PT2066339E - Composições e métodos de potenciar respostas imunes - Google Patents

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Young Min Kwon
Kimberly Cole
Mandy Cox
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Texas A & M Univ Sys
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Description

ΕΡ2066339Β1
DESCRIÇÃO
"COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE POTENCIAR RESPOSTAS IMUNES" PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica prioridade sobre o Pedido Temporário U.S. N.° 60/825,983, submetido a 18 de setembro de 2006.
DECLARAÇÃO REFERENTE A INVESTIGAÇÃO FINANCIADA A NÍVEL FEDERAL
Esta invenção foi feita com o apoio do governo dos Estados Unidos atribuído pelos Institutos Nacionais de Saúde bolsa R21 AI063137. Os Estados Unidos podem ter certos direitos nesta invenção.
INTRODUÇÃO A infeção pelo vírus da Influenza, particularmente influenza aviária H5N1, representa uma preocupação económica e sanitária crescente. A evidência indica claramente que ο H5N1 continua a circular entre aves e suínos suscetíveis em regiões estendidas por todo o mundo. Muitos cientistas pensam que se se deixar de monitorizar, a influenza aviária H5N1 atual mutará para permitir a transmissão entre humanos e causar uma pandemia mundial. Com uma taxa de mortalidade superior a 50%, tal surto seria devastador. Independentemente da capacidade do vírus de causar doença humana, a influenza aviária H5N1 já está a ameaçar ter um impacto económico enorme devido à erradicação de bandos de aves domésticas nas áreas afetadas. Portanto, é necessário o desenvolvimento de uma vacina para proteger humanos, aves domésticas, suínos e 1 ΕΡ2066339Β1 outros animais domésticos da influenza H5N1. Uma vacina contra a influenza que seja capaz de proteger contra o H5N1, bem como contra outros vírus de influenza, poderia ser ótimo. VEGA MAR10 I ET AL., IMMUNOLOGY, volume 110, número 2, outubro de 2003, páginas 206-216 descreve uma proteína de fusão OmpC de Salmonella typhi que expressa a estirpe de aminoácido Trpl40-Serl49 de CD154. Os autores reportam que a proteína de fusão liga CD40 e ativa uma linha de células de linfoma B. O documento WO2006/1105972 descreve um organismo transgénico que expressa um ácido nucleico que codifica CD40L e para utilizações do mesmo como um medicamento ou como uma vacina. Também são revelados uma composição de vacina ou farmacêutica que compreende dito organismo transgénico, métodos para tratar um sujeito infetado com dito organismo e métodos para estimular uma resposta imune contra doença(s) causada(s) por dito organismo num sujeito em necessidade do mesmo.
SUMÁRIO São reveladas as estirpes 13A de Salmonella enterltidis com os números de depósito ATCC PTA-7871, PTA-7872 ou PTA-7873. Também é revelada uma composição que compreende uma estirpe de Salmonella atenuada e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Num outro aspeto, são providenciados métodos de potenciar uma resposta imune num sujeito administrando um vetor vacina ao sujeito. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo de CD 154 capaz de ligar CD40, o polipeptídeo com menos de 50 aminoácidos e compreendendo os aminoácidos 140-149 da SEQ. ID N.° 26 ou um homólogo do mesmo. O vetor vacina é administrado ao sujeito numa quantidade eficaz para potenciar a resposta imune do sujeito à vacina. 2 ΕΡ2066339Β1
Num aspeto adicional, são providenciados métodos de potenciar a resposta imune contra Influenza A num sujeito administrando ao sujeito uma bactéria que compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo da proteína M2e da Influenza A numa quantidade eficaz para potenciar a resposta imune do sujeito à Influenza A.
Ainda num outro aspeto, são providenciados métodos de reduzir a morbidez associada à infeção pela Influenza A num sujeito administrando ao sujeito uma bactéria que compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo da proteína M2e da Influenza A numa quantidade eficaz para reduzir a morbidez associada à infeção subsequente com Influenza A.
Ainda num outro aspeto, são providenciados métodos de qerar mutações sítio-específicas numa bactéria. É gerado um primeiro polinucleotídeo que compreende um marcador de contra-seleção e um marcador de resistência a antibiótico flanqueado pelos polinucleotídeos homólogos às sequências que flanqueiam um local de mutação no cromossoma da bactéria. 0 primeiro polinucleotídeo é depois introduzido na bactéria e após recombinação homóloga e seleção de antibiótico um intermediário é isolado. É gerado um segundo polinucleotídeo que compreende a mutação flanqueada pelos polinucleotídeos homólogos às sequências que flanqueiam o local de mutação. 0 segundo polinucleotídeo é depois introduzido no intermediário e o mutante específico de local é isolado contra-selecionando pela perda do marcador de contra-seleção.
Ainda num aspeto adicional, são providenciados métodos para desenvolver vetores vacina bacterianos. É selecionada uma bactéria capaz de colonizar um sujeito. A bactéria é atenuada e um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo de CD 154 capaz de ligar a CD40 é incorporado na bactéria. 3 ΕΡ2066339Β1
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa o esquema para fazer mutações sítio-dirigidas em Salmonella enteritidis. A Figura 2 representa o esquema do desenho do método de PCR de extensão sobreposta utilizado para gerar as inserções M2e e M2e-CD154 no loop 9 do polinucleotideo lamB. A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra a quantidade relativa de anticorpo no soro gerado nos pontos temporais indicados em resposta à administração do tratamento indicado. A Figura 4 é um gráfico de linhas que mostra a quantidade de anticorpo no soro ao longo do tempo após administração dos tratamentos indicados. A Figura 5 é um gráfico que mostra a morbidez das galinhas após vacinação com SE HM no dia da eclosão, reforço ao dia 21 e infeção de desafio com uma Influenza A de baixa patogenicidade 32 dias após a eclosão. A Figura 6 é um gráfico que mostra a libertação de vírus nos dias 2 e 4 após o desafio com uma Influenza A de baixa patogenicidade após vacinação com SE HM no dia de eclosão, reforço ao dia 21 e infeção de desafio ao dia 32 após a eclosão. A Figura 7 é um gráfico que mostra a morbidez das galinhas após vacinação com SE HM no dia de eclosão, reforço ao dia 21 e infeção de desafio com uma Influenza A de alta patogenicidade 32 dias após a eclosão. A Figura 8 é um gráfico que mostra a libertação de vírus nos dias 2 e 4 após o desafio com uma Influenza A de alta patogenicidade após vacinação com SE HM no dia de eclosão, reforço ao dia 21 e infeção de desafio ao dia 32 após a eclosão. 4 ΕΡ2066339Β1
DESCRIÇÃO DETALHADA
Tecnologias de ADN recombinante permitem uma manipulação relativamente fácil de muitas espécies de bactérias e vírus. Algumas bactérias e vírus são não patogénicos ou moderadamente patogénicos, mas são capazes de gerar uma resposta imune robusta. Estas bactérias e vírus tornam os vetores vacina interessantes para despoletar uma resposta imune a um antígeno heterólogo ou estranho. Vetores vacina bacterianos ou virais podem imitar a infeção natural e produzir imunidade duradoura e robusta. Os vetores vacina são, com frequência, relativamente baratos de produzir e administrar. Além disso, tais vetores podem frequentemente transportar mais do que um antígeno e podem providenciar proteção contra múltiplos agentes infeciosos.
Num aspeto, esta revelação relaciona-se com a utilização de vetores de Salmonella na vacinação e geração de respostas imunes contra Salmonella e outros agentes patogénicos. As estirpes de Salmonella fazem vetores vacina adequados, por causa da capacidade de tornarem as bactérias capazes de expressar polipeptídeos heterólogos. Além disso, os genes bacterianos podem ser mutados ou atenuados para criar bactérias com baixa a nenhuma patogénese ao sujeito infetado ou imunizado, enquanto mantém a imunogenicidade. A capacidade da Salmonella sobreviver ao trato gastrointestinal do hospedeiro e originar uma resposta imune da mucosa é documentada. Vacinas orais que utilizam um vetor de Salmonella produzem uma resposta imune da mucosa robusta e são relativamente fáceis de administrar tanto a animais como a humanos. Muitas das estirpes de vacina de Salmonella atuais não são tão eficazes em gerar uma resposta imune protetora forte quando comparadas com as suas correspondentes mais virulentas. Uma estirpe de Salmonella que poderia ser utilizada para vacinação eficaz 5 ΕΡ2066339Β1 mucosal, por exemplo, oral, providenciaria um vetor que poderia ser utilizado para vacinar rapidamente um sujeito contra um ou mais agentes patogénicos, tais como influenza H5N1.
Uma estirpe de Salmonella enteritidis útil como um vetor vacina, e vários vetores vacina recombinantes feitos utilizando esta estirpe, são descritos. Especificamente, um vetor vacina que transporta o epítopo M2e do vírus da Influenza A é providenciado. Além disso, são revelados métodos de desenvolver vetores vacina e métodos de potenciar uma resposta imune num sujeito administrando um vetor vacina que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CD154 ou um homólogo do mesmo que é capaz de ligar a CD40. Os vetores vacina podem ser utilizados para potenciar uma resposta imune contra Influenza A ou para reduzir a morbidez associada à infeção por Influenza A. Finalmente, é providenciado um método de gerar mutações sítio-específicas numa bactéria utilizando o sistema de recombinação Red em conjunto com PCR de extensão sobreposta para gerar mutantes que não contêm qualquer ADN estranho.
Um isolado de tipo selvagem de Salmonella, Salmonella enteritidis 13A (SE13A) (depositado com a Coleção de Culturas Tipo Americana (ATCC) a 13 de setembro de 2006, número de depósito PTA-7871), foi selecionado com base na sua capacidade invulgar de causar colonização mucosal e translocação submucosal em galinhas, permitindo a apresentação robusta de antígenos associados ou epítopos em galinhas comerciais. De forma importante, este isolado de tipo selvagem de Salmonella não causa qualquer doença clinicamente detetável ou perda de desempenho em galinhas comerciais, o que indica baixo potencial causador de doença do tipo selvagem de Salmonella em animais vertebrados. A capacidade de um organismo de colonizar um sujeito, tal como uma galinha, é indicada pela capacidade do organismo 6 ΕΡ2066339Β1 de replicar no local de infeção. De forma ótima, um candidato a vacina também pode invadir e espalhar-se para tecidos além do local de infeção. Conforme demonstrado no Exemplo 4, o SE13A é capaz de replicação nas amígdalas cecais após infeção oral e pode ser isolado das amígdalas durante semanas após a infeção. Além disso, o SE13A pode invadir outros tecidos e é encontrada no fígado e no baço até um mês após a infeção. 0 isolado SE13A pode ser ainda atenuado desativando pelo menos um gene necessário para replicação prolongada das bactérias fora de condições de laboratório ou de fabrico. Estirpes atenuadas de Salmonella que podem ser utilizadas como vetores vacina são descritas a seguir. 0 SE13A foi utilizado para gerar estirpes atenuadas de Salmonella para desenvolver vacinas e gerar respostas imunes potenciadas. Conforme demonstrado nos Exemplos, o SE13A é invasivo, não patogénico para aves domésticas e não causa morbidez mensurável. Estas características resultam numa resposta imune potenciada quando comparada com vetores bacterianos não invasivos. A atenuação de SE13A por mutação de genes que limita a capacidade da bactéria de disseminar pode aumentar a segurança da vacina. Conforme demonstrado nos Exemplos no Quadro 4, as estirpes SE13A com mutações em aroA ou htrA retêm a capacidade de gerar uma resposta imune, mas têm replicação limitada no hospedeiro. Assim, a atenuação aumenta a segurança do vetor vacina sem comprometer a imunogenicidade.
As mutações podem ser feitas numa variedade de outros genes de Salmonella incluindo, mas não limitado a, cya, crp, asd, cdt, phoP, phoQ, ompR, proteínas da membrana exterior, dam, htrA ou outros genes relacionados com stress, aro, pur e gua. Conforme mostrado nos Exemplos, verificou-se que mutações em aroA e htrA atenuam SE13A. Os genes aro são enzimas envolvidas na via de biossíntese do chiquimato ou na via aromatase e os mutantes aro são 7 ΕΡ2066339Β1 auxotróficos para os aminoácidos aromáticos triptofano, tirosina e fenilalanina. htrA é um gene de resposta de stress que codifica uma protease periplasmática que degrada proteínas aberrantes. Mutantes em htrA também são atenuados e exibem sensibilidade aumentada ao peróxido de hidrogénio.
As mutações em aroA e htrA descritas nos Exemplos são mutações de deleção, mas as mutações podem ser feitas numa variedade de formas. De forma adequada, as mutações são mutações não reversíveis que não podem ser reparadas numa única etapa. Mutações adequadas incluem deleções, inversões, inserções e substituições. Um vetor vacina pode incluir mais de uma mutação, por exemplo, um vetor vacina pode conter mutações em ambos aroA e htrA. Métodos de fazer tais mutações são bem conhecidos na arte. SE13A ou os derivados atenuados recombinantes de SE13A podem ser utilizados como vetores vacina. Polinucleotídeos que codificam epítopos do polipeptídeo de um qualquer número de organismos patogénicos podem ser inseridos nas bactérias e expressos pelas bactérias para gerar polipeptideos antigénicos. Os polinucleotídeos podem ser inseridos no cromossoma das bactérias ou codificados nos plasmídeos ou noutros ADN extracromossómicos. De forma adequada, os polinucleotídeos que codificam epítopos são inseridos num polinucleotídeo bacteriano que é expresso. De forma adequada, o polinucleotídeo bacteriano codifica uma proteína transmembranar e o polinucleotídeo que codifica o epítopo é inserido na sequência do polinucleotídeo bacteriano para permitir a expressão do epítopo na superfície das bactérias. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o epítopo pode ser inserido em estrutura no polinucleotídeo bacteriano numa região que codifica uma região de loop externa de uma proteína transmembranar, de tal modo que a sequência do polinucleotídeo bacteriano permanece na estrutura. Ver Exemplo 1.
Em alternativa, o polinucleotídeo que codifica o 8 ΕΡ2066339Β1 epítopo pode ser inserido num polipeptídeo segregado. Aqueles habilitados na arte apreciarão que o polinucleotideo que codifica o epítopo poderia ser inserido numa ampla variedade de polinucleotídeos bacterianos para providenciar a expressão e apresentação do epítopo às células imunes de um sujeito tratado com o vetor vacina bacteriano. Nos Exemplos, um epítopo M2e do vírus da Influenza A foi inserido no loop 9 do gene lamB do SE13A e foi confirmada a expressão à superfície do epítopo por precipitação mediada por anticorpo. 0 polinucleotideo que codifica um epítopo pode ser incluído numa única cópia ou mais do que uma cópia. Nos Exemplos, é descrito um vetor vacina bacteriano que contém múltiplas cópias do epítopo M2e inserido no loop 9 do lamB. Em alternativa, múltiplas cópias de um epítopo podem ser inseridas num vetor vacina bacteriano em mais do que uma localização.
Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que são homólogos a proteínas do sujeito e capazes de estimular o sistema imune para responder ao epítopo estranho também podem ser inseridos num vetor vacina. Conforme descrito com maior detalhe a seguir, um vetor vacina pode incluir um polipeptídeo CD154 que é capaz de ligar CD40 no sujeito e estimular o sujeito a responder ao vetor vacina e ao seu epítopo estranho associado. Conforme descrito anteriormente, em relação aos epítopos, estes polinucleotídeos podem ser inseridos no cromossoma do vetor vacina ou mantidos extracromossomicamente. Alguém habilitado na arte apreciará que estes polipeptídeos podem ser inseridos numa variedade de polinucleotídeos e expressos em diferentes partes do vetor vacina ou podem ser segregados. 0 polinucleotideo que codifica um polipeptídeo CD 154 capaz de potenciar a resposta imune a um epítopo estranho também pode codificar o epítopo estranho. 0 polinucleotideo que codifica um polipeptídeo CD 154 pode estar ligado ao polinucleotideo que codifica o epítopo, de 9 ΕΡ2066339Β1 tal modo que no vetor vacina o polipeptídeo CD 154 e o epítopo estranho estão presentes no mesmo polinucleotídeo. Nos Exemplos, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de CD 154 que é capaz de ligar a CD40 também codifica o epítopo M2e da Influenza A. Ver SEQ. ID N.°s 8 e 9 na listagem de sequências anexa. Nos Exemplos, o polinucleotídeo que codifica o epítopo M2e e o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo CD 154 são ambos inseridos no loop 9 do gene lamB. Aqueles habilitados na arte apreciarão que os polinucleotídeos bacterianos que codificam outras proteínas transmembranares e outros loops do gene lamB também podem ser utilizados.
As bactérias SE13A podem incluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da proteína M2 da influenza. 0 ectodomínio da proteína M2 do vírus da Influenza A, conhecido como M2e, projeta-se da superfície do vírus. A porção M2e da proteína M2 contém cerca de 24 aminoácidos. 0 polipeptídeo M2e varia pouco de um isolado para o outro numa dada espécie. Na realidade, apenas umas poucas mutações que ocorrem naturalmente em M2e foram isoladas a partir de humanos infetados desde a epidemia de gripe de 1918. Além disso, os vírus de influenza isolados de hospedeiros aviários e suínos têm diferentes, ainda que conservadas, sequências M2e. Para revisões das sequências do polipeptídeo M2e isoladas de hospedeiros humanos, aviários e suínos ver Liu et al., Microbes and Infection 7:171-177 (2005) e Reid et al., J. Virol. 76:10717-10723 (2002). Ver também SEQ. ID N.°s 1-4 na listagem de sequências anexa.
De forma adequada, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo M2e completo pode ser inserido no vetor vacina ou pode ser utilizada apenas uma porção. Nos Exemplos, um polipeptídeo com oito aminoácidos (LM2 com a sequência de aminoácidos: EVETPIRN, SEQ. ID N.° 5 ou a sua variante M2eA com a sequência de aminoácidos EVETPTRN, SEQ. ID N.° 20) 10 ΕΡ2066339Β1 foi incorporado em SE13A e demonstrou-se produzir uma resposta de anticorpo após administração a galinhas. De forma adequada, a porção do polipeptídeo M2e inserida no vetor vacina é imunogénica. Um fragmento imunogénico é um péptido ou polipeptídeo capaz de despoletar uma resposta imune celular ou humoral. De forma adequada, um fragmento imunogénico de M2e pode ser o polipeptídeo M2e de comprimento completo, ou de forma adequada, pode ter 20 ou mais aminoácidos, 15 ou mais aminoácidos, 10 ou mais aminoácidos ou 8 ou mais aminoácidos da sequência de comprimento completo.
Outros epítopos adequados para inclusão num vetor vacina de Influenza A incluem, mas não se limitam a, polinucleotídeos que codificam polipeptídeos da hemaglutinina ou da proteína nuclear da Influenza A. Por exemplo, polinucleotídeos que codificam a SEQ. ID N.° 21, SEQ. ID N.° 22, SEQ. ID N.° 23 ou SEQ. ID N.° 24 podem ser incluídos num vetor vacina. Alguém habilitado na arte apreciará que qualquer destas sequências pode ser utilizada em combinação com qualquer outro epítopo e também pode ser utilizada em conjunto com polipeptídeos que codificam péptidos estimulantes imunes, tais como um polipeptídeo de CD154.
Conforme discutido anteriormente, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo homólogo a uma proteína do sujeito que é capaz de potenciar a resposta imune ao epítopo pode ser incluído no vetor vacina. Nos Exemplos, demonstrou-se que as estirpes de SE13A incluindo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CD154 capaz de ligar a CD40 potencial a resposta imune ao epítopo M2e conforme medido pela produção de anticorpo aumentada em resposta a vacinação. De forma adequada, o polipeptídeo CD154 tem menos de 50 aminoácidos de comprimento, mais adequadamente menos de 40, menos de 30 ou menos de 20 aminoácidos de comprimento. O polipeptídeo pode ter entre 11 ΕΡ2066339Β1 10 e 15 aminoácidos, entre 10 e 20 aminoácidos ou entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento. A sequência de CD154 e a região de ligação a CD40 não são altamente conservadas entre as diferentes espécies. As sequências de CD 154 da galinha e do Homem são providenciadas na SEQ. ID N.° 25 e SEQ. ID N.° 26, respetivamente.
As regiões de ligação a CD40 do CD 154 foram determinadas para um número de espécies, incluindo humana, galinha, pato, ratinho e gado e são mostradas nas SEQ. ID N.° 6, SEQ. ID N.° 7, SEQ. ID N.° 27, SEQ. ID N.° 28, SEQ. ID N.° 29, respetivamente. Apesar de haver variabilidade nas sequências na região de ligação a CD40 entre espécies, os Exemplos a seguir indicam que o polipeptídeo CD 154 humano foi capaz de potenciar a resposta imune em galinhas. Portanto, alguém pode utilizar polipeptideos CD154 específicos de espécie ou um polipeptídeo CD 154 heterólogo.
Nos Exemplos, foram geradas várias bactérias recombinantes de SE13A. Em cada uma das estirpes de SE13A o polipeptídeo M2e e o polipeptídeo CD154 foram codificados no mesmo polinucleotídeo e estavam em estrutura um com o outro e o polinucleotídeo de Salmonella no qual foram inseridos. Em modalidades alternativas, o polipeptídeo CD 154 e o polipeptídeo M2e podem ser codificados por diferentes polinucleotídeos. M2e aroA de SE13A contém uma deleção em aroA e o epítopo LM2-M2e (SEQ. ID N.° 5) inserido no loop 9 de lamB. M2e-CD154 aroA de SE13A é o mesmo que M2e aroA de SE13A, mas também contém o péptido CD154 (SEQ. ID N.° 6) inserido no loop 9 de lamB com o epítopo M2e (Ver SEQ. ID N.° 8). Esta estirpe está depositada com a ATCC com o número de depósito PTA-7872.
M2E htrA de SE13A contém uma deleção em htrA e tem o epítopo M2e-LM2 inserido no loop 9 de lamB. M2E-CD154 htrA de SE13A tem o péptido CD154 inserido no loop 9 de lamB com o epítopo M2e (SEQ. ID N.° 8) e está depositado com a ATCC 12 ΕΡ2066339Β1 como estirpe PTA-7873. A estirpe designada como HM de SE13A contém a SEQ. ID N.° 9 inserida no loop 9 de lamB. Esta estirpe contém
múltiplas cópias de dois epítopos de M2e, referidos como M2e-LM2 (SEQ. ID N.° 5) e M2eA (SEQ. ID N.° 20) e O polipeptideo CD154 (SEQ. ID N.° 6).
Nos Exemplos, demonstrou-se que as estirpes recombinantes de Salmonella anteriormente descritas produzem títulos elevados, supostamente protetores, de anticorpos contra o epítopo M2e dos vírus de influenza. Além disso, mostrou-se que a expressão da molécula imunoestimulante aumenta ainda mais os títulos de anticorpo, confirmando a funcionalidade deste conceito e destes vetores vacina bacterianos em particular.
Também são providenciadas composições que compreendem uma estirpe atenuada de Salmonella e um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veiculo farmaceuticamente aceitável é qualquer veículo adequado para administração in vivo. O veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir água, soluções tamponadas, soluções de glicose ou fluidos de cultura bacteriana. Componentes adicionais das composições podem, de forma adequada, incluir excipientes tais como estabilizadores, conservantes, diluentes, emulsionantes e lubrificantes. Exemplos de veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem estabilizadores tais como carbohidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, amido, sacarose, glicose, dextrano), proteínas tais como albumina ou caseina, agentes que contêm proteínas tais como soro bovino ou leite magro e tampões (por exemplo, tampão fosfato). Especialmente quando não são adicionados às composições quaisquer estabilizadores, a composição é adequada para liofilização ou secagem por vaporização.
Também são providenciados um método de potenciar respostas imunes num sujeito administrando um vetor vacina 13 ΕΡ2066339Β1 contendo um polipeptídeo CD 154 capaz de ligar a CD40 e ativar CD40. 0 vetor vacina que compreende o polinucleotideo que codifica um polipeptídeo de CD154 capaz de ligar a CD40 é administrado ao sujeito numa quantidade eficaz para potenciar a resposta imune do sujeito à vacina. De forma adequada, o vetor vacina contém um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo incluindo os aminoácidos 140-149 do polipeptídeo CD 154 humano (SEQ. ID N.° 26) ou um homólogo do mesmo. Vários polipeptídeos adequados são identificados aqui. De forma adequada, o polinucleotideo codifica um polipeptídeo CD154 da mesma espécie que o sujeito. De forma adequada, um polinucleotideo que codifica o polipeptídeo da SEQ. ID N.° 6 é utilizado em sujeitos humanos, um polinucleotideo que codifica o polipeptídeo da SEQ. ID N.° 7 é utilizado em galinhas, um polinucleotideo que codifica o polipeptídeo da SEQ. ID N.° 27 é utilizado em patos, um polinucleotideo que codifica o polipeptídeo da SEQ. ID N.°28 é utilizado em ratinhos e um polinucleotideo que codifica o polipeptídeo da SEQ. ID N.°29 é utilizado em vacas. Nos Exemplos, o polipeptídeo CD154 humano (SEQ. ID N.° 6) é utilizado num vetor vacina de galinha e demonstrou-se que potenciar a resposta imune a um antígeno estranho. Assim, outras combinações heterólogas de polipeptídeos CD 154 e sujeitos podem ser úteis nos métodos. 0 polipeptídeo CD154 pode ser utilizado para potenciar a resposta imune no sujeito a qualquer antígeno estranho ou polipeptídeo antigénico presente no vetor vacina. Alguém habilitado na arte apreciará que o polipeptídeo CD154 poderia ser utilizado para potenciar a resposta imune a mais de um polipeptídeo antigénico presente num vetor vacina. O polipeptídeo de CD154 estimula uma resposta imune pelo menos em parte ligando ao seu recetor, CD40. Nos Exemplos, foi utilizado um polipeptídeo homólogo ao CD154 expresso em células imunes do sujeito e que é capaz de 14 ΕΡ2066339Β1 ligar ao recetor CD40 em macrófagos e outras células apresentadoras de antígeno. A ligação deste complexo ligando-recetor estimula os macrófagos (e células de linhagem macrófagos, tais como células dendriticas) a potenciarem a fagocitose e apresentação de antigeno enquanto aumenta as secreções de citocina conhecidas por ativar outras células imunes locais (tais como os linfócitos B). Como tal, moléculas associadas com o péptido CD 154 são preferencialmente direcionadas para resposta imune e produção de anticorpo expandida.
Vetores vacina potenciais para utilização nos métodos incluem, mas não se limitam a, Salmonella (Salmonella enteritidis), Shigella, Escherichia (E. coli), Yersinia, Bordetella, Lactococcus, Streptococcus, Vibrio (Vibrio cholerae), Listeria, adenovirus, poxvírus, herpesvírus, alfavirus e virus adeno-associados.
Além disso, são revelados métodos de potenciar uma resposta imune contra a influenza A e métodos de reduzir a morbidez associada com a infeção subsequente por Influenza A. Em suma, os métodos compreendem administrar a um sujeito uma bactéria que compreende uma sequência polinucleotídica M2e da Influenza A que codifica um polipeptídeo M2e de Influenza A numa quantidade eficaz. Os polipeptídeos M2e incluem as SEQ. ID N.° 1-5 e 20. A inserção dos polipeptídeos M2e na bactéria pode ser conseguida numa variedade de formas conhecidas daqueles habilitados na arte, incluindo, mas não limitadas a, o sistema de mutação sitio-dirigido sem marcas descrito aqui. A bactéria também pode ser fabricada por engenharia para expressar os polipeptídeos M2e em conjunto com polinucleotídeos capazes de potenciar a resposta imune conforme discutido anteriormente, tal como na SEQ. ID N.° 8 e SEQ. ID N.° 9. Em particular, um polipeptídeo de CD 154 capaz de ligar CD40 pode ser expresso pela bactéria para potenciar a resposta imune do sujeito ao polipeptídeo M2e. 15 ΕΡ2066339Β1 A dosagem útil a ser administrada variará dependendo da idade, peso e espécie do sujeito, do modo e via de administração e do tipo de patógeno contra o gual se procura a resposta imune. A composição pode ser administrada em qualguer dose de bactérias suficiente para despoletar uma resposta imune. Prevê-se que doses que oscilem entre 103 a IO10 bactérias, entre 104 a 109 bactérias ou entre 105 a 107 bactérias são adequadas. A composição pode ser administrada apenas uma vez ou pode ser administrada duas ou mais vezes para aumentar a resposta imune. Por exemplo, a composição pode ser administrada duas ou mais vezes separadas por uma semana, duas semanas ou por três ou mais semanas. As bactérias são, de forma adequada, viáveis antes da administração, mas em algumas modalidades as bactérias podem ser mortas antes da administração. Em algumas modalidades, as bactérias podem ser capazes de replicar no sujeito, ao passo que noutras modalidades as bactérias podem não ser capazes de replicar no sujeito.
Para administração a animais ou humanos, as composições podem ser administradas por uma variedade de meios incluindo, mas não limitados a, intranasal, mucosal, por vaporização, intradérmico, parentérico, subcutâneo, oral, por aerosol ou intramuscular. As administrações em gotas oculares ou adição a água potável ou alimentos são adicionalmente adequadas. Para galinhas, as composições podem ser administradas no ovo.
Algumas modalidades providenciam métodos de potenciar respostas imunes num sujeito. Um sujeito inclui, mas não se limita a, um vertebrado, de forma adequada um mamífero, de forma adequada um humano, ou aves, de forma adequada aves domésticas, tais como galinhas. Outros modelos animais de infeção também podem ser utilizados. Potenciar uma resposta imune inclui, mas não se limita a, induzir um efeito terapêutico ou profilático que é mediado pelo sistema imune do sujeito. Especificamente, potenciar uma resposta imune 16 ΕΡ2066339Β1 pode incluir produção aumentada de anticorpos, tal como demonstrado na Figura 3 e na Figura 4, troca aumentada de classe de cadeias pesadas de anticorpo, maturação de células apresentadoras de antigeno, estimulação de células T auxiliares, estimulação de células T citoliticas ou indução de memórias de células T e B.
Prevê-se que vários epítopos ou antigenos do mesmo patógeno ou de patógenos diferentes possam ser administrados em combinação com um único vetor vacina para gerar uma resposta imune potenciada contra múltiplos antigenos. Vetores vacina recombinantes podem codificar antigenos de múltiplos microrganismos patogénicos, virus ou antigenos associados a tumor. A administração de vetores vacina capazes de expressar múltiplos antigenos tem a vantagem de induzir imunidade contra duas ou mais doenças ao mesmo tempo. Por exemplo, bactérias atenuadas vivas, tais como 13a de Salmonella enteritidis, providenciam um vetor vacina adequado para despoletar uma resposta imune contra múltiplos antigenos.
Polinucleotideos heterólogos que codificam antigenos podem ser inseridos no genoma bacteriano em qualquer local não essencial ou, em alternativa, podem ser transportados num plasmídeo utilizando métodos bem conhecidos na arte. Um local adequado para inserção de polinucleotideos é dentro de porções externas de proteínas transmembranares ou unidos a sequências que estão dirigidas ao polinucleotídeo heterólogo para vias secretoras. Um exemplo de uma proteína transmembranar adequada para inserção de polinucleotideos é o gene lamB. Nos Exemplos, os polinucleotideos M2e e CD 154 foram inseridos no loop 9 da sequência lamB.
Polinucleotideos heterólogos incluem, mas não se limitam a, polinucleotideos que codificam antigenos selecionados de microrganismos patogénicos ou vírus que não o vetor vacina. Tais polinucleotideos podem ser derivados de vírus patogénicos, tais como influenza (por exemplo, 17 ΕΡ2066339Β1 M2e, hemaglutinina ou neuraminidase), herpesvírus (por exemplo, os genes que codificam as proteínas estruturais dos herpesvírus), retrovírus (por exemplo, a proteína envelope gpl60), adenovírus, paramixovírus, coronavírus e afins. Polinucleotídeos heterólogos também podem ser obtidos a partir de bactérias patogénicas, por exemplo, genes que codificam proteínas bacterianas, tais como toxinas e proteínas da membrana exterior. Além disso, polinucleotideos heterólogos de parasitas, tais como Eimeria, são candidatos interessantes para utilização como um vetor vacina.
Polinucleotideos que codificam polipeptídeos envolvidos no despoletar do sistema imune também podem ser incluídos num vetor vacina, tais como uma vacina atenuada viva de Salmonella. Os polinucleotideos podem codificar moléculas do sistema imune conhecidas pelos seus efeitos estimulantes, tais como uma interleucina, fator de necrose tumoral ou um interferão, ou outro polinucleotídeo envolvido na imunorregulação. 0 vetor vacina também pode incluir polinucleotideos que codificam péptidos conhecidos por estimularem uma resposta imune, tais como o polipeptideo CD 154 descrito aqui. É providenciado um método de gerar mutações sítio-específicas numa bactéria que é um membro da família Enterobacteraciae. 0 método, conforme exemplificado, utiliza a PCR de extensão sobreposta, o sistema Red recombinase e uma inserção intermediária do local de reconhecimento da endonuclease I-Scel como um marcador de contra-seleção. Em alternativa, a sacB também pode ser utilizada como um marcador de contra-seleção. A estratégia global é mostrada na Figura 1. A PCR de extensão sobreposta foi utilizada para produzir ADN linear com homologia de flanco longa ao genoma de SE13A. 0 sistema Red recombinase foi utilizado para mediar a recombinação entre ADN linear emergente gerado por PCR com o genoma bacteriano. No 18 ΕΡ2066339Β1 processo de mutação em duas etapas, a cassete local I-Scel/ Kmr foi inserida primeiro no cromossoma no gene lamB por recombinação homóloga. Depois, esta mutação foi substituída com as sequências de inserção desejadas (LM2-M2e, CD154s ou sequências de combinação). Para fazer a substituição, foi adicionado um produto de PCR com a sequência de inserção desejada em simultâneo com um plasmídeo que codifica a enzima endonuclease I-Scel utilizada para contra-seleção entre a primeira e a segunda mutação. 0 procedimento de gerar mutantes sítio-dirigidos pode ser utilizado em qualquer membro da família Enterobacteraciae. A família Enterobacteraciae inclui, mas não se limita a, membros dos géneros Salmonella, Shigella, Escherichia e Yersinia. Um mutante sítio-dirigido inclui, mas não se limita a, mutações de inserção, deleção, substituição e reposição dirigidas a uma localização específica no cromossoma das bactérias. A vantagem do sistema atual é que resulta numa mutação "sem marcas" ou numa mutação que não contém quaisquer sequências extrínsecas. Logo, a mutagénese sítio-dirigida revelada aqui pode ser utilizada para gerar bactérias autólogas que são apagadas para um único gene ou mesmo um único aminoácido ou nucleotídeo.
Nos Exemplos, os polinucleotídeos foram gerados por PCR de extensão sobreposta, mas alguém habilitado na arte apreciará que estão disponíveis e que poderiam ser utilizados outros métodos de gerar polinucleotídeos lineares. Os primeiro e segundo polinucleotídeos lineares têm de conter alguma sequência homóloga à sequência que flanqueia o local de mutação para permitir a recombinação mediada por Red. A quantidade de sequência homóloga pode compreender menos de 300 pares de base em qualquer um dos lados do local de mutação. De forma adequada, a sequência homóloga tem menos de 200 pares de base. Os polinucleotídeos podem ser introduzidos nas bactérias por 19 ΕΡ2066339Β1 qualquer método conhecido daqueles habilitados na arte. Nos Exemplos, os polinucleotídeos lineares foram eletroporados nas bactérias.
Também são providenciados métodos de desenvolver um vetor vacina bacteriano. Em primeiro lugar, é selecionada uma bactéria capaz de colonizar um sujeito. Depois, a bactéria é atenuada para gerar uma bactéria atenuada. A atenuação pode ser realizada por uma variedade de métodos conhecidos daqueles habilitados na arte. Finalmente, uma sequência polinucleotídica CD154 que codifica um polipeptídeo CD 154 capaz de ligar CD40 é incorporada na bactéria atenuada para gerar um vetor vacina. 0 polipeptídeo CD154 pode ter menos de 50 aminoácidos de comprimento e compreenderá os aminoácidos 140-149 da SEQ. ID N.° 26 CD154 ou um homólogo do mesmo. O vetor vacina bacteriano também pode incorporar uma segunda sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo antigénico. Numa modalidade, o polipeptídeo CD 154 e o polipeptídeo antigénico são codificados na mesma sequência polinucleotídica.
Pretende-se que os exemplos seguintes sejam apenas ilustrativos e não se pretende que sejam limitações do âmbito da invenção ou das reivindicações anexas.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Construção das inserções M2e e M2e/CD154. Estirpes e condições de cultura
Todos os plasmídeos foram primeiro mantidos em células TOPIO de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) , a menos que descrito o contrário. 13A de Salmonella enteritidis foi utilizada para introdução de mutações. A estirpe 13A de Salmonella enteritidis era um isolado de campo disponível de USDA/APHIS/NVSL e depositado com a ATCC com o número de depósito PTA-7871. As bactérias que transportavam o 20 ΕΡ2066339Β1 plasmídeo pKD46 foram crescidas a 30°C. Outras bactérias foram crescidas a 37°C. A cura de plasmídeo foi conduzida a 37 °C. 0 meio de Luria-Bertani (LB) foi utilizado para crescimento de rotina das células e o meio SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foi utilizado para expressão fenotípica após eletroporação. Quando apropriado, os seguintes antibióticos foram adicionados aos meios: ampicilina (Amp) a 100 pg/ml, canamicina (Km) a 50 pg/ml e cloranfenicol (Cm) a 25 pg/ml.
Plasmideos
Os plasmideos pKD46, pKDl3 e pBC-I-Scel foram descritos previamente (Datsenko e Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645 e Kang et al., J Bacteriol 2004, 186:4921- 4930) . O plasmídeo pKD46 codifica as enzimas Red
recombinase que medeiam a recombinação homóloga de ADN linear emergente com ADN cromossómico. Este plasmídeo também contém o gene de resistência à ampicilina e é sensível à temperatura pelo que requer 30°C para manutenção na célula. O plasmídeo pKD13 serviu como um molde para amplificação do gene da resistência a Km (Kmr) utilizado na PCR sobreposta. O plasmídeo pBC-I-Scel, que é mantido na célula a 37°C, produz a enzima I-Scel, que divide a seguinte sequência de reconhecimento rara com 18 pares de base: 5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3' (SEQ. ID N.° 30). O plasmídeo pBC-I-Scel também contém o gene de resistência ao cloranfenicol (Cmr) .
PCR
Todos os iniciadores utilizados para PCR estão listados no Quadro 1. Tipicamente, a PCR foi realizada utilizando aproximadamente 0,1 pg de plasmídeo genómico 21 ΕΡ2066339Β1 purificado ou ADN gerado por PCR (Qiagen, Valência, CA, EUA) , tampão polimerase Pfu clonado lx, 5U Pfu polimerase (Stratagene La Jolla, CA, EUA), lmM dNTPs (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) e 1,2 μΜ de cada iniciador num volume total de 50 pL. O motor do termociclador de ADN (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) foi utilizado com as seguintes condições de amplificação: 94°C durante 2 minutos; 30 ciclos de 94°C segundos durante 30 segundos, 58°C durante 60 sec, 72°C durante 90 segundos por 1 kb; e 72°C durante 10 minutos para extensão final. Cada produto da PCR foi purificado em gel (Qiagen, Valência, CA, EUA) e ou eluido em 25 pL de tampão EB para preparação de moldes utilizados na PCR de extensão sobreposta ou em 50 pL de tampão EB, precipitado com etanol e suspenso em 5 pL de ddH20 para eletroporação em S. enteritidis. 22 ΕΡ2066339Β1 Φ U Ο V <d •Η Ο Ή d
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Quadro 1 . ΛΪΟ 23 ΕΡ2066339Β1
Quadro 1, os nucleotídeos em itálico são complementares a qualquer um dos lados do local de inserção loop 9 do gene lamB, que corresponda ao nucleotídeo 1257 utilizando S. typhimurium como um genoma de referência anotado. Os nucleotídeos em negrito representam o local de reconhecimento I-Scel no iniciador Km-f. Todas as outras sequências de inserção são mostradas como sublinhadas.
Eletroporação A transformação de pKD46 em S. enteritidis foi a primeira etapa realizada para que as enzimas Red recombinase pudessem ser utilizadas para mediar a recombinação das mutações subsequentes. 0 plasmídeo pKD46 foi colhido a partir de BW25113 de E. coli (Datsenko e Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645) utilizando um kit de preparação de plasmídeo (Qiagen Valência, CA, EUA) . Depois, 0,5 pL de ADN de pKD46 foi utilizado para transformação em 13a de S. enteritidis que tinha sido preparado para eletroporação. (Datsenko e Wanner, PNAS 2000, 97:6640— 6645) . Resumidamente, as células foram inoculadas em 10-15 mL de caldo 2X YT e crescidas a 37 °C durante a noite. Depois, 100 pL de cultura durante a noite foi reinoculada em 10 mL de caldo fresco 2X YT a 37°C durante 3-4 horas. As células a serem transformadas com o plasmídeo pKD46 foram aquecidas a 50°C durante 25 minutos para ajudar a desativar a restrição do hospedeiro. As células foram lavadas cinco vezes em água ddH20 e ressuspensas em 60 pL de 10% glicerol. As células foram depois pulsadas a 2400-2450kV durante 1-6 ms, incubadas em SOC durante 2-3 horas a 30°C e colocadas em placas em meio LB com antibióticos apropriados. Os transformantes de S. enteritidis com pKD46 foram mantidos a 30°C. Quando estes transformantes foram preparados para reações de eletroporação adicionais, todas as etapas foram as mesmas, exceto que foi adicionada 15% 24 ΕΡ2066339Β1 arabinose para induzir as enzimas Red recombinase uma hora antes da lavagem, e as células não foram submetidas à etapa de aquecimento a 50°C.
Construção Loop 9 montante- I-Scel/ Kmr- Loop 9 jusante A introdução do local de reconhecimento da enzimaf I-Scel juntamente com o gene Kmr gene no loop 9 do gene lamB foi feita combinando o sistema Red recombinase (Datsenko e Wanner, PNAS 2000, 97:6640-6645) e PCR sobreposta (Horton et al., BioTechniques 1990, 8:528-535) . O local de inserção corresponde ao nucleotideo 1257 do gene lamB utilizando LT2 de Salmonella typhimurium (S. typhimurium) como um genoma de referência anotado. Em primeiro lugar, as regiões a montante e a jusante que flanqueiam imediatamente o local de inserção do loop 9 (loop 9 montante e loop 9 jusante, respetivamente) foram amplificadas separadamente. Os iniciadores utilizados foram lam-montante-f e lam-montante-r para loop 9 montante e lam-jusante-f e lam-jusante-r para loop 9 jusante. Depois, o gene Kmr do plasmideo pKD13 foi amplificado utilizando os iniciadores Km-f e Km-r. Aqui, o local da enzima I-Scel foi adicionado sinteticamente à extremidade 5' do iniciador Km-f depois precedido por uma região complementar ao iniciador loop-montante-r. Da mesma forma, uma região complementar ao iniciador loop-jusante-f foi adicionada à extremidade 5' do iniciador Km-r. As regiões complementares permitem que todos os produtos das 3 PCR emparelhem quando utilizados como moldes numa reação de PCR. A Figura 2a representa este esquema de desenho. Os fragmentos de PCR que consistem na sequência loop 9 montante- I-Scel/ Kmr- loop 9 jusante (PCR-A) foram eletroporados em células de S. enteritidis, que albergavam pKD46 e foram induzidas pela arabinose e depois colocadas em placas em LB com placas Km. Para verificar a orientação de sequência correta da mutação, realizámos PCR em colónia 25 ΕΡ2066339Β1 com os pares de iniciadores Kan4F/lam3f e Kan4R/lam3r, onde Kan4F e Kan4R são iniciadores específicos do gene Kmr e lam3f e lam3r são iniciadores localizados fora da região loop 9 de lamB. Estes fragmentos de PCR foram purificados em gel (Qiagen, Valência, CA, EUA) e utilizados para sequenciação de ADN.
Construção Loop 9 montante- LM2 ou CD154s ou sequência de combinação - Loop 9 jusante 0 fragmento final de PCR sobreposta, PCR-B, continha o LM2 adicionado (ou CD154s ou sequências de combinação flanqueadas pelas regiões loop 9 montante e jusante (Figura 2b) . As sequências de combinação consistiram em LM2 ou num epítopo M2e alternado associado com espécies aviárias (M2eA) e CD154 juntamente com espaçadores, tais como resíduos de glicina (Gly) ou serina (Ser). As sequências inseridas foram como se segue: LM2 (SEQ. ID N.° 37); M2eA (SEQ. ID N.° 38); sequência de combinação N.° 1 (Gly>3- CD154s-(Gly) 3-LM2-(Gly) 3 (SEQ. ID N.° 39); e sequência de combinação N.° 2 (Ser)4-M2eA-(Ser)4-M2eA-(Ser)4-CD154- (Ser)4-LM2-(Ser)4-LM2-(Ser)4 (SEQ. IDN.° 40).
Para diminuir a quantidade de etapas para construção do próximo fragmento, a sequência LM2 ou CD154 foi adicionada sinteticamente à extremidade 5' do iniciador lam-jusante-f e precedida pela região complementar ao iniciador loop-montante-r. O produto de PCR previamente utilizado para loop 9 montante poderia ser utilizado juntamente com o produto de PCR construído recentemente no qual LM2 ou CDl54s foram incorporados na extremidade 5' do loop 9 jusante para realizar a reação final de PCR. Contudo, para outras sequências de inserção (referidas como sequências de combinação), foi necessária uma etapa extra de PCR, devido aos comprimentos maiores das sequências de 26 ΕΡ2066339Β1 inserção, para amplificar o loop 9 montante com nucleotideos adicionados específicos das sequências de inserção ligadas ao iniciador loop-montante-r. A sequência codificadora para Gly (GGT) e serina (TCC), bem como todos os outros aminoácidos, foram escolhidos com base em dados compilados sobre codões mais frequentemente utilizados em proteínas de E. coli e Salmonella typhimurium. Ver Quadro 1 para obter mais detalhes sobre o desenho dos iniciadores.
Substituição genómica de I-Scel/ Kmr com LM2 ou CDl54s ou sequências de combinação
Os productos PCR-B foram eletroporados em células de S. enteritidis juntamente com o plasmídeo pBC-I-Scel a uma razão molar de aproximadamente 40:1 (Kang et al., J Bacteriol 2004, 186:4921-4930). Clones para cada mutação de recombinação de PCR-B foram escolhidos de acordo com a capacidade de crescerem em placas Cm mas não em placas Km, devido à substituição de PCR-B pela sequência PCR-A codificadora de Kmr. Regiões modificadas nos clones selecionados foram amplificados por PCR e as sequências de ADN foram determinadas utilizando os iniciadores lam3f e lam3r localizados fora das regiões amplificadas do loop 9 jusante e montante.
Mutação de inserção local I-Scel / Kmr A primeira etapa de mutação envolveu desenhar um fragmento de PCR, PCR-A, que serviria como o veículo da cassete local I-Scel / Kmr a ser inserida no local lamB. O PCR-A consistiu no local de reconhecimento da enzima I-Scel adjacente ao gene Kmr com aproximadamente 200- 300 pb de ADN flanqueador em cada extremidade homóloga às regiões a montante e ajusante do local de inserção loop 9 de lamB (loop 9 montante e loop 9 jusante, respetivamente). 0 27 ΕΡ2066339Β1 fragmento foi introduzido em células de S. enteritidis que expressam enzimas Red recombinase e foram selecionadas colónias de Kmr. Após classificação de algumas colónias por PCR de colónia, os clones positivos foram sequenciados para a sequência inserida local I-Scel / Kmr desejada e o mutante identificado foi designado SE164.
Reposição genómica de I-Scel/ Kmr com LM2 ou CDl54s ou sequências de combinação A segunda etapa de mutação exigiu a construção de um fragmento de PCR, referido como PCR-B e mostrado na Figura 2B, que consistiu na sequência de inserção final, LM2 ou CD 154 ou sequências de combinação, flanqueadas por fragmentos homólogos de lamB. Amplicões PCR-B não têm qualquer marcador de seleção e têm de ser contra-selecionados após reposição para a mutação prévia local I-Scel / Kmr em SE164. 0 plasmideo pBC-I-Scel codifica o gene Cmr e a enzima I-Scel, que cortará o genoma no local I-Scel de SE164. Logo, pBC-I-Scel foi eletroporado em SE164 juntamente com PCR-B. Após a recombinação de PCR-B para repor o PCR-A, foram escolhidos clones positivos com base na capacidade de crescer em Cm, mas não em Km. Após sequenciação do ADN dos mutantes para confirmar a recombinação bem sucedida de PCR-B, as estirpes foram designadas SE172, SE173, SE180 e SE189 para as sequências de inserção LM2, CD154s, (Gly)3-CD154s-(Gly)3-LM2-(Gly)3 e (Ser)4-M2eA-(Ser)4-M2eA-(Ser)4-CD154- (Ser)4-LM2-(Ser)4-LM2-(Ser)4, respetivamente. Dez clones aleatórios para cada das inserções LM2 e CDl54s foram utilizados para PCR com lam 3f e lam 3r depois digeridos utilizando locais de enzimas de restrição únicos para cada sequência de inserção e 100% dos clones testados por digestão foram positivo para a sequência de mutação desejada. Os resultados da sequenciação demonstraram que a inserção de LM2 ou CD154s 28 ΕΡ2066339Β1 ou sequências de combinação foi exatamente na região loop 9 sem a adição de nucleotideos extrínsecos.
Exemplo 2. Atenuação de mutantes/inserções M2e ou M2e/CD154. A atenuação de SE13A foi conseguida por mutação de deleção do gene aroA e/ou do gene htrA. A mutação do gene aroA, um gene chave na via do ácido corismico das bactérias, resulta numa deficiência metabólica severa que afeta sete vias bioquímicas separadas. A mutação do gene htrA reduz a capacidade da célula de aguentar exposição a baixas e altas temperaturas, baixo pH e agentes oxidativos e danificadores do ADN e reduz a virulência das bactérias.
Para atingir mutações de deleção em SE13A, a sequência génica alvo no genoma bacteriano de S. enteritidis foi substituída com a sequência do gene de resistência à Km. Isto foi completado utilizando PCR de extensão sobreposta e eletroporação dos produtos de PCR, conforme descrito anteriormente. 0 gene de resistência à Km foi dirigido para a região genómica que contém os genes de interesse (aroA ou htrA) flanqueando o gene de resistência à Km com 200-300 pares de base de sequências homólogas aos genes de interesse. Assim que foram obtidos os mutantes resistentes a Km, as mutações de deleção aroA ou htrA foram confirmadas por sequenciação de ADN. As estirpes resultantes aroA e htrA de Salmonella foram depositadas com a Coleção de Culturas Tipo Americana a 13 de setembro de 2006 (depósito N.° PTA-7872 e depósito N.° PTA-7873, respetivamente). As estirpes atenuadas também foram testadas in vivo em relação ao tempo de eliminação. Ambas as estirpes atenuadas tinham tempos de eliminação mais rápidos do que a estirpe 13A de tipo selvagem, mas ambas foram capazes de colonizar o fígado, baço e amígdalas cecais de galinhas após infeção oral. Além disso, também foi isolada uma estirpe atenuada 29 ΕΡ2066339Β1 sem ambas aroA e htrA.
Exemplo 3. Confirmação de expressão de M2e e CD154à superfície da célula. A expressão das inserções M2e e CD154 à superfície da célula foi confirmada com uma simples reação de precipitação anticorpo/antígeno. Resumidamente, foram feitos anticorpos policlonais contra as sequências de aminoácidos de ambos M2E-LM2 (EVETPIRN; SEQ. ID N.° 5) e CD154 (WAEKGY YTMSC; SEQ. ID N.° 6) conjugados com uma proteína transportadora (KLH). Os anticorpos resultantes foram depois incubados com SE13A de tipo selvagem (sem inserções) ou SE13A com M2e-LM2, CD154 ou inserção combinada M2e-LM2 e CD154 numa placa de vidro à temperatura ambiente e permitidos incubar durante 30 segundos. A expressão à superfície das células foi determinada pela presença de um precipitado. Os resultados são mostrados no Quadro 2. Uma reação de precipitação positiva é indicada por um sinal (+) e uma reação de precipitação negativa é indicada por um sinal (-) .Os resultados demonstram que a SE13A de tipo selvagem não reagiu com os anticorpos peptídicos M2e e CD 154, ao passo que as estirpes que expressam M2e, CD 154 ou M2e e CD 154 reagiram com os anticorpos apropriados. Assim, os péptidos M2e e CD 154 estão a ser expressos à superfície das bactérias.
Quadro 2, Reação de precipitação SE13A SE13A-M2E SE13A-CD154 SE13A-M2E- CD154 Anticorpo M2E - + Não testado + Anticorpo CD 154 - Não testado + + 30 ΕΡ2066339Β1
Exemplo 4. Estudo de vacinação.
Foram obtidos pintos nascidos no dia de eclosão (dia 0) a partir de uma incubadora comercial local e distribuídos de forma aleatória em grupos de tratamento (n=55/grupo de tratamento). Quinze pintos de 55 possíveis em cada grupo de tratamento foram etiquetados e numerados. Os pintos foram infetados oralmente por tubo com 0,25 ml de ΙΟ4, 105 ou 107 (dados não mostrados) cfu/ml dos vários tratamentos de SE13A conforme indicado no Quadro 3.
Quadro 3. Dose de desafio para cada grupo de tratamento.
Grupo de tratamento Dose de desafio SE13A-M2E 105 cfu/ml SE13A-M2E-CD154 105 cfu/ml SE13A-M2E aroA 104 cfu/ml SE13A-M2E-CD154 aroA 104 cfu/ml SE13A-M2E htrA 105 cfu/ml SE13A-M2E-CD154 htrA 105 cfu/ml
Cada grupo de tratamento foi alojado numa jaula térrea individual com serradura fresca e providenciada água e comida ad libitum. Nos dias 7, 14, 21 e 28 após a eclosão, foi colhido aproximadamente 1 ml de sangue de cada uma das quinze aves etiquetadas e o soro foi removido para utilização posterior na determinação de títulos de anticorpo. Nos mesmos dias, dez aves de cada grupo de tratamento foram eutanasiadas, os seus fígados, baços e amígdalas cecais removidas asseticamente para determinação de colonização bacteriana (amígdalas cecais) e invasão bacteriana (fígado e baço). Amostras individuais de fígado, baço e amígdalas cecais foram pré-enriquecidas em caldo de tetrationato durante a noite a 37°C. No dia seguinte, pequenas porções de cada cultura de caldo foram colocadas rapidamente em placas de agar XLD suplementadas com 31 ΕΡ2066339Β1
Novabicina e ácido naladíxico e incubadas durante a noite a 37°C. Na manhã seguinte, as placas foram lidas para a presença ou ausência de colónias de Salmonella. Os dados de colonização e invasão bacterianas são apresentados no Quadro 4 por grupo de tratamento. Cada razão apresentada no Quadro 4 representa o número de aves das guais foram recuperados isolados positivos de Salmonella das dez aves possíveis gue foram cultivadas nos dias 7, 14, 21 e 28 após o desafio.
Quadro 4. Colonização e invasão bacteriana.
Gropes de tratamento Colonização (amígdalas cecais) Invasão (Fígado/Baço) D7 D14 D21 D28 D7 D14 D21 D28 SE13A 9/10 3/10 5/10 2/10 8/10 8/10 2/10 4/10 SE13A-M2E- CD154 9/10 7/10 6/10 9/10 8/10 1/10 5/10 4/10 SE13A-M2E aroA 10/10 4/10 0/10 3/10 9/10 4/10 0/10 3/10 SE13A-M2E-CD154 aroA 4/10 1/10 1/10 3/10 4/10 0/10 0/10 3/10 SE13A-M2E htrA 5/10 1/10 0/10 1/10 4/10 2/10 0/10 2/10 SE13A-M2E-CD154 htrA 4/10 1/10 0/10 0/10 6/10 0/10 0/10 0/10
Isolados bacterianos positivos de Salmonella recuperados de aves em cada grupo de tratamento foram sujeitos a análise por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os iniciadores específicos de cada inserção revelados no Quadro 1 para verificar a inserção M2e e/ou CD 154. Esta técnica foi utilizada para assegurar gue a estirpe que as aves foram originalmente dadas era equivalente à estirpe recuperada. Em cada grupo de tratamento, a PCR confirmou que as estirpes recuperadas eram as mesmas que as estirpes com as quais as aves foram infetadas. Os resultados indicaram colonização aceitável de 32 ΕΡ2066339Β1 tecidos com várias estirpes de Salmonella testadas.
Exemplo 5. Produção de anticorpo M2e. 0 soro colhido das aves etiquetadas em cada grupo de tratamento foi utilizado numa ELISA de captura de antigeno para calcular os níveis de anticorpo M2e. Resumidamente, poços individuais de uma placa com 96 poços foram revestidos com 5 yg/ml do epítopo M2e-LM2 (EVETPIRN: SEQ. ID N.° 5) conjugado com BSA. A adesão do antigeno foi permitida proceder durante a noite a 4°C. As placas foram enxaguadas com PBS + 0,05% Tween 20 e incubadas durante 2 horas com o soro previamente colhido das aves em cada um dos 6 grupos de tratamento descritos anteriormente. As placas foram enxaguadas com PBS + 0,05% Tween 20 seguido de incubação com anticorpo secundário IgY cabra-anti-galinha conjugado com peroxidase (diluição 1:10 000) obtido dos
Laboratórios Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) durante mais uma hora. Após enxaguamento subsequente, as placas foram desenvolvidas utilizando um kit de substrato de peroxidase obtido de Fisher Scientific e as absorvâncias foram lidas num espetrofotómetro a 450nm e 405nm.
Cada placa também continha um controlo positivo e controlo negativo onde o anticorpo policlonal M2e descrito anteriormente e o soro de galinha de uma ave não tratada, respetivamente, substituem o soro dos grupos de tratamento. As absorvâncias obtidas para o controlo positivo, controlo negativo e amostras experimentais foram utilizadas para calcular as razões amostra para controlo positivo (razões S/P) utilizando o cálculo seguinte: Cálculo razão S/P: média da amostra - média do controlo negativo média do controlo positivo — média do controlo negativo
As razões S/P calculadas para cada grupo são mostradas nas 33 ΕΡ2066339Β1
Figuras 3 e 4. Conforme mostrado, níveis de anticorpo específicos de M2e para cada grupo gue expressa M2e-CD154 produziram um sinal ELISA que foi, em média, mais de 30% superior quando comparado com o seu respetivo grupo que apenas expressa M2e. Os dados demonstram que SE13A-M2e e SE13A-M2e-CD154 são ambos capazes de despoletar uma resposta de anticorpo robusta a M2e. Esta resposta foi claramente aumentada por adição do péptido CD154. Além disso, foram geradas respostas semelhantes quando tanto as estirpes de SE13A auxotróficas aroA or htrA foram utilizadas. Estas estirpes podem providenciar vetores vacina com maior segurança para utilização clínica sem sacrificar a geração de uma resposta imune robusta.
Exemplo 6. Neutralização do vírus.
Antissoros (colhidos 2 semanas depois da imunização reforço em cada experiência) gerados contra os vetores SE recombinantes descritos anteriormente foram sujeitos ao teste de neutralização do virus utilizando o Influenza H9N2 (Laboratórios Charles River, Franklin, CT) utilizando protocolos convencionais (Laboratórios Charles River). Ver Quadro 5. Os índices de neutralização indicam que os antissoros das galinhas vacinadas foram eficazes em neutralizar a Influenza aviária e, assim, em proteger os embriões do vírus (títulos VN oscilaram de 6,3 a 8,8 em dois estudos). Foi utilizado soro hiperimune criado contra péptido M2e sintético como um controlo positivo.
Quadro 5. Neutralização do vírus
Estirpe SE índice de neutralização SE aroA M2E 7,5 SE aroA M2E-CD154 8,3 SE aroA M2E (multi-cópia)-CD154 8,3 controlo Positivo 8,3 34 ΕΡ2066339Β1
Exemplo 7. Estudo de desafio. Vírus.
Os vírus da influenza utilizados nestes estudos foram A/Turkey/Virginia/158512/2002 (TV/02) H7N2 LP da Influenza aviária (LPAI H7N2) e A/Egret/Hong Kong/757.2/2002 (Eg/02) H5N1 HP da influenza aviária (HPAI H5N1). Os vírus foram crescidos e titulados em ovos de galinha SPF (livres de patógenos específicos) embrionados com 9-11 dias de idade, conforme descrito previamente (Suarez et al., J Virol. 1998 Aug; 72(8):6678-88.).
Galinhas e alojamento.
Para os desafios LP e HPAI as galinhas foram transferidas para unidades Horsfall em aço inoxidável com pressão negativa que continham filtros HEPA numa instalação agrícola de nível de biossegurança 3 certificado pela USDA. O alimento e água foram fornecidos ad libitum.
Serologia e isolamento do vírus.
Foi realizado o teste de inibição da hemaglutinação com antigeno H5N1 homólogo desativado por BPL com soros colhidos no dia 0 na Experiência I e Dia 0 e 14 na Experiência II, conforme descrito previamente (Suarez et al., 1998). Títulos superiores a h 3 (log2) foram considerados positivos. O isolamento do vírus de esfregaços orais e cloacais nos dias 2 e 4 após o desafio foi realizado em ovos de galinha SPF com 9-11 dias de embrionação, conforme descrito previamente (Tumpey et al., Avian Dis. 2004 Jan-Mar;48(1):167-76). Resumidamente, os esfregaços foram colhidos em 2 ml de caldo de infusão cérebro-coração (BHI) com antibióticos (1000 unidades/ml penicilina G, 200 pg/ml sulfato de gentamicina e 4 pg/ml anfotericina B; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) de 35 ΕΡ2066339Β1 cada ave no dia 0, 2, 4, dias após desafio para isolamento do vírus.
Western blot.
Proteínas AIV purificadas do vírus completo (H5N1 e H7N2) foram separadas por SDS-PAGE em 10 % gel de poliacrilamida e transferidas, conforme descrito previamente (Kapczynski e Tumpey, Avian Dis. 2003 Jul-Set;47(3):578-87). Resumidamente, foi incubado soro anti-M2e de aves previamente imunizadas com ASE M2e-HM (1:1000) com a membrana contendo antígeno AIV durante 1 hora à temperatura ambiente. Após três lavagens em PBS-Tween 20 (0,05%), a membrana foi reagida com anticorpo secundário IgG de cabra anti-galinha rotulado com peroxidase de raiz-forte (Southern Biotech Associates, Inc, Birmingham, AL) a uma diluição de 1:2000 durante 1 hora. Após lavagem como anteriormente, a membrana foi reagida com Reagentes de Deteção de Western Blotting ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) , de acordo com as recomendações do fabricante, e exposta a Hiperfilme ECL (Amersham Biosciences). A película foi desenvolvida utilizando reagentes de revelação Kodak GBX (Eastman Kodak Company), de acordo com as recomendações do fabricante.
Estudos de proteção. A experimentação inicial foi desenhada para avaliar a proteção das galinhas que receberam vacinação com ASE M2e-HM (sequência de inserção M2e-CD154 multi-cópias com a SEQ. ID N.° 9) de Salmonella do desafio com LPAI TV/02 (106 EID50 por ave (EID refere-se à dose infeciosa do embrião) ) para determinar a redução da morbidez e libertação do vírus. Subsequentemente, a proteção do desafio com HPAI Eg/02 foi investigada utilizando uma dose subletal (0,1 CLD50 por ave 36 ΕΡ2066339Β1 (CLD refere-se à dose letal do pinto) ) e dose letal (100 CLD50 por ave), em termos de morbidez, mortalidade e libertação do vírus.
Experiência I. Desafio com LPAI H7N2
Grupos de dez galinhas SPF com 1 dia de idade foram divididos em 3 grupos. As aves nos grupos 1 e 2 receberam falsa vacinação com 100 μΐ de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). As aves no grupo 3 receberam vacinação com ASE M2e-HM. Três semanas mais tarde (Dia 21) os três grupos de galinhas SPF receberam uma segunda vacinação idêntica (reforço) utilizando solução salina (Grupos 1 e 2) ou a vacina recombinante vetorizada de Salmonella (Grupo 3). Três semanas após o reforço (Dia 42), as aves no grupo 2 e 3 foram desafiadas por via intranasal (IN) com 106 da dose infeciosa de embrião 50 (EID50) / ave de TV/02 (LPAI H7N2) . As aves não desafiadas foram falsamente desafiadas com 100 μΐ PBS por via intranasal. Após o desafio, as aves foram monitorizadas diariamente relativamente a sinais de doença durante 14 dias após a infeção (PI). Os resultados de morbidez após o desafio com LPAI H7N2 são mostrados na Figura 5 e demonstram uma redução significativa na morbidez após vacinação com SE13A que expressa M2E e CD154. Para determinar a incidência da libertação do vírus, foram colhidos esfregaços orais e cloacais no dia 2 e 4 após a infeção. A quantidade da libertação do vírus após o desafio com LPAI H7N2 aos dias 2 e 4 após a infeção é mostrada na Figura 6 e demonstrou que a vacinação com SE13A-HM também reduz a capacidade do AI de replicar nos pintos.
Experiência II. Desafio com HPAI H5N1
Grupos de dez galinhas SPF com 1 dia de idade foram 37 ΕΡ2066339Β1 divididos em 5 grupos. As aves nos grupos 1, 2 e 3 receberam falsa vacinação com 100 μΐ de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). As aves no grupo 4 e 5 receberam vacinação com ASE M2e-HM, conforme descrito na Experiência I. No dia 42, as aves no grupo 1 recebem falso desafio com 100 μΐ PBS por via intranasal. As aves nos grupos 2 e 3 receberam desafio com 0,1 e 100 CLD50 Eg/02 (HPAI H5N1) por ave, respetivamente. As aves nos grupos 4 e 5 receberam desafio com 0,1 e 100 CLD50 Eg/02 (HPAI H5N1) por ave, respetivamente. Após o desafio, as aves foram monitorizadas diariamente relativamente à morbidez e mortalidade durante 14 dias após a infeção. As galinhas com sinais clínicos severos de doença foram eutanasiadas por sobredose de pentobarbital de sódio. Os resultados de morbidez após o desafio com HPAI H5N1 são mostrados na
Figura 7 e demonstram uma redução significativa na morbidez após vacinação com SE13A que expressa M2E e CD154. Para determinar a incidência da libertação do vírus, foram colhidos esfregaços orais e cloacais no dia 2 e 4 após a infeção. A quantidade da libertação do vírus após o desafio com HPAI H5N1 nos dias 2 e 4 após a infeção é mostrada na Figura 8 e demonstrou que a vacinação com SE13A-M2e também reduz a capacidade de AI de replicar nos pintos.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> O Conselho de Direção da Universidade de Arkansas <120> Composições e Métodos de potenciar respostas imunes <130> SMK/FP6618268 <140> EP 07842706.9 38 ΕΡ2066339Β1 <141> 18-09-2007 <150> PCT/US2007/078785 <151> 18-09-2007 <150> US 60/825.983 <151> 18-09-2006 <160> 40 <17 0> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Vírus da influenza aviária <400> 1
Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 1 5 10 15
Cys Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Vírus da Influenza A <400> 2
Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Gly 15 10 IS
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 3 39 ΕΡ2066339Β1
<211> 24 <212> PRT <213> Vírus da Influenza A <400> 3
Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 15 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Vírus da Influenza A <400> 4
Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu 15 10 15
Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20
<210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Vírus da Influenza A <400> 5
Glu Vai Glu Thr Pro Ile Arg Asn 1 5
<210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens 40 ΕΡ2066339Β1 <400> 6
Trp Alá Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Cys 15 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 7
Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser 15 10 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 8
Gly Gly Gly Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 20 <210> 9 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial
Glu Vai Glu Thr Pro Ile Arg Asn Gly Gly Gly 41 ΕΡ2066339Β1 <22 0> <223> Sintético <400> 9
Ser Ser Ser Ser Glu Vai Glu Thr Pro Thr Arg Asn Ser Ser Ser Glu 15 10 15
Vai Glu Thr Pro Thr Arg Asn Ser Ser Ser Ser Trp Ala Glu Lys Gly 20 25 30
Tyr Tyr Thr Met Ser Ser Ser Ser Ser Glu Vai Glu Thr Pro Ile Arg 35 40 45
Asn Ser Ser Ser Ser Glu Vai Glu Thr Pro Ile Arg Asn Ser Ser Ser 50 55 60
Ser 65
<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Salmonella enteritidis <400> 10 tgtacaagtg gacgccaatc 20
<210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Salmonella enteritidis <400> 11 gttatcgccg tctttgatat agcc 24 <210> 12 <211> 20 42 ΕΡ2066339Β1
<212> ADN <213> Salmonella enteritidis <400> 12 atttcccgtt atgccgcagc 20 <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Salmonella enteritidis <400> 13 gttaaacaga gggcgacgag 20 <210> 14 <211> 68 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 14 gctatateaa agacggcgat aactaactat aacggtccta aggtagcgaa tttccgggga 60 tccgtcga 68 <210> 15 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <22 3> Sintético 43 ΕΡ2066339Β1 <4 Ο 0> 15 gctgcggcat aacgggaaat tgtaggctgg agctgcttcg 40 <210> 16 <211> 68 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 16 gctatatcaa agacggcgat aacgaagttg aaaccccgat tcgtaacatt tcccgttatg 60 ccgcagcg 68 <210> 17 <211> 73 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sintético <400> 17 gctatatcaa agacggcgat aactgggcag aaaaaggtta ttataccatg tctatttccc 60 gttatgccgc age 73
<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Salmonella enterítidis <400> 18 gccatctcgc ttggtgataa 20 44 ΕΡ2066339Β1 <2 10> 19 <2 11> 20 <2 12> ADN <2 13> Salmonella enteritidis <4 Λ O O 19 cgctggtatt ttgcggtaca 20 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Vírus da Influenza A <40 0> 20
Glu Vai Glu Thr Pro Thr Arg Asn 1 5 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Vírus da Influenza A <400> 21
Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gin 15 10 <2 10> 22 <2 11> 19 <2 12> PRT <2 13> Vírus da Influenza A <4 Λ O O 22 45 ΕΡ2066339Β1
Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr 15 10 15
Glu Glu Leu
<210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Vírus da Influenza A <400> 23
Gly Arg Leu Ile Gin Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met vai Leu Ser 1 5 10 15 <210> 24 <2H> 14
<212> PRT <213> Vírus da Influenza A <400> 24
Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Vai Arg Thr Gly Met Asp 1 5 10 <210> 25 <2H> 272
<212> PRT <213> Gallus gallus <400> 25 46 ΕΡ2066339Β1
Met Asn Glu Ala Tyr Ser Pro Ala Ala Pro Arg Pro Met Gly Ser Thr 15 10 15
Ser Pro Ser Thr Met Lys Met Phe Met Cys Phe Leu Ser Vai Phe Met 20 25 30
Vai Vai Gin Thr ile Gly Thr vai Leu. Phe Cys Leu Tyr Leu His Met 35 40 45
Lys Met Asp Lys Met Glu Glu Vai 50 55
Leu Ser Leu Asn Glu Asp Tyr ile 60
Phe Leu Arg Lys Vai Gin Lys Cys 65 70
Gin Thr Gly Glu Asp Gin Lys Ser 75 80
Thr Leu Leu Asp Cys Glu Lys Vai 85
Leu Lys Gly Phe Gin Asp Leu Gin 90 95
Cys Lys Asp Arg Thr Ala Ser Glu 100
Glu Leu Pro Lys Phe Glu Met His 105 110
Arg Gly His Glu His Pro His Leu
Lys Ser Arg Asn Glu Thr Ser Vai 47 ΕΡ2066339Β1 115 120 125
Ala Glu Glu Lys Arg Gin Pro Ile Ala Thr His Leu Ala Gly Vai Lys 130 135 140
Ser Asn Thr Thr Vai Arg Vai Leu Lys Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala 145 150 155 160
Pro Thr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr His Glu Gly Lys Leu Lys Vai Glu 165 170 175
Lys Ala Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr 180
Ser Gin Vai Ser Phe Cys Thr Lys 185 190
Ala Ala Ala Ser Ala Pro Phe Thr Leu Tyr Ile Tyr Leu Tyr Leu Pro 195 200 205
Met Glu Glu Asp Arg Leu Leu Met Lys Gly Leu Asp Thr His Ser Thr 210 215 220
Ser Thr Ala Leu Cys Glu Leu Gin Ser Ile Arg Glu Gly Gly Vai Phe 225 230 235 240
Glu Leu Arg Gin Gly Asp Met Vai 245
Phe Val Asn Vai Thr Asp 250
Ser Thr 255
Ala Val Asn Val Asn Pro Gly Asn 260 <210> 26 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Thr Tyr 265
Phe Gly Met Phe 270
Lys Leu 48 ΕΡ2066339Β1
Met IIe Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 is
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr vai Phe Leu 20 25 30
Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Vai 50 55 60 49 ΕΡ2066339Β1
Phe MeC Lys Thr Ile Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Vai Lys 85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110
Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin Ile Ala Ala His Vai Ile Ser 115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Vai Leu Gin Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Vai Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin 145 150 155 160
Leu Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr 165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser Ile His 210 215 220
Leu Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn 225 230 235 240
Vai Thr Asp Pro Ser Gin vai Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Anas 50 ΕΡ2066339Β1 <4Ο0> 27
Trp Asn Lys Thr Ser Tyr Ala Pro Mét Asn 15 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 28 Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 29
Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Leu Ser 15 10 <210> 30 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <22 3> Sintético <400> 30 tagggataac agggtaat 18 <210> 31 51 ΕΡ2066339Β1 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 31 caaaagcgct ctgaagttcc 20 <210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 32 gcgtgagggg atcttgaagt 20 <210> 33 <211> 92 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 33 tgggcagaaa aaggttatta taccatgtct ggtggtggtg aagttgaaac cccgattcgt 60 aacggtggtg gtatttcccg ttatgccgca gc 92 <210> 34 52 ΕΡ2066339Β1 <211> 63 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 34 60 63 agacatggta taataacctt tttctgccca accaccaccg ttatcgccgt ctttgatata gcc <210> 35 <211> 134 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 35 tgggcagaaa aaggttatta taccatgtct tcctcctcct ccgaagttga aaccccgatt 60 cgtaactcct cctcctccga agttgaaacc ccgattcgta actcctcctc ctccatttcc 120 cgttatgccg cagc - 134 <210> 36 <211> 138 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <22 3> Sintético <400> 36 53 60 ΕΡ2066339Β1 120 138 agacatggta taataacctt tttctgccca ggaggaggag gagttacggg tcggggtttc aacttcggag gaggaggagt tacgggtcgg ggtttcaact tcggaggagg aggagttatc gccgtctttg atatagcc <210> 37 <211> 24 <212> ADN <213> Vírus da Influenza A <400> 37 gaagttgaaa ccccgattcg taac 24 <210> 38 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 38 tgggcagaaa aaggttatta taccatgtct 30 <210> 39 <211> 81 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 39 60 81 ggtggtggtt gggcagaaaa aggttattat accatgtctg gtggtggtga agttgaaacc ccgattcgta acggtggtgg t 54 ΕΡ2066339Β1 <210> 40 <211> 198 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sintético <400> 40 60 120 180 198 tcctcctcct ccgaagttga aaccccgacc cgtaactcct cctcctccga agttgaaacc ccgacccgta actcctcctc ctcctgggca gaaaaaggtt attaCaccat gtctccctcc tcctccgaag ttgaaacccc gattcgtaac tcctcctcct ccgaagttga aaccccgatt cgtaactcct cctcctcc 55 ΕΡ2066339Β1
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP nao assume qualquer responsabilidade neste sentido.
Documentos de Patente citados na descrição • US 82598306 P [0001] • WO 20061105972 A [0005] • EP 07842706 A [0077] • US 2007078785 W [0077] • US 60825983 B [0077]
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Lisboa, 23 de Outubro de 2014 56

Claims (16)

  1. ΕΡ2066339Β1 REIVINDICAÇÕES 1. um vetor vacina bacteriano que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo antigénico e uma sequência polinucleotídica CD154 que codifica um polipeptídeo CD154 capaz de ligar a CD40, em que o polipeptídeo CD154 tem menos de cerca de 50 aminoácidos e compreende os aminoácidos 140-149 da SEQ. ID N.° 26 ou um homólogo do mesmo que é capaz de ligar a CD40, em que o polipeptídeo antigénico é um polipeptídeo de Influenza, em que a sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo antigénico e a sequência polinucleotídica CD154 são inseridas numa sequência que codifica uma porção externa de uma proteína transmembranar e em que o vetor vacina potência a resposta imune de um sujeito.
  2. 2. 0 vetor vacina da reivindicação 1, em que a sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo antigénico é um polinucleotídeo M2e de Influenza que codifica um polipeptídeo M2e de Influenza.
  3. 3. O vetor vacina da reivindicação 1 ou 2, em que o polipeptídeo antigénico e o polipeptídeo CD154 são codificados pela mesma sequência polinucleotídica.
  4. 4. Utilização de uma sequência polinucleotídica CD154 que codifica um polipeptídeo CD154 capaz de ligar a um CD40 para o fabrico de um vetor vacina bacteriano para potenciar a resposta imune de um sujeito a um polipeptídeo de Influenza, em que o polipeptídeo CD154 tem menos de cerca de 50 aminoácidos e compreende os aminoácidos 140-149 da SEQ. ID N.° 26 ou um homólogo do mesmo capaz de ligar a CD40, em que a sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo de Influenza e a sequência polinucleotídica CD154 são inseridas numa sequência que codifica uma porção 1 ΕΡ2066339Β1 externa de uma proteína transmembranar.
  5. 5. A utilização da reivindicação 4, em que o polipeptídeo CD154 tem menos de 25 aminoácidos.
  6. 6. A utilização de qualquer uma das reivindicações 4-5, e que o polipeptídeo CD154 é expresso na superfície do vetor vacina.
  7. 7. A utilização de qualquer uma das reivindicações 4-6, em que o vetor vacina compreende ainda pelo menos uma sequência polinucleotídica M2e da Influenza A que codifica um polipeptídeo M2e da Influenza A uma quantidade eficaz para potenciar a resposta imune de um sujeito à Influenza A.
  8. 8. A utilização de qualquer uma das reivindicações 4-7, em que o polipeptídeo de Influenza e o polipeptídeo CD154 são codificados pela mesma sequência polinucleotídica.
  9. 9. Utilização de uma bactéria que compreende, pelo menos, uma sequência polinucleotídica M2e da Influenza A que codifica um polipeptídeo M2e da Influenza A para o fabrico de uma vacina eficaz para potenciar a resposta imune de um sujeito à Influenza A, em que a bactéria compreende ainda uma sequência polinucleotídica CD154 que codifica um polipeptídeo CD154 capaz de ligar a CD40 e com menos de 50 aminoácidos e compreende os aminoácidos 140-149 da SEQ. ID N.° 26 ou um homólogo do mesmo capaz de ligar a CD40 e em que a sequência polinucleotídica M2e da Influenza A e a sequência polinucleotídica CD154 são inseridas numa sequência polinucleotídica que codifica uma porção externa de uma proteína transmembranar.
  10. 10. Utilização de uma bactéria que compreende, pelo menos, 2 ΕΡ2066339Β1 uma sequência polinucleotídica M2e da Influenza A que codifica um polipeptídeo M2e da Influenza A para o fabrico de uma vacina eficaz para reduzir a morbidez relacionada com a Influenza A, em que a bactéria compreende ainda uma sequência polinucleotídica CD154 que codifica um polipeptídeo CD154 capaz de ligar a CD40 e com menos de 50 aminoácidos e compreende os aminoácidos 140-149 da SEQ. ID N.° 26 ou uma homóloga da mesma capaz de ligar a CD40 e em que a sequência polinucleotídica M2e da Influenza A e a sequência polinucleotídica CD154 são inseridas numa sequência polinucleotídica que codifica uma porção externa de uma proteína transmembranar.
  11. 11. A utilização de qualquer uma das reivindicações 8-10, em que o polipeptídeo M2e da Influenza A é selecionado para o grupo que consiste na SEQ. ID N.°l; SEQ. ID N.° 2; SEQ. ID N.° 3; SEQ. ID N.° 4; SEQ. ID N.° 5; SEQ. ID N.° 20 e fragmento imunogénico da SEQ. ID N.° 1, um fragmento imunogénico da SEQ. ID N.° 2, um fragmento imunogénico da SEQ. ID N.° 3 e um fragmento imunogénico da SEQ. ID N.° 4.
  12. 12. A utilização de qualquer uma das reivindicações 7-11, em que a bactéria é um membro da família Enterobacteraciae.
  13. 13. A utilização da reivindicação 12, em que a bactéria é uma estirpe de Salmonella de qualquer de (a) Salmonella enteritidis com o número de depósito ATCC PTA-7871, (b) uma estirpe de Salmonella capaz de colonizar um sujeito, (c) uma estirpe de Salmonella que compreende uma mutação numa via de aromatização, (d) uma estirpe de Salmonella que compreende uma mutação dentro de aroA, (e) uma estirpe de Salmonella que compreende uma mutação uma via de resposta de stress e (f) uma estirpe de Salmonella que compreende uma mutação em htrA. 3 ΕΡ2066339Β1
  14. 14. A utilização de qualquer uma das reivindicações 9-13, em que o polipeptídeo CD154 e o polipeptídeo M2e da Influenza são codificados pela mesma sequência polinucleotidica.
  15. 15. Um método para desenvolver um vetor vacina bacteriano que compreende: a) selecionar uma bactéria capaz de colonizar um sujeito; b) atenuar a bactéria para gerar uma bactéria atenuada; c) incorporar uma sequência polinucleotidica CD154 que codifica um polipeptídeo CD154 capaz de ligar CD40 na bactéria atenuada para gerar um vetor vacina, em que o polipeptídeo CD154 tem menos de 50 aminoácidos e compreende os aminoácidos 140-149 da SEQ. ID N.° 26 ou uma homóloga da mesma capaz de ligar a CD40; e d) incorporar uma segunda sequência polinucleotidica que codifica um polipeptídeo de Influenza no cromosoma do vetor vacina, em que as sequências polinucleotídicas que codifica o polipeptídeo de Influenza e a sequência polinucleotidica CD154 são inseridos numa sequência que codifica uma porção externa da proteína transmembranar.
  16. 16. O método da reivindicação 15, em que o polipeptídeo CD154 e o polipeptídeo antigénico são codificados pela mesma sequência polinucleotidica. Lisboa, 23 de Outubro de 2014 4
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