, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de injerto contra hospedero y rechazo de transplante, o enfermedades alérgicas que incluyen, sin limitación, alergia a los alimentos, fiebre del heno, rinitis alérgica, asma alérgica y alergia a veneno; el método comprendiendo: a. preparar una célula natural presentadora de antígeno (APC) o una línea de células no naturales presentadoras de antígeno (nnAPC), en donde dichas APC o nnAPC son capaces de presentar aproximadamente hasta quince moléculas de péptido-epítope diferentes que están asociadas con dichas enfermedades, de preferencia aproximadamente diez péptidos de forma simultánea, en donde cada póptido es de ocho a diez aminoácidos de longitud; b. cosechar células CD8+ de dicho sujeto; c. estimular dichas células CD8+ con dicha APC o dicha línea de células nnAPC durante aproximadamente seis a siete días; d. estimular dichas células CD8+ con IL-2 e IL-7 en un medio; e. mezclar monocitos de sangre periférica recolectados de dicho sujeto con aproximadamente 20 pg/ml de cada péptido que dicha APC o dicha nnAPC pueda presentar; f. irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica agotados en CD8 con aproximadamente 5,000 rad de radiación ?; g. aislar monocitos adherentes de sangre periférica; h. cargar dichos monocitos adherentes de sangre periférica con aproximadamente 100 ng/ml de dicho epltope; i. combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos adherentes de sangre periférica, en una relación de aproximadamente diez células CD8+ a un monocito de sangre periférica; j. estimular dicha suspensión combinada de células CD8+ y monocitos de sangre periférica durante alrededor de seis a siete días; k. estimular dicha suspensión de células CD8+ y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en un medio; I. determinar la actividad, pureza, esterilidad y contenido de endotoxina de CTL de la suspensión de CD8\ y m. inocular dicha suspensión de CD8+ a dicho sujeto. Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento de enfermedades alérgicas o autoinmunes en donde la nnAPC presenta los siguientes péptidos, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 49. Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento de una enfermedad o condición patológica no cancerosa que da como resultado una respuesta inmune insuficiente o inadecuada, que está asociada normalmente con moléculas de HLA de clase I, en donde el tratamiento elimina células infectadas o transformadas y en donde se ha demostrado que dicha eliminación es mediada por CTLs. Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento de una enfermedad o condición patológica no cancerosa que da como resultado una respuesta inmune insuficiente o inadecuada, que está asociada normalmente con moléculas de HLA de clase I, en donde las células infectadas o transformadas que se han mostrado susceptibles a eliminación por CTL, son tratadas por el método que comprende: a. preparar una célula natural presentadora de antígeno (APC) o una línea de células no naturales presentadoras de antígeno (nnAPC), en donde dichas APC o nnAPC son capaces de presentar aproximadamente hasta quince moléculas de péptido diferentes que están asociadas con dicha enfermedad o condición patológica, de preferencia aproximadamente diez moléculas de péptido epítope diferentes de forma simultánea, en donde cada péptido es de aproximadamente seis a doce aminoácidos de longitud de preferencia de aproximadamente ocho a diez aminoácidos de longitud, y en una escala de concentración de aproximadamente 10 nM a 100 µ?; cosechar células CD8+ de dicho sujeto o un donador adecuado; estimular dichas células CD8+ con dicha APC o dicha Knea de células nnAPC; agregar dichas células CD8+ a medio que contiene una citocina tal como IL-2, IL-7 o CGM, de preferencia IL-2 o IL-2 e IL-7 en combinación; mezclar monocitos no suspendidos de sangre periférica, o alternativamente monocitos de sangre periférica agotados en CD8, recolectados de dicho sujeto o un donador adecuado con aproximadamente 10 a 50 pg/ml de un péptido; irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica con una dosis suficiente de radiación ? necesaria para esterilizar todos los componentes de la suspensión, excepto los monocitos de sangre periférica deseados, por ejemplo una dosis en la escala de aproximadamente 3,000 a 7,000 rad, de preferencia aproximadamente 5,000 rad; aislar monocitos adherentes de sangre periférica; cargar dichos monocitos adherentes de sangre periférica con aproximadamente 10 ng/ml a 10 pg/ml de cada péptido; i. combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos adherentes de sangre periférica, en una relación de aproximadamente diez células CD8+ a un monocito de sangre periférica; j. opcionalmente estimular dicha suspensión combinada de células CD8+ y monocitos de sangre periférica durante alrededor de seis a siete días; k. opcionalmente estimular dicha suspensión de células CD8+ y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en un medio; I. opcionalmente determinar la actividad de CTL de la suspensión de CD8+, y opcionalmente determinar la pureza, esterilidad y contenido de endotoxina del CTL; y m. inocular dicha suspensión de CD8+ a dicho sujeto. La presente invención provee una célula no natural presentadora de antígeno (nnAPC) derivada de células de Drosophila melanogaster transfectadas con ADN para su expresión, en donde la nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta quince moléculas de péptido diferentes asociadas con enfermedades alérgicas o autoinmunes, de preferencia diez moléculas de péptido que son codificadas por el ADN. La presente invención provee una célula no natural presentadora de antígeno (nnAPC) derivada de células de Drosophila melanogaster transfectadas con ADN de moléculas de HLA clase I humana, de unión y coestimuladoras para su expresión, en donde la nnAPC es capaz de presentar hasta quince moléculas de péptido diferentes asociadas con enfermedades alérgicas o autoinmunes, de preferencia diez moléculas de péptido que son codificadas por el ADN simultáneamente. Otra modalidad de la presente invención provee una nnAPC que presenta péptidos que están asociados con varias funciones deseadas que mejoran el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, además de los péptidos asociados con la enfermedad o condición patológica a tratar, la nnAPC puede presentar péptidos asociados con moléculas accesorias tales como por ejemplo antígenos con función de linfocito (LFA-1 , LFA-2 y LFA-3), molécula de adhesión intercelular I (ICAM-1 ), factores coestimuladores de células T (CD2, CD28, B7), que aumentan la adhesión de célula a célula o traducen señales adicionales de activación celular. Otra modalidad de la presente invención provee una nnAPC que presenta péptidos que están asociados con enfermedades alérgicas o autoinmunes. Por ejemplo, los péptidos asociados o derivados de IgE pueden ser presentados con péptidos asociados o derivados de un alérgeno, o además en combinación con péptidos CD40L. Otra modalidad de la presente invención provee un método de preparación de una célula no natural presentadora de antígeno (nnAPC) capaz de presentar de forma simultánea hasta diez moléculas de péptido diferentes asociadas con enfermedades alérgicas o autoinmunes, dicho método comprendiendo los pasos de: a. preparar una línea de células de insecto de huevos de Drosophila melanogaster, alternativamente preparar una línea de células de insecto en donde las células se desarrollan durante doce días, seleccionadas con péptidos, de preferencia tetrámeros, que son capaces de identificar las células deseadas, y después expandir dichas células deseadas con OKT3 e IL-2; b. desarrollar dichas células de insecto en un medio que es adecuado para desarrollar células de insecto, de preferencia medio Drosophila de Schneider™; c. hacer un plásmido pRmHa-3 de un vector de expresión pRmHa-1 , en donde dicho plásmido pRmHa-3 incluye un promotor de metalotioneina, secuencias de consenso de respuesta de metal y un gen de alcohol deshidrogenasa que lleva una señal de poliadenilación aislada de Drosophila melanogaster, d. insertar en dicho plásmido pRmHa-3 ADN complementario para A2.1 de HLA humano de clase I, B7.1 , B7.2, ICAM-1 , microglobulina ß-2 y LFA-3, en donde se puede sustituir A2.1 con cualquier secuencia de ADN humana de clase I; e. transfectar dichas células de insecto con un plásmido phshneo y dicho plásmido pRmHa-3 que contiene ADN complementario; f. crear nnAPC poniendo en contacto dichas células de insecto con CuS04 para inducir la expresión de los genes transfectados en dichas células de insecto. Las células presentadoras de antígeno profesionales, tales como las células dendríticas y los macrófagos, pueden ser cargados con péptidos de IgE (Dalyot-Herman y otros (2000), arriba citados) o proteínas recombinantes de IgE (Paglia y otros (1996), arriba citados), o ser traducidos con virus que codifican IgE o fragmentos de IgE (Yang y otros, Cellular Immunology (2000) 204:29-37). Estas células presentadoras de antígeno profesionales modificadas se pueden usar entonces para activar células T CD8 específicas de IgE y generar in vivo CTLs específicos de IgE. Alternativamente, también las células presentadoras de antígeno no profesionales pueden ser transfectadas o traducidas con varios genes que codifican moléculas de coestimulación mas los genes que codifican IgE y un fragmento de IgE. Así, las células presentadoras de antígeno no profesionales modificadas se pueden usar para estimular células T CD8 específicas de IgE para generar CTLs específicos de IgE. Las células de insecto de la presente invención se desarrollan en un medio adecuado para desarrollar insectos, en adelante referido como "medio de desarrollo de insecto". El medio de desarrollo de insecto está disponible comercialmente de varios vendedores tales como el medio Drosophila de Schneider , el medio de insecto de Grace y el medio de insecto TC-100. Alternativamente, el medio de desarrollo de insecto puede ser preparado por una persona con conocimientos medios en la materia. Típicamente, el medio incluirá componentes necesarios para promover y sostener el crecimiento de las células de insecto, tales como sales inorgánicas (por ejemplo cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio y fosfato de sodio), aminoácidos, varios carbohidratos y especies químicas (Imogene Schneider, Exp. Zool. (1964) 156(1 ):91 -104). Alternativamente, el medio también puede incluir vitaminas, minerales y otros componentes que ayudan al desarrollo de las células de insecto. A continuación se da una lista de abreviaciones y definiciones usadas en la presente especificación.

Abreviaciones APC Células presentadoras de antígeno CD8 Células T CD8+ CTL Linfocitos T citotóxicos FAS También conocido como CD95, epítope sobre células T ICAM Molécula de adhesión intercelular IL Interleucina LFA Antígenos con función de linfocito MHC Complejo de histocompatibilidad mayor nnAPC Célula no natural presentadora de antlgeno PBMC Célula mononuclear de sangre periférica PBS Solución salina de fosfato amortiguadora PCR Reacción en cadena de polimerasa RPMI Instituto Roswell Park Memorial RWJPRI Instituto R. W. Johnson Pharmaceutical Research T Blanco TCR Receptor de antígeno de célula T A continuación se da una lista de abreviaciones usadas en la presente especificación para varios epítopes de péptido. Los residuos de aminoácido individuales están identificados de acuerdo con el código de una sola letra que es muy conocido y usado por los expertos en la materia.

Aminoácido Abreviaciones 3 Letras 1 Letra alanina ala A valina val V leucina leu L isoleucina ile I prolina pro P fenilalanina phe F triptófano tyr W metionina met M glicina giy G serina ser S treonina thr T cisteina cys C tirosina tyr Y asparagina asn N glutamina gln Q ácido aspártico asp D ácido glutámico glu E lisina lys K arginina arg R histidina his H Abreviaciones de péptido epítope Como se usa aquí, el término IgE 1 1 se refiere a la secuencia de aminoácidos KPCKGTASM (SEQ ID NO: 1 ). Como se usa aquí, el término IgE 209 se refiere a la secuencia de aminoácidos IPPSPLDLY (SEQ ID NO: 2). Como se usa aquí, el término IgE 366 se refiere a la secuencia de aminoácidos GSNQGFFIF (SEQ ID NO: 3). Como se usa aquí, el término IgE 29 se refiere a la secuencia de aminoácidos FPNPVTVTW (SEQ ID NO: 4).

Como se usa aquí, el término IgE 105 se refiere a la secuencia de aminoácidos HSSCDPNAF (SEQ ID NO: 5). Como se usa aquí, el término IgE 1 14 se refiere a la secuencia de aminoácidos HSTIQLYCF (SEQ ID NO: 6). Como se usa aquí, el término IgE 363 se refiere a la secuencia de aminoácidos KSNGSNQGF (SEQ ID NO: 7). Como se usa aquí, el término IgE 307 se refiere a la secuencia de aminoácidos RSAPEVYVF (SEQ ID NO: 8). Como se usa aquí, el término IgE 44 se refiere a la secuencia de aminoácidos MSTVNFPAL (SEQ ID NO: 9). Como se usa aquí, el término IgE 41 1 se refiere a la secuencia de aminoácidos TSLGNTSLR (SEQ ID NO: 10). Como se usa aquí, el término IgE 16 se refiere a la secuencia de aminoácidos TASMTLGCL (SEQ ID NO: 1 1 ). Como se usa aquí, el término IgE 159 se refiere a la secuencia de aminoácidos de ASTCSKLNI (SEQ ID NO: 12). Como se usa aquí, el término IgE 125 se refiere a la secuencia de aminoácidos de GHILNDVSV (SEQ ID NO: 13). Como se usa aquí, el término CD40L 17 se refiere a la secuencia de aminoácidos LPASMKIFM (SEQ ID NO: 15). Como se usa aquí, el término CD40L 186 se refiere a la secuencia de aminoácidos RPFIVGLWL (SEQ ID NO: 16). Como se usa aquí, el término CD40L 1 18 se refiere a la secuencia de aminoácidos DPQIAAH V (SEQ ID NO: 17). Como se usa aquí, el término CD40L 220 se refiere a la secuencia de aminoácidos QSVHLGGVF (SEQ ID NO: 18). Como se usa aquí, el término CD40L 9 se refiere a la secuencia de aminoácidos SP SVATGL (SEQ ID NO: 19). Como se usa aquí, el término CD40L 195 se refiere a la secuencia de aminoácidos KPSIGSERI (SEQ ID NO: 20). Como se usa aquí, el término CD40L 252 se refiere a la secuencia de aminoácidos FSSFGLLKL (SEQ ID NO: 21 ). Como se usa aquí, el término CD40L 7 se refiere a la secuencia de aminoácidos QPSPRSVAT (SEQ ID NO: 22). Como se usa aquí, el término CD40L 181 se refiere a la secuencia de aminoácidos EPSSQRPFI (SEQ ID NO: 23). Como se usa aquí, el término CD40L 79 se refiere a la secuencia de aminoácidos LSLLNCEEM (SEQ ID NO: 24). Como se usa aquí, el término CD40L 152 se refiere a la secuencia de aminoácidos de VMLENGKQL (SEQ ID NO: 25). Como se usa aquí, el término CD40L 146 se refiere a la secuencia de aminoácidos de TMKSNLVML (SEQ ID NO: 26). Como se usa aquí, el término CD40L 235 se refiere a la secuencia de aminoácidos de SVFVNVTEA (SEQ ID NO: 27). Como se usa aquí, el término CD40L 38 se refiere a la secuencia de aminoácidos de GSVLFAVYL (SEQ ID NO: 28).

Como se usa aquí, el término CD40L 19 se refiere a la secuencia de aminoácidos de ASMKIFMYL (SEQ ID NO: 29). Como se usa aquí, el término CD40L 24 se refiere a la secuencia de aminoácidos FMYLLTVFL (SEQ ID NO: 30). Como se usa aquí, el término CD40L 167 se refiere a la secuencia de aminoácidos GLYYIYAQV (SEQ ID NO: 31 ). Como se usa aquí, el término CD40L 22 se refiere a la secuencia de aminoácidos KIFMYLLTV (SEQ ID NO: 32). Como se usa aquí, el término CD40L 36 se refiere a la secuencia de aminoácidos MIGSALFAV (SEQ ID NO: 33). Como se usa aquí, el término CD40L 58 se refiere a la secuencia de aminoácidos NLHEDFVFM (SEQ ID NO: 34). Como se usa aquí, el término CD40L 1 70 se refiere a la secuencia de aminoácidos YIYAQVTFC (SEQ ID NO: 35). Como se usa aquí, el término CD40L 26 se refiere a la secuencia de aminoácidos YLLTVFLIT (SEQ ID NO: 36). Como se usa aquí, el término CD40L 231 se refiere a la secuencia de aminoácidos LQPGASVFV (SEQ ID NO: 37). Como se usa aquí, el término CD40L 45 se refiere a la secuencia de aminoácidos YLHRRLDKI (SEQ ID NO: 38). Como se usa aquí, el término CD40L 147 se refiere a la secuencia de aminoácidos TMSNNLVTL (SEQ ID NO: 39). Como se usa aquí, el término CD40L 229 se refiere a la secuencia de aminoácidos de FELQPGASV (SEQ ID NO: 40). Como se usa aquí, el término CD40L 160 se refiere a la secuencia de aminoácidos de QLTVKRQGL (SEQ ID NO: 41 ). Como se usa aquí, el término CD40L 35 se refiere a la secuencia de aminoácidos de QMIGSALFA (SEQ ID NO: 42). Como se usa aquí, el término CD40L 185 se refiere a la secuencia de aminoácidos de SQAPFIASL (SEQ ID NO: 43). Como se usa aquí, el término CD40L 19 se refiere a la secuencia de aminoácidos de ISMKIFMYL (SEQ ID NO: 44). Como se usa aquí, el término CD40L 153 se refiere a la secuencia de aminoácidos de VTLENGKQL (SEQ ID NO: 45). Como se usa aquí, el término CD40L 126 se refiere a la secuencia de aminoácidos de VISEASSKT (SEQ ID NO: 46). Como se usa aquí, el término CD40L 227 se refiere a la secuencia de aminoácidos de GVFELQPGA (SEQ ID NO: 47). Como se usa aquí, el término CD40L 20 se refiere a la secuencia de aminoácidos de SMKIFMYLL (SEQ ID NO: 48). Como se usa aquí, el término CD40L 165 se refiere a la secuencia de aminoácidos de RQGLYYIYA (SEQ ID NO: 49). Como se usa aquí, el término IgE 47 se refiere a la secuencia de aminoácidos de SLNGTTMTL (SEQ ID NO: 50). Como se usa aquí, el término IgE 96 se refiere a la secuencia de aminoácidos de WVDNKTFSV (SEQ ID NO: 51 ).

Como se usa aquí, el término IgE 185 se refiere a la secuencia de aminoácidos de WLSDRTYTC (SEQ ID NO: 52). Como se usa aquí, el término IgE 309 se refiere a la secuencia de aminoácidos de ALSDRTYTC (SEQ ID NO: 53). Como se usa aquí, el término IgE 876 se refiere a la secuencia de aminoácidos de SLLTVSGAWA (SEQ ID NO: 54). Como se usa aquí, el término IgE 883 se refiere a la secuencia de aminoácidos de WLEDGQVMDV (SEQ ID NO: 55). Como se usa aquí, el término IgE 884 se refiere a la secuencia de aminoácidos de TLTVTSTLPV (SEQ ID NO: 56). Como se usa aquí, el término IgE 887 se refiere a la secuencia de aminoácidos de QMFTCRVAHT (SEQ ID NO: 57). Como se usa aquí, el término IgE 890 se refiere a la secuencia de aminoácidos de YATISLLTV (SEQ ID NO: 58). Como se usa aquí, el término IgE 895 se refiere a la secuencia de aminoácidos de TLACLIQNFM (SEQ ID NO: 59). Como se usa aquí, el término IgE 898 se refiere a la secuencia de aminoácidos de QVMDVDLSTA (SEQ ID NO: 60).

Términos y Definiciones Como se usa aquí, el término "inmunoterapia adoptiva" se refiere a la administración de linfocitos T de donador o autólogos para el tratamiento de una enfermedad o condición patológica, en donde la enfermedad o condición patológica da como resultado una respuesta inmune insuficiente o inadecuada que está asociada normalmente con moléculas de HLA de clase I. La inmunoterapia adoptiva es un tratamiento apropiado para cualquier enfermedad o condición patológica en donde se haya mostrado eliminación de células infectadas o transformadas por medio de CTLs. Por ejemplo, la enfermedad o condición patológica incluye sin limitación cáncer o tumores, tales como melanoma, cáncer de próstata, de mama, colorrectal, del estómago, de garganta y cuello, pancreático, cervical, ovárico, de hueso, leucemia, y de pulmón; infecciones virales tales como hepatitis B, hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana; e infecciones bacterianas como malaria, tuberculosis y monocitogénesis de listeria. Como se usa aquí, el término "B7.1 " se refiere a una molécula coestimuladora asociada con células presentadoras de antígeno. Como se usa aquí, el término "BCNU" se refiere a carmustina, también conocida como 1 ,3-bis-(2-cloroetil)-1-nitrosourea. Como se usa aquí, el término "BSE" se refiere a encefalitis espongiforme de bovino. Como se usa aquí, el término "CD" se refiere a racimos de diferenciación, linfocitos T (originalmente), linfocitos B, monocitos, macrófagos y granulocitos agrupados por epítopes de antígeno y función. Como se usa aquí, el término "DTIC" se refiere a dicarbazina, 5-(3,3-dimetil-1 -triazeno)-imidazol-4-carboxamida. Como se usa aquí, el término "ex vivo" o "terapia ex vivo" se refiere a una terapia en donde se obtienen materiales biológicos, típicamente células, de un paciente o una fuente alternativa adecuada, por ejemplo un donador adecuado, y son modificados de tal manera que las células modificadas se pueden usar para tratar una condición patológica que será mejorada mediante el suministro a largo plazo o constante del beneficio terapéutico producido por las células modificadas. El tratamiento incluye la reintroducción al paciente de los materiales biológicos modificados, obtenidos del paciente o de la fuente alternativa. Un beneficio de la terapia ex vivo es la capacidad de proveer al paciente el beneficio del tratamiento sin exponerlo a efectos colaterales indeseados del tratamiento. Por ejemplo, frecuentemente se administran citocinas a pacientes con cáncer o infecciones virales para estimular la expansión de los CTLs del paciente. Sin embargo, las citocinas frecuentemente ocasionan en los pacientes la aparición de síntomas semejantes a resfriado. En un procedimiento ex vivo, las citocinas son utilizadas para estimular la expansión de CTLs fuera del cuerpo del paciente, evitando su exposición y los efectos secundarios consecuentes de las citocinas. Alternativamente, bajo situaciones o condiciones adecuadas, en donde sea apropiado y en donde el sujeto pueda derivar el beneficio, el sujeto puede ser tratado concurrentemente con un nivel de dosificación bajo de -interferón. Como se usa aquí, el término "HEPES" se refiere a una solución amortiguadora de ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico. Como se usa aquí, el término "HLA-A2.1 " se refiere a una molécula de HLA de clase I encontrada en aproximadamente 45% de los caucásicos. Como se usa aquí, el término "MPC-10" se refiere a un concentrador de partículas magnéticas. Como se usa aquí, el término "células NK" se refiere a células asesinas naturales. Como se usa aquí, el término ???3" se refiere a ORTHOCLONE OKT3, anticuerpo monoclonal anti-CD3, muromonab-CD3. Como se usa aquí, el término "TAP-1 , 2" se refiere al transportador asociado con procesador de antígeno 1 , 2. Como se usa aquí, el término "células Th" se refiere a células T auxiliares, CD4+. Como se usa aquí, el término "lectina C" se refiere a un péptido de la secuencia que se ha encontrado asociada con cáncer ovárico. Como se usa aquí, el término "complejo de histocompatibilidad mayor" o "MHC" es una designación genérica que abarca los sistemas de antígeno de histocompatibilidad descritos en diferentes especies incluyendo los antígenos de leucocito humanos (HLA). Como se usan aquí, los términos "epítope", "péptido epítope", "péptido antigénico" y "péptido inmunogénico" se refieren a un péptido derivado de un antígeno capaz de ocasionar una respuesta inmune celular en un mamífero. Estos péptidos también pueden ser reactivos con anticuerpos de un animal inmunizado con los péptidos. Estos péptidos pueden ser de aproximadamente cinco a veinte aminoácidos de longitud, de preferencia de aproximadamente ocho a quince aminoácidos de longitud, y muy de preferencia de aproximadamente nueve a diez aminoácidos de longitud. Como se usa aquí, el término "análogo" incluye cualquier polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácido sustancialmente idéntica a la secuencia de polipéptido de la presente invención, en el cual uno o más residuos han sido sustituidos conservativamente con un residuo funcionalmente similar, y que exhibe los aspectos funcionales de la presente invención como aquí se describe. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen las sustituciones de un residuo no polar (hidrofóbico) por otro, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina; la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro, por ejemplo entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina; la sustitución de un residuo básico por otro, tal como lisina, arginina o histidina; o la sustitución de un residuo ácido por otro, tal como ácido aspártico o ácido glutámico. Como se usa aquí, el término "sustitución conservativa" también incluye el uso de un residuo derivado químicamente en lugar de un residuo no derivado. Como se usa aquí, el término "derivado químico" se refiere a un polipéptido sujeto que tiene uno o más residuos derivados químicamente por reacción de un grupo secundario funcional. Ejemplos de tales moléculas derivadas incluyen por ejemplo aquellas moléculas en las cuales los grupos amino libres se han derivado para formar clorhidratos de amina, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres se pueden derivar para formar sales, esteres metílico y etílico u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres se pueden convertir a derivados O-acilo o O-alquilo. El nitrógeno del imidazol de la histidina se puede derivar para formar N-im-bencilhistidina. También se incluyen como derivados químicos las proteínas o péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos normales. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede sustituir a prolina; 5-hidroxilisina puede sustituir a lisina; 3-metilhistidina puede sustituir á histidina; homoserina puede sustituir a serina; y ornitina puede sustituir a lisina. Las proteínas o polipéptídos de la presente invención también incluyen cualquier polipéptido que tiene una o más adiciones o supresiones o residuos con respecto a la secuencia de un polipéptido cuya secuencia es codificada por la secuencia nucleica correspondiente de la presente invención, siempre que se mantenga la actividad requerida. Las células T citolíticas (CD8+) son la línea principal de defensa contra infecciones virales. Los linfocitos CD8+ reconocen y destruyen específicamente células hospederas que están infectadas por un virus. Teóricamente, debe ser posible aprovechar el sistema inmune para combatir otros tipos de enfermedades incluido el cáncer. Sin embargo, han estado disponibles pocos procedimientos in vivo/ex vivo para activar específicamente los CTLs. La identificación de los antígenos alérgicos o autoinmunes claves que se indican en la presente, y un método para la activación específica in vitro de CTLs que se describe más abajo, permiten ahora probar el concepto de inmunoterapia adoptiva de enfermedades alérgicas o autoinmunes. Todas las células T intactas requieren dos señales de activación para provocar una respuesta inmune. Para linfocitos CD8+ (CTLs), la primera señal, que imparte especificidad, consiste de la presentación a la célula CD8+ de un fragmento de péptido inmunogénico (epítope) del antígeno enlazado al complejo MHC de clase I (HLA) presente sobre la superficie de células presentadoras de antígeno (APCs). Este complejo es reconocido específicamente por un receptor de antígeno de células T (TCR), que comunica la señal intracelularmente. La unión al receptor de células T es necesaria pero no suficiente para inducir la activación de células T, y usualmente no conducirá a proliferación celular ni a secreción de citocina. La activación completa requiere una segunda señal o señales coestimuladoras; estas señales sirven para realzar más la cascada de activación. Entre las moléculas coestimuladoras sobre las células presentadoras de antígeno, las B7 y las moléculas de adhesión celular (integrinas) tales como ICAM-1 ayudan en este proceso uniéndose a CD28 y LFA-1 , respectivamente, sobre la célula T. Cuando una célula CD8+ interacciona con una célula presentadora de antígeno que lleva un péptido inmunogénico (epítope) enlazado por una molécula de MHC de clase I en presencia de interacciones de moléculas coestimuladoras apropiadas, la célula CD8+ se convierte en una célula T citolítica completamente activada. La destrucción de células mediada por linfocitos involucra una secuencia de eventos biológicos que comienza con la unión del CTL de CD8+ a una célula blanco que lleva antígeno (tumor) por medio del proceso de reconocimiento arriba descrito para la activación de células T. La interacción comienza con la unión del antígeno en asociación con una molécula de MHC de clase I sobre la APC o célula blanco, al receptor de antígeno de células T (TCR). Moléculas accesorias tales como antígenos de función de linfocito (LFA-1 , LFA-2 y LFA-3), molécula de adhesión intercelular I (ICAM-I), factores coestimuladores de células T (CD2, CD28, B7), realzan la adhesión célula-célula o traducen señales adicionales de activación celular. Después de la interacción célula-célula, los CTL destruyen la célula blanco por medio de la acción de mediadores citolíticos solubles (perforina y granzimas almacenadas en gránulos citoplásmicos en la célula T) y una molécula de superficie CTL (ligando de FAS). Después del ataque citolítico, las células blanco mueren por necrosis (perforación de membrana y destrucción de organelos) o apoptosis (condensación de cromatina, fragmentación de ADN y formación de vejigas en la membrana). Los mecanismos de citólisis mediada por linfocitos se representan gráficamente en la figura 2. En la figura 2A, después de la unión a la célula blanco, los gránulos citoplásmicos en el CTL son reorientados rápidamente hacia la célula blanco para la liberación de gránulos que contienen perforina y granzimas al espacio intercelular. Estas enzimas proteolíticas forman poros en la membrana plasmática de la célula blanco conduciendo finalmente a necrosis de la célula. En la figura 2B, después de la unión a la célula blanco aumenta el nivel de expresión de FAS sobre el CTL. La interacción de FAS y el receptor de FAS sobre la célula blanco conduce a apoptosis. Se han Implicado proteasas tales como CPP32 y otras relacionadas con la enzima convertidora de IL-1 b (ICE) en la inducción de apoptosis. Es posible usar células naturales presentadoras de antígeno para la activación in vitro de CD8+, por ejemplo células dendríticas, macrófagos, células de tumor autólogas. Sin embargo, es baja la eficiencia de activación siguiendo este enfoque. Esto se debe a que las moléculas de clase I de APCs nativas contienen muchos otros tipos de epítopes de péptido además de epítopes de tumor. La mayoría de los péptidos derivan de proteínas celulares inocuas normales dando como resultado una dilución del número de APCs nativas activas que realmente serian efectivas contra un tumor (Allison y otros, Curr. Op. Immunol. (1995) 7:682-686). Un enfoque más directo y eficiente a este problema es activar específicamente células CD8+ solo con aquellos epítopes relevantes para combatir una enfermedad específica (tal como una enfermedad alérgica o autoinmune). Para este fin, se crea una célula presentadora de antígeno artificial expresando las moléculas de MHC de clase I en células de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). Puesto que la Drosophila no tiene un sistema inmune, los transportadores de péptido TAP-1 ,2 involucrados en cargar epítopes de péptido sobre las moléculas de clase I están ausentes. Como resultado, las moléculas de clase I aparecen sobre la superficie de la célula de Drosophila como recipientes vacíos. Incubando estas células de Drosophila transfectadas con péptidos exógenos que se unen a las moléculas de clase I , tales como epítopes específicos de cáncer o tumor, que incluyen sin limitación epítopes específicos de melanoma, es posible ocupar cada molécula de clase I con el mismo péptido. La expresión en alta densidad de las moléculas de clase I que contienen un solo péptido en estas APCs de Drosophila, permite la generación in vitro de células T CD8+ citotóxicas, que son completamente específicas para el péptido del antígeno. Se enseñan métodos y procedimientos para preparar células de Drosophila en la patente de E.U.A. No. 5,529,921 , expedida el 25 de junio de 1996, titulada "In Vitro Activation of Cytotoxic T-Cells Using Insect Cells Expressing Human Class I MHC and p2-Microglobulin", y la patente de E.U.A. No. 5,314,813, expedida el 24 de mayo de 1994, titulada "Drosophila Cell Lines Expressing Genes Encoding MHC Class I Antigens And p2-M¡croglobulin and Capable of Assembling Empty Complexes and Methods of Making Said Cell Lines". En particular, la patente de E.U.A. No. 5,529,921 describe en la columna 26, renglón 56, a la columna 28, renglón 22, varios métodos para separar o enriquecer cultivos de células precursoras. Adicionalmente, esta característica elimina la necesidad de estimulación in vivo del sistema inmune con varias citocinas. Así, se obtiene como resultado un tratamiento que evita los efectos secundarios causados por las citocinas. Alternativamente, bajo situaciones o condiciones adecuadas, en donde sea apropiado y en donde el sujeto pueda derivar un beneficio, el sujeto puede ser tratado concurrentemente con un nivel de dosificación bajo de -interferón. Eliminando la necesidad de estimulación in vivo con citocinas mejora la calidad del cuidado del paciente. Con frecuencia los regímenes de tratamiento que incluyen la administración de citocinas a pacientes dan como resultado el desarrollo de síntomas similares al resfriado, tales como náusea, vómito y fiebre. Estas reacciones secundarias por lo general no amenazan la vida, aunque si ocurriera una reacción particularmente severa en un paciente que ya está en una condición debilitada, podría presentarse una situación que pone en riesgo su vida. Otra consideración es el impacto adverso que tales reacciones secundarias tienen sobre la aceptación y cumplimiento del paciente de un régimen de tratamiento por lo demás benéfico. Eliminando la necesidad de estimulación in vivo con citocinas se obtiene un régimen de tratamiento que mejora la comodidad del paciente y provee al clínico de un método eficaz de tratamiento con mayor probabilidad de que sea cumplido por su paciente. La utilidad de este método para inmunoterapia adoptiva se ha demostrado en ratones usando células de Drosophila transfectadas como APCs y células CD8* de la línea 2C de ratones transgénicos del receptor de células T (TCR). En este sistema, células CD8+ 2C puras son altamente sensibles a péptidos in vitro presentados por células de Drosophila transfectadas con MHC clase I (Ld) que también llevan las moléculas coestimuladoras B7-1 e ICAM-1. Células de Drosophila transfectadas como una sonda para definir los requerimientos mínimos para estimular células T CD8+ no activadas (Caí y otros, P.N.A.S. USA (1996) 93:14736-14741 ). Alternativamente, cuando se usan células de bazo de ratón no separadas como respondedores en lugar de células 2C puras, la necesidad de moléculas coestimuladoras no se aplica. En este caso, las células CD8+ en la población del bazo reciben coestimulación "espectadora" de células B activadas. Utilizando este hallazgo ha sido posible mostrar que las células de Drosophila transfectadas con MHC clase I (Ld), son capaces de provocar que las células de bazo de ratón DBA/2 respondan a péptidos singeneicos específicos de tumor de mastocitoma P815 in vitro, en ausencia de linfocinas añadidas. La inyección de estos CTLs en ratones DBA/2 que llevan mastocitoma P815 produce una rápida regresión de tumor (Sun y otros, Immunity (1996) 4:555-564). El uso de cualquier sistema de células presentadoras de antígeno (APC), naturales o artificiales, para generar in vitro linfocitos T citotóxicos, está limitado por las especificidades de antígeno que estos sistemas son capaces de generar. Se han utilizado los siguientes sistemas de APC para generar CTLs específicos de antígeno para epítopes solos: 1 . Células dendríticas humanas (DC) pulsadas con péptidos definidos; 2. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) que han sido inducidas a linfoblastos y pulsadas con póptidos; 3. Líneas de células linfoblastoides (LCL) en donde los péptidos naturales son removidos con ácido y se cargan los péptidos de interés; 4. Células de Drosophila diseñadas para expresar moléculas de clase I vacías; y células 3T3 de ratón transfectadas con moléculas de clase I y coestimuladoras de humano (J-B. Latouche y M. Sadelain, Nature Biotech (2000) 18:405- 409). Las células dendríticas (DCs) son consideradas el principal sistema de células presentadoras de antígeno en humanos debido a su amplia aplicación en la presentación de células de antígeno primario. Proteínas propias o ajenas son procesadas dentro de una DC. Los epítopes de péptido resultantes son presentados por moléculas de HLA y son transportados a la superficie de la DC. Sin embargo, se encontró que las DCs no generan consistentemente in vitro CTLs dirigidos contra cuatro póptidos diferentes. Esto ha provisto CTLs que tienen actividad correspondiente para cada uno de los cuatro péptidos. Además, también se encontró que el fenotipo de la DC en el momento de la pulsación con péptido, maduro o inmaduro, no produce el resultado. Alternativamente, la estimulación de células de Drosophila usualmente dio como resultado CTLs dirigidos contra hasta diez tipos diferentes de péptidos. Esto provee CTLs que son activos para cada uno de los diez péptidos. La capacidad de las células de Drosophila y DCs para provocar respuestas de CTL se evaluó inicialmente para un solo péptido epítope siguiendo los protocolos estándares de estimulación para cada una, para comparar DCs y células de Drosophila transfectadas. Se generaron DCs inmaduras cultivando durante una semana monocitos autólogos en presencia de IL-4 y GM-CSF. Se obtuvieron DCs maduras de DCs inmaduras por adición de TNF al medio de cultivo veinticuatro horas antes de recolección. Se recolectaron DCs (inmaduras y maduras), se pulsaron con péptidos y se mezclaron con células CD8 puras siguiendo el procedimiento usado para la estimulación de células CD8 y células de Drosophila pulsadas con péptido. Se encontró que las células de Drosophila son generalmente mejores estimuladores que las DCs. Además, las DCs que exhibieron el fenotipo ya sea inmaduro o maduro no fueron tan eficientes como las células de Drosophila para provocar respuestas especificas de CTL cuando se usaron péptidos definidos para pulsar las APCs. Esto es particularmente sorprendente debido a la función dominante realizada por las DCs en el sistema inmune.

Preparación de linfocitos citotóxicos Células CD8+ aisladas de muestras de leucoféresis por selección positiva con anticuerpo anti-CD8 se estimulan contra péptidos asociados con IgE o CD40L presentados por células de Drosophila que expresan moléculas de clase I humanas (HLA-A2.1 ), B7.1 , ICAM-1 , LFA-3 y B7.2. Las células CD8+ se reestimulan dos rondas con monocitos autólogos cargados con el péptido epítope en presencia de IL-2 e IL-7. Los CTLs se expanden no específicamente con OKT3 e IL-2. La actividad de CTL se mide contra células y la pureza de las células T CD8+ se determina por citometrta de flujo. Los procedimientos de fabricación y los protocolos se hicieron de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio y las Buenas Prácticas de Fabricación. Las "Buenas Prácticas de Laboratorio" y las "Buenas Prácticas de Fabricación" son normas de las prácticas de laboratorio y de fabricación que son dictadas por la Administración de Fármacos y Alimentos de E.U.A., y son muy conocidas para el experto en la materia. Se monitoreó la identidad, viabilidad, actividad, esterilidad y contenido de endotoxina de los CTLs. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar mas no limitar la presente invención.

EJEMPLO 1 Fabricación de células presentadoras de antígeno de Drosophila La línea celular S2 de Schneider se preparó de huevos de Drosophila melanogaster (Oregon-R) de acuerdo con los procedimientos publicados, y se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (CRL 10974). Las células S2 se desarrollan en medio comercial de Drosophila de Schneider complementado con suero fetal de bovino al 10%. El vector plasmídico pRmHa-3 para expresar proteínas de MHC clase I y proteínas coestimuladoras en las células S2 se derivó del vector de expresión pRmHa-1 construido como se describe en la literatura. Contiene un promotor de metalotioneina, secuencias de consenso de respuesta de metal y un gen de alcohol deshidrogenasa que lleva una señal de poliadenilación aislada de Drosophila melanogaster.

Los ADNs complementarios para transfección se prepararon como sigue: HLA-A2.1 y p2-microglobulina: Transcripción inversa-PCR partiendo de células K562 usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. B7.1 : Transcripción inversa-PCR partiendo de células K562 usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. ICAM-1 : Transcripción inversa-PCR partiendo de células K562 usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. B7.2: Transcripción inversa-PCR partiendo de células HL-60 (ATCC CCL-240) usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. LFA-3: Transcripción inversa-PCR partiendo de células HL-60 (ATCC CCL-240) usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. Se insertaron individualmente ADNs complementarios en el vector pRmHa-3. Las células S2 se transfectaron con una mezcla de ADNs plasmldicos de HLA-A2.1 , B7.1 e ICAM-1 y el plásmido phshneo usando el método de precipitación con fosfato de calcio. Las células transfectadas establemente se seleccionaron cultivando en medio de Schneider que contenía geneticina. Veinticuatro horas antes de usar se indujo la expresión de los genes transfectados por adición de CuSCv El nivel de expresión se determinó por citometría de flujo usando anticuerpos anti-HLA-A2.1 , anti-B7.1 y anti-ICA -1 . Para una activación in vitro eficiente de linfocitos CD8+ es necesaria una expresión de HLA de las células mayor de 30%.

Aislamiento de células CD8* humanas Se aislaron células CD8+ de muestras de leucofóresis por selección positiva usando el procedimiento de aislamiento Dynabeads™ (Dynal). Se agregó un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD8 humano (50 pg/ml en gammaglobulina humana [Gammagard®]) a las células lavadas en PBS de Dulbecco complementado con seroalbúmina humana al 1 % (Baxter-Hyland) y citrato Na al 0.2%. Después de incubación a 4°C durante cuarenta y cinco minutos con mezclado suave, las células se lavaron y se resuspendieron en el mismo amortiguador conteniendo esferas magnéticas Dynal (Dynabeads™) recubiertas con anti-lgG de ratón de cabra, a una relación de esfera a célula de 1 :1 . Las células y esferas se colocaron en un tubo estéril y se mezclaron suavemente cuarenta y cinco minutos a 4°C. Al final de este tiempo, las células enlazadas a anticuerpo se removieron magnéticamente usando el separador MPC-1® de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Dynal). La disociación del complejo célula CD8-esfera se logra por incubación a 37°C durante cuarenta y cinco minutos en presencia de péptido59.70 de CD8 (AAEGLDTQRFSG, SEQ. ID. NO: 52). Las esferas libres se removieron magnéticamente y las células CD8 se contaron y se analizaron por citometría de flujo para evaluar su pureza. La recuperación de células CD8+ es regularmente mayor del 80%. El cuadro 1 resume la composición de células de catorce preparaciones de CD8+ separadas de preparaciones de PBMC humanas por selección positiva con anticuerpo anti-CD8.

CUADRO 1 Purificación de células CD8* por selección positiva analizadas por citometría de flujo Tipo de célula PBMC Selección positiva % medio (Escala) % medio ÍEscala) Células T CD8 15% (7-24) 82% (56-95) Células T CD4 36% (14-52) 2% (0.1 -10) Monocitos CD14 15% (7-26) 0.8% (0.2-2) Neutrófilos CD15 12% (8-21 ) 0.6% (0.1 -3) Células B CD19 2% (0.4-7) 3% (0.5-9) Células NK CD56 6% (2-17) 6% (0.1 -20) Inmunización in vitro de células CD8+ humanas puras Estimulación primaria: Células de Drosophila S2 transfectadas se incuban en medio de Schneider (106 células/ml) complementado con suero fetal de becerro al 10% y CuS04 a 27°C durante veinticuatro horas. Las células se recolectan, se lavan y se resuspenden en medio X-press de insecto (BioWhittaker) que contiene 100 pg/ml de tirosinasa369-377 humana (RWJPRI). Después de incubación a 27°C durante tres horas, las células S2 se mezclan con células CD8+ a una relación de 1 : 10 en medio RPMI (Gibco) complementado con suero autólogo al 10%. La mezcla celular se incuba a 37°C por cuatro días, durante los cuales mueren las células de Drosophila. El día 5 se le agrega IL-2 (20 U/ml) e IL-7 (30 U/ml) con un cambio de medio para expandir selectivamente la población de CTLs específicos de tirosinasa.

Reestimulación: PB Cs agotadas en CD8 autólogas, congeladas, obtenidas en el momento de la leucoféresis, se descongelan, se lavan y se vuelven a suspender a 106 células/ml en medio RPMI que contiene suero autólogo al 10% (como una fuente de microglobulina ß2) y 20 pg/ml de péptido epítope. Después de irradiación ? (5,000 rad), las células se incuban a 37°C durante dos horas. Las células no adherentes se retiran lavando con PBS de Dulbecco. Se cargan monocitos adherentes con el epítope de tirosinasa por incubación de 90 minutos en medio amortiguador Hepes-RPMI conteniendo suero autólogo al 10% y 10 pg/ml de péptido epítope. El sobrenadante se retira y se agrega la suspensión de células CD8+ activadas de Drosophila (3 x 106 células/ml en medio RPMI con suero autólogo al 10%), a una relación de diez células CD8+ a un monocito adherente. Después de tres a cuatro días de cultivo a 37°C, se le agrega IL-2 (20 U/ml) e IL-7 (30 U/ml) con un cambio de medio para expandir selectivamente la población de CTLs específica de epítope. Expansión no específica: CD8+s se expanden no específicamente y se cultivan en medio RPMI complementado con suero autólogo, anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT®3), IL-2 y PBMCs autólogas irradiadas con rayos ?.

Pruebas de actividad v pureza Prueba de CTLs: Se usan células que llevan epítope (blanco) como células blanco en una prueba de liberación de 1Cr. Se marcan 5 x 106 células en medio RPMI conteniendo suero fetal de becerro al 4%, amortiguador HEPES al 1 % y gentamicina al 0.25%, a 37°C durante una hora con 0.1 mC¡ de 51Cr. Las células se lavan cuatro veces y se diluyen hasta 05 células/ml en RPMI con suero fetal de bovino al 10% (HyClone). En una placa de microtltulo de 96 cavidades, se combinan 100 µ? de CTLs efectores y 100 µ? de células blanco marcadas con 51Cr, cargadas con péptido, a relaciones de 100:1 , 20:1 y 4.1 (efector : blanco). Se agregan células K562 a una relación de 20: 1 (K562) para reducir la lisis basal natural de las células asesinas. La lisis no específica se determina usando células marcadas con 51Cr como se describe arriba, pero que no llevan el epítope de la línea celular. Se incluyen por duplicado controles para medir la liberación espontánea y la liberación máxima de 51Cr. Después de incubación a 37°C durante seis horas, las placas se centrifugan y los sobrenadantes se cuentan para medir la liberación de 5 Cr.

El porcentaje de lisis específica se calcula usando la siguiente ecuación: cpm muestra - cpm liberación espontánea x 100 cpm liberación máxima - cpm liberación espontánea Citometría de flujo: Las células CD8+ se analizaron antes y después de la activación in vitro para determinar el número de marcadores de superficie celular usando anticuerpos monocionales fluorescentes y análisis FACS. En el cuadro 2 se muestran los resultados de un protocolo típico de activación usando células de un donador sano.

CUADRO 2 Análisis de citometría de flujo de células CD8+ activadas in vitro Además de la actividad y pureza, se probó la esterilidad y el contenido de endotoxina de las preparaciones de CTL.

Cuadro A Reactivos Cuadro B Líneas celulares ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo EJEMPLO 1 Prueba de instilación de células T citotóxicas contra células productoras de IgE Propósito de la prueba Este ejemplo enseña la efectividad de instilación de células T citotóxicas en el tratamiento de enfermedades alérgicas, determinada de acuerdo con los siguientes factores: 1 . Seguridad y tolerancia de los CTLs autólogos reinstilados después de inmunización in vitro; 2. Cinética de los CTLs instilados en la circulación sistémica factorizando en el análisis de dilución limitativo; 3. Disposición de los CTLs en todo el cuerpo según radioescintigrafía; 4. Composición celular de las biopsias tomadas de ganglios según inmunohistología (CTLs, TH, NK, células B)¡ y 5. Regresión de lesiones mensurables y duración de la respuesta durante dos meses.

Tratamiento con CTLs autóloaos generados ex vivo Todos los pacientes recibirán por lo menos una instilación de CTLs autólogos. El número de ciclos y la dosis de células administradas a cada paciente se resumen en el cuadro 1. El número de células generadas in vitro depende de factores relacionados con el paciente tales como los números de PBMCs aisladas del procedimiento de aféresis y el número de células T CD8+ presentes en cada preparación de PBMC. Puesto que todas las células generadas in vitro son reinstiladas en el donador, necesariamente se varían las dosis administradas a cada paciente. En un intento por normalizar las dosis entre pacientes, se registra una puntuación calculada de "potencia" para cada dosis. El valor se obtiene multiplicando el número total de células por la actividad lítica obtenida con células blanco cargadas con péptido. Los pacientes entran a un segundo, tercero o cuarto ciclo de tratamiento en base a su estado clínico al final de cada ciclo. El número total de células T CD8+ intactas aisladas depende de su porcentaje en cada preparación de PBMC. El porcentaje de células T CD8+ varia entre los pacientes. El procedimiento para generar CTLs ex vivo es enseñado en la especificación y el ejemplo 1 anterior.

Regulación positiva de antígenos de clase I v antígenos asociados con melanoma en respuesta a IFN -2b En un intento por incrementar la capacidad de los CTLs específicos de antígeno para producir lisis de células productoras de IgE ¡n vivo, se administran dosis bajas de IFN -2b durante cinco días consecutivos antes de la instilación de CTLs, y tres veces a la semana durante cuatro semanas más. Una manera de medir una respuesta in vivo a la citocina es evaluar biopsias obtenidas en puntos de tiempo seriados por análisis inmunohistoquímico de marcación positiva con anticuerpos específicos.

Especificidad antigénica de CTLs generados ex vivo Los CTLs generados de todos los pacientes se evalúan el día de la liberación contra blancos T2 cargados con péptido, una línea celular 4 de la clona M-14 productora de HLA-A2 IgE y una línea celular M-14 autóloga, si estuviera disponible material de biopsia para establecer una línea. Se evalúa la actividad citolítica de cada dosis preparada de células. Para determinar la especificidad de la respuesta de CTLs generada para cada paciente se usan células T2 cargadas con péptido que presentan cada péptido solo o todos los péptidos simultáneamente. La capacidad para producir lisis de células que llevan antígeno asociadas con HLA-A2 expresadas endógenamente se determina con una línea igualada de HLA-A2 o una línea celular autóloga. Además de la actividad citolítica, se evalúa la especificidad de antígeno con un método establecido para detectar la producción de interferón gamma intracelular, hecho en respuesta a un estímulo de péptido específico. Los CTLs generados al final del protocolo ex vivo se evalúan por medio de este método. Se registra individualmente el porcentaje de células específicas para cada péptido. El número total de células específicas en cada cultivo en masa de CD8 de un paciente se calcula añadiendo cada especificidad de péptido detectada en esa población de células T. Se detecta un incremento en el número total de células específicas con cada ciclo de tratamiento sucesivo.

La presencia de estado anérgico no obstaculiza la capacidad para generar CTLs ni impide una respuesta clínica La mayoría de los pacientes tratados con este protocolo reciben intervención médica previa. Se realiza una prueba de pretratamiento en la piel para determinar si se correlaciona una respuesta anérgica de un panel de siete antígenos comunes con una incapacidad para generar CTLs ex vivo, o con una obstaculización de una respuesta clínica documentada. La capacidad para generar CTLs ex vivo no se correlaciona con los resultados de la prueba de pretratamiento de la piel del paciente.

EJEMPLO 3 La IgE tiene una función esencial en la patogénesis de asma alérgica. Aquí, los autores muestran que se pueden generar in vitro linfocitos T citotóxicos (CTLs) específicos para péptidos antigénicos derivados de una molécula de IgE, estimulando células T CD8 intactas en reposo con péptidos de IgE presentados por células presentadoras de antígeno artificiales. Los CTLs específicos de IgE producen tisis de las células blanco cargadas con péptidos de IgE in vitro e inhiben la respuesta de IgE específica de antígeno in vivo. Además, la transferencia adoptiva de los CTLs específicos de IgE a un modelo de ratón asmático puede inhibir el desarrollo de inflamación del pulmón e hipersensibilidad de las vías respiratorias. De esta manera, los CTLs específicos de IgE pueden ofrecer un tratamiento para asma alérgica y otras enfermedades alérgicas medidas por IgE. Los linfocitos T citotóxicos se derivan de células T CD8 intactas en reposo. En presencia de antígenos y coestimuladores, las células T CD8 intactas en reposo se pueden activar y diferenciar para convertirse en células T citotóxicas armadas que pueden destruir las células blanco que expresan los antígenos. Los CTLs tienen una función esencial en la inmunidad contra virus y patógenos intracelulares por lisis de las células infectadas o mediante el efecto de las citocinas de CTL producidas.

Identificación de péptidos antigénicos a partir de la secuencia de la proteina IgE Se han descrito previamente dos alelos de IgE de ratón (IgE3 e lgE ) (P06336). La alineación de las secuencias de aminoácido lgEa e lgE mostraron que 95% de las secuencias de aminoácidos son idénticas. Una diferencia de catorce aminoácidos está localizada en la región de unión entre la región CH1 y CH2 y otra diferencia de cinco aminoácidos está localizada en la región de unión entre la región CH3 y CH4. La secuencia de aminoácidos de lgEb se analizó para determinar secuencias de péptidos nonámeros que contienen motivos de unión para moléculas de clase I de MHC Ld y Db usando el software de la Sección de Bioinformática y Análisis Molecular disponible en http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/. Este programa califica nonapóptidos potenciales en base a un tiempo medio de disociación predicho para moléculas de MHC de clase I. En base al análisis de la puntuación se seleccionaron para síntesis ocho péptidos con motivos de unión Ld y cinco péptidos con motivos de unión D (cuadro 3). La capacidad de unión de estos péptidos sintéticos a las moléculas de clase I Ld y Db se probó en un ensayo de estabilización de MHC clase I (Cai y otros (1996), arriba citados). Células RMAS deficientes en transportación de antígeno (???') (H-2b) o células RMAS transfectadas con Ld (RMAS-Ld) se cultivaron en presencia de una concentración titulada de péptidos a 27°C. Después de cultivar durante la noche a 27°C, estas células se cultivaron dos horas más a 37°C y se analizó por citometría de flujo la expresión en superficie de Ld o D sobre las células. Como se muestra en el cuadro 3, dos péptidos de IgE, lgE1 1 e lgE366, se unen fuertemente a Ld, mientras que lgE1 14 se une débilmente a Ld. De los cinco péptidos que se esperaba se unieran a Db, solo lgE44 se une fuertemente a Db y dos péptidos, lgE16 e lgE125, se unen débilmente a Db. De manera interesante, el lgE366, que originalmente se había predicho que se unía a Ld, se une tanto a Ld como a Db. De esta manera, se identificaron seis péptidos en total que se unen a las moléculas de MHC de clase I ya sea Ld o Db.

Secuencia de aminoácidos de laEa de ratón: SEQ ID NO: 14 1 sirnpqlypl kpckgtasmt Igclvkdyep npvtvtwysd slnmstvnfp 51 algselkvtt sqvtswgksa knftchvthp psfnesrtil vrpvnitept 101 lellhsscdp nafhstiqly cfiyghilnd vsvswlmddr eitdtlaqtv 151 likeegklas tcsklniteq qwmsestftc kvtsqgvdyl ahtrrcpdhe 201 prgvitylip pspldlyqng apkltcl vd leseknvnvt wnqekktsvs 251 asqwytkbhn nattsitsil p vakdwieg ygyqcivdhp dfpkpivrsi 301 tktpgqrsap evyvfpppee esedkrtltc liqnffpedi svqwlgdgkl 351 isnsqhsttt plksngsnqg ffifsrleva ktlwtqrkqf tcqvihealq 401 kprklektis tslgntslpr s CUADRO 3 Identificación de péptidos antigénicos de I E de ratón a Puntuación calculada en unidades arbitrarias. La relación de intensidad de fluorescencia con péptidos -sin péptido / sin péptidos menos de dos veces se califica como "+" y más de dos veces se califica como "++". c IgE 366 también estabiliza moléculas de clase I D .

Generación de CTLs específicos de péptido de IgE ¡n vitro La capacidad de estos péptidos de IgE para provocar respuestas evaluó ¡n vitro. Como se describió previamente, las células de Drosophila transfectadas con MHC clase I mas B7-1 e ICAM-1 son células presentadoras de antigeno (APC) potentes en la activación in vitro de células T CD8 intactas en reposo. Las células T CD8 intactas en reposo se purificaron de ganglios linfáticos de ratón y se cultivaron con células de Drosophila cargadas con péptido transfectadas con Ld o Db mas B7-1 e ICAM-1 en ausencia de citocinas. Se agregó IL-2 (20 unidades/ml) el día 3 y después cada tercer día. El día 9 se midió la actividad de CTL hacia células RMAS cargadas con péptidos (K , Db) o células RMAS-Ld. Como se muestra en la figura 1 , los CTLs inducidos por el péptido lgE44 produjeron lisis específica de las células RMAS cargadas con péptidos lgE44; ni las células blanco solas ni las células blanco cargadas con otros péptidos de IgE fueron reconocidas por los CTLs específicos de lgE44. No fue inducida actividad específica de CTL por los péptidos lgE16 o lgE125, que se había visto que se unen a D . Originalmente se identificó lgE366 como péptido de unión de Ld; interesantemente, además de inducir CTLs restringidos a Ld, lgE366 también induce CTLs restringidos a Db (figura 2B). De los tres péptidos que se unen a Ld, además de lgE366, IgE 1 1 también induce CTLs específicos de antígeno. La destrucción por CTLs específica de IgE es dependiente de perforina y es independiente de la expresión de IFNy (figura 2C). Además, los CTLs inducidos por péptidos de IgE están restringidos por el MHC porque la destrucción realizada por CTLs específicos de lgE44 de blancos de RMAS cargados con lgE44, fue bloqueada completamente por mAb anti-D (figura 2D). El análisis de FACS de estos CTLs reveló que son células T CD8+ apTCR positivas, y no se detectó expresión de marcador de células NK (DX5 o NK1 .1 ) sobre estas células (datos no mostrados).

Inhibición de respuestas de IgE por CTLs específicos anti-laE Como los CTLs inducidos por péptidos de IgE destruyen in vitro las células blanco específicamente, los autores de la presente invención se interesaron en examinar si estos CTLs podían inhibir las respuestas de IgE in vivo. Los ratones tienen IgE en suero muy baja y no desarrollan espontáneamente respuesta alérgica. La ovoalbúmina precipitada con hidróxido de aluminio se ha usado en ratones para inducir respuestas de IgE específicas de antígeno. Como se muestra en la figura 3, después de dos inmunizaciones con OVA mas hidróxido de aluminio, tanto la IgE total como la IgE específica de OVA en el suero de ratones inmunizados fueron altas, y el nivel de IgE aumentó más después de la inoculación intranasal de OVA en estos ratones.

Efecto de CTL antl-lgE sobre la inflamación de las vías respiratorias3 Ratones CBF1/J adultos se inmunizaron intraperitonealmente con 50 pg de ovoalbúmina (OVA) mas hidróxido de aluminio los días 1 y 14. Dos semanas después de la segunda inmunización se les dio 5x106 de CTL antl-lgE o CTL de control o PBS, cada tércer día por tres veces. Tres semanas después del último tratamiento con CTL se inoculó ¡ntranasalmente OVA a los ratones cada tercer día por tres veces. Un día después de la última inoculación se recolectó de cada ratón lavado alveolar bronquial y tejido de pulmón y se marcó con HE; la inflamación de pulmón de cada ratón fue evaluada independientemente por un patólogo, Puntuación: 0 = Normal; T = trazas, 1 = ligera; 2 - ligera a moderada; 3 = moderada; 4 = severa. c BALT = Hiperplasia Linfoide Bronquial Asociada.

CUADRO 5 Búsqueda de motivo de péptido de HLA-A2 para ?a? humana Puntuación Posición Lista de residuos Puntuación de inicio de la (Tiempo medio estimado subsecuencia de disociación de HLA-2 que contiene esta subsecuencia) 1 185 WLSDRTYTC 93.696 2 96 WVDNKTFSV 64.948 3 71 LLTVSGAWA 46.451 4 365 QLPDARHST 30.553 5 3 TQSPSVFPL 28.893 6 309 ALMRSTTKT 27.572 7 59 TLTLSGHYA 27.324 8 54 TLPATTLTL 21.362 9 47 SLNGTTMTL 21.362 10 61 TLSGHYATI 15.649 1 1 52 T TLPATTL 15.428 12 178 LTLSQKHWL 10.264 13 66 YATISLLTV 10.220 14 154 QVMDVDLST 9.892 15 17 NIPSNATSV 9.563 16 133 LLCLVSGYT 9.058 17 403 FICRAVHEA 7.227 18 236 TITCLVVDL 6.756 19 356 SVQWLHNEV 6.086 20 155 V DVDLSTA 5.612 CUADRO 6 Búsqueda de motivo de péptido de HLA-A2 para IgE humana mediante Neuro-Network Resultado C150 Inicio Final Secuencia 0.747555 5.71921 223 231 RPSPFDLFI 0.695169 8.21283 349 357 NFMPEDISV 0.628452 13.021 358 366 QWLHNEVQL 0.60628 15.1782 33 41 GYFPEPVMV 0.53619 24.6281 54 62 TLPATTLT 0.45981 41.7417 108 1 16 DFTPPTVKI 0.406526 60.3147 229 237 LFIRKSPTI 0.382602 71.153 96 04 WVDNKTFSV 0.37391 75.6184 148 156 TWLEDGQVM 0.34985 89.2174 61 69 TLSGHYATI 0.348214 90.2317 396 404 EWEQKDEFI 0.344683 92.4594 278 286 LTVTSTLPV 0.317372 1 1 1.656 128 136 PPTIQLLCL 0.29653 128.947 170 178 ELASTQSEL 0.292132 132.924 236 244 TITCLVVDL 0.27291 151.798 106 1 14 SRDFTPPTV 0.26747 157.612 213 221 NPRGVSAYL 0.252711 174.529 10 18 PLTRCCKNI 0.227935 207.107 147 155 ITWLEDGQV 0.220931 217.374 234 242 SPTITCLW 0.219179 220.02 47 55 SLNGTTMTL 0.218951 220.368 384 392 FFVFSRLEV 0.199355 252.309 139 147 GYTPGTINI .188573 271.82 123 131 GGGHFPPTI 0.170795 307.296 245 253 APSKGTVNL 0.136633 389.134 302 310 THPHLPRAL .124225 423.96 284 292 LPVGTRDWI .1 15665 449.785 378 386 KTKGSGFFV EJEMPLO 4 En presencia de antígeno específico y coestimulación, las células T CD8 se pueden activar y diferenciar para convertirse en CTLs, que desempeñan una función esencial en la respuesta inmune antivirus. Recientemente también se ha mostrado que CTLs específicos de antígeno asociados a tumor generados in vitro se pueden usar para tratar pacientes de cáncer. Aquí, los autores de la presente muestran que péptidos antigénicos identificados de autoantígenos no tumorales pueden inducir linfocitos T citotóxicos (CTLs) específicos in vitro. Los CTLs inducidos por péptidos identificados de CD40L, un autoantígeno expresado transitoriamente sobre células T CD4 activadas, pueden destruir células T CD4 activadas y la destrucción puede ser bloqueada bien por el anticuerpo específico (Ab) para la molécula de clase I de restricción, o por el Ab que reconoce la molécula de CD8. Además, ni las células T CD4 activadas generadas de ratones CD40L7" ni de ratones 2m7', son destruidas por los CTL específicos de CD40L, demostrando que la destrucción de células T CD4 activadas por CTLs específicos de CD40L es dependiente del antígeno y está restringida por el MHC. Es importante notar que los CTLs específicos para CD40L generados in vitro inhiben in vivo respuestas de anticuerpo dependientes de CD4 de todos los isotipos. En contraste, los CTL inducidos por péptidos antigénicos derivados de IgE inhiben específicamente las respuestas de IgE, y la transferencia adoptiva de CTL específicos de CD40L a ratones NOD en edad temprana, retrasa el desarrollo de diabetes en los ratones NOD. De esta manera, los CTL específicos para autoantígenos no tumorales expresados sobre células T CD4 activadas, generados in vitro, pueden regular las respuestas inmunes in vivo. Las enfermedades alérgicas como fiebre del heno, asma y anafilaxis sistémica son respuestas inmunes a sustancias inocuas. El sello distintivo de las enfermedades es la activación de células CD4 y la sobreproducción de IgE por parte de las células B. Las terapias actuales se han enfocado al tratamiento de los síntomas y no previenen el desarrollo ni el avance de las enfermedades. Como las células CD4 activadas por alérgeno y las células B productoras de IgE desempeñan una función central en la patogénesis de la alergia, la estrategia de los presentes autores es usar CTL autólogos para eliminar células T CD4 activadas y células B productoras de IgE, impidiendo así el desarrollo y avance de las enfermedades. Se seleccionaron dos moléculas, ligando de CD40 (CD40L) e IgE, como antígenos blanco para la terapia de CTL. Se identificaron tres péptidos antigénicos de CD40L y dos péptidos antigénicos de IgE. Se han generado CTLs específicos para estos péptidos y la función de estos CTLs ha sido evaluada tanto in vitro como in vivo. Se identificaron tres epítopes antigénicos de CD40L y dos epítopes de moléculas de IgE. Los péptidos sintéticos de los epítopes antigénicos fueron capaces de unirse a moléculas de clase I y de activar in vitro células T CD8 intactas en reposo.

Se generaron CTLs por estimulación de células T CD8 con péptidos CD40L o IgE presentados por células de Drosophila que expresan moléculas de MHC de clase I, B7-1 e ICAM-1 . Los CTLs así generados in vitro destruyeron específicamente células blanco cargadas con péptido. Los CTL específicos de péptido CD40L destruyeron células T CD4 activadas y el reconocimiento fue dependiente de la expresión de moléculas de CD40L y MHC de clase I.

La función de CTL específicos de CD40L también se evaluó in vivo. La respuesta de anticuerpo específica de antígeno fue inhibida por CTL anti-CD40L. El efecto de CTL anti-CD40L y CTL anti-lgE sobre la alergia y las enfermedades autoinmunes será investigado en modelos de animales.

CUADRO 7 Búsqueda de motivo de unión de MHC clase I para CP40L do ratón # Estimado del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia.

CUADRO 8 Búsqueda de motivo de péptido de HLA-A2 para CD40L humano PunPosición de Lista de No. de No. tuación inicio residuos de identificación de puntuación subsecuencia secuencia (Estimado del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia) 1 24 FMYLLTVFL SEQ ID NO: 30 1249.083 2 167 GLYYIYAQV SEQ ID NO: 31 333.850 3 22 KIFMYLLTV SEQ ID NO: 32 284.846 4 36 MIGSALFAV SEQ ID NO: 33 216.879 5 58 NLHEDFVF SEQ ID NO: 34 212.854 6 170 YIYAQVTFC SEQ ID NO: 35 127.199 7 26 YLLTVFLIT SEQ ID NO: 36 98.803 8 231 LQPGASVFV SEQ ID NO: 37 65.934 9 45 YLHRRLDKI SEQ ID NO: 38 54.086 10 147 TMSNNLVTL SEQ ID NO: 39 35.485 1 1 229 FELQPGASV SEQ ID NO: 40 23.018 12 160 QLTVKRQGL SEQ ID NO: 41 21.362 13 35 QMIGSALFA SEQ ID NO: 42 19.734 14 185 SQAPFIASL SEQ ID NO: 43 18.930 15 19 ISMKIFMYL SEQ ID NO: 44 9.166 16 153 VTLENGKQL SEQ ID NO: 45 7.652 17 126 VISEASSKT SEQ ID NO: 46 7.142 18 227 GVFELQPGA SEQ ID NO: 47 6.594 19 20 SMKIFMYLL SEQ ID NO: 48 4.720 20 165 RQGLYYIYA SEQ ID NO: 49 4.156 CUAPRQ 9 Resumen de actividad CTL generada de PBMC en diferentes donadores x/N; x = número de donadores de los cuales se generó CTL anti-lgE; N = número de donadores probados. Se purificaron células T CD8+ de PBMC y se cultivaron con células de Drosophila transfectadas con A2.1 , B7.1 e ICAM-1 en presencia de péptidos de IgE. El análisis estadístico indicó la capacidad del péptido de IgE para generar respuesta de CTL específica de diferentes donadores. 1 y 2 indican que se generó CTL anti-lgE de nonámero y decámero, respectivamente.

LISTADO DE SECUENCIAS <1 10> Cai, Zeling Jackson, Michael R Peterson, Per A. Shi, Weixing Kong, Yan Degraw, Juli <120> Activación ex_vivo para generar linfocitos T citotóxicos específicos para antfgenos no tumorales para tratar enfermedades autoinmunes y alérgicas <130> ORT-1627 <160> 60 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <21 1> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antigénico <400> 1 Lys Pro Cys Lys Gly Thr Ala Ser Met 1 5 <210> 2 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 2 lie Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr 1 5 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación! <210> 3 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 3 Gly Ser Asn GIn Gly Phe Phe He Phe 1 5 <210> 4 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antfgeno <400> 4 Phe Pro Asn Pro Val Thr Val Thr Trp 1 5 <210> 5 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 5 His Ser Ser Cys Asp Pro Asn Ala Phe 1 5 <210> 6 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <220> <223> péptido antígeno <400> 6 His Ser Thr lie GIn Leu Tyr Cys Phe 1 5 <210> 7 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 7 Lys Ser Asn Gly Ser Asn GIn Gly Phe 1 5 <210> 8 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 8 Arg Ser Ala Pro Glu Val Tyr Val Phe 1 5 <210> 9 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 9 Met Ser Thr Val Asn Phe Pro Ala Leu 1 5 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 10 Thr Ser Leu Gly Asn Thr Ser Leu Arg 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 11 Thr Ala Ser Met Thr Leu Gly Cys Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 12 Ala Ser Thr Cys Ser Lys Leu Asn lie 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <220> <223> péptido antígeno <400> 13 Gly His lie Leu Asn Asp Val Ser Val 1 5 <210> 14 <21 1> 421 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 14 Ser lie Arg Asn Pro Gln Leu Tyr Pro Leu Lys Pro Cys Lys Gly Thr 1 5 10 15 Ala Ser Met Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Asn Pro 20 25 30 Val Thr Val Thr Trp Tyr Ser Asp Ser Leu Asn Met Ser Thr Val Asn 35 40 45 Phe Pro Ala Leu Gly Ser Glu Leu Lys Val Thr Thr Ser Gln Val Thr 50 55 60 Ser Trp Gly Lys Ser Ala Lys Asn Phe Thr Cys His Val Thr His Pro 65 70 75 80 Pro Ser Phe Asn Glu Ser Arg Thr lie Leu Val Arg Pro Val Asn lie 85 90 95 Thr Glu Pro Thr Leu Glu Leu Leu His Ser Ser Cys Asp Pro Asn Ala 100 105 1 10 Phe His Ser Thr lie Gln Leu Tyr Cys Phe lie Tyr Gly His lie Leu 1 15 120 125 Asn Asp Val Ser Val Ser Trp Leu Met Asp Asp Arg Glu lie Thr Asp 130 135 140 Thr Leu Ala Gln Thr Val Leu lie Lys Glu Glu Gly Lys Leu Ala Ser 145 150 155 160 Thr Cys Ser Lys Leu Asn He Thr Glu Gln Gln Trp Met Ser Glu Ser 165 170 175 Thr Phe Thr Cys Lys Val Thr Ser Gln Gly Val Asp Tyr Leu Ala His 180 185 190 Thr Arg Arg Cys Pro Asp His Glu Pro Arg Gly Val He Thr Tyr Leu 195 200 205 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) lie Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr GIn Asn Gly Ala Pro Lys Leu 210 215 220 Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Glu Ser Glu Lys Asn Val Asn Val Thr 225 230 235 240 Trp Asn GIn Glu Lys Lys Thr Ser Val Ser Ala Ser GIn Trp Tyr Thr 245 250 255 Lys His His Asn Asn Ala Thr Thr Ser lie Thr Ser lie Leu Pro Val 260 265 270 Val Ala Lys Asp Trp lie Glu Gly Tyr Gly Tyr GIn Cys lie Val Asp 275 280 285 His Pro Asp Phe Pro Lys Pro lie Val Arg Ser Me Thr Lys Thr Pro 290 295 300 Gly GIn Arg Ser Ala Pro Glu Val Tyr Val Phe Pro Pro Pro Glu Glu 305 310 315 320 Glu Ser Glu Asp Lys Arg Thr Leu Thr Cys Leu lie GIn Asn Phe Phe 325 330 335 Pro Glu Asp lie Ser Val GIn Trp Leu Gly Asp Gly Lys Leu lie Ser 340 345 350 Asn Ser GIn His Ser Thr Thr Thr Pro Leu Lys Ser Asn Gly Ser Asn 355 360 365 GIn Gly Phe Phe lie Phe Ser Arg Leu Glu Val Ala Lys Thr Leu Trp 370 375 380 Thr GIn Arg Lys GIn Phe Thr Cys GIn Val He His Glu Ala Leu GIn 385 390 395 400 Lys Pro Arg Lys Leu Glu Lys Thr lie Ser Thr Ser Leu Gly Asn Thr 405 410 415 Ser Leu Pro Arg Ser 420 <210> 15 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 15 Leu Pro Ala Ser et Lys lie Phe Met 1 5 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 16 Arg Pro Phe He Val Gly Leu Trp Leu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 17 Asp Pro GIn lie Ala Ala His Val Val 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 18 GIn Ser Val His Leu Gly Gly Val Phe 1 5 <210> 19 <211>9 <212> PRT <213> Artificial LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <220> <223> péptido antlgeno <400> 19 Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly Leu 1 5 <210> 20 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 20 Lys Pro Ser lie Gly Ser Glu Arg lie 1 5 <210> 21 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223 péptido antígeno <400> 21 Phe Ser Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 1 5 <210> 22 <21 1> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antigeno <400> 22 GIn Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr 1 5 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación <210> 23 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 23 Glu Pro Ser Ser GIn Arg Pro Phe lie 1 5 <210> 24 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 24 Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met 1 5 <210> 25 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 25 Val Met Leu Glu Asn Gly Lys GIn Leu 1 5 <210> 26 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <400> 26 Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu 1 5 <210> 27 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 27 Ser Val Phe Val Asn Val Thr Glu Ala 1 5 <210> 28 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 28 Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu 1 5 <210> 29 <21 1> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 29 Ala Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Leu 1 5 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 30 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 30 Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 1 5 <210> 31 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 31 Gly Leu Tyr Tyr lie Tyr Ala Gln Val 1 5 <210> 32 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 32 Lys lie Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val 1 5 <210> 33 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <400> 33 Met lie Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val 1 5 <210> 34 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 34 Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met 1 5 <210> 35 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 35 Tyr lie Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys 1 5 <210> 36 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antigeno <400> 36 Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu lie Thr 1 5 <210> 37 <21 1 > 9 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antigeno <400> 37 Leu GIn Pro Gly Ala Ser Val Phe Val 1 5 <210> 38 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 38 Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp Lys lie 1 5 <210> 39 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 39 Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu 1 5 <210> 40 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <400> 40 Phe Glu Leu GIn Pro Gly Ala Ser Val 1 5 <210> 41 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 41 GIn Leu Thr Val Lys Arg GIn Gly Leu 1 5 <210> 42 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 42 GIn Met lie Gly Ser Ala Leu Phe Ala 1 5 <210> 43 <21 1 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 43 Ser GIn Ala Pro Phe He Ala Ser Leu 1 5 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 44 lie Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Leu 1 5 <210> 45 <21 1> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 45 Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys GIn Leu 1 5 <210> 46 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 46 Val lie Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr 1 5 <210> 47 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <220> <223> póptido antígeno <400> 47 Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala 5 <210> 48 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antigeno <400> 48 Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Leu Leu 1 5 <210> 49 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 49 Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr lie Tyr Ala 1 5 <210> 50 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 50 Ser Leu Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu 1 5 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 51 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 51 Trp Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val 1 5 <210> 52 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 52 Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys 1 5 <210> 53 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 53 Ala Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys 1 5 <210> 54 <21 1 > 10 <212> PRT <213> Artificial LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <220> <223> péptido antígeno <400> 54 Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala 1 5 10 <210> 55 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 55 Trp Leu Glu Asp Gly GIn Val Met Asp Val 1 5 10 <210> 56 <21 1 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 56 Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val 1 5 10 <210> 57 <21 1 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 57 GIn Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr 1 5 10 LISTADO DE SECUENCIAS (Continuación) <210> 58 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <40O 58 Tyr Ala Thr He Ser Leu Leu Thr Val 1 5 <210> 59 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 59 Thr Leu Ala Cys Leu lie GIn Asn Phe Met 1 5 10 <210> 60 <21 1 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido antígeno <400> 60 GIn Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala 1 5 10

Claims

95 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Un método para producir CTL específicos para uno o más epítopes autoantigénicos no tumorales de células T, que comprende: (a) aislar células T CD8+ de un sujeto; (b) cargar células presentadoras antígeno (APC's) que tienen moléculas de MHC de clase I con los epítopes de células T; (c) cultivar las células T CD8+ con las APC's durante un período suficiente para la activación de células T CD8+ precursoras específicas para los epítopes de células T; (d) expandir en cultivo las células T CD8+ activadas en presencia de los componentes requeridos para la proliferación de las células T CD8+ activadas; y (e) recoger las células T CD8+ del cultivo.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los epítopes de células T están presentes sobre proteína de IgE.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los epítopes de células T están presentes sobre proteína de ligando de CD40.

4.- Células T CD8+ que son específicamente cítotóxicas para una célula blanco causante de una enfermedad, en donde la célula blanco tiene sobre su superficie uno o más epítopes autoantigénicos no tumorales de células T asociados con moléculas de MHC de clase I, y en donde las células 96 T CD8+ han sido activadas selectivamente por interacción con moléculas de MHC de clase I asociadas con los epítopes autoantigénicos no tumorales de células T.

5. - Las células de conformidad con la reivindicación 4, caracterizadas además porque los epítopes de células T están presentes sobre proteína de IgE.

6. - Las células de conformidad con la reivindicación 4, caracterizadas además porque los epítopes de células T están presentes sobre proteína de ligando de CD40.

7.- El uso de células T CD8+ activadas, en donde las células T CD8+ activadas han sido activadas selectivamente por interacción con moléculas de MHC de clase I asociadas con los epítopes autoantigénicos no tumorales de células T para preparar un medicamento para tratar una enfermedad mediada por una célula blanco causante de una enfermedad, en donde la célula blanco tiene sobre su superficie uno o más epítopes autoantigénicos no tumorales de células T asociados con moléculas de MHC de clase I.

8.- El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde los epítopes de células T están presentes sobre proteína de IgE.

9.- El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde los epítopes de células T están presentes sobre proteína de ligando de CD40.