KR101460551B1 - 면역 반응을 향상시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에는 살모넬라 엔테리티디스 13A 균주 및 이들 균주를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 인플루엔자 A에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법과 인플루엔자 A 감염과 관련된 이환율을 감소시키는 방법이 제공된다. CD40에 결합할 수 있는 CD154의 폴리펩타이드를 발현함에 의해 백신 벡터에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법이 또한 개시된다. 세균 백신 벡터를 제조하는 방법이 개시된다. 세균내 스카리스(scarless) 부위-특이적 돌연변이의 생성의 방법이 또한 개시된다.
Figure R1020097007854
살모넬라 엔테리티디스, 인플루엔자, 백신 벡터, 부위-특이적 돌연변이

Description

면역 반응을 향상시키는 조성물 및 방법{Compositions and methods of enhancing immune responses}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2006년 9월 18일자로 출원된 미국 임시출원 제60/825,983호에 대해 우선권을 주장하고, 상기 출원은 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
연방 후원 연구에 관한 성명
본 발명은 미국 국립보건원의 보조금 R21 AI063137에 의해 부여된 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국은 본 발명에 관하여 일정한 권리를 소유할 수도 있는 바이다.
인플루엔자 바이러스 감염, 특히 조류 인플루엔자 H5N1은 증대되어가는 보건 및 경제적 우려를 표명한다. H5N1은 전세계 넓은 범위에 걸쳐 위약한 조류 및 돼지들 사이에 지속적으로 순환되고 있다는 것이 분명히 증명된 바 있다. 많은 과학자들은 이들이 견제되어지지 않는 경우 현재의 H5N1 조류 인플루엔자가 돌연변이를 거쳐 사람간의 전염을 일으키고 전세계적 유행병을 낳을 것으로 믿고 있다. 50% 이 상의 사망률로서 이같은 발발은 압도적 형태에 해당한다. 바이러스가 사람 질병을 일으키는 능력을 차치하고서도, 조류 인플루엔자 H5N1은 이미 감염 지역내의 가금류의 박멸로 말미암아 거대한 경제적 영향력으로 위협하여 오고 있다. 그러므로 사람, 가금류, 돼지 및 기타 가축을 H5N1 인플루엔자으로부터 보호하기 위한 백신의 개발은 절실하게 된다. 기타 인플루엔자 바이러스 뿐만 아니라 H5N1으로부터 보호할 수 있는 인플루엔자 백신이 최선의 형태가 되겠다.
발명의 개요
ATCC 수탁번호가 PTA-7871, PTA-7872 또는 PTA-7873인 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 13A 균주가 개시된다. 또한 약독화된 살모넬라 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 개시된다.
또 다른 측면에서 백신 벡터를 피험체에 투여하여 피험체에서 면역 반응을 향상시키는 방법들이 제공된다. CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 이 폴리펩타이드는 50개 미만의 아미노산을 가지며 서열번호 26의 아미노산 140-149 또는 이의 동족체를 포함한다. 백신 벡터는 백신에 대한 피험체의 면역 반응을 향상시키는데 유효한 양으로 피험체에 투여되어진다.
추가의 측면에서 인플루엔자 A M2e 단백질의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세균을 인플루엔자 A에 대한 피험체의 면역 반응을 향상시키는데 유효한 양으로 피험체에 투여함으로써 피험체에서 인플루엔자 A에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법이 제공된다.
또한 다른 측면에서 인플루엔자 A M2e 단백질의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세균을 인플루엔자 A로의 후속적인 감염과 관련된 이환율을 감소시키는데 유효한 양으로 피험체에 투여함으로써 피험체에서 인플루엔자 A 감염과 관련한 이환율을 감소시키는 방법이 제공된다.
또한 다른 측면에 있어 세균에서 부위-특이적 돌연변이를 생성하는 방법이 제공된다. 세균의 염색체내 돌연변이 부위를 플랭킹(flanking)하는 서열에 상동인 폴리뉴클레오타이드에 의해 플랭킹된 항생제 내성 마커 및 역선별 마커를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드가 생성된다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 이후 세균 속으로 도입되고 상동 재조합과 항생제 선별 이후 중간체가 분리되어진다. 돌연변이 부위를 플랭킹하는 서열에 상동인 폴리뉴클레오타이드에 의해 플랭킹된 돌연변이를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드가 생성된다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 이후 중간체 속으로 도입되고 부위-특이적 돌연변이체는 역선별 마커의 소실에 대한 역선별에 의해 분리된다.
또 다른 측면에 있어 세균 백신 벡터를 제조하는 방법들이 제공된다. 피험체에서 콜로니화(colonization) 할 수 있는 세균이 선택된다. 세균은 약독화되고 CD40에 결합할 수 있는 CD154의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 세균 속으로 도입되어진다.
도면 1은 살모넬라 엔테리티디스의 부위-특이적 돌연변이를 만드는 방법을 도시한다.
도면 2는 lamB 폴리뉴클레오타이드의 루프 9 속으로의 M2e 및 M2e-CD154 삽입을 생성하기 위해 사용되는 오버랩핑 연장(overlapping extension) PCR 방법의 설계 방법을 도시한다.
도면 3은 표시된 치료제의 투여에 반응하여, 표시된 시점에 생성되는 혈청 항체의 상대적 양을 나타내는 막대 그래프이다.
도면 4는 표시된 치료제의 투여 이후에 시간에 걸쳐 혈청 항체의 양을 나타내는 선 그래프이다.
도면 5는 부화된 당일에 SE HM으로 백신접종하고, 21일째에 부스터(booster) 접종하고, 부화한지 32일째에 저병원성 인플루엔자 A로 챌린지(challenge) 감염시킨 후 닭의 이환율을 나타내는 그래프이다.
도면 6은 부화된 당일에 SE HM으로 백신접종하고, 21일째에 부스터 접종하고, 부화한지 32일째에 챌린지 감염시킨 후 저병원성 인플루엔자 A로 챌린지한 후 2 및 4일째의 바이러스 배출을 나타내는 그래프이다.
도면 7은 부화된 당일에 SE HM으로 백신접종하고, 21일째에 부스터 접종하고, 부화한지 32일째에 고병원성 인플루엔자 A로 챌린지 감염시킨 후 닭의 이환율을 나타내는 그래프이다.
도면 8은 부화된 당일에 SE HM으로 백신접종하고, 21일째에 부스터 접종하고, 부화한지 32일째에 챌린지 감염시킨 후 고병원성 인플루엔자 A로 챌린지한 후 2 및 4일째의 바이러스 배출을 나타내는 그래프이다.
재조합 DNA 기술은 많은 세균과 바이러스종의 비교적 쉬운 조작을 가능케 한다. 일부 세균과 바이러스는 저병원성이거나 비병원성이지만, 강력한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이들 세균과 바이러스는 이종 또는 외부 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 매력적인 백신 벡터를 만들어낸다. 세균 또는 바이러스 백신 벡터는 자연발생적 감염을 모방하여 강력하고 오래 지속되는 면역성을 자아낼 수 있다. 백신 벡터는 생산하고 투여하는데 있어 종종 비교적 값이 싼 편에 속한다. 게다가 이같은 벡터는 종종 하나 이상의 항원을 지닐 수 있고 여러 감염원에 대하여 보호를 할 수 있다.
한가지 측면에 있어 본 발명은 살모넬라와 기타 병원체에 대한 백신접종 및 면역 반응의 생성에 있어서 살모넬라 벡터의 이용과 관련된다. 살모넬라 균주는 적합한 백신 벡터를 만들어내는데, 이는 이종 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 세균을 만들 수 있기 때문이다. 게다가 세균 유전자는 돌연변이되어지거나 약독화되어, 면역원성을 유지하면서, 감염되거나 면역화된 피험체에 대해 병원성이 낮거나 없는 세균을 생성할 수 있다.
살모넬라가 숙주의 위장관에서 생존하여 점막의 면역 반응을 일으킬 수 있는 능력이 기록되었다. 살모넬라 벡터를 이용한 경구 백신은 강력한 점막 면역 반응을 생성하고 비교적 동물 및 사람에 대한 투여가 모두 용이한 편이다. 현재의 살모넬라 백신 균주의 대부분은, 강력한 보호성 면역 반응을 생성하는데 있어, 이들보다 병독성이 높은 상응물과 비교하여 효과적이지가 못하다. 효과적인 점막 (예: 경구) 백신에 이용될 수 있는 살모넬라 균주는 H5N1 인플루엔자와 같은 하나 이상의 병원체에 대하여 피험체를 쉽게 백신접종하는데 사용될 수 있는 벡터를 제공할 수 있다.
백신 벡터만큼 유용한 살모넬라 엔테리티디스 균주, 및 이러한 균주를 이용하여 만든 다양한 재조합 백신 벡터가 기술된다. 구체적으로 인플루엔자 A 바이러스의 M2e 에피토프(epitope)를 지니는 백신 벡터가 제공된다. 게다가 백신 벡터를 제조하는 방법과 CD40에 결합할 수 있는 CD154의 폴리펩타이드 또는 이의 동족체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신 벡터를 투여하여 피험체에서 면역 반응을 향상시키는 방법이 개시된다. 백신 벡터는 인플루엔자 A에 대한 면역 반응을 향상시키거나 인플루엔자 A 감염과 관련된 이환율을 감소시키는데 사용될 수 있다. 마지막으로 외부 DNA를 함유하지 않는 돌연변이체를 생성하기 위해 오버랩핑 연장 PCR과 함께 Red 재조합 시스템을 이용하여 세균에서 부위-특이적 돌연변이를 생성하는 방법이 제공된다.
살모넬라의 야생형 분리주인 살모넬라 엔테리티디스 13A (SE13A) (2006년 9월 13일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)에 기탁됨, 수탁번호 PTA-7871)는, 닭에서 점막 콜로니화와 점막하 이동을 일으켜, 상업용 닭에서 관련 항원 또는 에피토프의 강력한 제시를 허용하는 특이한 능력을 바탕으로 선택되었다. 중요하게 야생형 살모넬라 분리주는 상업용 닭에서 임상적으로 검출이 가능한 질병 또는 수행기능의 소실을 일으키지 않아, 척추동물에 있어 야생형 살모넬라의 질병 유발 잠재성이 미미함을 가리키고 있다. 닭과 같은 피험체에서 콜로니화할 수 있는 유기체의 능력은 감염 부위에서 복제할 수 있는 유기체의 능력으로서 나타내어지게 된다. 최적의 상태로서 백신 후보물은 또한 감염 부위를 벗어나 조직에 침입하고 전염될 수 있다. 실시예 4에서 나타낸 바와 같이 SE13A는 구강 감염 이후 맹장편도에서 복제가 가능하며 감염 후 수주가 지난 뒤 편도선으로부터 분리될 수 있다. 게다가 SE13A는 다른 조직에 침투할 수 있으며 간 및 비장에서 감염 후 1달이 지나서까지 나타난다.
SE13A 분리주는, 연구실이나 제조현장 이외에서 세균의 지속적인 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 불활성화시켜 추가로 약독화될 수 있다. 백신 벡터로서 사용될 수 있는 약독화된 살모넬라 균주가 아래 기술되었다. SE13A는 백신을 개발하고 향상된 면역 반응을 이루기 위해 약독화된 살모넬라 균주를 생성하는데 사용되었다. 실시예에서 나타난 바와 같이 SE13A는 가금류에 비침투적이고 비병원성이며 측정이 가능한 이환율을 일으키지 않는다. 이러한 특징은 비침입성 세균 벡터에 비하여 향상된 면역 반응을 일으킨다. 세균의 전염 능력을 제한하는 유전자의 돌연변이에 의한 SE13A의 약독화는 백신의 안전성을 증대시킬 수 있다. 실시예에서 표 4에 나타낸 바와 같이 aroA 또는 htrA내 돌연변이를 갖는 SE13A 균주는 면역 반응을 일으키는 능력을 보유하지만, 숙주에서 복제가 제한적이게 된다. 따라서, 약독화는 면역원성을 약화시키지 않으면서 백신 벡터의 안전성을 증대시킨다.
돌연변이는 cya, crp, asd, cdt, phoP, phoQ, ompR , 외막 단백질, dam, htrA 또는 기타 스트레스 관련 유전자, aro, pur 및 gua를 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 기타 살모넬라 유전자에서 행하여질 수 있다. 실시예에서 보여진 바와 같이 aroA 및 htrA의 돌연변이는 SE13A를 약독화시키는 것으로 밝혀졌다. aro 유전자는 시키메이트(shikimate) 생합성 경로 또는 아로마타제 경로와 관련된 효소이며 aro 돌연변이체는 방향족 아미노산 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌에 대하여 영양요구성을 지닌다. htrA는 비정상 단백질을 분해시키는 주변세포질 프로테아제를 암호화하는 스트레스 반응 유전자이다. htrA내 돌연변이체는 또한 약독화되고 과산화수소에 대한 증가된 민감도를 나타낸다.
실시예의 aroA 및 htrA의 돌연변이는 결실 돌연변이이지만 돌연변이는 여러가지 방식으로 이루어질 수 있다. 적절하게 돌연변이는 한 단계에서 복구될 수 없는 비복귀형 돌연변이이다. 적절한 돌연변이는 결실, 역위, 삽입 및 치환을 포함한다. 백신 벡터는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들어 백신 벡터는 aroA 및 htrA 모두에 돌연변이를 함유할 수 있다. 이같은 돌연변이를 만드는 방법은 이 기술방면에서 잘 알려져 있다.
SE13A 또는 약독화된 재조합 SE13A 유도체는 백신 벡터로서 사용되어질 수 있다. 여러 병원성 유기체로부터의 폴리펩타이드 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세균 속으로 삽입되어지고 세균에 의해 발현되어 항원성 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 세균의 염색체에 삽입되어질 수도 있고, 플라스미드 또는 기타 비염색체 DNA에 암호화될 수도 있다. 적절하게, 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이를 발현하는 세균 폴리뉴클레오타이드에 삽입되어진다. 적절하게, 세균 폴리뉴클레오타이드는 막관통 단백질을 암호화하며 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세균 폴리뉴클레오타이드 서열에 삽입되어 세균 표면상의 에피토프의 발현을 허용한다. 예를 들어, 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세균 폴리뉴클레오타이드 서열이 프레임내(in frame) 유지되어지는 식으로, 막관통 단백질의 외부 루프 영역을 암호화하는 영역내 세균 폴리뉴클레오타이드에 프레임내 삽입되어질 수 있다. 실시예 1을 참조한다.
또는, 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 분비되는 폴리펩타이드에 삽입되어질 수 있다. 당업자는 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 여러 종류의 세균 폴리뉴클레오타이드에 삽입되어져, 세균 백신 벡터로 치료받는 피험체의 면역 세포에 에피토프의 발현과 제시를 제공할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 실시예에서, 인플루엔자 A 바이러스 M2e 에피토프는 SE13A의 lamB 유전자의 루프 9 속으로 삽입되어졌고 에피토프의 표면 발현은 항체-매개된 침전에 의해 확인되어졌다. 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 1 카피(copy) 또는 1 카피 이상으로 포함되어질 수 있다. 실시예에서 lamB의 루프 9에 삽입된 M2e 에피토프를 여러 카피로 함유하는 세균 백신 벡터가 기술되어진다. 또는, 여러 카피의 에피토프는 하나 이상의 위치에서 세균 백신 벡터 속으로 삽입되어질 수 있다.
피험체의 단백질에 상동이고 면역계를 자극하여 외부 에피토프에 반응할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 백신 벡터에 삽입되어질 수 있다. 아래 보다 상세히 기술되었듯이, 백신 벡터는, 피험체에서 CD40에 결합할 수 있으며 피험체을 자극하여 백신 벡터 및 이의 관련 외부 에피토프에 반응하도록 하는 CD154 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 에피토프와 관련하여 위에 기술하였듯이, 이들 폴리뉴클레오타이드는 백신 벡터의 염색체에 삽입되거나 염색체 외부에 유지되어질 수 있다. 당업자는 이들 폴리펩타이드가 여러 폴리뉴클레오타이드에 삽입될 수 있고 백신 벡터의 여러 부분에서 발현되거나 분비되어질 수 있는 것을 인식할 것이다. 외부 에피토프에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 외부 에피토프를 암호화할 수 있다. CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 백신 벡터에서 CD154 폴리펩타이드와 외부 에피토프가 동일한 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 방식으로, 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결되어질 수 있다. 실시예에서, CD40에 결합되어질 수 있는 CD154의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 인플루엔자 A의 M2e 에피토프를 암호화한다. 첨부된 서열 목록의 서열번호 8 및 9를 참조하기 바란다. 실시예에서, M2e 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 모두 lamB 유전자의 루프 9에 삽입되어진다. 당업자는 기타 막관통 단백질을 암호화하는 세균 폴리뉴클레오타이드 및 lamB 유전자의 기타 루프가 또한 사용되어질 수 있는 것을 인식할 것이다.
SE13A 세균은 인플루엔자 M2 단백질의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. M2e로 알려진 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 엑토도메인(ectodomain)은 바이러스 표면으로부터 돌출될 수 있다. M2 단백질의 M2e 부분은 약 24개의 아미노산을 포함한다. M2e 폴리펩타이드는 주어진 종에서 분리주 간에 거의 차이가 없다. 사실 1918년 인플루엔자 전염병 이래로 M2e의 오직 몇몇의 자연적으로 발생하는 돌연변이만이 감염된 사람으로부터 분리되어졌다. 또한, 조류 및 돼지 숙주로부터 분리된 인플루엔자 바이러스는, 상이하지만 여전히 보존된 M2e 서열을 갖는다. 사람, 조류 및 돼지 숙주로부터 분리된 M2e 폴리펩타이드 서열에 대한 고찰은 문헌[Lie et al., Microbes and Infection 7:171-177 (2005), 및 Reid et al., J. Virol. 76:10717-10723 (2002)]을 참조하기 바라며, 이들은 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 또한 첨부된 서열 목록의 서열번호 1 내지 4를 참조하기 바란다.
적절하게, 전체 M2e 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 백신 벡터에 삽입되어지거나, 일부분만이 사용되어질 수 있다. 실시예에서, 8개 아미노산의 폴리펩타이드 (아미노산 서열 EVETPIRN(서열번호 5)를 갖는 LM2, 또는 아미노산 서열 EVETPTRN(서열번호 20)을 갖는 변이체 M2eA)는 SE13A에 도입되어져 닭에 투여되어진 이후 항체 반응을 생성하는 것으로 증명되었다. 적절하게, 백신 벡터에 삽입되는 M2e 폴리펩타이드의 일부분이 면역원성을 지닌다. 면역원성 단편은 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 적절하게, M2e의 면역원성 단편은 완전한 길이의 M2e 폴리펩타이드이거나, 적절히 전체 길이 서열의 20개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 또는 8개 이상의 아미노산일 수 있다.
인플루엔자 A 백신 벡터에 포함되는데 적절한 기타 에피토프는 인플루엔자 A의 헤마글루티닌 또는 핵 단백질의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 등을 포함한다. 예를 들어, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 또는 서열번호 24를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 백신 벡터에 포함되어질 수 있다. 당업자는 이들 서열 중 어느 것이라도 기타 에피토프와 함께 사용되어질 수 있고 또한 CD154 폴리펩타이드와 같은 면역 자극 펩타이드를 암호화하는 폴리펩타이드와 함께 사용되어질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
위에서 논의하였듯 에피토프에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있는 피험체의 단백질에 상동인 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 백신 벡터에 포함되어질 수 있다. 실시예에서, CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 SE13A 균주는, 백신접종에 대해 반응하여 증가된 항체 생성으로서 측정되는, M2e 에피토프에 대한 면역 반응을 향상시키는 것으로 증명되었다. 적절하게, CD154 폴리펩타이드는 50개의 아미노산 길이보다 작으며, 40개보다 작거나 30개보다 작거나 20개의 아미노산 길이보다 작은 것이 더욱 적절하다. 폴리펩타이드는 10 내지 15개 아미노산, 10 내지 20개의 아미노산 또는 10 내지 25개의 아미노산 길이일 수 있다. CD154 서열과 CD40 결합 영역은 여러 종 사이에 고도로 보존되어 있지 않다. 닭 및 사람의 Cd154 서열은 각각 서열번호 25 및 서열번호 26에 제시되어 있다.
CD154의 CD40 결합 부분은 사람, 닭, 오리, 마우스 및 소를 포함하여 여러 종에서 결정되어져 왔으며 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29에 각각 제시되어 있다. 종 사이에 CD40 결합 영역내의 서열에 있어 변이가 있으나 아래 실시예는 사람의 CD154 폴리펩타이드가 닭에서 면역 반응을 향상시킬 수 있었다는 것을 나타낸다. 그러므로 종-특이적 CD154 폴리펩타이드 또는 이종 CD154 폴리펩타이드를 사용하여 본 발명을 실시할 수가 있다.
실시예에서 다수의 SE13A 재조합 세균이 생성되었다. 각각의 SE13A 균주에서 M2e 폴리펩타이드와 CD154 폴리펩타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드상에 암호화되었으며 서로간과 이들이 삽입되어진 살모넬라 폴리뉴클레오타이드와 프레임내 있었다. 대안적 양태에서 CD154 폴리펩타이드와 M2e 폴리펩타이드는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되어질 수 있다. SE13A aroA M2e는 aroA에 결실을 포함하고, lamB의 루프 9에 삽입되어진 LM2-M2e 에피토프 (서열번호 5)를 포함한다. SE13A aroA M2e-CD154는 SE13A aroA M2e와 동일하지만, 또한 M2e 에피토프(서열번호 8 참조)를 지닌 lamB의 루프 9에 삽입되어진 CD154 펩타이드(서열번호 6)를 포함한다. 이 균주는 ATCC에 수탁번호 PTA-7872로서 기탁되어 있다.
SE13A htrA M2E는 htrA내 결실을 포함하며 lamB의 루프 9에 삽입된 M2e-LM2에피토프를 보유한다. SE13A htrA M2E-CD154는, M2e 에피토프 (서열번호 8)를 보유한 lamB의 루프 9에 삽입된 CD154 펩타이드를 가지며, ATCC에 수탁번호 PTA-7873으로서 기탁되어 있다.
SE13A HM으로 명명 균주는 lamB의 루프 9에 삽입된 서열번호 9를 보유한다. 이 균주는 CD154 폴리펩타이드 (서열번호 6) 및 M2e-LM2 (서열번호 5) 및 M2eA (서열번호 20)라고 하는 M2e의 2개의 에피토프를 여러 카피로 보유한다.
실시예에서 위에 기술된 재조합 살모넬라 균주들은, 인플루엔자 바이러스의 M2e 에피토프에 대해, 높고 추정적인 형태로서의 보호적인 항체 역가를 생성하는 것으로 증명되었다. 게다가 면역자극 분자의 발현이 항체의 역가를 더욱 증가시키는 것으로 밝혀져, 이 개념과 이들 특정 세균 백신 벡터의 기능성을 확증하였다.
약독화된 살모넬라 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 생체내 투여에 적합한 임의의 담체이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 완충 용액, 글루코즈 용액 또는 세균 배양액을 포함할 수 있다. 조성물의 추가적 요소는 안정화제, 보존제, 희석제, 유화제 및 윤활제와 같은 부형제를 적절히 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 예로서는 안정화제, 예를 들어 탄수화물(예: 소르비톨, 만니톨, 녹말, 수크로즈, 글루코즈, 덱스트란), 알부민 또는 카세인과 같은 단백질, 소의 혈청 또는 탈지우유와 같은 단백질 함유제 및 완충제 (예: 인산염 완충제)를 포함한다. 특히 이같은 안정화제가 조성물들에 추가되어질 때, 조성물은 동결 건조 또는 분무 건조에 적합하다.
CD40에 결합할 수 있으며 CD40을 활성화시킬 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 함유하는 백신 벡터를 투여하여 피험체에서 면역 반응을 향상시키는 방법이 또한 제공된다. CD40에 결합할 수 있는 CD154의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴레뉴클레오타이드를 포함하는 백신 벡터가 백신에 대한 피험체의 면역 반응을 향상시키는데 유효한 양으로서 피험체에 투여된다. 적절한 형태로서 백신 벡터는 사람 CD154 폴리펩타이드 (서열번호 26)의 아미노산 140 내지 149 또는 이의 동족체를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇의 적절한 폴리펩타이드는 본원에서 확인되어 있다. 적절하게, 폴리뉴클레오타이드는 피험체와 동일한 종으로부터의 CD154 폴리펩타이드를 암호화한다. 적절한 형식으로서 서열번호 6의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 사람 피험체에 사용되고, 서열번호 7의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 닭에서 사용되고, 서열번호 27의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 오리에 사용되고, 서열번호 28의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 마우스에서 사용되며, 서열번호 29의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 소에 사용되어진다. 실시예에서 사람 CD154 폴리펩타이드(서열번호 6)는 닭 백신 벡터에 사용되며 외부 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 것으로 입증된다. 그리하여 피험체와 CD154 폴리펩타이드의 다른 이종 조합물은 본 발명의 방법에 유용할 수가 있다. CD154 폴리펩타이드는 피험체에 있어 백신 벡터에 존재하는 임의의 외부 항원 또는 항원성 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 향상시키는데 사용되어질 수 있다. 당업자는 CD154 폴리펩타이드가 백신 벡터에 존재하는 하나 이상의 항원성 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 향상시키는데 사용되어질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
CD154로부터의 폴리펩타이드는 이의 수용체 CD40에 결합하여 적어도 부분적으로 면역 반응을 자극한다. 실시예에서, 피험체의 면역 세포에서 발현하며 대식세포 및 기타 항원 제시 세포상의 CD40 수용체에 결합할 수 있는 CD154에 상동인 폴리펩타이드가 사용되었다. 이러한 리간드-수용체 복합체의 결합은 다른 주위의 면역 세포(B-림프구와 같은)를 활성화시키는 것으로 알려진 사이토카인 분비를 증가시키면서, 대식세포(그리고 수지상세포와 같은 대식세포 계열 세포)를 자극하여 식균작용과 항원 제시를 향상시킨다. 이와 같이, CD154 펩타이드와 관련된 분자는 선택적으로 면역 반응 및 확장된 항체 생성에 대하여 표적화된다.
본 방법에 사용하는데 가능한 백신 벡터는 살모넬라 (살모넬라 엔테리티디스), 시겔라(Shigella), 에스케리키아(Escherichia) (이.콜라이(E. coli)), 예르시니아(Yersinia), 보르데텔라(Bordetella), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 비브리오(Vibrio) (비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)), 리스테리아(Listeria), 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등을 포함한다.
추가로 인플루엔자 A에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법과 차후의 인플루엔자 A 감염과 관련한 이환율을 감소시키는 방법이 개시된다. 간단하게 본 방법들은 피험체에 유효량의 인플루엔자 A M2e의 폴리펩타이드를 암호화하는 인플루엔자 A M2e 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세균을 투여하는 것을 포함한다. M2e 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 5 및 20을 포함한다. M2e 폴리펩타이드의 세균으로의 삽입은 본 문서에 기술된 스카리스(scarless) 부위-지시된 돌연변이 시스템 등을 포함하는 당업자에게 알려진 여러 방법들로서 달성되어질 수 있다. 세균은 또한 위에 논의된 바와 같이 서열번호 8 및 서열번호 9처럼 면역 반응을 향상시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드와 함께 M2e 폴리펩타이드를 발현하도록 조작되어질 수 있다. 특히 CD40에 결합할 수 있는 CD154의 폴리펩타이드는 피험체의 M2e 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있도록 세균에 의해 발현되어질 수 있다.
투여되는 유용한 형태의 복용량은 피험체의 연령, 체중 및 종, 투여의 방식 및 경로, 면역 반응이 요구되어지는 병원균의 유형에 따라 달리할 것이다. 조성물은 면역 반응을 일으키기에 충분한 세균 용량으로서 투여되어질 수 있다. 103개 내지 1010개의 세균, 104개 내지 109개의 세균 또는 105개 내지 107개의 세균의 투여량이 적절한 것으로 고려되어진다. 조성물은 단 1회 투여되거나 면역 반응을 증가시키기 위하여 2회 이상 투여되어질 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주 또는 3주 이상의 간격을 두고 2회 이상 투여되어질 수 있다. 세균은 투여 이전에 적절하게는 생존 상태이지만, 몇몇 양태에 있어 세균은 투여 이전에 사멸시킬 수 있다. 몇몇 양태에 있어 세균은 피험체에서 복제할 수 있지만, 다른 양태의 경우에 세균은 피험체에서 복제할 수 없을 수 있다.
사람 또는 동물에 대한 투여에 있어 조성물은 비강내, 점막, 분무, 피부내, 비경구, 피하, 경구, 에어졸로서 또는 근육내 투여 등의 여러 방법을 통하여 투여되어질 수 있다. 안구 점적 투여 또는 음료수 또는 음식에 대한 첨가는 추가적으로 적절하다. 닭의 경우 조성물은 난내(in ovo) 투여되어질 수 있다.
본 발명의 일부 양태는 피험체에서 면역 반응을 향상시키는 방법들을 제공한다. 피험체는 척추동물, 적절하게는 포유동물, 적절하게는 사람, 또는 조류, 적절하게는 닭과 같은 가금류 등을 포함하게 된다. 감염의 기타 동물 모델도 또한 사용되어질 수 있다. 면역 반응을 향상시키는 것은 피험체의 면역계에 의한 매개되는 치료 또는 예방 효과 등을 포함한다. 구체적으로서 면역 반응을 향상시키는 것은 도 3 및 4에서 제시된 바와 같은 항체의 향상된 생성, 항체 중쇄의 향상된 클래스 전환, 항원 제시 세포의 성숙, 헬퍼 T 세포의 자극, 세포용해 T 세포의 자극 또는 T 및 B 세포 기억의 유도를 포함할 수 있다.
동일하거나 상이한 병원균으로부터의 몇몇의 에피토프 또는 항원들은 다수의 항원에 대한 면역 반응을 생성하기 위하여 단일 백신 벡터에서 함께 투여되어질 수 있는 것으로 고려된다. 재조합 백신 벡터는 다수의 병원성 미생물, 바이러스 또는 종양 관련 항원으로부터의 항원을 암호화할 수 있다. 다수의 항원을 발현할 수 있는 백신 벡터의 투여는 동시에 두가지 이상의 질병에 대한 면역성을 유도하는 잇점을 보유한다. 예로서, 살모넬라 엔테리티디스 13A와 같은 살아있는 약독화된 세균은 다수의 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 적합한 백신 벡터를 제공한다.
항원을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드는 중요하지 않은 부위의 세균 게놈에 삽입되어지거나 또는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 플라스미드에 보유되어질 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 적절한 한 위치는 막관통 단백질의 외부 부분 내부가 되거나 분비 경로에 대한 이종 폴리뉴클레오타이드를 표적화하는 서열과 쌍을 이루게 된다. 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 적절한 막관통 단백질의 한 예는 lamB 유전자이다. 실시예에서 M2e 및 CD154 폴리뉴클레오타이드는 lamB 서열의 루프 9에 삽입되었다.
이종 폴리뉴클레오타이드는 백신 벡터 이외의 병원성 미생물 또는 바이러스로부터 선택된 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 등을 포함한다. 이같은 폴리뉴클레오타이드는 인플루엔자(예: M2e, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제), 헤르페스바이러스 (예: 헤르페스바이러스의 구조적 단백질을 암호화하는 유전자), 레트로바이러스 (예: gp160 외피 단백질), 아데노바이러스, 파라믹소바이러스, 코로나바이러스 등과 같은 병원성 바이러스로부터 유래될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드는 또한 병원성 세균 - 예를 들어, 독소 및 막 단백질과 같은 세균 단백질을 암호화하는 유전자 - 로부터 수득되어질 수 있다. 게다가 에이메리아(Eimeria)와 같은 기생충으로부터의 이종 폴리뉴클레오타이드는 벡터 백신의 사용에 매력적인 후보가 된다.
면역계를 유발하는 것에 관련되는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 살아있는 약독화된 살모넬라 백신과 같은 백신 벡터에 포함되어질 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 인터루킨, 종양 괴사 인자 또는 인터페론 또는 면역 조절에 관련되는 다른 폴리뉴클레오타이드와 같이, 자극 효과로서 알려진 면역계 분자를 암호화할 수 있다. 백신 벡터는 또한 본원에 기술된 CD154 폴리펩타이드와 같은 면역 반응을 자극하는 것으로 알려진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)과의 일원인 세균에서 부위-특이적 돌연변이를 생성하는 방법이 제공된다. 예시된 바와 같은 방법은 오버랩핑 연장 PCR, Red 재조합 시스템 및 역선별 마커로서의 I-SceI 엔도뉴클레아제 인식 부위의 중간 삽입을 이용하다. 대안으로서 sacB는 또한 역선별 마커로서 사용되어질 수 있다. 전체 전략이 도 1에 나타내어진다. 오버랩핑 연장 PCR은 SE13A의 게놈에 대해 긴 플랭킹 상동성을 가진 선형 DNA를 생성하기 위해 사용되었다. Red 재조합 시스템은 들어오는 선형 PCR-생성된 DNA와 세균 게놈 사이의 재조합을 매개하기 위해 사용되었다. 2단계 돌연변이 과정에서 I-SceI 부위/ Kmr 카세트는 상동 재조합에 의해 염색체에서 lamB 유전자로 삽입되었다. 이후 이 돌연변이는 바람직한 삽입 서열(LM2-M2e, CD154 또는 조합 서열)로 대체되었다. 대체를 이루기 위하여 바람직한 삽입 서열을 보유하는 PCR 산물은 첫번째와 두번째 돌연변이 사이에 역선별을 위해 사용되는 I-SceI 엔도뉴클레아제를 암호화하는 플라스미드와 동시에 추가되었다.
부위-특이적 돌연변이체를 생성하는 절차는 엔테로박테리아세애과의 어느 한 일원에 사용되어질 수 있다. 엔테로박테리아세애과는 살모넬라, 시겔라, 에스케리키아, 예르시니아등의 일원 등을 포함한다. 부위-특이적 돌연변이체는 세균의 염색체의 특정 위치를 대상으로 하는 삽입, 결실, 치환 및 대체 돌연변이 등을 포함한다. 현재 시스템의 잇점은 "스카리스(scarless)" 돌연변이 또는 외부 서열을 포함하지 않는 돌연변이를 결과로 하는 것에 있다. 그리하여, 본원에 개시된 부위-특이적 돌연변이유발은 단일 유전자 또는 단일 아미노산 또는 뉴클레오타이드가 결실된 자가 세균을 생성하기 위해 사용되어질 수 있다
실시예에서 폴리뉴클레오타이드는 오버랩핑 연장 PCR에 의해 생성되었으나 당업자는 선형 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 다른 방법들이 존재하며 활용되어질 수 있음을 인지하게 될 것이다. 선형 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 돌연변이 부위를 플랭킹하는 서열에 상동인 일부 서열을 포함하여 Red 매개된 재조합을 허용하도록 하여야 한다. 상동 서열의 양은 돌연변이 부위의 각 측면에 300개 미만의 염기쌍을 포함할 수 있다. 적절한 상동 서열은 200개 미만의 염기쌍이다. 폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 세균에 도입되어질 수 있다. 실시예에서 선형 폴리뉴클레오타이드는 세균내로 전기천공되었다.
세균 백신 벡터를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 첫째, 피험체에서 콜로니화할 수 있는 세균이 선택된다. 이후, 세균을 약독화시켜, 약독화된 세균을 생성한다. 약독화는 당업자에게 알려진 여러 방법들에 의해 수행되어질 수 있다. 최종적으로, CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 CD154 폴리뉴클레오타이드 서열을 약독화된 세균으로 도입시켜 백신 벡터를 생성하게 된다. CD154 폴리펩타이드는 50개 미만의 아미노산 길이일 수 있으며 CD154 서열번호 26의 아미노산 140 내지 149 또는 이의 동족체를 포함할 것이다. 세균 백신 벡터는 또한 항원성 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입할 수 있다. 한가지 양태에서 CD154 폴리펩타이드와 항원성 폴리펩타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열 상에서 암호화된다.
다음 실시예는 예증을 위한 목적일 뿐이며 본 발명 또는 첨부된 청구의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
실시예 1. M2e 및 M2e / CD154 삽입체의 작제 .
균주와 배양 조건
모든 플라스미드는 다른 조건이 제시되지 않는 한 먼저 TOP10 이.콜라이 세포(Invitrogen, 미국 캘리포니아 칼즈버드)에 유지되었다. 살모넬라 엔테리티디스 13A는 돌연변이의 도입을 위해 사용되었다. 살모넬라 엔테리티디스 균주 13A는 USDA/APHIS/NVSL로부터 구할 수 있는 야외 분리주였으며 ATCC에 수탁번호 PTA-7871로서 기탁되었다. 플라스미드 pKD46을 보유하는 세균은 30℃에서 성장되었다. 기타 세균은 37℃에서 성장되었다. 플라스미드 큐어링(curing)은 37℃에서 수행되었다.
Luria-Bertani (LB) 배지는 세포의 일반 성장을 위해 사용되었고, SOC 배지 (Invitrogen, 미국 캘리포니아 칼즈버드)는 전기천공법 이후 표현형 발현을 위하여 사용되었다. 적절한 경우에 다음의 항생제가 배지에 첨가되었다: 암피실린 (Amp) 100㎍/ml, 카나마이신 (Km) 50㎍/ml, 클로람페니콜 (Cm) 25㎍/ml.
플라스미드
플라스미드 pKD46, pKD13 및 pBC-I-SceI는 이전에 기술된 바 있다 (Datsenko and Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645 및 Kang et al., J Bacteriol 2004, 186:4921-4930, 두 문헌은 전문이 본원에 참조로서 인용된다). 플라스미드 pKD46은 들어오는 선형 DNA와 염색체 DNA의 상동 재조합을 매재하는 Red 리콤비나제를 암호화한다. 이 플라스미드는 또한 암피실린 내성 유전자를 포함하며 온도에 민감하여서 세포내에서의 유지를 위해 30℃를 요하게 된다. 플라스미드 pKD13은 오버랩핑 PCR에 사용된 Km 내성(Kmr) 유전자의 증폭을 위한 주형으로 기능하였다. 37℃에서 세포내 유지되어진 플라스미드 pBC-I-SceI은 다음의 18개 염기쌍의 드문 인식 서열을 절단하는 I-SceI 효소를 생성한다: 5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3'(서열번호 30). 플라스미드 pBC-I-SceI은 또한 클로람페니콜 내성 (Cmr) 유전자를 포함한다.
PCR
PCR에 사용되는 모든 프라이머는 표 1에 열거된다. 통상적으로 PCR은 전체 용적을 50㎕로 하여, 약 0.1㎍의 정제된 게놈 플라스미드 또는 PCR-생성된 DNA (Qiagen, 미국 캘리포니아 발렌시아), 1x 클로닝된 Pfu 폴리머라제 완충제, 5U Pfu 폴리머라제 (Stratagene La Jolla, 미국 캘리포니아), 1mM dNTPs(GE Healthcare Bio-Sciences Corp., 뉴저지 피스카타웨이) 및 1.2μM의 각각의 프라이머를 사용하여 수행되었다. DNA 엔진 써멀 사이클러(thermal cycler) (Bio-Rad, 미국 캘리포니아 헤르큘레스)는 다음 증폭 조건으로서 사용되었다: 94℃ 2분; 1kb당 30초간 94℃, 60초간 58℃, 90초간 72℃의 30 주기; 및 최종 연장을 위한 10분간 72℃. 각 PCR 산물은 겔 정제하여(Qiagen, 미국 캘리포니아 발렌시아), 오버랩핑 연장 PCR에 사용되눈 주형의 제조를 위하여 20㎕ EB 완충액 또는 50㎕ EB 완충액 중에 용출시켜, 에스.엔테리티디스내로의 전기천공을 위하여 에탄올 침전시키고 5㎕의 ddH2O에 현탁시켰다.
Figure 112009023178059-pct00001
표 1에서 이탤릭체의 뉴클레오타이드는 lamB 유전자 루프 9 삽입 부위의 어느 한 측에 상보적이며, 이는 주석을 단 참조 게놈으로서 에스.티피뮤리움(S. typhimurium)을 사용하는 뉴클레오타이드 1257에 상응한다. 굵은 활자체의 뉴클레오타이드는 Km-f 프라이머의 I-SceI 인식 부위를 나타낸다. 모든 다른 삽입 서열은 밑줄로 표시되었다.
전기천공법
pKD46의 에스.엔테리티디스로의 형질전환은 첫번째 단계로서 수행되어 Red 리콤비나제가 후속의 돌연변이의 재조합을 매개하는데 사용될 수 있게 하였다. 플라스미드 pKD46은 플라스미드 제조 키트(Qiagen, 미국 캘리포니아 발렌시아)를 이용하여 이.콜라이 BW25113 (Datsenko and Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645)으로부터 회수하였다. 이후 0.5㎕의 pKD46 DNA가 전기천공법을 위해 준비된 에스.엔테리티디스 13A로의 형질전환에 사용되었다 (Datsenko and Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645). 간략히, 세포는 10-15mL의 2X YT 브로쓰로 접종되고 하루밤 동안 37℃에서 성장되었다. 이후 100㎕의 하룻밤 배양액이 3 내지 4시간 동안 37℃에서 10mL의 새로운 2X YT 브로쓰에 다시 접종되었다. pKD46 플라스미드로 형질전환될 세포를 25분간 50℃에서 가열하여 숙주에 대한 제한을 불활성화하는 것을 도왔다. 세포는 ddH2O 물에서 5회 세척되었고 60㎕의 10% 글리세롤에 재현탁시켰다. 이후 세포는 1 내지 6ms 동안 2400 내지 2450kV에서 펄스를 가하고, 2 내지 3시간 동안 30℃로 SOC에서 배양되고, 적절한 항생제를 함유한 LB 배지에 접종하였다. pKD46을 사용한 에스.엔테리티디스 형질전환체를 30℃로 유지시켰다. 이들 형질전환체를 추가의 전기천공 반응을 위해 제조한 경우, 모든 단계들은 세척 1시간 전에 15% 아라비노스가 추가되어 Red 리콤비나제 효소를 유도한 것과 세포가 50℃ 가열 단계를 거치지 않은 것을 제외하고서는 동일하였다.
루프 9 상부- I- SceI / Km r - 루프 9 하부 작제물
Kmr 유전자와 함께 I-SceI 효소 인식 부위의 lamB 유전자의 루프 9로의 도입은 Red 리콤비나제 시스템(Datsenko and Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645, 전문이 본원에 참조로서 인용됨)과 오버랩핑 PCR(Horton et al., BioTechniques 1990, 8:528-535, 전문이 본원에 참조로서 인용됨)을 결합하여 수행하였다. 삽입 부위는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) LT2 (에스.티피뮤리움)를 주석된 참조 게놈으로서 사용하여 lamB 유전자의 뉴클레오타이드 1257에 상응한다. 먼저, 루프 9 삽입 부위 (각각 루프 9 상부 및 루프 9 하부)를 바로 플랭킹하는 상류 및 하류 영역은 각기 별도로 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 루프 9 상부에 대한 lam-up-f 및 lam-up-r이였으며 루프 9 하부에 대한 lam-dn-f 및 lam-dn-r이였다. 이후 pKD13 플라스미드로부터의 Kmr 유전자는 프라이머 Km-f 및 Km-r을 사용하여 증폭시켰다. 여기에, I-SceI 효소 부위는 Km-f 프라이머의 5' 말단에 합성적으로 부가된 후 loop-up-r 프라이머에 상보적인 영역이 앞에 부가되었다. 이와 마찬가지로 loop-dn-f 프라이머에 상보적인 영역은 Km-r 프라이머의 5' 말단에 부가되었다. 상보적인 영역은 모든 3개의 PCR 반응에서 주형으로서 사용되어질 때 어닐링(annealing)되게 한다. 도 2a는 이러한 고안 구조를 나타낸다. 루프 9 상부- I-SceI/ Kmr- 루프 9 하부 서열(PCR-A)로 구성되는 PCR 단편은 에스.엔테리티디스 세포로 전기천공되었으며 이는 pKD46를 보유하였고 아라비노스에 의해 유도된 이후 Km 플레이트로 LB에 접종되었다. 돌연변이의 올바른 서열 배향을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 프라이머쌍 Kan4F/lam3f 및 Kan4R/lam3r로 콜로니 PCR을 수행하였으며, 여기서 Kan4F 및 Kan4R은 Kmr 유전자-특이적 프라이머이며 lam3f 및 lam3r은 lamB 루프 9 영역 밖에 위치하는 프라이머가 된다. 이들 PCR 단편은 겔 정제하여 (Qiagen, 미국 캘리포니아 발렌시아) DNA 시퀀싱을 위해 사용되었다.
루프 9 상부- LM2 또는 CD154 또는 조합 서열- 루프 9 하부 작제물
최종 오버랩핑 PCR 단편 PCR-B는 부가된 LM2 (또는 CD154 또는 루프 9 상부 및 하부 영역에 의해 플랭킹된 조합 서열 (도 2b)를 포함하였다. 조합 서열은 글리신 (Gly) 또는 세린 (Ser) 잔기와 같은 스페이서와 함께 조류 종 (M2eA) 및 CD154와 관련된 LM2 또는 대신의 M2e 에피토프로 구성되었다. 삽입된 서열은 다음과 같다: LM2 (서열번호 37); M2eA (서열번호 38); 조합 서열 번호 1 (Gly)3-CD154-(Gly)3-LM2-(Gly)3 (서열번호 39); 및 조합 서열 번호 2 (Ser)4-M2eA-(Ser)4-M2eA-(Ser)4-CD154-(Ser)4-LM2-(Ser)4-LM2-(Ser)4 (서열번호 40).
다음 단편의 작제에 대한 단계들의 양을 줄이기 위하여, LM2 또는 CD154 서열은 합성적으로 lam-dn-f 프라이머의 5' 말단에 부가되었으며 앞에는 loop-up-r 프라이머에 상보적인 영역이 위치하였다. 루프 9 상부에 대한 이전에 사용된 PCR 산물은 최종 PCR 반응을 수행하기 위하여 LM2 또는 CD154가 루프 9 하부의 5' 말단에 도입되어진 새로 작제된 PCR 산물과 함께 사용될 수 있다. 그러나, 삽입 서열의 보다 긴 길이로 인해, 루프 9 상부를 loop-up-r 프라이머에 연결된 삽입 서열에 특이적인 부가된 뉴클레오타이드로 증폭시키기 위하여, 다른 삽입 서열(조합 서열로 칭함)의 경우에는 기타 PCR 단계가 필요하였다. 모든 다른 아미노산뿐 아니라 Gly (GGT) 및 Ser (TCC)을 위한 암호화 서열은 이.콜라이 및 살모넬라 티피뮤리움 단백질내 가장 자주 사용된 코돈의 집계 데이터를 기초로 선택되었다. 프라이머 설계에 대한 자세한 사항을 위하여 표 1을 참조하기 바란다.
I-SceI/ Kmr의 LM2 또는 CD154 또는 조합 서열로의 게놈 대체
PCR-B 산물은 약 40:1의 몰비로 플라스미드 pBC-I-SceI과 함께 에스.엔테리티디스 세포로 전기천공되었다. (Kang et al., J Bacteriol 2004, 186:4921-4930, 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 각 PCR-B 재조합 돌연변이를 위한 클론은 Km 플레이트가 아닌 Cm 플레이트에서 성장할 수 있는 능력에 따라 선택되었는데, 이는 PCR-A 서열을 암호화하는 Kmr로 PCR-B가 대체됨으로 인함이다. 선택된 클론내 변형된 영역을 PCR-증폭시키고, DNA 서열은 루프 9 하부 및 상부 증폭된 영역 바깥에 위치하는 프라이머 lam3f 및 lam3r을 사용하여 결정되었다.
I- SceI 부위/ Km r 삽입 돌연변이
첫째 돌연변이 단계는 PCR 단편 PCR-A를 고안하는 것을 포함하였고, lamB 부위에 삽입될 I-SceI 부위/ Kmr 카셋트의 캐리어로서 기능하게 된다. PCR-A는 lamB 루프 9 삽입 부위(각각 루프 9 상부 및 루프 9 하부)의 상류 및 하류 영역에 상동인 각 말단상의 약 200 내지 300bp의 플랭킹 DNA와 함께 Kmr 유전자 근처의 I-SceI 효소 인식 부위로 구성되었다. 단편은 Red 리콤비나제 효소를 발현하는 에스.엔테리티디스 세포에 도입되어 Kmr 콜로니가 선별되었다. 콜로니 PCR에 의해 몇몇 콜로니를 선별과정을 거친 이후, 양성 클론을 바람직하게 삽입된 I-SceI 부위/ Kmr 서열에 대해 서열분석하였으며, 확인된 돌연변이체는 SE164로 명명되었다.
I-SceI/ Kmr의 LM2 또는 CD154 또는 조합 서열로의 게놈 대체
2번째 돌연변이 단계는 PCR-B로 칭하여지는 도 2B에 나타낸 lamB 상동 단편에 의해 플랭킹된 최종 삽입 서열 LM2 또는 CD154 또는 조합 서열로 구성되는 PCR 단편을 작제하는 것을 요구하였다. PCR-B 앰플리콘(amplicon)은 선별 마커가 없으며 SE164에 이전의 I-SceI 부위/ Kmr 돌연변이에 대한 대체 이후 역선별되어야 한다. 플라스미드 pBC-I-SceI은 Cmr 유전자 및 I-SceI 효소를 암호화하고, 이는 SE164의 I-SceI 부위에서 게놈을 절단하게 될 것이다. 그러므로, pBC-I-SceI은 PCR-B와 함께 SE164로 전기천공되었다. PCR-A를 대체하기 위한 PCR-B의 재조합 이후, 양성 클론이 Km이 아닌 Cm에서 성장할 수 있는 능력을 기반으로서 선택되었다. PCR-B의 성공적인 재조합을 확인하기 위한 돌연변이체의 DNA 시퀀싱 이후, 균주들은 삽입 서열 LM2, CD154, (Gly)3-CD154-(Gly)3-LM2-(Gly)3 및 (Ser)4-M2eA-(Ser)4-M2eA-(Ser)4-CD154-(Ser)4-LM2-(Ser)4-LM2-(Ser)4 각각에 대해 SE172, SE173, SE180 및 SE189로 명명되었다. 각 LM2 및 CD154 삽입에 대한 10개의 무작위 클론은 lam 3f 및 lam 3r과 함께 PCR을 위하여 사용되었고, 이후 각 삽입 서열에 대한 유일한 제한 효소 부위를 사용하여 분해되었으며 분해에 의해 시험된 클론의 100%는 바람직한 돌연변이 서열에 대하여 양성이었다. 시퀀싱 결과는 LM2 또는 CD154 또는 조합 서열의 삽입이 외부 뉴클레오타이드의 부가없이 루프 9 영역에 정확히 들어갔음을 증명하였다.
실시예 2. M2e 또는 M2e / CD154 돌연변이체/ 삽입체의 약독화 .
SE13A의 약독화가 aroA 유전자 및/또는 htrA 유전자의 결실 돌연변이에 의해 달성되었다. 세균의 코리슴산 경로의 주요 유전자인 aroA유전자의 돌연변이는 심각한 대사 결손을 초래하여 이는 7개의 상이한 생화학 경로에 영향을 미친다. htrA 유전자의 돌연변이는 저온 및 고온, 낮은 pH, 산화, DNA 손상 제제에의 노출을 견디는 세포의 능력을 감소시키며 세균의 병독성을 감소시킨다.
SE13A의 결실 돌연변이를 달성하기 위하여, 에스.엔테리티디스의 세균 게놈의 표적 유전자 서열이 Km 내성 유전자 서열로 대체되었다. 이는 상기 서술한 바와 같이 오버랩핑 연장 PCR과 PCR 산물의 전기천공법을 사용하여 완료되었다. Km 내성 유전자는 목적 유전자에 상동인 서열의 200 내지 300 염기쌍으로 Km 내성 유전자를 플랭킹하여 목적 유전자(aroA 또는 htrA)를 포함하는 게놈 영역으로 표적화하였다. Km 내성 돌연변이체가 수득되게 되면, aroA 또는 htrA 결실 돌연변이는 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 생성된 aroA- 및 htrA- 살모넬라 균주는 2006년 9월 13일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁되었다 (각각 수탁번호 PTA-7872 및 수탁번호 PTA-7873). 약독화된 균주는 또한 제거 시간에 대하여 생체내에서 시험되었다. 약독화된 두 균주 모두는 야생형 13A 균주보다 빠른 제거 시간을 보유하였으나, 구강 감염 이후 닭의 간, 비장 및 맹장편도에서 콜로니화할 수 있었다. 또한, aroA 및 htrA가 없는 약독화된 균주는 또한 분리되어졌다.
실시예 3. M2e 및 CD154 의 세포 표면 발현의 확인.
M2e 및 CD154 삽입체의 세포 표면 발현은 단순한 항체/항원 침전 반응으로 확인되었다. 간략히, 폴리클로날 항체는 담체 단백질(KLH)에 접합된 M2E-LM2 (EVETPIRN; 서열번호 5) 및 CD154 (WAEKGYYTMSC; 서열번호 6)의 아미노산 서열에 대해 만들어졌다. 생성된 항체는 이후 실온에서 유리 플레이트에서 M2e-LM2, CD154 또는 M2e-LM2 및 CD154 조합 삽입체를 갖는 SE13A 야생형 (삽입체 없음) 또는 SE13A와 함께 항온배양되었으며 30초간 항온배양되었다. 세포 표면 발현은 침전의 존재 여부에 의해 결정되었다. 결과가 표 2에 나타나졌다. 양성 침전 반응은 (+)로, 음성 침전 반응은 (-)로 표시된다. 이의 결과는 SE13A 야생형이 M2e 및 CD154 펩타이드 항체와 반응하지 않은 것에 반하여 M2e, CD154 또는 M2e 및 CD154를 발현하는 균주는 적절한 항체와 반응한 것을 증명하게 되었다. 따라서, M2e 및 CD154 펩타이드는 세균 표면에 발현되어지고 있다.
침전 반응
SE13A SE13A-M2E SE13A-CD154 SE13A-M2E-CD154
M2E 항체 - + 시험 미실시 +
CD154 항체 - 시험 미실시 + +
실시예 4. 백신 연구.
부화 당일 (0일) 병아리는 지역 상업 부화장에서 구입하였으며 무작위로 처리그룹 (n=55/처리그룹)에 배분되었다. 각 처리그룹내 가능한 55마리 중 15마리의 병아리는 태그와 번호가 주어졌다. 표 3에서 나타난 바와 같이 병아리는 0.25 ml의 104, 105 또는 107 (데이타 보여지지 않음) cfu/ml의 각종 SE13A 처리로 위관영양법에 의해 경구로 감염되어졌다.
각 처리그룹의 챌린지 용량
처리그룹 챌린지 용량
SE13A-M2E 105 cfu/ml
SE13A-M2E-CD154 105 cfu/ml
SE13A-M2E aroA 104 cfu/ml
SE13A-M2E-CD154 aroA 104 cfu/ml
SE13A-M2E htrA 105 cfu/ml
SE13A-M2E-CD154 htrA 105 cfu/ml
각 처리그룹은 신선한 소나무 깔짚이 깔린 개별 우리에 수용되었고 물과 사료를 자유롭게 섭취하도록 공급하였다. 부화후 7, 14, 21 및 28일째 약 1 ml의 혈액이 15마리의 이름표가 부착된 새로부터 수집되었으며 혈청이 항체 역가를 측정하기 위하여 후의 사용을 위해 채취되었다. 동일한 일자에 각 처리그룹으로부터의 10마리의 새가 안락사되어 간, 비장 및 맹장편도가 세균 콜로니 형성(맹장편도)과 세균 침입(간 및 비장)에 대한 감정을 위하여 무균적으로 제거되었다. 각각의 간, 비장 및 맹장편도 샘플을 하룻밤동안 37℃에서 테트라티오네이트 브로쓰 중에 미리 풍부화시켰다. 다음날 각 브로쓰 배양물을 루프에 묻혀 노바비신과 날라딕스산으로 보충된 XLD 한천 플레이트를에 그었으며 하룻밤동안 37℃에서 항온배양되었다. 다음날 아침에 플레이트를 살모넬라 콜로니의 존재의 여부에 대하여 판독하였다. 세균 콜로니 형성과 침습 데이터가 처리그룹별로 표 4에 표시되었다. 표 4의 각 비는 챌린지후 7, 4, 21 및 28일째 배양된 가능한 10마리 중에서 살모넬라 양성 분리주가 회수된 새의 수를 나타낸다.
세균 콜로니 형성 및 침습

처리그룹 		콜로니 형성 (맹장 편도) 침습 (간/비장)
D7 D14 D21 D28 D7 D14 D21 D28
SE13A 9/10 3/10 5/10 2/10 8/10 8/10 2/10 4/10
SE13A-M2E-CD154 9/10 7/10 6/10 9/10 8/10 1/10 5/10 4/10
SE13A-M2E aroA 10/10 4/10 0/10 3/10 9/10 4/10 0/10 3/10
SE13A-M2E-CD154 aroA 4/10 1/10 1/10 3/10 4/10 0/10 0/10 3/10
SE13A-M2E htrA 5/10 1/10 0/10 1/10 4/10 2/10 0/10 2/10
SE13A-M2E-CD154 htrA 4/10 1/10 0/10 0/10 6/10 0/10 0/10 0/10
각 처리그룹의 새로부터 회수된 양성 살모넬라 세균 분리주는 M2e- 및/또는 CD154 삽입체를 확인하기 위해 표 1에 나타낸 각 삽입체에 특이적인 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 분석을 받게 되었다. 이 기술은 처음 새에게 주어진 균주가 회수된 균주와 동일한 것임을 확인하기 위하여 이용되었다. 각 처리그룹에서 PCR은 회수된 균주가 새를 감염시킨 균주와 동일한 것임을 확증하였다. 이의 결과는 시험을 거친 각종 살모넬라 균주로 조직의 허용가능한 콜로니 형성을 나타내었다.
실시예 5. M2e 항체 생성.
각 처리그룹의 이름표가 부착된 새에서 수집된 혈청은 M2e 항체 수준을 계산하기 위해 항원 포획 ELISA에서 사용되었다. 간략히, 96웰 플레이트의 각각의 웰을 BSA에 접합된 5 ㎍/ml의 M2e-LM2 에피토프(EVETPIRN: 서열번호 5)로 코팅하였다. 항원 부착이 4℃에서 하룻밤동안 시행되었다. 플레이트는PBS + 0.05% Tween 20으로 헹구었고 2시간 동안 이전에 상기 기술된 바와 같이 각 6개의 처리그룹의 새로부터 수집된 혈청과 함께 항온처리되었다. 플레이트를 PBS + 0.05% Tween 20으로 헹구고, 추가로 1시간 동안 Jackson ImmunoResearch Laboratories (펜실베니아 West Grove)에서 구입한 퍼옥시다제 접합된 염소 항-닭 IgY 2차 항체 (1:10,000 희석)와 함께 항온처리하였다. 이후 세척을 거쳐 Fisher Scientific에서 구입한 퍼옥시다제 기질 키트를 사용하여 플레이트를 발색시키고, 450nm와 405nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다.
각 플레이트는 또한 양성 대조군 및 음성 대조군을 함유하였고, 여기서 위의 기술된 M2e 폴리클로날 항체 및 처리되지 않은 새로부터의 닭 혈청은 각각 처리그룹으로부터의 혈청을 대체한다. 양성 대조군, 음성 대조군 및 실험 샘플에 대하여 얻은 흡광도는 다음 계산식을 이용하여 샘플 대 양성 대조군 비(S/P 비)를 계산하기 위해 사용되었다:
S/P 율 계산: 샘플 평균 - 음성 대조군 평균
양성 대조군 평군 - 음성 대조군 평균
각 그룹의 계산된 S/P 비는 표 3 및 4에 나타내었다. 이처럼 M2e-CD154를 발현하는 각 그룹의 M2e-특이적 항체의 수준은 M2e만을 발현하는 이들의 각 그룹과 비교시에 평균 30% 이상이 더 높은 ELISA 시그날을 생성하였다. 이 데이터는 SE13A-M2e 및 SE13A-M2e-CD154가 M2e에 대한 강력한 항체반응을 유도할 수 있음을 입증한다. 이 반응은 CD154 펩타이드의 추가로 분명하게 증가되었다. 또한, aroA 또는 htrA 영양요구성 SE13A 균주를 사용한 경우 유사한 반응이 생성되었다. 이들 균주는 강력한 면역 반응 생성의 희생없이 임상적 사용을 위한 보다 안전한 백신 벡터를 제공할 수가 있을 것이다.
실시예 6. 바이러스 중화.
위의 기술된 재조합 SE 벡터에 대하여 생성된 항혈청 (각 실험에서 부스터 면역접종 후 2주 뒤 수집됨)은 표준 프로토콜(Charles River Laboratories)을 사용하여 H9N2 인플루엔자(Charles River Laboratories, 코네티컷 Franklin)를 사용해 바이러스 중화 시험을 거치었다. 표 5를 참조하기 바란다. 중화 지수는 백신접종된 닭으로부터의 항혈청이 조류 인플루엔자를 중화하고 이로서 바이러스로부터 배아를 보호하는데 효과적임을 나타내었다 (두 연구에서 6.3 내지 8.8의 범위인 VN 역가). 합성 M2e 펩타이드에 대하여 생성시킨 과면역 혈청은 양성 대조군으로서 사용되었다.
바이러스 중화
SE 균주 중화 지수
SE aroA M2E 7.5
SE aroA M2E-CD154 8.3
SE aroA M2E(멀티-카피)-CD154 8.3
양성 대조군 8.3
실시예 7. 챌린지 연구.
바이러스
이들 연구에서 사용된 인플루엔자 바이러스는 A/Turkey/Virginia/158512/2002 (TV/02) H7N2 LP 조류 인플루엔자 (LPAI H7N2) 및 A/Egret/Hong Kong/757.2/2002 (Eg/02) H5N1 HP 조류 인플루엔자 (HPAI H5N1)이였다. 바이러스는 앞에서 서술한 바와 같이 9 내지 11일된 배아를 가진 SPF(특정 병원균 미함유) 달걀에서 성장되고 적정되었다 (Suarez et al., J Virol. 1998 Aug; 72(8):6678-88.).
닭 및 사육
LP 및 HPAI 챌린지를 위해 닭은 USDA입증 생물학적 안전성 3급 농업설비물의 HEPA 필터를 함유하는 음압 스테인리스 스틸 Horsfall 유닛으로 옮겨졌다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 공급되었다.
혈청학 및 바이러스 분리.
적혈구 응집 억제 시험이 앞에서 기술한 바와 같이 실험 I의 0일, 실험 II의 0일 및 14일에 수집된 혈청과 함께 BPL-불활성화된 상동 H5N1 항원으로 수행되었다 (Suarez et al., 1998). 역가 > 3 (log2)은 양성으로 고려되었다. 챌린지후 2일 및 4일째 구강 및 배설강 면봉으로부터의 바이러스 분리가 앞에서 기술한 바와 같이 배아를 가진 SPF 달걀의 9일 내지 11일에 수행되었다 (Tumpey et al., Avian Dis. 2004 Jan-Mar;48(1):167-76). 간략히, 바이러스의 분리를 위해 챌린지후 0, 2, 4일째 각각의 새로부터의 면봉을 항생제(1000 단위/ml 페니실린 G, 200 ㎍/ml 겐타마이신 설페이트 및 4 ㎍/ml 암포테리신 B; Sigma Chemical Company, 몬타나 세인트 루이스)를 함유한 2ml 뇌-심장 주입(BHI) 브로쓰에 수집하였다.
웨스턴 블롯 .
전체 바이러스(H5N1 및 H7N2)로부터 정제된 AIV 단백질이 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 이전에 기술한 바와 같이 이동되었다 (Kapczynski and Tumpey, Avian Dis. 2003 Jul-Sep;47(3):578-87). 간략히, 이전에 ΔSE M2e-HM (1:1000)으로 면역접종된 새로부터의 항-M2e 혈청이 실온에서 1시간 동안 AIV 항원을 함유하는 막과 함께 항온처리되었다. PBS-Tween 20 (0.05%)에서 3회의 세척 이후, 막을 1시간 동안 1:2000 희석에서 서양 고추냉이 퍼옥시다제-표지된 염소 항-닭 IgG 2차 항체(Southern Biotech Associates, Inc, 알라바마 Birmingham)와 반응시켰다. 위와 같이 세척한 후, 막을 제조업체의 권장사항에 따라 ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences, 뉴저지 Piscataway)와 반응시키고, Hyperfilm ECL (Amersham Biosciences)에 노출시켰다. 필름은 제조업체의 권장사항에 따라 Kodak GBX 현상 시약(Eastman Kodak Company)을 사용하여 현상하였다.
보호 연구.
최초의 실험은 이환율 및 바이러스 배출의 감소를 측정하기 위하여 LPAI TV/02 (새 한 마리당 106 EID50 (EID는 배아 감염 용량을 말함))로 챌린지한 ΔSE M2e-HM (서열번호 9 삽입 서열을 갖는 멀티-카피 M2e-CD154) 살모넬라로 백신접종한 닭의 보호를 평가하기 위해 고안되었다. 이후, HPAI Eg/02 챌린지로부터의 보호는 이환율, 사망률 및 바이러스 배출에 관해 치사량에 가까운 용량(새 한 마리당 0.1 CLD50 (CLD는 병아리 치사량을 말함))과 치사량(새 한 마리당 100 CLD50)을 이용하여 조사되었다.
실험 I. LPAI H7N2로의 챌린지
10마리의 1일령 SPF 닭 그룹을 3개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1 및 2의 새는100 ㎕의 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 모의 백신접종을 받았다. 그룹 3의 새는 ΔSE M2e-HM으로 백신접종받았다. 3주 후 (21일) SPF 닭의 3개 그룹은 식염수(그룹 1 및 2) 또는 재조합 살모넬라 벡터 백신(그룹 3)을 사용하여 동일한 2차 백신접종(부스트)을 받았다. 부스트 3주 이후 (42일), 그룹 2 및 3의 새를 비강내로(IV) TV/02 (LPAI H7N2)의 새 한 마리당 106 배아 감염 용량 50 (EID50)으로 챌린지하였다. 챌린지되지 않은 새는 비강내 경로로 100 ㎕ PBS로 모의 챌린지되었다. 챌린지 이후, 감염 후(PI) 14일 동안 매일 질병을 모니터하였다. LPAI H7N2로의 챌린지 이후의 이환율의 결과가 도 5에 도시되었으며 이로서 M2E 및 CD154를 발현하는 SE13A로의 백신접종 이후 이환율의 상당한 감소가 입증되었다. 바이러스 배출의 발생율을 측정하기 위하여, 구강 및 배설강 면봉을 감염후 2 및 4일째 수거하였다. 감염 후 2 및 4일째 LPAI H7N2로의 챌린지 이후 바이러스 배출의 양은 도 6에 도시되었으며 이로서 SE13A-HM의 백신접종은 또한 병아리에서 복제할 수 있는 AI의 능력을 감소시킴을 입증하여 주었다.
실험 II . HPAI H5N1으로의 챌린지
10마리의 1일령 SPF 닭 그룹을 5개 그룹으로 나뉘었다. 그룹 1, 2 및 3의 새는100 ㎕의 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 모의 백신접종을 받았다. 그룹 4 및 5의 새는 실험 I에 기술한 바와 같이 ΔSE M2e-HM으로 백신접종받았다. 42일째 그룹 1의 새는 비강내 경로로 100 ㎕ PBS로 모의 챌린지하였다. 그룹 2 및 3의 새는 각각 새 한 마리당 0.1 및 100 CLD50 Eg/02 (HPAI H5N1)로 챌린지하였다. 그룹 4 및 5의 새는 각각 새 한 마리당 0.1 및 100 CLD50 Eg/02 (HPAI H5N1)로 챌린지하였다. 챌린지 이후, 감염 후 14일 동안 매일 이환율 및 사망률을 모니터하였다. 심한 임상적 징후를 보이는 닭은 나트륨 펜토파르비탈을 과량 투여하여 안락사시켰다. HPAI H5N1으로의 챌린지 이후 이환율의 결과는 도 7에 도시되었고 이로서 M2E 및 CD154를 발현하는 SE13A로의 백신접종 이후 이환율의 상당한 감소가 입증되었다. 바이러스 배출의 발생을 측정하기 위하여, 구강 및 배설강 면봉을 감염후 2 및 4일째 수거하였다. 감염 후 2 및 4일째 HPAI H5N1으로의 챌린지 이후 바이러스 배출의 양은 도 8에 도시되었으며 이로서 SE13A-M2e의 백신접종은 또한 병아리에서 복제할 수 있는 AI의 능력을 감소시킴을 입증하여 주었다.
<110> The Board of Trustees of the University of Arkansas <120> Compositions and methods of enhancing immune responses <130> 013961-9010-WO00 <150> US 60/825,983 <151> 2006-09-18 <160> 40 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 1 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 3 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 4 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 5 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 7 Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 8 Gly Gly Gly Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Gly Gly Gly 20 25 <210> 9 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 Ser Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Ser Ser Ser Glu 1 5 10 15 Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Ser Ser Ser Ser Trp Ala Glu Lys Gly 20 25 30 Tyr Tyr Thr Met Ser Ser Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg 35 40 45 Asn Ser Ser Ser Ser Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Ser Ser Ser 50 55 60 Ser 65 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Salmonella enteritidis <400> 10 tgtacaagtg gacgccaatc 20 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Salmonella enteritidis <400> 11 gttatcgccg tctttgatat agcc 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Salmonella enteritidis <400> 12 atttcccgtt atgccgcagc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Salmonella enteritidis <400> 13 gttaaacaga gggcgacgag 20 <210> 14 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 14 gctatatcaa agacggcgat aactaactat aacggtccta aggtagcgaa tttccgggga 60 tccgtcga 68 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 15 gctgcggcat aacgggaaat tgtaggctgg agctgcttcg 40 <210> 16 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 16 gctatatcaa agacggcgat aacgaagttg aaaccccgat tcgtaacatt tcccgttatg 60 ccgcagcg 68 <210> 17 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 17 gctatatcaa agacggcgat aactgggcag aaaaaggtta ttataccatg tctatttccc 60 gttatgccgc agc 73 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Salmonella enteritidis <400> 18 gccatctcgc ttggtgataa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Salmonella enteritidis <400> 19 cgctggtatt ttgcggtaca 20 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 20 Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn 1 5 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 21 Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln 1 5 10 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 22 Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Glu Leu <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 23 Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 24 Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 272 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 25 Met Asn Glu Ala Tyr Ser Pro Ala Ala Pro Arg Pro Met Gly Ser Thr 1 5 10 15 Ser Pro Ser Thr Met Lys Met Phe Met Cys Phe Leu Ser Val Phe Met 20 25 30 Val Val Gln Thr Ile Gly Thr Val Leu Phe Cys Leu Tyr Leu His Met 35 40 45 Lys Met Asp Lys Met Glu Glu Val Leu Ser Leu Asn Glu Asp Tyr Ile 50 55 60 Phe Leu Arg Lys Val Gln Lys Cys Gln Thr Gly Glu Asp Gln Lys Ser 65 70 75 80 Thr Leu Leu Asp Cys Glu Lys Val Leu Lys Gly Phe Gln Asp Leu Gln 85 90 95 Cys Lys Asp Arg Thr Ala Ser Glu Glu Leu Pro Lys Phe Glu Met His 100 105 110 Arg Gly His Glu His Pro His Leu Lys Ser Arg Asn Glu Thr Ser Val 115 120 125 Ala Glu Glu Lys Arg Gln Pro Ile Ala Thr His Leu Ala Gly Val Lys 130 135 140 Ser Asn Thr Thr Val Arg Val Leu Lys Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala 145 150 155 160 Pro Thr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr His Glu Gly Lys Leu Lys Val Glu 165 170 175 Lys Ala Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Val Ser Phe Cys Thr Lys 180 185 190 Ala Ala Ala Ser Ala Pro Phe Thr Leu Tyr Ile Tyr Leu Tyr Leu Pro 195 200 205 Met Glu Glu Asp Arg Leu Leu Met Lys Gly Leu Asp Thr His Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Leu Cys Glu Leu Gln Ser Ile Arg Glu Gly Gly Val Phe 225 230 235 240 Glu Leu Arg Gln Gly Asp Met Val Phe Val Asn Val Thr Asp Ser Thr 245 250 255 Ala Val Asn Val Asn Pro Gly Asn Thr Tyr Phe Gly Met Phe Lys Leu 260 265 270 <210> 26 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Anas sp. <400> 27 Trp Asn Lys Thr Ser Tyr Ala Pro Met Asn 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 28 Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 29 Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Leu Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 tagggataac agggtaat 18 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 31 caaaagcgct ctgaagttcc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 32 gcgtgagggg atcttgaagt 20 <210> 33 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 33 tgggcagaaa aaggttatta taccatgtct ggtggtggtg aagttgaaac cccgattcgt 60 aacggtggtg gtatttcccg ttatgccgca gc 92 <210> 34 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 34 agacatggta taataacctt tttctgccca accaccaccg ttatcgccgt ctttgatata 60 gcc 63 <210> 35 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 35 tgggcagaaa aaggttatta taccatgtct tcctcctcct ccgaagttga aaccccgatt 60 cgtaactcct cctcctccga agttgaaacc ccgattcgta actcctcctc ctccatttcc 120 cgttatgccg cagc 134 <210> 36 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 36 agacatggta taataacctt tttctgccca ggaggaggag gagttacggg tcggggtttc 60 aacttcggag gaggaggagt tacgggtcgg ggtttcaact tcggaggagg aggagttatc 120 gccgtctttg atatagcc 138 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 37 gaagttgaaa ccccgattcg taac 24 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 38 tgggcagaaa aaggttatta taccatgtct 30 <210> 39 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 39 ggtggtggtt gggcagaaaa aggttattat accatgtctg gtggtggtga agttgaaacc 60 ccgattcgta acggtggtgg t 81 <210> 40 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 40 tcctcctcct ccgaagttga aaccccgacc cgtaactcct cctcctccga agttgaaacc 60 ccgacccgta actcctcctc ctcctgggca gaaaaaggtt attataccat gtcttcctcc 120 tcctccgaag ttgaaacccc gattcgtaac tcctcctcct ccgaagttga aaccccgatt 180 cgtaactcct cctcctcc 198

Claims (106)

  1. 항원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 CD154 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 백신 벡터로서, 상기 CD154 폴리펩타이드가 50개 미만의 아미노산을 가지고, 서열번호 26의 아미노산 140 내지 149 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 항원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 CD154 폴리뉴클레오타이드 서열이 백신 벡터의 표면에 발현되는, 백신 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이, 인플루엔자 M2e 폴리펩타이드를 암호화하는 인플루엔자 M2e 폴리뉴클레오타이드인, 백신 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원성 폴리펩타이드 및 CD154 폴리펩타이드가 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고, 막관통 단백질의 외부 부분을 암호화하는 서열 내로 삽입되는, 백신 벡터.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CD154 폴리펩타이드가 25개 미만의 아미노산을 갖는, 백신 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 백신 벡터가 세균인, 백신 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세균이 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)과의 일원인, 백신 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세균이 (a) ATCC 수탁번호가 PTA-7871인 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), (b) 피험체에서 콜로니화(colonization) 할 수 있는 살모넬라 균주, (c) 방향족화 경로내에 돌연변이를 포함하는 살모넬라 균주, (d) aroA 내에 돌연변이를 포함하는 살모넬라 균주, (e) 스트레스 반응 경로내에 돌연변이를 포함하는 살모넬라 균주 및 (f) htrA 내에 돌연변이를 포함하는 살모넬라 균주 중 어느 한 살모넬라 균주인, 백신 벡터.
  8. 제2항에 있어서, 인플루엔자 A M2e 폴리펩타이드가, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 20의 8개 이상의 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 백신 벡터.
  9. 인플루엔자 A에 대한 피험체의 면역 반응을 향상시키는데 유효한 백신의 제조를 위한, 인플루엔자 A M2e 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 인플루엔자 A M2e 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세균으로서,
    50개 미만의 아미노산을 가지며 CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 CD154 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하며,
    상기 인플루엔자 A M2e 폴리펩타이드 및 CD154 폴리펩타이드는 세균의 표면에 발현되고 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 세균.
  10. 인플루엔자 A-관련 이환율을 감소시키는데 유효한 백신의 제조를 위한, 인플루엔자 A M2e 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 인플루엔자 A M2e 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세균으로서,
    50개 미만의 아미노산을 가지고 CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 CD154 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하며,
    상기 인플루엔자 A M2e 폴리펩타이드 및 CD154 폴리펩타이드는 세균의 표면에 발현되고 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 세균.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 인플루엔자 A M2e 폴리펩타이드가, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 20의 8개 이상의 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 세균.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 인플루엔자 A M2e 폴리뉴클레오타이드 서열이, 막관통 단백질의 외부 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 내로 삽입되는, 세균.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 세균이 엔테로박테리아세애과의 일원인, 세균.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세균이 (a) ATCC 수탁번호가 PTA-7871인 살모넬라 엔테리티디스, (b) 피험체에서 콜로니화할 수 있는 살모넬라 균주, (c) 방향족화 경로내에 돌연변이를 포함하는 살모넬라 균주, (d) aroA 내에 돌연변이를 포함하는 살모넬라 균주, (e) 스트레스 반응 경로내에 돌연변이를 포함하는 살모넬라 균주 및 (f) htrA 내에 돌연변이를 포함하는 살모넬라 균주 중 어느 한 살모넬라 균주인, 세균.
  15. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 CD154 폴리뉴클레오타이드 서열이, 막관통 단백질의 외부 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 내로 삽입되는, 세균.
  16. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 CD154 폴리펩타이드가, 서열번호 26의 아미노산 140 내지 149 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하는, 세균.
  17. 제1항, 제2항, 제8항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항의 백신 벡터 또는 세균을, 면역 반응을 향상시키기에 효과적인 양으로 사람이 아닌 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 사람이 아닌 피험체에서 면역 반응을 향상시키는 방법.
  18. a) 피험체에서 콜로니화할 수 있는 세균을 선택하는 단계;
    b) 상기 세균을 약독화시켜, 약독화된 세균을 생성하는 단계;
    c) CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩타이드를 암호화하는 CD154 폴리뉴클레오타이드 서열을, 상기 약독화된 세균 내로 도입하여, 백신 벡터를 생성하는 단계로서, 상기 CD154 폴리펩타이드는 50개 미만의 아미노산을 가지며, 서열번호 26의 아미노산 140 내지 149 또는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하는 단계: 및
    d) 항원성 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열을 상기 백신 벡터의 염색체 내로 도입하는 단계
    를 포함하고, 이때, 상기 항원성 폴리뉴클레오타이드 서열 및 CD154 폴리뉴클레오타이드 서열은 막관통 단백질의 외부 부분을 암호화하는 서열 내로 삽입되는, 세균 백신 벡터의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 CD154 폴리펩타이드 및 항원성 폴리펩타이드가 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는, 방법.
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