JP2009511452A - Ｃ型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せ - Google Patents
Ｃ型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009511452A JP2009511452A JP2008534032A JP2008534032A JP2009511452A JP 2009511452 A JP2009511452 A JP 2009511452A JP 2008534032 A JP2008534032 A JP 2008534032A JP 2008534032 A JP2008534032 A JP 2008534032A JP 2009511452 A JP2009511452 A JP 2009511452A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- combination
- protein
- immunostimulants
- cells
- response
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 title claims abstract description 23
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 43
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 11
- 229940123189 CD40 agonist Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 88
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 53
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 claims description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 37
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 35
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 17
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 17
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 13
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 6
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 102000008230 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010060885 Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 101800000511 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 101000955367 Pseudomonas putida Transcriptional regulatory protein XylR Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 108030003004 Triphosphatases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 231100000749 chronicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本発明は、TLR3 アゴニスト、CD40 アゴニストおよびC型肝炎ウイルスのNS3 タンパク質を含むことを特徴とする、C型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せに関する。さらに本発明は、前記免疫刺激物質の組合せを含む医薬組成物、その使用、および前記医薬組成物から構成されるキットに関する。最後に、本発明は、C型肝炎ウイルスに対する免疫応答を生じさせる方法および前記ウイルスに対するワクチンの産生方法に関する。
Description
本発明は、HCVのNS3 タンパク質を、HCV ウイルスに対する特異的な強力かつ持続性のCD8+およびCD4+ 応答の誘導能のため選択されたアジュバントとともに含む、C型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せに関する。
C型肝炎ウイルス (HCV)の感染は今日、全世界の推定感染患者数が1億7千万人を超えており、公衆衛生の多大な負担となっている。また、この患者数はこの先数年は変化しそうにない。
HCVの感染は、慢性化の傾向が高いことが特徴である。HCVは70%の感染個体中に存在し続け、その20%が硬変を発症し、2.5%が肝臓癌に進展する。
現在の標準的治療手段は、インターフェロンの使用に基づく治療プロトコールである。それにもかかわらず、この抗ウイルス療法は高価であり、比較的毒性があり、また処置した患者の50-60%にしか有効でない。それゆえ、より効果的でより患者の耐用性に優れた新しい治療法を開発する必要があり、またその開発が望まれている。
最新のHCV の総説は、Natureにみられる (”Insights: Hepatitis C”. Nature 2005, Supplements; Vol. 436, Nr. 7053, pp 929-978)。
残念なことにまだC型肝炎ウイルスに対する有効なワクチンはないが、有効なワクチンが可能と考えられる実験データおよび証拠が存在する。抗ウイルス抗体は感染に応答して合成されるが、細胞傷害性T細胞(CD8+) およびヘルパーT細胞 (CD4+)の部分の細胞性免疫応答が存在しないことが慢性状態の特徴である。つまり、HCVが特異的に抗ウイルス免疫応答から逃れられる方法を発達させたと仮定される。ここで細胞傷害性T 応答およびヘルパーT 応答の力および質がその患者が（自然にまたは治療に応じて）回復するか慢性感染に進展するかを決定する。
いずれのワクチンも主な目的は抗原特異的獲得免疫を刺激することであり、そのメディエーターはBおよびT-リンパ球である。これに関して、抗原提示細胞(APC) は特異的免疫応答の開始に、特にT リンパ球の活性化に重要な役割を果たす。APC、主に樹状細胞は、末梢臓器で抗原を捕捉し、活性化刺激を受けた後にリンパ系臓器に移行する。そこで樹状細胞は、抗原(エピトープ)の分解により生じたペプチド産物を主要組織適合性複合体MHCの存在分子に結合してその表面に提示し、同時にケモカインおよびサイトカインを産生し、T細胞を誘引および活性化する。樹状細胞の活性化プロセス（成熟としても知られる）は、MHC 分子 (シグナル 1)、補助刺激分子 (シグナル 2)および分極性サイトカイン、例えばインターロイキン-12 (IL-12) (シグナル 3)の高発現を特徴とする。成熟は、病原体成分または炎症もしくは細胞傷害プロセスにおいて頻出する宿主の分子のような因子により誘導される。これらの因子は微生物由来産物に対する特異的レセプター、例えばTLR タイプレセプター (Toll様レセプター)、サイトカイン（TNF-α、IL-1、IFN-α）に対するレセプター、または細胞表面上のリガンドに対するレセプター（例えばCD40)を介して樹状細胞に作用する。
様々なT 細胞集団のAPCによる刺激および活性化は、一方ではMHC 分子のタイプに拘束され、他方ではこれらMHC 分子と複合体を形成するエピトープの特徴に拘束される。つまり、例えば細胞傷害性CD8+ T リンパ球(CTL)の活性化を特異的に誘導するウイルスタンパク質のある種のフラグメントが同定されており、これはリンパ球エピトープまたはCD8+ T 細胞もしくはCD8+ エピトープとして知られている; あるいは、CD4+ ヘルパーT リンパ球(HTL)の活性化を特異的に誘導するエピトープ、CD4+ エピトープが知られている。データベース”HCV Immunology Database” (http://hcv.lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html) は、C型肝炎ウイルスの様々な株および分離株のウイルスタンパク質に基づいて同定された、CD8+ CTLおよびCD4+ HTLの両方のT リンパ球に対するエピトープを蓄積する。
ペプチド形態のエピトープの使用に基づく免疫化プロトコールの開発は、このように、各個体が提示するMHC 分子に依存した各個体に適するそれらペプチドの事前の選択を必要とする。このことは、各個体のMHCに依存して、この状況でエピトープとして機能しうる特定のペプチドの組合せを選択しなければならないことを示唆する。大きな抗原を使用すればこの問題は克服でき、なぜならそれは通常多エピトープ性（polyepitopic）であり、その配列中に異なる個体のMHC 分子によって提示されうるCD8+ CTLおよびCD4+ HTLの両方に対する各種エプトープが存在するからである。このように、単一の抗原が異なるMHCを有する個体においてワクチンとして使用可能である。
HCVの各種タンパク質の中で、コアおよびNS3は優れた免疫原性を示し、感染を克服した個体ではそれらに対する強力なCD8+ CTLおよびCD4+ HTL応答が検出される。それにもかかわらず、コアが免疫系の細胞に接触したときにそれらに対して有害な効果を有することを示すデータも存在し、そのためコアはワクチン法における抗原として推奨されない。一方、NS3はこのタイプの効果をほとんど示さないタンパク質であり、CD8+ CTLおよびCD4+ HTL応答の誘導のための抗原としてふさわしい候補でありうる。
CD4+ HTLは獲得免疫において機能し、様々なメカニズムの中でもとりわけAPC 活性化、CTL 活性化およびメモリー誘導により機能する。特に、HCVに特異的なCD4+ 細胞が抗ウイルスCTLの維持に必要であることが示されている (Grakoui A. et al., ”HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help”; Science, 2003; 302: 659-662)。それゆえ、C型肝炎ウイルスに対して有効なワクチンは、CD8+ CTL 応答だけでなくCD4+ HTL応答の誘導にも最大の効力を示さなければならない。かかるワクチンは、それゆえ、これら応答を提供する特異的抗原の選択を必要とする。
それにもかかわらず、抗原の組合せ自体はHCVに対する有効なワクチンを提供しえないようである。樹状細胞の成熟がT リンパ球の効果的な惹起および活性化に必要であることを考慮すると、かかるワクチンは樹状細胞の成熟を刺激する幾つかのアジュバントを含む免疫刺激物質の組合せに含ませることが有益であろう。アジュバントとして、TLRレセプター、サイトカインレセプター、または前述の細胞内リガンドのレセプターに対するリガンド、あるいはより好ましくはこれらアジュバントの相乗的組合せを使用することができる。
つまり、例えば、US2004/0141950はTLRアンタゴニストおよび腫瘍壊死因子 (TNF) またはそのレセプター (TNFR)のスーパーファミリーの分子のアンタゴニストを含み、さらに抗原を含みうる免疫刺激物質の組合せについて記載する。多数の可能性ある組合せの中で、CD40のリガンド(抗CD40 抗体) とポリ(I:C)、すなわちTLR3の合成リガンドとの組合せが提示され、この組合せはCD8+ T リンパ球の増殖において相乗効果を示す。同様に、Ahonen et al. (J. Exp. Med. 2004; 199: 775-784) は、CD4+ T リンパ球とは無関係に抗原特異的CD8+ CTLの増殖および分化を誘導するアゴニストの相乗的誘導能についてのデータを示す。これらの研究はTLR/CD40の抗原特異的メモリーCD8+ T リンパ球の活性化能について記載するが、TLR/CD40アゴニストの組合せがCD4+ HTL応答も高めることができるかについては確立できていない。
HCVの感染の場合、感染患者と感染を除去できた患者とを比較するとCD4+ HTL応答に明らかな相違が見られている。一方、治癒した患者より弱いもののCD8+ CTL応答は感染患者でもまだ検出可能である。つまり、CTLがHCV 感染の除去に重要なエフェクター集団として機能するが、CD4+ 細胞もまたこの疾患の制御に重要な役割を果たしている。さらに、CD4+ T-リンパ球の誘導は抗ウイルスCTL応答の維持に重要であることが示されている (Grakoui A. et al., ”HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help”; Science, 2003; 302: 659-662)。これらのデータは、HCVによるウイルス性疾患に対するワクチン接種および治療に、強力かつ持続性のCD8+およびCD4+両方の抗ウイルス応答の誘導が重要であることを示唆する。
それゆえ、本発明の目的は、より強力、完全かつ持続性の、CD8+およびCD4+両方の応答を刺激するC型肝炎の予防および治療に適する抗原およびアジュバントの免疫刺激物質の組合せを選択することである。
本発明の第一の目的は、C型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せであって、TLR3 アゴニスト、CD40 アゴニストまたはそれをコードするDNA配列、およびC型肝炎ウイルスのNS3 タンパク質またはCD8+およびCD4+応答の誘導能を有する前記NS3 タンパク質のフラグメントを含むポリペプチドを含む免疫刺激物質の組合せ（以下本発明の免疫刺激物質の組合せと称する）に関する。
「TLR3 アゴニスト」とは、TLR3 レセプター(「Toll様受容体 3」) に作用または結合し、細胞応答を提供しうるリガンドを意味する。TLR3は、NF-κBを活性化してタイプ Iインターフェロン (IFN) (IFN-αおよびIFN-β) を産生させるシグナルを伝達し樹状細胞の成熟を刺激する二本鎖RNAの受容体である。TLR3を発現しないマウスは、ポリ(I:C) （HCV タイプのウイルスの複製中に生じる二本鎖RNAに類似するTLR3 リガンド）に対する応答が減少し、D-ガラクトサミンで感作した場合のポリ(I:C)の致死効果に対して耐性を示し、また炎症性サイトカインの産生が減少していた (Alexopoulou et al. Nature, 2001, Vol. 413, pp. 732-738)。本発明の特定の態様において、前記TLR3リガンドは、ウイルスの二本鎖RNAまたはポリイノシン酸-ポリシチジル酸二本鎖、すなわちポリ(I:C)であってよい。
「CD40 アゴニスト」は、CD40 レセプターに作用または結合し、同様に細胞応答を誘導しうるリガンドを意味する。CD40は、各種細胞タイプ、例えばB-リンパ球または抗原提示細胞(マクロファージ、樹状細胞など)、の膜に発現する分子である。CD40の天然リガンド(CD40LまたはCD154) は、抗原の認識後に活性化されたT リンパ球上に主に発現する。CD40Lと抗原提示細胞に存在するCD40との相互作用は、その抗原提示細胞の成熟を誘導する。この現象は、病原体由来の刺激と同様の方法で、抗原提示細胞により優れた免疫応答誘導能を持たせる。それゆえ、本発明の免疫刺激物質組成物のCD40 アゴニストは、一方ではCD40L リガンドを意味し、またはCD40に対する結合能および細胞応答または免疫応答の誘導能を保存するCD40Lのフラグメントを意味する。特定の態様において、リガンドはCD40特異的抗体(抗CD40) またはCD40に対する結合能を保存するそのフラグメントでありうる。さらに、CD40 リガンドまたはそのフラグメントは、タンパク質の形態にて、あるいはそのリガンドをコードする組換え核酸 (DNA)、例えば移行または遺伝子治療のためのウイルスベクター、の形態にても、免疫刺激物質の組合せに存在しうる。
「抗原」とは、個体（ヒトまたは動物）の生命体において免疫応答（液性および細胞性）を誘導しうる、または免疫細胞と接触したときに細胞性免疫応答(免疫細胞の増殖、活性化および／または成熟、サイトカインまたは抗体の産生)を誘導しうる、あらゆる物質を意味する。特に、抗原は、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質のペプチドもしくはフラグメント、またはウイルスタンパク質の組換えタンパク質であってよく、あるいはそれにより伝達される応答を誘導しうる合成ペプチドであってもよい。
「CD8+誘導エピトープ」とは、特異的にCD8+ 細胞傷害性T リンパ球 (CTL)の活性化を誘導しうる抗原のフラグメントまたは部分ポリペプチド鎖を意味する。「CD4+誘導エピトープ」とは、特異的にCD4+ ヘルパーT リンパ球 (HTL)の活性化を誘導しうる抗原のフラグメントまたは部分ポリペプチド鎖を意味する。
「NS3 タンパク質」とは、C型肝炎ウイルスの非構造性タンパク質 NS3を意味し、これはN末端の189 アミノ酸をカバーするセリンプロテイナーゼ、およびC末端の442 アミノ酸をカバーするヘリカーゼ-ヌクレオシドトリフォスファターゼ活性を有するドメインの2つのドメインを含む67 kDaのタンパク質である。本発明の免疫刺激物質の組合せのポリペプチドに含まれるNS3 タンパク質の配列は、C型肝炎ウイルスのいずれの株または分離株に、特にヒトC型肝炎ウイルスのいずれの株または分離株に相当するものであってもよい。特定の態様において、NS3 タンパク質を含むポリペプチドは、組換え技術によって得られたものである。本発明の具体的な非限定的態様において、配列番号 1の配列（Genebank登録番号DQ068198.1およびAAY84763.1, VRL 28-NOV-2005に相当）を有する組換えNS3 タンパク質が用いられる。また、配列番号 2の配列（Genebank登録番号D90208に相当）を有する別の組換えタンパク質も使用した。
本発明の別の態様において、CD4+およびCD8+ 応答を誘導可能なようにNS3 タンパク質のフラグメントを含むポリペプチドもまた使用可能である。それゆえ、前記フラグメントは少なくとも1つのCD8+誘導エピトープおよび少なくとも1つのCD4+誘導エピトープを含まなければならない。
具体的態様において、本発明の免疫刺激物質の組合せは、ポリ(I:C)、抗CD40抗体、およびNS3 タンパク質を含むポリペプチドを含む。
本発明の好ましい態様において、免疫刺激物質の組合せは、全ての成分が同一の医薬組成物の一部を形成し、ここで各成分は医薬上許容される量にて存在する。さらに、本発明はまた、前記医薬組成物に関する。
本発明の別の具体的態様において、免疫刺激物質の組合せの成分は少なくとも2つの医薬組成物の一部を形成する。同様に本発明は、前記医薬組成物が同時に投与されることを特徴とする前記免疫刺激物質の組合せの使用に関する。本発明の別の態様において、前記免疫刺激物質の組合せの使用は、前記医薬組成物が異なる時点に同じまたは相異なる投与経路にて投与されることを特徴とする。それゆえ、本発明のある具体的態様は、少なくとも2つの異なる医薬組成物を含むことを特徴とする、上記の免疫刺激物質の組合せの投与のためのキットである。
別の局面において、本発明は、上記定義の刺激用組合せを免疫応答の誘導に有効な量にて投与することからなることを特徴とする、C型肝炎ウイルスに対する免疫応答を生じさせる方法に関する。好ましい態様において、本発明の方法は、予防的処置である。より好ましい態様において、本発明の方法は、治療的処置である。
最後に、本発明はまた、上記定義の免疫刺激物質の組合せを含むことを特徴とするC型肝炎ウイルスに対するワクチンに関し、これは本発明の目的を形成する。
本発明の実施態様
以下の実施例は、決して限定ではなく、本特許出願を形成する発明の態様を説明することを目的とする。
以下の実施例は、決して限定ではなく、本特許出願を形成する発明の態様を説明することを目的とする。
関連する材料および方法
エピトープ、抗原、および試薬
使用したペプチドまたはエピトープは、Fmoc化学を用いてマルチプルペプチドシンセサイザにより手動で合成した(Wellings DA. and Atherton E. Methods Enzymol 1997; 289: 44-67)。カイザーニンヒドリン試験を各工程のモニタリングに使用した。合成の最後に継ぎ合わせ、トリフルオロ酢酸で脱保護し、ジエチルエーテルで洗浄した。HPLCで測定したペプチドの純度は常に90％以上であった。
エピトープ、抗原、および試薬
使用したペプチドまたはエピトープは、Fmoc化学を用いてマルチプルペプチドシンセサイザにより手動で合成した(Wellings DA. and Atherton E. Methods Enzymol 1997; 289: 44-67)。カイザーニンヒドリン試験を各工程のモニタリングに使用した。合成の最後に継ぎ合わせ、トリフルオロ酢酸で脱保護し、ジエチルエーテルで洗浄した。HPLCで測定したペプチドの純度は常に90％以上であった。
ペプチドまたはエピトープのナンバリングは、通常プロトタイプと見なされるヒトC型肝炎のH 株における完全配列(GeneBank登録番号M67463)をレファレンスとした、その相対的HCVH位置を意味する。つまり、例えばデータベース”HCV Immunology Database (http://hcv.lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html)”はC型肝炎ウイルスの様々な株および分離株のウイルスタンパク質において同定された細胞傷害性T リンパ球およびヘルパー T リンパ球の両方のT リンパ球に対するエピトープを蓄積しており、それらも全て前述のGenbankレファレンスのH株ウイルスに関する相対的位置にしたがって並んでいる。
免疫原として、NS3 タンパク質の完全配列 (配列番号: 1; Genebank登録番号AAY84763.1, VRL 28-NOV-2005; 631アミノ酸)を含む655 アミノ酸の組換えポリペプチドを使用した。NS3 タンパク質の631 アミノ酸に加えて、このポリペプチドはまた、抗mycモノクローナル抗体による検出のためのc-myc 配列を有するテイルおよびヒスチジンテイルを含む。このタンパク質はPichia pastorisにおいて産生した。これをTris 22.5 mM / 尿素 3.76 M / NaCl 300 mMの溶液中に懸濁して維持した。このタンパク質をNi カラムクロマトグラフィーにより精製した。
NS3 タンパク質の完全配列 (配列番号: 2; Genebank登録番号D90208)を含む635 アミノ酸を含む別の組換えポリペプチドもまた免疫原として使用した。NS3に相当するアミノ酸に加えて、このポリぺプチドはまた精製用のヒスチジンテイルを含む。NS3に相当するDNA配列は、NS3配列を含むgWIZプラスミド (Dr. G. Inchauspe, Lyon, Franceより供与)をSal IおよびNot Iにより消化して得た。消化産物をpET-45 (+)プラスミド (Novagen, Madison WI)のBsrG IサイトとNot Iサイトの間にクローン化した。これをE. coliで発現し、そしてアフィニティークロマトグラフィーによりニッケルカラムにて精製し、次いでイオン交換 クロマトグラフィーにより精製した。
同様に、インビトロアッセイのため、組換えポリペプチド(Mikrogen; カタログNo. 94302) を抗原として使用した。これは非構造タンパク質 NS2の最後の20 アミノ酸およびHVCのNS3 タンパク質の最初の508 アミノ酸を含む(配列番号: 3)。
TLR3 アゴニストとして、ポリ(I:C)をAmershamより得て使用した(カタログNo. 27-4732-01)。
CD40 アゴニストとして、ハイブリドーマFGK-45 (Rolink A. et al., Immunity 1996. 5: 319-330)から精製した抗CD40抗体を使用した。
いずれも試薬も、変形細胞リムルス（amoebocyte limulus）のライセート QCL-1000 アッセイ(Bio Whittaker)により測定した産物1mgあたりのエンドトキシンは＜1ユニットであった。
マウス
6〜8週齢のC57B1/6 マウスをHarlanから入手した。ヒトHLA-A2.1分子のトランスジェニックマウスであるHHD マウスもまた使用した (Pascolo S. et al., J. Exp. Med. 1997. 185: 2043-2051)。いずれの動物も無菌条件下で維持され、施設の規則にしたがい扱われた。
6〜8週齢のC57B1/6 マウスをHarlanから入手した。ヒトHLA-A2.1分子のトランスジェニックマウスであるHHD マウスもまた使用した (Pascolo S. et al., J. Exp. Med. 1997. 185: 2043-2051)。いずれの動物も無菌条件下で維持され、施設の規則にしたがい扱われた。
細胞株
T2 細胞 (Salter R. et al. immunogenetics, 1985 21: 235-246) をHHDマウス由来の細胞傷害性T-リンパ球 (CTL) を用いたクロム放出アッセイの標的細胞として使用した。
T2 細胞 (Salter R. et al. immunogenetics, 1985 21: 235-246) をHHDマウス由来の細胞傷害性T-リンパ球 (CTL) を用いたクロム放出アッセイの標的細胞として使用した。
T1 細胞にHCVのコード領域のキャリアプラスミドをトランスフェクトして(T1/HCVcon 細胞)、HCVのタンパク質を発現する細胞の認識アッセイに使用した。これらの細胞はDr. D. Moradpour (Freiburg, Germany; Volk B. et al., J Gen Virol. 2005; 86: 1737-1746)より供与された。トランスフェクトしていないT1 細胞(ATCC, カタログNo. CRL-1991) をコントロールとして使用した。
細胞はいずれも完全培地(RPMI 1640、10% ウシ胎児血清、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、2 mM グルタミン、および50 μM 2-メルカプトエタノール含有)中にて培養した。T1/HCVcon 細胞株の培養には2 mg/ml G418 (Gibco)も含めた。
免疫化
2匹のマウスの群をi.p. 経路にて50 μg 抗CD40により免疫化した。4時間後、50 μg ポリ(I:C) (i.v.) 、および様々な量の抗原、つまりNS3 タンパク質またはNS3とペプチドの混合物 (i.p.)を注射した。
2匹のマウスの群をi.p. 経路にて50 μg 抗CD40により免疫化した。4時間後、50 μg ポリ(I:C) (i.v.) 、および様々な量の抗原、つまりNS3 タンパク質またはNS3とペプチドの混合物 (i.p.)を注射した。
サイトカイン産生のための脾細胞の刺激
脾細胞を完全培地に再懸濁し、ペプチドまたは組換えHCV NS3 タンパク質の存在または非存在下において、8 x 105 細胞/ウェル、0.2 ml中にてU底96-ウェルプレート上に播種した。
脾細胞を完全培地に再懸濁し、ペプチドまたは組換えHCV NS3 タンパク質の存在または非存在下において、8 x 105 細胞/ウェル、0.2 ml中にてU底96-ウェルプレート上に播種した。
2日後、上清を回収し、IFN-γの存在をELISA (BD-Pharmingen)により製造元の指示書にしたがい測定した。
CTLの溶解活性の測定
CTL 応答を測定するため、免疫化した動物に由来する脾細胞をペプチド (10 μM) と2 時間37℃でインキュベートし、2回洗浄し、そして24-ウェルプレートで7.5 x 106 細胞/ウェルのコンフルエンスにて培養した。T1/HCVcon 細胞の認識の測定ため行った実験では、HHD マウスの7.5 x 106の脾細胞を、事前にマイトマイシン C (Sigma)で刺激した7.5 x 105 のT1/HCVcon 細胞とともに培養した。全てのケースで、2日後に2.5 U/ml IL-2 (Boehringer-Mannheim GmbH, Germany) をウェルに添加し、そして5日後に細胞を回収し、クロム放出活性を行った。
CTL 応答を測定するため、免疫化した動物に由来する脾細胞をペプチド (10 μM) と2 時間37℃でインキュベートし、2回洗浄し、そして24-ウェルプレートで7.5 x 106 細胞/ウェルのコンフルエンスにて培養した。T1/HCVcon 細胞の認識の測定ため行った実験では、HHD マウスの7.5 x 106の脾細胞を、事前にマイトマイシン C (Sigma)で刺激した7.5 x 105 のT1/HCVcon 細胞とともに培養した。全てのケースで、2日後に2.5 U/ml IL-2 (Boehringer-Mannheim GmbH, Germany) をウェルに添加し、そして5日後に細胞を回収し、クロム放出活性を行った。
溶解活性は、様々な量のエフェクター細胞を、事前にペプチド（標的）と51Crまたは51Crのみをロードした3000個のT2 標的細胞と4時間インキュベートすることで測定した。T1/HCVconで刺激した細胞の場合、事前に51CrをロードしたT1/HCVcon またはT1とエフェクター細胞を接触させた。培養上清を4 時間のインキュベーション後に回収した。
特異的溶解率は以下の式にしたがい計算した：
(cpm実験 − cpm自発) / (cpm最大 − cpm自発) x 100
、ここで、自発溶解 (cpm自発として測定) はエフェクター細胞の非存在下でインキュベートした標的細胞であり、また最大溶解 (cpm最大) は標的細胞を5% Tritonx100とインキュベートして得られるものである。
(cpm実験 − cpm自発) / (cpm最大 − cpm自発) x 100
、ここで、自発溶解 (cpm自発として測定) はエフェクター細胞の非存在下でインキュベートした標的細胞であり、また最大溶解 (cpm最大) は標的細胞を5% Tritonx100とインキュベートして得られるものである。
実施例１
NS3 タンパク質とともに抗CD40およびポリ(I:C)を用いて免疫化すると、多エピトープ性CD4+およびCD8+ T 応答が誘導される。
抗CD40およびポリ(I:C)による免疫化は、CD8+細胞のエピトープに相当する合成ペプチドを免疫原として使用したCD8+ 応答の誘導に非常に効果的であることが示されている。この方法は強力な応答を誘導するが、CD4+ 応答を誘導する少量のNS3 タンパク質 (5 μg/マウス)とともに共免疫化すると、CD8+ 応答の大きさが増強され、また、高親和性のCD8+ 応答、換言すれば低濃度の抗原を認識するCD8+ 応答が増加することが示されている。さらに、ペプチドによる免疫化は、選択したペプチドと同じ拘束性のHLA 分子を有する個体においてのみ有効である。これらの2つの点に対処するため、多量の組換えNS3 タンパク質による免疫化によってCD4+応答だけでなくCD8+応答も誘導できるかについて研究を行った。この目的のため、マウスをポリ(I:C)および抗CD40とともにNS3にて免疫化し、そして誘導された応答について研究した。つまり、HHD マウス(各群2匹) に50 μg 抗CD40をi.p.注射した。4時間後、それらに50 μg ポリ(I:C) (i.v.) および500 μg 組換えNS3 タンパク質 (i.p.) (配列番号: 1)を注射した。6日後、動物を屠殺し、脾細胞を抽出した。NS3の能力を解析する目的で、CD8+およびCD4+ T 応答を誘導すべくアジュバント ポリ(I:C) と抗CD40 とを処方する場合、脾細胞をこれら細胞集団を特異的に活性化する様々な抗原によりイン・ビトロで刺激した。(A) CD8+ 応答の解析のため、第一の実験では、脾細胞をCD8+ エピトープ 1073、1406、または1038でIL-2の存在下5日間刺激した。その後、ペプチドで刺激した各細胞群について、対応ペプチドをロードした標的細胞 (黒バー) またはペプチドなしのコントロール標的細胞(白バー)の溶解能を測定した。図1Aは、エフェクター:標的比 100:1で得られた結果を示す。(B) NS3による免疫化後に誘導されるCD8+ 応答は、同じCD8+ エピトープに対するIFN-γ産生の研究によっても解析した。この目的のため、脾細胞を様々な量の1073 (黒丸)、1406 (白三角) または1038 (黒三角)とともに培養した。培養48時間後、上清を回収し、IFN-γ含量を測定した。(C) 誘導されたCD4+ 応答を解析するため、脾細胞を免疫化に使用したNS3 タンパク質(配列番号: 1)で刺激した。また、細胞を細菌で産生された市販のNS3 タンパク質 (配列番号: 3)で刺激した。前述のように、活性化の程度はIFN-γの産生により測定した。
NS3 タンパク質とともに抗CD40およびポリ(I:C)を用いて免疫化すると、多エピトープ性CD4+およびCD8+ T 応答が誘導される。
抗CD40およびポリ(I:C)による免疫化は、CD8+細胞のエピトープに相当する合成ペプチドを免疫原として使用したCD8+ 応答の誘導に非常に効果的であることが示されている。この方法は強力な応答を誘導するが、CD4+ 応答を誘導する少量のNS3 タンパク質 (5 μg/マウス)とともに共免疫化すると、CD8+ 応答の大きさが増強され、また、高親和性のCD8+ 応答、換言すれば低濃度の抗原を認識するCD8+ 応答が増加することが示されている。さらに、ペプチドによる免疫化は、選択したペプチドと同じ拘束性のHLA 分子を有する個体においてのみ有効である。これらの2つの点に対処するため、多量の組換えNS3 タンパク質による免疫化によってCD4+応答だけでなくCD8+応答も誘導できるかについて研究を行った。この目的のため、マウスをポリ(I:C)および抗CD40とともにNS3にて免疫化し、そして誘導された応答について研究した。つまり、HHD マウス(各群2匹) に50 μg 抗CD40をi.p.注射した。4時間後、それらに50 μg ポリ(I:C) (i.v.) および500 μg 組換えNS3 タンパク質 (i.p.) (配列番号: 1)を注射した。6日後、動物を屠殺し、脾細胞を抽出した。NS3の能力を解析する目的で、CD8+およびCD4+ T 応答を誘導すべくアジュバント ポリ(I:C) と抗CD40 とを処方する場合、脾細胞をこれら細胞集団を特異的に活性化する様々な抗原によりイン・ビトロで刺激した。(A) CD8+ 応答の解析のため、第一の実験では、脾細胞をCD8+ エピトープ 1073、1406、または1038でIL-2の存在下5日間刺激した。その後、ペプチドで刺激した各細胞群について、対応ペプチドをロードした標的細胞 (黒バー) またはペプチドなしのコントロール標的細胞(白バー)の溶解能を測定した。図1Aは、エフェクター:標的比 100:1で得られた結果を示す。(B) NS3による免疫化後に誘導されるCD8+ 応答は、同じCD8+ エピトープに対するIFN-γ産生の研究によっても解析した。この目的のため、脾細胞を様々な量の1073 (黒丸)、1406 (白三角) または1038 (黒三角)とともに培養した。培養48時間後、上清を回収し、IFN-γ含量を測定した。(C) 誘導されたCD4+ 応答を解析するため、脾細胞を免疫化に使用したNS3 タンパク質(配列番号: 1)で刺激した。また、細胞を細菌で産生された市販のNS3 タンパク質 (配列番号: 3)で刺激した。前述のように、活性化の程度はIFN-γの産生により測定した。
第一に、この抗原がCD8+ 応答を誘導できることが確認され、これはクロム放出アッセイ (図 1A) および IFN-γの産生誘導(図 1B)の両方により検出できた。さらに、この応答は多エピトープ性で、NS3 配列内に特徴的な各種CD8+ エピトープ(例えば、ペプチド1073、1406および1038)に対するものであった。最後に、免疫化に使用したNS3 タンパク質および細菌で産生された市販のNS3 タンパク質を認識するCD4+ 応答を誘導できることも確認された(図 1C)。この後者に対する応答のほうが弱く、これはおそらく、両タンパク質の配列に何らかの変化が存在すること、および細菌で発現させたタンパク質の方が短く、CD4+ T リンパ球により認識される一部のエピトープを欠失している可能性があることによる。
実施例 2
25 μg 組換えNS3はポリ(I:C)および抗CD40とともに投与すればCD4+およびCD8+ T 応答を十分に誘導できる。
以前の実験から、本発明者らは、5 μg NS3ではCD4+ 応答は誘導されるがCD8+応答は誘導されないことがわかっていたので、CD8+ 応答の誘導に十分なNS3の最小量を知りたかった。この目的のため、HHD マウスを500、250、125、および25 μg のNS3 (配列番号: 1)で免疫化した。また、コントロールとして、CD8+ 応答を誘導するCD8+ エピトープに相当するペプチドとCD4+ 応答を誘導する5 μg NS3 (配列番号: 1)とで免疫化した群を含めた。このため、ある投与量のNS3で免疫化した動物の群それぞれにおいて、CD8+ 応答およびCD4+ 応答について解析を行った。CD8+ 応答は、CD8+ エピトープ1073をロードした標的細胞の溶解能(図 2A)として、また様々な濃度のCD8+ エピトープ1073 (図 2B)および1038 (図 2C)についてのIFN-γ産生能として解析した。CD4+ 応答は、様々な濃度のNS3 (配列番号: 1)についてのIFN-γ産生能により測定した (図 2D)。この実験は、解析したいずれの量のNS3もCD8+ 応答を誘導できることを示し、ペプチド 1073に対する溶解応答を研究すると (図 2A)投与量25 μg で誘導される応答が最も弱かった。さらに、エピトープ1073 (図 2B) および1038 (図2C)についていずれの投与量もIFN-γ産生を誘導することができ、このことは多エピトープ性応答の誘導能が投与量を減らしても維持されたことを示唆する。最後に、予想されたように、それらはいずれもCD4+ 応答を誘導できた。大抵の場合25 μg NS3を使用したときに誘導された応答の方がより弱かったことを考慮して、後の実験では、応答の誘導の増加がみられなくなった投与量100 μg/マウスを選択した。
25 μg 組換えNS3はポリ(I:C)および抗CD40とともに投与すればCD4+およびCD8+ T 応答を十分に誘導できる。
以前の実験から、本発明者らは、5 μg NS3ではCD4+ 応答は誘導されるがCD8+応答は誘導されないことがわかっていたので、CD8+ 応答の誘導に十分なNS3の最小量を知りたかった。この目的のため、HHD マウスを500、250、125、および25 μg のNS3 (配列番号: 1)で免疫化した。また、コントロールとして、CD8+ 応答を誘導するCD8+ エピトープに相当するペプチドとCD4+ 応答を誘導する5 μg NS3 (配列番号: 1)とで免疫化した群を含めた。このため、ある投与量のNS3で免疫化した動物の群それぞれにおいて、CD8+ 応答およびCD4+ 応答について解析を行った。CD8+ 応答は、CD8+ エピトープ1073をロードした標的細胞の溶解能(図 2A)として、また様々な濃度のCD8+ エピトープ1073 (図 2B)および1038 (図 2C)についてのIFN-γ産生能として解析した。CD4+ 応答は、様々な濃度のNS3 (配列番号: 1)についてのIFN-γ産生能により測定した (図 2D)。この実験は、解析したいずれの量のNS3もCD8+ 応答を誘導できることを示し、ペプチド 1073に対する溶解応答を研究すると (図 2A)投与量25 μg で誘導される応答が最も弱かった。さらに、エピトープ1073 (図 2B) および1038 (図2C)についていずれの投与量もIFN-γ産生を誘導することができ、このことは多エピトープ性応答の誘導能が投与量を減らしても維持されたことを示唆する。最後に、予想されたように、それらはいずれもCD4+ 応答を誘導できた。大抵の場合25 μg NS3を使用したときに誘導された応答の方がより弱かったことを考慮して、後の実験では、応答の誘導の増加がみられなくなった投与量100 μg/マウスを選択した。
実施例 3
NS3 タンパク質とともにポリ(I:C)および抗CD40を用いて免疫化すると、異なるMHCを有する他のマウスの系統においてCD4+およびCD8+ 応答が誘導される。
NS3 タンパク質と同じ大きさの抗原において様々なMHC分子に提示されうるCD4+およびCD8+ エピトープが見つかることを考慮して、この免疫化プロトコールのCD4+およびCD8+応答の誘導能を異なるMHC分子を有する別のマウスの系統において研究した。この目的のため、H-2b拘束性MHC 分子を有するC57/B16 マウスを100 μg NS3 (配列番号: 1)で免疫化した。応答の改善を目的として、一方の群は1回の免疫化を行い、他方の群には第二の追加免疫化を行った。第一に、CD8+ 応答を、クラス I H-2 Db のMHC 分子に提示されるCD8+ エピトープを含むペプチド1629-1637 (配列番号: 7)に対するIFN-γ産生として測定した。図 3Aに示されるように、検出可能な応答が両マウス群において誘導されたが、そのレベルは2回の免疫化を施した群(黒四角)のほうが1回の免疫化を施した群 (白四角)よりもかなり大きかった。組換えNS3 タンパク質 (配列番号: 1)に対するIFN-γ産生として測定したCD4+ 応答もまた両群で検出され (図 3B)、ここでも2回の免疫化 (黒四角) は1回の免疫化 (白四角)よりもより強力な応答を誘導した。
NS3 タンパク質とともにポリ(I:C)および抗CD40を用いて免疫化すると、異なるMHCを有する他のマウスの系統においてCD4+およびCD8+ 応答が誘導される。
NS3 タンパク質と同じ大きさの抗原において様々なMHC分子に提示されうるCD4+およびCD8+ エピトープが見つかることを考慮して、この免疫化プロトコールのCD4+およびCD8+応答の誘導能を異なるMHC分子を有する別のマウスの系統において研究した。この目的のため、H-2b拘束性MHC 分子を有するC57/B16 マウスを100 μg NS3 (配列番号: 1)で免疫化した。応答の改善を目的として、一方の群は1回の免疫化を行い、他方の群には第二の追加免疫化を行った。第一に、CD8+ 応答を、クラス I H-2 Db のMHC 分子に提示されるCD8+ エピトープを含むペプチド1629-1637 (配列番号: 7)に対するIFN-γ産生として測定した。図 3Aに示されるように、検出可能な応答が両マウス群において誘導されたが、そのレベルは2回の免疫化を施した群(黒四角)のほうが1回の免疫化を施した群 (白四角)よりもかなり大きかった。組換えNS3 タンパク質 (配列番号: 1)に対するIFN-γ産生として測定したCD4+ 応答もまた両群で検出され (図 3B)、ここでも2回の免疫化 (黒四角) は1回の免疫化 (白四角)よりもより強力な応答を誘導した。
実施例 4
NS3 タンパク質とともにポリ(I:C)および抗CD40を用いて免疫化すると、HCVタンパク質発現細胞を認識できるCD8+ 応答が誘導される。
ポリ(I:C)および抗CD40とともにNS3 タンパク質を用いる免疫化によりHCV感染細胞を傷害できる可能性のある応答を誘導できるかについて研究するため、HCVのタンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした標的細胞 (T1/HCVcon)のインビトロモデルを使用した。これら細胞は、HCV感染細胞が発現するペプチドと同じペプチドをそのクラス I MHC 分子に発現する；それゆえ、それらに対する何らかの応答はHCV感染細胞に対する応答と見なすことができる。図 1〜3の実験に使用したNS3 タンパク質 (配列番号: 1)は、T1/HCVcon細胞に存在するウイルス株とは異なるウイルス株に相当する。これら2つの株は、これまで研究されたCD8+ エピトープに一部相違が見られる。T1/HCVcon細胞に存在するCD8+ エピトープの認識能を最適化することを目的として、この実験ではT1/HCVcon細胞に存在するタンパク質により高い相同性を有する配列であるNS3 タンパク質 (配列番号: 2) を免疫原として使用した。HHD マウスを100 μg NS3で免疫化した6日後、脾細胞をT1/HCVcon細胞で刺激した。T1/HCVcon 細胞を認識する能力は溶解活性アッセイにおいて解析した。この目的のため、刺激した脾細胞をT1/HCVcon 細胞およびT1コントロール細胞と接触させた。図 4に示すように、NS3による免疫化により、HCV タンパク質を発現するT1 細胞(黒丸) に対してT1 コントロール細胞(白丸)に対してよりも優れた溶解応答が誘導された。
NS3 タンパク質とともにポリ(I:C)および抗CD40を用いて免疫化すると、HCVタンパク質発現細胞を認識できるCD8+ 応答が誘導される。
ポリ(I:C)および抗CD40とともにNS3 タンパク質を用いる免疫化によりHCV感染細胞を傷害できる可能性のある応答を誘導できるかについて研究するため、HCVのタンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした標的細胞 (T1/HCVcon)のインビトロモデルを使用した。これら細胞は、HCV感染細胞が発現するペプチドと同じペプチドをそのクラス I MHC 分子に発現する；それゆえ、それらに対する何らかの応答はHCV感染細胞に対する応答と見なすことができる。図 1〜3の実験に使用したNS3 タンパク質 (配列番号: 1)は、T1/HCVcon細胞に存在するウイルス株とは異なるウイルス株に相当する。これら2つの株は、これまで研究されたCD8+ エピトープに一部相違が見られる。T1/HCVcon細胞に存在するCD8+ エピトープの認識能を最適化することを目的として、この実験ではT1/HCVcon細胞に存在するタンパク質により高い相同性を有する配列であるNS3 タンパク質 (配列番号: 2) を免疫原として使用した。HHD マウスを100 μg NS3で免疫化した6日後、脾細胞をT1/HCVcon細胞で刺激した。T1/HCVcon 細胞を認識する能力は溶解活性アッセイにおいて解析した。この目的のため、刺激した脾細胞をT1/HCVcon 細胞およびT1コントロール細胞と接触させた。図 4に示すように、NS3による免疫化により、HCV タンパク質を発現するT1 細胞(黒丸) に対してT1 コントロール細胞(白丸)に対してよりも優れた溶解応答が誘導された。
実施例 5
NS3 タンパク質とともにポリ(I:C)および抗CD40を用いて免疫化すると、持続性のT CD4+およびCD8+ 応答が誘導される。
ワクチン接種プロトコールが有する主要な性質の1つは、免疫化によって付与される保護が長期間持続できるように、持続性の免疫応答を誘導する能力である。NS3 タンパク質とともにポリ(I:C)および抗CD40を用いる免疫化によりこの種の応答を誘導できるかについて研究するため、HHD マウスを100 μg NS3にて実施例 1に記載のプロトコールにしたがい免疫化した。応答を強化するため、15日後に動物に同じ条件下で追加投与を施した。2回目の免疫化の60日後、動物を屠殺し、その脾細胞を様々な抗原で刺激し、その時点で持続しているCD8+およびCD4+ T 応答を解析した。CD8+ T 応答の研究のため、細胞をエピトープ1073で刺激し、IFN-γの産生および溶解活性を測定した。図 5Aに示すように、2回目の免疫化の60日後、NS3 タンパク質とともに抗CD40およびポリ(I:C)を用いて免疫化したマウスの脾細胞は、ペプチド 1073で刺激した場合は多量のIFN-γを産生することができたが、抗原の非存在下では産生できなかった。さらに、これら細胞はペプチド 1073をパルスした標的細胞(黒丸)を溶解できたが、抗原を含まない標的細胞 (白丸) は溶解できなかった(図 5B)。最後に、免疫化に使用したNS3 タンパク質を抗原として用いてCD4+ 応答 も研究した。図 5Cは、この免疫化プロトコールが特異的にNS3を認識する強力かつ持続性の CD4+ 応答も誘導できることを示す。
NS3 タンパク質とともにポリ(I:C)および抗CD40を用いて免疫化すると、持続性のT CD4+およびCD8+ 応答が誘導される。
ワクチン接種プロトコールが有する主要な性質の1つは、免疫化によって付与される保護が長期間持続できるように、持続性の免疫応答を誘導する能力である。NS3 タンパク質とともにポリ(I:C)および抗CD40を用いる免疫化によりこの種の応答を誘導できるかについて研究するため、HHD マウスを100 μg NS3にて実施例 1に記載のプロトコールにしたがい免疫化した。応答を強化するため、15日後に動物に同じ条件下で追加投与を施した。2回目の免疫化の60日後、動物を屠殺し、その脾細胞を様々な抗原で刺激し、その時点で持続しているCD8+およびCD4+ T 応答を解析した。CD8+ T 応答の研究のため、細胞をエピトープ1073で刺激し、IFN-γの産生および溶解活性を測定した。図 5Aに示すように、2回目の免疫化の60日後、NS3 タンパク質とともに抗CD40およびポリ(I:C)を用いて免疫化したマウスの脾細胞は、ペプチド 1073で刺激した場合は多量のIFN-γを産生することができたが、抗原の非存在下では産生できなかった。さらに、これら細胞はペプチド 1073をパルスした標的細胞(黒丸)を溶解できたが、抗原を含まない標的細胞 (白丸) は溶解できなかった(図 5B)。最後に、免疫化に使用したNS3 タンパク質を抗原として用いてCD4+ 応答 も研究した。図 5Cは、この免疫化プロトコールが特異的にNS3を認識する強力かつ持続性の CD4+ 応答も誘導できることを示す。
Claims (17)
- 以下を含むことを特徴とする、C型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せ：
a)TLR3 アゴニスト、
b)CD40 アゴニストまたはそれをコードするDNA配列、および
c)C型肝炎ウイルスのNS3 タンパク質またはCD8+およびCD4+ 応答の誘導能を有する該NS3 タンパク質のフラグメントを含むポリペプチド。 - TLR3 アゴニストがポリ(I:C)であることを特徴とする、請求項１の免疫刺激物質の組合せ。
- CD40 アゴニストが抗CD40抗体、CD40LおよびCD40に対する結合能が保存されたそれらのフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項１または２の免疫刺激物質の組合せ。
- CD40 アゴニストが抗CD40抗体であることを特徴とする、請求項３の免疫刺激物質の組合せ。
- 以下を含むことを特徴とする、請求項１の免疫刺激物質の組合せ：
a)ポリ(I:C)、
b)抗CD40抗体、および
c)NS3 タンパク質を含むポリペプチド。 - NS3 タンパク質を含むポリペプチドが配列番号１のポリペプチドであることを特徴とする、請求項４または５の免疫刺激物質の組合せ。
- 全ての成分が単一の医薬組成物の一部を形成することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかの免疫刺激物質の組合せ。
- 全ての成分が少なくとも２つの異なる医薬組成物の一部を形成することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかの免疫刺激物質の組合せ。
- 該医薬組成物が同時に投与されることを特徴とする、請求項８の免疫刺激物質の組合せの使用。
- 該医薬組成物が異なる時点で投与されることを特徴とする、請求項９の免疫刺激物質の組合せの使用。
- 該医薬組成物が異なる投与経路で投与されることを特徴とする、請求項９の免疫刺激物質の組合せの使用。
- 各成分が医薬上許容される量にて存在することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの免疫刺激物質の組合せを含む医薬組成物。
- 少なくとも２つの異なる医薬組成物を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかの免疫刺激物質の組合せを投与するためのキット。
- 請求項１〜８のいずれかの免疫刺激物質の組合せを免疫応答の誘導に有効な量にて投与することからなることを特徴とする、C型肝炎ウイルスに対する免疫応答を生じさせる方法。
- 予防的処置であることを特徴とする、請求項１４の方法。
- 治療的処置であることを特徴とする、請求項１４の方法。
- 請求項１〜８のいずれかの免疫刺激物質の組合せを含むことを特徴とする、C型肝炎ウイルスに対するワクチン。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200502446 | 2005-10-07 | ||
| ES200601563A ES2334472B1 (es) | 2006-06-09 | 2006-06-09 | Combinacion inmunoestimuladora para profilaxis y tratamiento de hepatitis c. |
| PCT/ES2006/000554 WO2007042583A1 (es) | 2005-10-07 | 2006-10-05 | Combinación inmunoe s t imuladora para profilaxis y tratamiento de hepatitis c |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009511452A true JP2009511452A (ja) | 2009-03-19 |
| JP2009511452A5 JP2009511452A5 (ja) | 2009-11-26 |
Family
ID=37942331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008534032A Pending JP2009511452A (ja) | 2005-10-07 | 2006-10-05 | Ｃ型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せ |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20100047231A1 (ja) |
| EP (1) | EP1949913B1 (ja) |
| JP (1) | JP2009511452A (ja) |
| CN (1) | CN101330928B (ja) |
| AT (1) | ATE469657T1 (ja) |
| AU (1) | AU2006301171B9 (ja) |
| BR (1) | BRPI0616978A2 (ja) |
| CA (1) | CA2625506C (ja) |
| CY (1) | CY1110744T1 (ja) |
| DE (1) | DE602006014720D1 (ja) |
| DK (1) | DK1949913T3 (ja) |
| ES (1) | ES2346570T3 (ja) |
| HR (1) | HRP20100473T1 (ja) |
| PL (1) | PL1949913T3 (ja) |
| PT (1) | PT1949913E (ja) |
| RS (1) | RS51402B (ja) |
| RU (1) | RU2431499C2 (ja) |
| SI (1) | SI1949913T1 (ja) |
| WO (1) | WO2007042583A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101522210B (zh) | 2006-09-18 | 2017-03-22 | 阿肯色大学评议会 | 增强免疫应答的组合物和方法 |
| NZ585776A (en) * | 2007-10-30 | 2012-07-27 | Univ Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium |
| PL2214701T3 (pl) * | 2007-11-01 | 2017-01-31 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Kompozycje i sposoby wzmacniania odpowiedzi odpornościowych na Eimeria |
| US20110268757A1 (en) | 2008-12-03 | 2011-11-03 | Institut Pasteur | Use of phenol-soluble modulins for vaccine development |
| BRPI1009458A2 (pt) * | 2009-03-10 | 2016-03-01 | Baylor Res Inst | vacinas antivirais direcionadas às células de apresentação de antígeno |
| UA110024C2 (uk) | 2010-01-21 | 2015-11-10 | Вакцинний вектор і спосіб посилення імунної відповіді | |
| KR102007132B1 (ko) | 2010-06-09 | 2019-08-05 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소 | 캄필로박터 감염을 감소시키기 위한 백신 및 방법 |
| NZ711019A (en) | 2013-02-14 | 2019-07-26 | Univ Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection |
| EP2968423A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-09 | Univ Arkansas | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING IMMUNE REACTIONS AGAINST ENTERAL PATHOGENES |
| BR112018072592A2 (pt) | 2016-05-03 | 2019-04-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | vetor de vacina de levedura que inclui polipeptídeos imunoestimulantes e antigênicos, e métodos de uso dos mesmos |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004027049A2 (en) * | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Astral, Inc. | Methods and compositions to generate and control the effector profile of t cells by simultaneous loading and activation of selected subsets of antigen presenting cells |
| WO2004048402A2 (en) * | 2002-11-26 | 2004-06-10 | Tripep Ab | A hepatitis c virus codon optimized non-structural ns3/4a fusion gene |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5049390A (en) * | 1987-09-02 | 1991-09-17 | Allergy Immuno Technologies, Inc. | Liposome containing immunotherapy agents for treating IgE mediated allergies |
| CN1325517C (zh) * | 1998-07-21 | 2007-07-11 | 展马博联合股份有限公司 | 抗丙型肝炎病毒抗体及其用途 |
| AU9215101A (en) * | 2000-08-17 | 2002-02-25 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| JP2006512391A (ja) * | 2002-12-30 | 2006-04-13 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 組み合わせ免疫賦活薬 |
-
2006
- 2006-10-05 JP JP2008534032A patent/JP2009511452A/ja active Pending
- 2006-10-05 CN CN2006800457078A patent/CN101330928B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-05 DK DK06830863.4T patent/DK1949913T3/da active
- 2006-10-05 RU RU2008117328/15A patent/RU2431499C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-10-05 AU AU2006301171A patent/AU2006301171B9/en not_active Ceased
- 2006-10-05 CA CA2625506A patent/CA2625506C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-05 PL PL06830863T patent/PL1949913T3/pl unknown
- 2006-10-05 EP EP06830863A patent/EP1949913B1/en active Active
- 2006-10-05 SI SI200630732T patent/SI1949913T1/sl unknown
- 2006-10-05 DE DE602006014720T patent/DE602006014720D1/de active Active
- 2006-10-05 ES ES06830863T patent/ES2346570T3/es active Active
- 2006-10-05 AT AT06830863T patent/ATE469657T1/de active
- 2006-10-05 US US12/083,217 patent/US20100047231A1/en not_active Abandoned
- 2006-10-05 BR BRPI0616978-3A patent/BRPI0616978A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-10-05 PT PT06830863T patent/PT1949913E/pt unknown
- 2006-10-05 RS RSP-2010/0373A patent/RS51402B/en unknown
- 2006-10-05 WO PCT/ES2006/000554 patent/WO2007042583A1/es active Application Filing
-
2010
- 2010-08-19 CY CY20101100769T patent/CY1110744T1/el unknown
- 2010-08-30 HR HR20100473T patent/HRP20100473T1/hr unknown
-
2013
- 2013-09-27 US US14/039,269 patent/US20140056943A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004027049A2 (en) * | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Astral, Inc. | Methods and compositions to generate and control the effector profile of t cells by simultaneous loading and activation of selected subsets of antigen presenting cells |
| WO2004048402A2 (en) * | 2002-11-26 | 2004-06-10 | Tripep Ab | A hepatitis c virus codon optimized non-structural ns3/4a fusion gene |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE469657T1 (de) | 2010-06-15 |
| BRPI0616978A2 (pt) | 2011-07-05 |
| HRP20100473T1 (hr) | 2010-10-31 |
| US20100047231A1 (en) | 2010-02-25 |
| SI1949913T1 (sl) | 2011-02-28 |
| RU2008117328A (ru) | 2009-11-20 |
| ES2346570T3 (es) | 2010-10-18 |
| PT1949913E (pt) | 2010-08-24 |
| CA2625506C (en) | 2014-06-10 |
| EP1949913A1 (en) | 2008-07-30 |
| CN101330928B (zh) | 2012-11-14 |
| RS51402B (en) | 2011-02-28 |
| WO2007042583A1 (es) | 2007-04-19 |
| CN101330928A (zh) | 2008-12-24 |
| EP1949913B1 (en) | 2010-06-02 |
| DE602006014720D1 (de) | 2010-07-15 |
| PL1949913T3 (pl) | 2010-10-29 |
| AU2006301171B2 (en) | 2011-10-27 |
| AU2006301171B9 (en) | 2012-03-29 |
| CA2625506A1 (en) | 2007-04-19 |
| CY1110744T1 (el) | 2015-06-10 |
| RU2431499C2 (ru) | 2011-10-20 |
| DK1949913T3 (da) | 2010-10-04 |
| AU2006301171A1 (en) | 2007-04-19 |
| US20140056943A1 (en) | 2014-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2009511452A (ja) | Ｃ型肝炎の予防および治療のための免疫刺激物質の組合せ | |
| US10556929B2 (en) | Cytotoxic T lymphocyte inducing immunogens for prevention treatment and diagnosis of dengue virus infection | |
| US20100047271A1 (en) | Vaccine compositions | |
| EP2391383A2 (en) | Codon-optimised hepatitis b virus core antigen (hbcag) | |
| Yu et al. | A novel dendritic-cell-targeting DNA vaccine for hepatitis B induces T cell and humoral immune responses and potentiates the antivirus activity in HBV transgenic mice | |
| TWI507413B (zh) | 脂質化多抗原表位疫苗 | |
| US20090060875A1 (en) | HCV Vaccines for Chronic HCV Patients | |
| TWI754817B (zh) | 以人工混雜ｔ輔助細胞抗原決定位以有限度的ｔ細胞發炎反應促進目標抗體的生產 | |
| JP5901084B2 (ja) | ペプチドアジュバント | |
| WO2005042564A1 (en) | Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines and methods of use | |
| Mansilla et al. | Immunization against hepatitis C virus with a fusion protein containing the extra domain A from fibronectin and the hepatitis C virus NS3 protein | |
| ES2334472B1 (es) | Combinacion inmunoestimuladora para profilaxis y tratamiento de hepatitis c. | |
| KR20240110821A (ko) | SARS-CoV-2로 인한 질병의 예방적 및 치료적 처치에 사용하기 위한 면역원성 작제물 및 백신 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091005 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091005 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120228 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120525 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120814 |