BRPI0616978A2

BRPI0616978A2 - combinação imuno-estimulante para a profilaxia e tratamento de hepatite c, sua utilização, composição farmacêutica que a contém, kit para sua administração, método para produzir uma resposta imune e vacina contra o vìrus da hepatite c

Info

Publication number: BRPI0616978A2
Application number: BRPI0616978-3A
Authority: BR
Inventors: Aintzane Zabaleta Azpiroz; Francisco Borras Cuesta; Prieto Valtueda Jesus; Pablo Sarobe Ugarriza; Juan Jose Lasarte Sagastibelza
Original assignee: Proyecto Biomedicina Cima Sl
Priority date: 2005-10-07
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2011-07-05
Also published as: ATE469657T1; HRP20100473T1; US20100047231A1; SI1949913T1; JP2009511452A; RU2008117328A; ES2346570T3; PT1949913E; CA2625506C; EP1949913A1; CN101330928B; RS51402B; WO2007042583A1; CN101330928A; EP1949913B1; DE602006014720D1; PL1949913T3; AU2006301171B2; AU2006301171B9; CA2625506A1

Abstract

COMBINAçãO IMUNO-ESTIMULANTE PARA A PROFILAXIA E TRATAMENTO DE HEPATITE C, SUA UTILIZAçãO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA QUE A CONTEM, KIT PARA SUA ADMINISTRAçãO, MéTODO PARA PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE E VACINA CONTRA O VìRUS DE HEPATITE C. A presente invenção refere-se a uma combinação imuno-estimulante para profilaxia e tratamento de hepatite, caracterizada pelo fato de que compreende um agonista de TLR3, um agonista de CD40 e a proteína NS3 do vírus de hepatite C. Além disso, a invenção refere-se a composições farmacêuticas que compreendem a dita combinação imuno-estimulante, ao seu uso e a um kit composto das ditas composições farmacêuticas. Finalmente, a presente invenção refere-se a um método para produzir uma resposta imune ao vírus da hepatite C e a uma vacina contra o dito vírus.

Description

COMBINAÇÃO IMUNO-ESTIMULANTE PARA A PROFILAXIA ETRATAMENTO DE HEPATITE C, SUA UTILIZAÇÃO, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA QUE A CONTÉM, KIT PARA SUA ADMINISTRAÇÃO,MÉTODO PARA PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNE E VACINA CONTRAO VÍRUS DE HEPATITE C

Campo Técnico da Invenção

Refere-se a presente invenção a uma combi-nação imuno-estimulante para a profilaxia e tratamentode hepatite C, que incorpora a proteína NS3 de HCV, emconjunto com adjuvantes selecionados pela sua capacida-de de induzirem respostas potentes e duradouras especí-ficas de CD8+ e CD4+ contra o vírus HCV.

Estado da Técnica

Com uma preponderância mundial estimadaatualmente em mais de 170 milhões de pessoas infectadaspelo vírus da hepatite C (HCV) isto implica em um pesa-do ônus para a saúde pública. E esta é uma preponde-rância que presumivelmente permanecerá invariável nosanos vindouros.

A infecção pelo HCV é caracterizada poruma alta tendência no sentido de cronicidade. O HCVpersiste em 70% dos indivíduos infectados, 20% dosquais desenvolvem cirrose e 2,5% derivam para gerarcâncer do fígado.

A atual ferramenta terapêutica de referên-cia compreende protocolos terapêuticos baseados no usode interferon. Não obstante, estas terapias antivírussão economicamente dispendiosas, relativamente tóxicase somente efetivas em 50-60% dos pacientes tratados.Portanto, é necessário e desejável desenvolver novasestratégias terapêuticas que sejam mais efetivas e me-lhor toleradas pelo paciente.

Uma consideração atualizada do HCV podeser encontrada em Nature ("Insights: Hepatite C". Natu-re 2005, Supplements; Vol. 436, Nr. 7053, pp 929-978).

Muito embora, lamentavelmente, ainda nãotenhamos uma vacina efetiva contra o virus da hepatiteC, existem dados experimentais e evidência que nos levaa pensar que é possível uma vacina efetiva. Muito em-bora anticorpos antivírus sejam sintetizados em respos-ta à infecção, o estado crônico é caracterizado pelaausência de imuno respostas celulares na parte das cé-lulas T citotóxicas (CD8+) e células T auxiliares(CD4+). Assim, postula-se que a HCV desenvolveu estra-tégias que lhe permitem especificamente esquivar-se dasimunes respostas antivírus, onde a potência e qualidadedas respostas das citotóxicas T e das auxiliares T de-terminam se os pacientes se recuperarão (seja esponta-neamente ou em resposta a um tratamento) ou se eles de-senvolverão uma infecção crônica.

O objetivo principal de qualquer vacina éestimular a imunidade adquirida específica de antígeno,cujos mediadores são os linfócitos BeT. Neste con-texto, as células que apresentam antígenos (APCs) de-sempenham uma função importante na iniciação das imunesrespostas específicas e em particular na ativação delinfócitos Τ. As APCs, principalmente as células den-driticas, capturam antigenos nos órgãos periféricos e,depois de receberem um estimulo de ativação, elas mi-gram o=para os órgãos linfáticos. Nesse caso, as célu-las dendriticas apresentam na sua superfície, unidos àsmoléculas reais do complexo de histocompatibilidadeprincipal MHC, os produtos peptídicos derivados da de-gradação dos antigenos (epítopes), e simultaneamenteproduzem quimioquinas e citoquinas a fim de atrair ede ativar as células Τ. O processo de ativação de cé-lulas dendriticas, também conhecido como maturação, écaracterizado por uma alta expressão de moléculas deMHC (sinal 1) , moléculas co-estimuladoras (sinal 2) ecitoquinas de polarização, tais como interleucina-12(IL-12) (sinal 3). A maturação é induzida por fatorestais como componentes ou moléculas patogênicos do hos-pedeiro que são freqüentes nos processos de inflamaçãoou danificação de células. Estes fatores agem nas cé-lulas dendriticas por intermédio de receptores especí-ficos para Produtos derivados de microorganismos, taiscomo receptores do tipo TLR (receptores semelhantes aToll), receptores para citoquinas (TNF-α, IL-1, IFN-a)ou receptores para ligantes nas superfícies das células(por exemplo, CD40).

O estímulo e ativação das diferentes popu-lações de células T pelas APCs é restringido pelo tipode moléculas de MHC, por um lado, e pelo outro, pelascaracterísticas dos epítopes que formam complexos comaquelas moléculas de MHC. Assim, por exemplo, identi-ficaram-se determinados fragmentos das proteínas viraisque especificamente induzem a ativação de CD8+ T-Linfócitos citotóxicos (CTL), conhecidos como epítopesde linfócitos ou T-células CD8+ ou epítopes CD8+; ouepítopes que induzem especificamente a ativação de T-Linfócitos auxiliares CD4+ (HTL), epítopes CD4+. A ba-se de dados "HCV Immunology Database"(http: //hcv.Ianl.gov/content/immuno/immuno-main.html)promove a compilação dos epítopes para T-Linfócitos,ambos dos CD8+ CTL e dos CD4+ HTL, identificados na ba-se de proteínas virais de diferentes variedades e iso-lados do vírus da hepatite C.

0 desenvolvimento de protocolos de imuni-zação baseados no uso de epítopes na forma de peptídeosrequer, desta forma, a seleção prévia daqueles peptí-deos que são adequados para cada indivíduo, na depen-dência do moléculas de MHC que eles apresentam. Istosubentende que, na dependência do MHC de cada indiví-duo, terá de ser escolhida uma combinação de peptídeosparticular que seja capaz de comportar-se como epítopesnesse contexto. 0 uso de antígenos amplos permite queeste problema seja superado, uma vez que eles são nor-malmente poliepitópicos e dentro de sua seqüência elesapresentam vários epítopes, os dois para CD8+ CTL e pa-ra CD4+ HTL, que podem ser apresentados por moléculasde MHC de diferentes indivíduos. Desta maneira, um ú-nico antígeno pode ser usado como uma vacina em indiví-duos com MHC diferentes.

Dentro das diferentes proteínas de HCV, onúcleo e NS3 apresentam grande imunogenicidade e naque-les indivíduos que se refazem da infecção, são detecta-das potentes respostas de CD8+ CTL e de CD4 + HTL contraelas. Não obstante, existem dados que mostram que onúcleo também pode ter efeitos prejudiciais para as cé-lulas do sistema imune, quando ele fica em contacto comelas, o que o torna desaconselhável como um antígeno emestratégias de vacinação. Por outro lado, a NS3 é umaproteína que dificilmente demonstrou este tipo de efei-to e poderia ser uma boa candidate como um antígeno pa-ra a indução de respostas de CD8+ CTL e CD4+ HTL.

As CD4+ HTL desempenham uma função na imu-nidade adquirida, entre outros mecanismos por meio deativação de APC, ativação de CTL e indução de memória.Em particular, descreveu-se que as células CD4+ especí-ficas para HCV são necessárias para manutenção de CATA-LISADOR antivírus (Grakoui A. et al., "HCV persistencee immune evasion in the absence of memory T-cell help";Science, 2003; 302: 659-662). Portanto, uma vacina efi-caz contra o vírus da hepatite C tem de proporcionar apotência máxima na indução não apenas de respostas deCD8+ CTL, mas também de respostas de CD4 + HTL. Uma va-cina destas irá, portanto, requerer uma seleção de an-tígenos específicos que proporcionarão essas respostas.

Não obstante, não parece que uma combina-ção de antígenos pode, por si mesma, ser capaz de pro-porcionar uma vacina eficaz contra o HCV. Consideran-do-se que a maturação de células dendriticas constituium requisito para a iniciação eficaz e ativação de T-Linfócitos, uma vacina destas poderia beneficiar-se dainclusão na combinação imune-estimulante de alguns ad-juvantes, que estimulariam a maturação das células den-driticas. Como adjuvantes, poderiam utilizar-se os Ii-gantes dos receptores de TLR, de receptores de citoqui-nas ou de receptores para ligantes intercelulares jácitados, ou melhor, ainda uma combinação sinérgica des-ses adjuvantes.

Assim, por exemplo, o US2004/0141950 des-creve combinações imune-estimulantes que incluem um an-tagonista de TLRs e um antagonista de moléculas das su-perfamilias do fator de necrose de tumor (TNF) ou deseus receptores (TNFR), que também podem incluir um an-tigeno. Entre as numerosas combinações possíveis eleapresenta a combinação de um ligante de CD40 (um anti-corpo anti-CD40) e de poli(I:C), um ligante sintéticode TLR3, uma combinação para a qual um efeito sinérgicoé demonstrado na expansão de CD8+ T-Linfócitos. Deforma assemelhada, Ahonen et al., (J. Exp. Med. 2004;199: 775-784) apresentam dados na capacidade sinérgicade agonistas de TLR/CD40 para induzirem a expansão ediferenciação de CD8+ CTL especifico de antigenos deuma maneira que é independente dos CD4+ T-Linfócitos.Muito embora estes trabalhos descrevam a capacidade daTLR/CD40 para ativar CD8+ T-Linfócitos de memória espe-cífica de antigenos, os ditos trabalhos não permitemestabelecer-se se a combinação de agonistas TLR/CD40também pode intensificar as respostas de CD4+ HTL.

No caso de infecção por HCV, encontraram-se diferenças claras nas respostas de CD4+ HTL quandopacientes infectados são comparados a pacientes que nãoforam capazes de eliminar a infecção. Não obstante,muito embora com menor intensidade do que em pacientescurados, as respostas de CD8+ CTL são ainda suscetíveisde ser detectadas nos pacientes infectados. Conseqüen-temente, muito embora os CTL se comportem como uma po-pulação de órgão motor importante no aclaramento da in-fecção de HCV, as células de CD4+ também desempenhamuma função importante no controle da enfermidade. Alémdisto, descreveu-se que a indução de CD4+ T-Linfócitosé importante para a manutenção das respostas de CATALI-SADOR antivírus (Grakoui A. et al., "HCV persistence eimmune evasion in the absence of memory T-cell help";Science, 2003; 302: 659-662). Estes dados sugerem quepara a vacinação e terapia de enfermidades virais devi-das a HCV, a indução de respostas antivírus potentes eprolongadas, tanto de CD8+ quanto de CD4+, é importante.

Constitui, portanto, o objetivo da presen-te invenção selecionar combinações imune-estimulantesde antigenos e adjuvantes adequados para a profilaxia etratamento de hepatite C, que proporcionará um estímulode respostas tanto de CD8+ quanto de CD4+ que são maispotentes, completas e prolongadas.

Descrição Detalhada da Invenção

Um primeiro objetivo da invenção refere-sea uma combinação imuno-estimulante para profilaxia etratamento de hepatite C, doravante referida como acombinação imuno-estimulante da invenção, que compreen-de um agonista de TLR3, um agonista de CD40 ou uma se-qüência de DNA que o codifica, e um polipeptidio quecompreende a proteína NS3 do vírus da hepatite C, ou umfragmento da dita proteína NS3 com capacidade para in-duzir respostas de CD8+ e CD4 +.

Um "agonista de TLR3" refere-se a um li-gante que pode ser combinado ou unido aos receptores deTLR3 ("receptor 3 semelhante a portagem") e produz umaresposta celular. O TLR3 é um receptor para RNA tran-çado duplo que transmite sinais, os quais ativam NF-kBe a produção de interferons (IFN) do tipo I (IFN-α eIFN-β) e que estimula a maturação das células dendríti-cas. Camundongos deficientes em expressão de TLR3 mos-traram uma redução nas suas respostas a poli(I:C) - umligante de TLR3 similar ao RNA trançado duplo geradodurante a replicação de vírus do tipo HCV -, juntamentecom resistência ao efeito letal de poli(I:C) quandosensibilizado com D-galactosamina e uma redução na pro-dução de citoquinas inflamatórias (Alexopoulou et al.Nature, 2001, Vol. 413, pp. 732-738). Em uma concreti-zação particular da invenção, o dito ligante de TLR3pode ser um RNA trançado duplo viral ou uma cadeia du-pia de ácido poliinosínico-policitidílico, poli(I:C).

Um "agonista de CD40" refere-se a um Ii-gante, o qual pode ser combinado ou unidos aos recepto-res de CD40 induzindo similarmente uma resposta celu-lar. A CD40 é uma molécula expressada na membrana dediferentes tipos de células, tais como B-Linfócitos oucélulas que apresentam antigenos (macrófagos, célulasdendríticas, e assemelhadas). 0 ligante natural deCD40 (CD40L ou CD154) é expresso principalmente em T-Linfócitos que foram ativados em seguida ao reconheci-mento do antigeno. A interação de CD40L com CD40 pre-sente na célula apresentadora de antigeno induz uma ma-turação da última. Este fenômeno, de uma maneira asse-melhada aos estímulos provenientes dos agentes patogê-nicos, faz com que a célula apresentadora de antigenotenha uma capacidade maior para induzir respostas imu-nológicas. Desta forma, o agonista de CD40 da composi-ção imuno-estimulante da invenção refere-se, por um la-do, ao ligante de CD40L ou a um fragmento dessa CD40Lque conserva a capacidade para unir-se a CD40 e induziruma resposta celular ou imuno. Em uma concretizaçãoparticular, o ligante pode ser um anticorpo específicopara CD40 (anti-CD40) ou um fragmento do mesmo que con-serva a capacidade para unir-se a CD40. Além disto, oligante de CD40 ou seu fragmento pode estar presente nacombinação imuno-estimulante, seja na forma de proteínaou também como um ácido nucléico recombinante (DNA) oqual codifica este ligante, por exemplo, em um vetorviral para transferência ou terapia de gene.

Um "antígeno" refere-se a qualquer subs-tância que é capaz de induzir uma resposta imuno, tantohumoral quanto celular, no organismo de um indivíduo(homem ou um animal) , ou que pode induzir uma respostaimuno celular (expansão, ativação e/ou maturação de cé-lulas imuno, produção de citoquinas, ou anticorpos)quando ele entra em contacto com células de imunização.Em particular, um antígeno pode ser uma proteína viral,um peptídio ou um fragmento da dita proteína viral, umaproteína recombinante dessas proteínas virais, ou mesmoum peptídio sintético capaz de induzir as respostas si-nalizadas .

o "epítope indutor de CD8+" refere-se a umfragmento ou cadeia de polipeptídios parcial de um an-tígeno que é capaz de induzir especificamente a ativa-ção a ativação of T-Linfócitos citotóxicos CD8+ (CTL).Um "epítope indutor de CD4 + " refere-se a um fragmentode cadeia de polipeptídio parcial de um antígeno que écapaz de induzir especificamente a ativação de T-Linfócitos auxiliares CD4+ (HTL).

A "proteína NS3" refere-se à proteína NS3não-estrutural do vírus da hepatite C, uma proteína de67 kDa que inclui 2 domínios, uma serin-proteínaase quecobre 189 aminoácidos da extremidade N-terminal e umdomínio com atividade de helicase-nucleoside trifosfa-tase que cobre 442 aminoácidos da extremidade terminalC. A seqüência da proteína NS3 incluída no polipeptí-dio da combinação imuno-estimulante da invenção podecorresponder a qualquer variedade ou isolado do virusda hepatite C, em particular qualquer variedade ou iso-lado do virus da hepatite C humano. Em uma concretiza-ção particular, o polipeptidio, o qual compreende aproteína NS3, foi obtido por meio de tecnologia recom-binante. Em uma concretização não-limitativa específi-ca da invenção, uma proteína NS3 recombinante é usadacom uma seqüência SEQ ID. NO: 1 (correspondente aos nú-meros de Genebank Accession DQ068198.1 e AAY84763.1,VRL 28-NOV-2005). Os inventores usaram também outraseqüência de proteínas de recombinação SEQ ID. NO: 2(correspondente ao número Genebank Accession D90208).

Em outra concretização alternativa da in-venção, é possível também utilizar um polipeptidio quecompreende um fragmento da proteína NS3, de uma maneiratal que o dito fragmento é capaz de induzir respostasde CD4+ e CD8+ . Portanto, o dito fragmento terá deincluir pelo menos um epítope indutor de CD8+ e um epí-tope indutor de CD4+ .

Em uma concretização específica, a combi-nação imuno-estimulante da invenção compreende po-li (I:C), um anticorpo anti-CD40, e um polipeptidio quecontém a proteína NS3.

Em uma concretização preferida da inven-ção, a combinação imuno-estimulante possui todos oscomponentes que formam parte da mesma composição farma-cêutica, onde cada um dos componentes está presente emquantidades farmaceuticamente aceitáveis. Além disso,a invenção também se refere à dita composição farmacêutica.

Em outra concretização especifica da pre-sente invenção, os componentes da combinação imuno-estimulante são para ser encontrados fazendo parte depelo menos duas composições farmacêuticas. De formaassemelhada, a invenção refere-se ao uso da dita combi-nação imuno-estimulante caracterizado por as ditas com-posições farmacêuticas serem administradas simultanea-mente. Em outra concretização da invenção, o uso dadita combinação imuno-estimulante é caracterizado pelofato de que as ditas composições farmacêuticas são ad-ministradas em momentos diferentes, por meio da mesmavia de administração ou por meio de vias diferentes.

Desta forma, uma concretização especifica da invençãorefere-se a um kit para a administração da combinaçãoimuno-estimulante descrita anteriormente, caracterizadopor compreender pelo menos duas composições farmacêuti-cas diferentes.

Em outro aspecto, a invenção refere-se aum método para produzir uma imuno resposta ao vírus dahepatite C, caracterizado pelo fato de consistir em ad-ministrar uma combinação estimuladora definida anteri-ormente, em uma quantidade efetiva para induzir uma i-muno resposta. Em uma concretização preferida, o méto-do da invenção consiste de um tratamento profilático.

Em uma concretização de maior preferência, o método dainvenção consiste de um tratamento terapêutico.

Finalmente, a invenção também se refere auma vacina contra o virus da hepatite C, caracterizadapelo fato de compreender uma combinação imuno-estimulante definida anteriormente e que constitui oobjeto desta invenção.Breve Descrição das Figuras

Figura 1. Imanização com anti-CD40 e po-li (I:C) em conjunto com a proteína NS3 induz respostas10 multi-epitópicas CD4+ e CD8+ T. Camundongos HHD (doispor grupo) foram injetados com 50 g de anti-CD40(i.p.). Quatro horas mais tarde, eles foram injetadoscom 50 g de poli(I:C) (i.v.) e 500 g de proteína NS3 derecombinação (i.p.) (SEQ. ID. NO: 1). Seis dias de-15 pois, os animais foram sacrificados e as passarinhasforam extraídas para seu estímulo in vitro com diferen-tes antígenos e a análise da resposta de imunização in-duzida. (A) As células foram estimuladas durante cincodias com os epítopes CD8+ 1073, 1406 ou 1038 (10 μΜ) na20 presença de IL-2. Depois disso, para cada grupo depassarinhas a resposta lítica foi medida quanto às cé-lulas visadas que foram carregadas (peptídio; barraspretas) ou não (controle; barras brancas) com o peptí-dio correspondente. Os resultados obtidos foram ilus-25 trados com uma proporção de órgão motor raivo de 100:1.B) Da mesma maneira, as passarinhas foram cultivadascom diferentes concentrações (0,1-10 μΜ) dos peptídios1073 (círculos pretos), 1406 (triângulos brancos) ou1038 (triângulos pretos), e na cultura dos sobrenadan-tes obtidos depois de 48 horas de estimulo o teor deIFN-γ foi medido por meio de ELISA. (C) As passarinhastambém foram estimuladas durante 48 h com 5 ou 1 μς/πιΐda proteína NS3 usada na imunização (SEQ. ID. NO: 1) ,com 1 yg/ml da proteína NS3 produzida nas bactérias(SEQ. ID. NO: 3), ou com meio de cultura (controle) afim de medir a resposta de CD4+ . Em seguida a esteperíodo de tempo, os sobrenadantes foram coletados epor meio de ELISA mediu-se a quantidade de IFN-γ produ-zido .

Figura 2. Medição da quantidade de proteí-na NS3 necessária para induzir respostas de CD4 + e CD8+T na imunização com poli(I:C) e anti-CD40. Camundongos HHD (dois por grupo) foram imunizados com proteína NS3(SEQ. ID. NO: 1) (500, 250, 125 ou 25 yg/camundongo) emconjunto com poli(I:C) e anti-CD40, seguindo-se o pro-tocolo descrito na Figura 1. Igualmente incluído foium grupo de controle imunizado da mesma maneira, o qualusou como antígenos 5 yg de NS3 (SEQ. ID. NO: 1) e 50pg dos peptídeos 1073 e 1038, juntamente com poli(I:C)e anti-CD40. Seis dias mais tarde os animais foram sa-crificados e as passarinhas foram extraídas e estimula-das com diferentes antígenos (A). A fim de se medir aresposta lítica induzida as células foram estimuladasdurante cinco dias com a epítope CD8+ 1073 (10 μΜ) eIL-2. Depois disso, esta reposta foi medida confron-tando-se diferentes quantidades de células de órgão mo-tor contra um número fixo de células visadas carregadascom os peptideos. Além disso, a resposta de CD8+ quetinha sido induzida também foi analisada por meio daprodução de IFN-γ. Para fazer isto, as células foramestimuladas com diferentes concentrações de peptideos1073 (B) e 1038 (C) . As células foram estimuladas coma proteína NS3 (SEQ. ID. NO: 1) (D), a fim de quantifi-car a resposta de CD4+. Depois de 48 horas, mediu-se aquantidade de IFN-γ presente nos sobrenadantes.

Figura 3. Imunização com poli(I:C) e o an-ti-CD40 em conjunto com a proteína NS3 induz respostasde CD4+ e CD8+ em outras variedades de camundongos comMHC diferentes. Camundongos C57BL6 (que tinham molécu-las MHC do tipo H-2b) (dois por grupo) receberam uma(quadrados brancos) ou duas (quadrados pretos) imuniza-ções com 100 μg de NS3 (SEQ. ID. NO: 1) em conjunto compoli(I:C) e anti-CD40, seguindo-se o protocolo indicadona Figura 1. Seis dias depois, os animais foram sacri-ficados e as passarinhas foram cultivadas com antígenosdiferentes com a finalidade de medir as respostas deCD8+ e CD4+ induzidas. A epitope de restrição H-2 Db1629-1637 (GAVQNEVTL) (SEQ. ID. NO: 7) foi usada paraestimular as passarinhas ,e medir as respostas de CD8+(A) . A proteína NS3 (SEQ. ID. NO: 1) (B) foi usada co-mo estímulo para determinação da resposta de CD4+. De-pois de dois dias de cultura, os sobrenadantes foramcoletados e a quantidade de IFN-γ produzida foi medida.

Figura 4. Imunização com proteína NS3 emconjunto com poli(I:C) e anti-CD40 induz respostas deCD8 + capazes de reconhecerem células que expressam pro-teínas do HCV. (A) Camundongos HHD (dois por grupo)foram injetados com 100 pg de proteína NS3 (SEQ. ID.NO: 2) mais poli(I:C) e anti-CD40 conforme indicado naFigura 1. Seis dias depois, os animais foram sacrifi-cados e suas passarinhas foram estimuladas com célulasTl/HCVcon (células Tl transfectadas com um plasmídioque expressa as proteínas do HCV) tratadas com mitomi-cina, na presença de IL-2. Depois de 5 dias de estímu-lo, mediu-se a capacidade das passarinhas reconheceremas células Tl/HCVcon em ensaios de atividade lítica.

Para fazer isto, diferentes quantidades de passarinhasforam confrontadas com um número fixo de célulasTl/HCVcon (círculos pretos) ou células de controle Tlsem serem transfectadas (círculos brancos).

Figura 5. Imunização com poli(I:C) e anti-CD40 em conjunto com proteína NS3 induz respostas dura-douras de T CD4+ e CD8+. Camundongos HHD (dois porgrupo) foram injetados com 100 pg de proteína NS3 (SEQ.ID. NO: 2) mais poli(I:C) e anti-CD40 conforme indicadona Figura 1. Duas semanas mais tarde, os animais rece-beram uma segunda imunização sob as mesmas condições.

Sessenta dias depois da segunda imunização os animaisforam sacrificados e as suas passarinhas foram extraí-das para se estudar a resposta duradoura de CD8+ e CD4 +T. (A) As passarinhas foram estimuladas com o epítopeCD8+ 1073 (10 μΜ) ou na ausência de antígeno, e 48 ho-ras mais tarde os sobrenadantes da cultura foram cole-tados para se medir a quantidade de IFN-γ produzido.(B) As passarinhas foram cultivadas durante 5 dias como peptidio 1073 (10 μΜ) e IL-2 e estudou-se, então, a sua capacidade para lisar as células visadas carregadascom o peptidio 1073. Para fazer isto, diferentes quan-tidades de células de órgão motor foram confrontadascom um número fixo de células visadas carregadas com opeptidio 1073 (círculos pretos) ou não carregadas com peptidio (círculos brancos) . (C) A resposta de CD4 +foi estudada por meio de estímulo das passarinhas com aproteína NS3 (1 pg/ml) (SEQ. ID. NO: 2) ou com ausênciade antígeno. Depois de 48 horas, os sobrenadantes fo-ram coletados e mediu-se a quantidade de IFN-γ produzido.

Modalidade de Concretização da Invenção

Os exemplos seguintes, sem serem de formaalguma limitativos, ajudam a ilustrar a concretizaçãoda invenção que constitui o presente pedido de patente.

Material Relativo e Métodos

Epi topes, antígenos e reagentes

Os peptídios ou epítopes usados foram sin-tetizados manualmente em um sintetizador de múltiplospeptídeos utilizando-se química Fmoc (Wellings DA. eAtherton E. Methods Enzymol 1997; 289: 44-67). Utili-zou-se o teste de ninhidrina de Kaiser para monitorarcada etapa. Ao final da síntese eles foram emendados edesprotegidos com ácido trifluoroacético e lavados comdietil éter. A pureza dos peptidios foi o tempo todomais alta do que 90% determinada por HPLC.

Tabela 1. Peptideos e epitopes sintetizados e usadosnos exemplos.

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A numeração do peptidio ou epitope refere-se à sua posição de CVH relativa, tomando como referên-cia a seqüência completa na variedade H de hepatite Chumana que é usualmente tomada como o protótipo (Gene-Bank Accession Number M67463). Desta forma, por exem-plo, a base de dados "HCV Immunology Database"(http://hcv.Ianl.gov/content/ immuno/immuno-main.html)compila os epitopes para T-Linfócitos, tanto dos T-Linfócitos citotóxicos, quanto dos T-Linfócitos auxili-ares, identificados nas proteínas virais de diferentesvariedades e isolados do vírus da hepatite C, todos e-Ies também ordenados de acordo com a sua posição rela-tiva com relação à variedade H do vírus de acordo com areferência de GeneBank estabelecida.

Como agente imunogênico utilizou-se um po-lipeptídio de recombinação de 655 aminoácidos o qualcontém a seqüência completa de uma proteína NS3 (SEQ.ID. NO: 1; número de acesso do Genebank AAY84763.1, VRL28-NOV-2005; 631 aminoácidos). Da mesma maneira que os631 aminoácidos da proteína NS3, o polipeptídio tambéminclui uma ponta com uma seqüência c-myc, para detecçãocom o anticorpo monoclonal anti-myc, e uma ponta deHistidinas. A proteína foi produzida em Pichia pasto-ris. Ela é mantida em suspensão em uma solução de Tris22, 5 mM / Urea 3,76 M / NaCl 300 mM. A proteína foipurificada por meio de cromatografia de coluna de Ni.

Outro polipeptídio de recombinação tambémfoi usado como agente imunogênico, o qual contém os 635aminoácidos que compreendem a seqüência completa de umaproteína NS3 (SEQ. ID. NO: 2; número de acesso GenebankD90208). Da mesma maneira que os aminoácidos corres-pondentes a NS3, a poliproteína também inclui uma pontade Histidinas para a sua purificação. A seqüência deDNA correspondente a NS3 foi obtida por digestão comSal I e Not I do plasmídio gWIZ, que continha a seqüên-cia de NS3 (fornecida por Dr. G. Inchauspe, Lyon, Fran-ce) . 0 produto da digestão foi clonado entre os locaisBsrG I e Not I do plasmídio pET-45 (+) (Novagen, Madi-son WI) . Ele foi expresso com E. coli e purificado pormeio de cromatografia de afinidade em uma coluna de ní-quel seguida por cromatografia por permuta iônica.

De maneira assemelhada, para os ensaios invitro utilizou-se como antígeno um polipeptídio de re-combinação (Mikrogen; número de catálogo 94302), o qualcontém os últimos 20 aminoácidos da proteína não-estrutural NS2 e os primeiros 508 aminoácidos da prote-ína NS3 do HVC (SEQ. ID. NO: 3).

Como agonista de TLR3 utilizou-se po-li (I:C) obtido a partir da Amersham (número de catálogo27-4732-01).

Como agonistas de CD40, utilizaram-se an-ticorpos anti-CD40, purificados a partir do hibridomaFGK-45 (Rolink A. et al., Immunity 1996. 5: 319-330).

Todos os reagentes continham <1 unidade deendotoxina per mg de produto, determinada por meio doensaio de lisado QCL-1000 do límulo amebócito (BioWhittaker).

Camundongos

Camundongos C57B1/6 de seis a oito semanasforam obtidos a partir da Harlan. Também foram usadoscamundongos HHD, transgênicos para moléculas humanasHLA-A2.1 (Pascolo S. et al., J. Exp. Med. 1997. 185:2043-2051). Todos os animais foram mantidos sob condi-ções isentas de agentes patogênicos e foram tratados deacordo com as regras da instituição.

Linhas de células

Utilizaram-se células T2 (Salter R. et al.Immunogenetics, 1985 21: 235-246) como células alvo pa-ra ensaios de liberação de cromo com T-Linfócitos (CTL)citotóxicos provenientes de camundongos HHD.

Utilizaram-se células TI, transfectadascom um plasmidio carreador da região de codificação doHCV (células Tl/HCVcon), para os ensaios de reconheci-mento de células que expressaram as proteínas do HCV.

Estas células foram proporcionadas pelo Dr. D. Morad-pour (Freiburg, Germany; Volk B. et al., J Gen Virol.2005; 86: 1737-1746). Também foram usadas células Tlsem transfecção (ATCC, No. de catálogo CRL-1991) comocontrole.

Todas as células foram desenvolvidas emmeio completo (RPMI 1640 10% de soro bovino fetal, 100U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 2 mMde glutamina e 50 μΜ de 2-mercaptoetanol) . A culturada linha Tl/HCVcon também continha 2 mg/ml de G418(Gibco).

Imunização

Grupos de dois camundongos foram imuniza-dos por meio da via i.p. com 50 μg de anti-CD40. Qua-tro horas depois, eles foram injetados com 50 μg de po-li (I:C) (i.v.) e diferentes quantidades dos antígenos:Proteína NS3 ou misturas de NS3 com peptídeos (i.p.).

Estímulo de células esplênicas para a produção de cito-quinas

Células esplênicas foram resuspensas emmeio complete e chapeadas a 8 χ 105 células/cavidade em0,2 ml em placas de 96 cavidades com fundo em forma de"U", na ausência ou presença de peptídeos ou da proteí-na NS3 de recombinação do HCV.Dois dias depois, os sobrenadantes foramcoletados para medição da presença de IFN-γ por meio deELISA (BD-Pharmingen), seguindo-se as instruções do fa-bricante .

Medição da atividade lítica de CTL

Com a finalidade de se medirem as respos-tas de CTL, as passarinhas provenientes dos animas imu-nizados foram incubadas com peptideos (10 μΜ) durante 2horas a 37°C, lavadas duas vezes e cultivadas em placasde 24 cavidades com uma confluência de 7,5 χ 106 célu-las/cavidade. Em experiências conduzidas para se mediro reconhecimento das células Tl/HCVcon, cultivaram-se7,5 χ 106 passarinhas de camundongos HHD com 7,5 χ 105de células Tl/HCVcon previamente tratadas com MitomycinC (Sigma) . Em todos os casos, dois dias depois, adi-cionaram-se 2,5 U/ml de IL-2 (Boehringer-Mannheim GmbH,Germany) às cavidades e 5 dias mais tarde as célulasforam recuperadas com a finalidade de realizar ensaiosde liberação de cromo.

A atividade litica foi medida por incuba-ção de quantidades diferentes de células de órgão motordurante 4 horas com 3000 células alvo T2 previamentecarregadas com 51Cr, com e sem peptidio (alvo) . No ca-so de células estimuladas com Tl/HCVcon, as células deórgão motor foram confrontadas com Tl/HCVcon ou TI,previamente carregadas com 51Cr. Os sobrenadantes dacultura foram coletados depois de 4 horas de incubação.

A percentagem de Iise especifica foi cal-culada de acordo com a fórmula:(cpmexperimental - cpmespontânea) / (cpmmáxima - cpmespontânea) χ 100

em que a Iise espontânea (medida como cpmespontânea)corresponde às células alvo incubadas na ausência decélulas de órgão motor, e a Iise máxima (cpmmáxima) éobtida por incubação das células alvo com 5% Tri-tonxlOO.

EXEMPLO 1

A imunização com anti-CD40 e poli(I:C) em conjunto comuma proteína NS3 induz respostas de CD4+ e CD8+ T mul-ti-epitópicos.

A imunização com anti-CD40 e poli(I:C)mostrou por si mesma ser muito eficiente para a induçãode respostas de CD8+ por meio da utilização, como agen-tes imunogênicos, de peptídeos sintéticos que represen-tam epítopes de células CD8+. Muito embora esta estra-tégia induza respostas potentes, foi demonstrado quequando ela é co-imunizada com pequenas quantidades deproteína NS3 (5 pg/camundongo) , que induz resposta de CD4 + , ela aumenta a magnitude da resposta de CD8+ etambém aumenta a resposta de CD8+ de alta afinidade, emoutras palavras, aquela que reconhece baixas concentra-ções de antígeno. Além disso, a imunização com peptí-dios é apenas efetiva naquelas pessoas que possuem mo-léculas de HLA da mesma restrição que os epítopes esco-lhidos. Com o objetivo de atacar estes dois pontos,realizou-se um estudo de se imunização com maioresquantidades de proteína NS3 de recombinação seria capazde induzir respostas, não apenas de CD4+ , mas tambémde CD8+. Para fazer isto, camundongos foram imunizadoscom NS3 juntamente com poli(I:C) e anti-CD40, e as res-postas induzidas foram estudadas. Desta forma, camun-dongos HHD (dois por grupo) foram injetados i.p. com 50yg de anti-CD40. Quatro horas mais tarde, eles foraminjetados com 50 μg de poli(I:C) (i.v.) e 500 pg deproteína NS3 de recombinação (i.p.) (SEQ. ID. NO: 1).

Seis dias mais tarde, os animais foram sacrificados eas passarinhas foram extraídas. Com o objetivo de ana-lisar a capacidade de NS3, quando o adjuvante poli(I:C)+ anti-CD40 é formulado para induzir respostas de CD8+e CD4+ T, as passarinhas foram estimuladas in vitro comantígenos diferentes que ativam especificamente estaspopulações de células. (A) Com a finalidade de anali-sar as respostas de CD8+, em uma primeira experiênciaas passarinhas foram estimuladas durante cinco dias comos epítopes CD8 + 1073, 1406 ou 1038 na presença de IL-2. Depois disso, para cada grupo de células estimula-das com um peptídio, a sua capacidade foi medida paraefetuar a Iise das células alvo que foram carregadascom o correspondente peptídio (barras pretas) ou paracontrolar células alvo sem peptídio (barras brancas).

A Figura IA mostra os resultados obtidos com uma rela-ção órgão motorralvo de 100:1. (B) A resposta de CD8+induzida depois de imunização com NS3 também foi anali-sada por meio de estudo da produção de IFN-γ no sentidodos mesmos epítopes de CD8+. Para fazer isto, as pas-sarinhas foram cultivadas com quantidades diferentes de1073 (círculos pretos), 1406 (triângulos brancos) ou1038 (triângulos pretos). Depois de 48 horas de cultu-ra, os sobrenadantes foram coletados e mediu-se o con-teúdo de IFN-γ. (C) Com o objetivo de analisar a res-posta de CD4+ induzida, as passarinhas foram estimula-das com a proteína NS3 usada na imunização (SEQ. ID.NO: 1) . Também, as células foram estimuladas com pro-teína NS3 comercial produzida na bactéria (SEQ. ID. NO:3) . Da mesma maneira que no ponto anterior, o grau deativação foi medido por meio da produção de IFN-γ.

Antes de qualquer coisa, foi possível che-car que este antígeno foi capaz de induzir respostas deCD8+, que puderam ser detectadas tanto nos ensaios deliberação de cormo (Figura IA) quanto por meio da indu-ção da produção de IFN-γ (Figura 1B). Além disso, estaresposta foi multi-epitópica, sendo dirigida no sentidode vários epítopes de CD8+, que foram caracterizadosdentro da seqüência de NS3 (por exemplo: peptídeos1073, 1406 e 1038) . Finalmente, também foi confirmadoque foi capaz de induzir respostas de CD4+ , que reco-nheceram a proteína NS3 usada na imunização e a proteí-na NS3 comercial produzida na bactéria (Figura 1C). Aresposta no sentido desta última foi mais baixa, presu-mivelmente devido ao fato de que existiram algumas al-terações na seqüência das duas proteínas e que a prote-ína expressada nas bactérias foi mais curta, com o queela poderia perder alguns epítopes reconhecidos pelosCD4+ T-Linfócitos.

EXEMPLO 2

A administração de 25 μς de recombinante NS3 em conjun-to com poli(I:C) e anti-CD40 é suficiente para induzirrespostas de CD4+ e CD8+ T.

A partir de experiências anteriores os in-ventores souberam que com 5 μς de NS3 foram induzidasrespostas de CD4 + , mas não de CD8+, e portanto deseja-ram descobrir a quantidade mínima de NS3 que seria su-ficiente para induzir respostas de CD8+. Com esta fi-nalidade, imunizaram-se camundongos HHD com 500, 250,125 e 25 μς de NS3 (SEQ. ID. NO: 1) . Também incluídocomo controle estava um grupo imunizado com peptídeoscorrespondentes aos epítopes CD8+, que induziriam res-postas de CD8 + , mais 5 μg de NS3 (SEQ. ID. NO: 1), queinduziria respostas de CD4+. Para isto, em cada grupode animais imunizados com uma dose de NS3 conduziu-seuma análise da resposta de CD8+ e da resposta de CD4+.A resposta de CD8+ foi analisada como a capacidade Ii-sar células alvo carregadas com o epitope CD8+ 1073(Fig. 2A) , juntamente com a capacidade de produzir IFN-Y com relação às diferentes concentrações dos epítopesCD8+ 1073 (Figura 2B) e 1038 (Figura 2C). As respostasde CD4+ foram medidas por meio da capacidade de produ-zir IFN-γ com relação a diferentes concentrações de NS3(SEQ. ID. NO: 1) (Figura 2D). Esta experiência demons-trou que todas as quantidades de NS3 ensaiadas foramcapazes de induzir respostas de CD8+ , quando as res-postas liticas ao peptídio 1073 foram estudadas (Figura2A) , com a dose de 25 μς sendo aquela que induziu aresposta de intensidade mais fraca. Além disso, todasas doses foram capazes de induzir a produção de IFN-γcom relação aos epitopes 1073 (Figura 2B) e 1038 (Figu-ra 2C) , que indicaram que a capacidade de induzir res-postas multi-epitópicas foi mantida mesmo quando as do-ses foram reduzidas. Finalmente, e como era esperado,todas elas induziram respostas de CD4+. Considerando-se que, na maior parte dos casos, a resposta induzidafoi menos quando se utilizaram 25 μg de NS3, para expe-riências posteriores escolheu-se uma dose de 100μg/camundongo, dose essa a partir da qual não se obser-vou aumento na indução de respostas.

EXEMPLO 3

A imunização com poli(I:C) e anti-CD40 em conjunto comuma proteína NS3 induz respostas de CD4 + e CD8+ em ou-tras variedades de camundongos com diferentes MHC.

Considerando-se que em um antígeno tão am-pio quanto uma proteína NS3, é possível encontrar epi-topes de CD4+ e CD8 + , que podem ser apresentadas pordiferentes moléculas de MHC, foi estudada a capacidadedeste protocolo de imunização para induzir respostas deCD4 + e CD8+ em outra variedade de camundongo com dife-rentes moléculas de MHC. Para isto, camundongosC57/B16, que têm moléculas de MHC de restrição a H-2b,foram imunizados com 100 μg de NS3 (SEQ. ID. NO: 1) .Com a finalidade de aperfeiçoar as respostas, um gruporecebeu uma única imunização e o outro grupo recebeuuma segunda imunização de reforço. Antes de qualquercoisa, mediu-se a resposta de CD8+, como a produção deIFN-γ contra o peptidio 1629-1637 (SEQ. ID. NO: 7), quecontém um epitope de CD8+ apresentado pelas moléculasde MHC da classe I H-2 Db. Tal como pode ser observadona Figura 3A, uma resposta capaz de ser detectada foiinduzida nos dois grupos de camundongos, posto que osniveis foram consideravelmente maiores no grupo que ti-nha recebido duas imunizações (quadrados pretos) do quenaqueles que receberam uma imunização (quadrados bran-cos). A resposta de CD4+, medida como a produção deIFN-γ contra a proteína NS3 de recombinação (SEQ. ID.NO: 1) também foi detectada nos dois grupos (Figura3B), e novamente demonstrou que duas imunizações (qua-drados pretos) induziram respostas mais potentes do queuma única imunização (quadrados brancos).

EXEMPLO 4

A imunização com proteína NS3 em conjunto com poli(I:C)e anti-CD40 induz respostas de CD8+ capazes de reconhe-cerem células que expressam proteínas do HCV.

Com a finalidade de estudar se imunizaçãoutilizando-se proteína NS3 em conjunto com poli(I:C) eanti-CD40 seria capaz de induzir respostas que pudessempotencialmente exterminar células infectadas com HCV,utilizou-se um modelo in vitro de células alvo trans-fectadas com um plasmídio que expressou as proteínas doHCV (Tl/HCVcon). Estas células expressaram os mesmospeptideos nas suas moléculas MHC de Class I, como seri-am expressos por uma célula infectada com HCV; portan-to, poderia supor-se como uma resposta contra a últimade qualquer resposta contra elas. A proteína NS3 (SEQ.

ID. NO: 1) usada nas experiências das Figuras 1 a 3corresponde a uma variedade viral diferente da varieda-de viral presente nas células Tl/HCVcon. Estas duasvariedades apresentam algumas diferenças nos epítopesCD8+ estudados até agora. Com o objetivo de aperfeiço-ar a capacidade de reconhecimento dos epítopes CD8+presentes nas células Tl/HCVcon, para esta experiênciautilizou uma Proteína NS3 (SEQ. ID. NO: 2) como agenteimunogênico, cuja seqüência teve um grau de homologiamaior do que a proteína presente nas células Tl/HCVcon. Seis dias depois da imunização de camundongos HHD com100 pg de NS3, as passarinhas foram estimuladas com cé-lulas Tl/HCVcon. A capacidade de reconhecimento dascélulas Tl/HCVcon foi analisada em ensaios de atividadelítica. Para isto, passarinhas estimuladas foram con-frontadas com células Tl/HCVcon e células de controleTI. Conforme ilustrado na Figura 4, a imunização comNS3 induziu respostas com uma capacidade maior para aIise de células TI, que expressaram proteínas do HCV(círculos pretos) do que as células de controle Tl (círculos brancos).

EXEMPLO 5

A imunização com poli(I:C) e com anti-CD40 em conjuntocom a Proteína NS3 induz respostas de T CD4 + e CD8+ du-radouras.

Uma das propriedades principais que umprotocolo de vacinação tem de possui é a sua capacidadede induzir respostas de imunização duradouras, de raa-neira a proteção conferida pela imunização possa per-sistir em longo prazo. Com a finalidade de estudar seimunização com anti-CD40 e poli(I:C) em conjunto comuma proteína NS3 seriam capazes de induzir esta espéciede resposta, camundongos HHD foram imunizados com 100yg de NS3 de acordo com o protocolo descrito no Exem-plo 1. Com o objetivo de reforçar a resposta, depoisde 15 dias os animais receberam uma dose de reforço sobas mesmas condições. Sessenta dias depois da segundaimunização os animais foram sacrificados e suas passa-rinhas foram estimuladas com diferentes antígenos a fimde se analisarem as respostas de CD8+ e CD4+ T que Per-sistiam nesse momento. A fim de se estudar a respostade CD8+ T, as células foram estimuladas com o epitope1073 e realizou-se a medição da produção de IFN-γ e daatividade litica. Tal como se encontra ilustrado naFigura 5A, sessenta dias depois da segunda imunização,as passarinhas dos camundongos imunizados com anti-CD40e poli(I:C) em conjunto com a proteína NS3 foram capa-zes de produzir grandes quantidades de IFN-γ quando es-timuladas com o peptídio 1073, mas não na ausência deantígeno. Além disso, estas células foram capazes delisar células alvo pulsadas com o peptídio 1073 (círcu-los pretos), mas não as células alvo que não continhamantígeno (círculos brancos) (Figura 5B). Finalmente,também se estudou a resposta de CD4+ , utilizando-secomo antígeno uma proteína NS3 usada na imunização. AFigura 5C mostra que este protocolo de imunização tam-5 bém induz respostas de CD4+ potentes e duradouras, queespecificamente reconhecem o NS3.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS<110> PROJETO DE BIOMEDICINA CIMA S.L.

<120> COMBINAÇÃO IMUNO-ESTIMULANTE PARA PROFILAXIA E TRATAMENTO DEHEPATITE C

<130> 05009<160> 7

<170> Patentin Versão 3.1

<210> SEQ ID. NO.: 1

<211> 631

<212> PRT

<213 > Vírus da hepatite C

<220>

<221> CONFIGURAÇÃO--MISC<223> Proteína NS3 não-estrutural

<400>

Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys1 5 10 15

Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu20 25 30

Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile35 40 45

Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Lys Thr Ile50 55 60Ala Ser Ser Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln65 70 75 80

Asp Leu Val G.l.y Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro85 90 95

Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg Hls Ala Asp100 105 110

Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser115 120 125

Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu130 135 140

Cys Pro Ala Val His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala AIa Val Cys Thr145 150 155 160

Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Gly Leu Glu165 170 175

Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala180 185 190

Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser195 200 205

Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys210 215 220

Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Ciy Ala225 230 235 24C

Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Ile Ile Arg Thr Gly Val245 250 255

Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys260 265 270

Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile275 280 285

Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Asp290 295 300Thr Val Leu Asp Gin Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val Leu305 310 315 320

Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile325 330 335

Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys340 345 350

Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys355 360 365

His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu370 375 380

Gly Val Asn Aia Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile385 390 395 400

Prc Ala Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Ket Thr405 410 415

Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val420 425 430

Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr435 440 445

Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly Arg450 455 460

Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu465 470 475 480

Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp485 490 495

Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg500 505 510

Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His515 520 525

Leu Glu Phe Trp Giu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala530 535 540His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly GIu Asn Leu Pro Tyr Leu545 550 555 560

Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro565 570 575

Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu580 585 590

His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu595 600 605

Ile Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser610 615 620

Ala Asp Leu Glu Val Val Thr625 630

<210> SEQ. ID. NO.: 2<211> 635<212> PRT

<213> Vírus da hepatite C

<220>

<221> Configuração—Misc<223> Proteína NS3 não-estrutural

<40C> 2

Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys1 5 10 15

Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu20 25 30

Val Gln Val Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val35 40 45

Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu50 55 60Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln65 70 75 80

Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr Pro85 90 95

Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp100 105 · 110

Val Val Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg GIy Ser Leu Leu Ser115 120 125

Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu130 135 140

Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr145 150 155 160

Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Met Glu165 170 175

Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala180 185 190

vai Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser195 200 205

Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Aia Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys210 215 220

Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala225 230 235 240

Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Glu Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val245 250 255

Arg Thr Ile Thr Thr Gly Gly Prc Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Cys Lys260 265 270

Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile275 280 285

Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly290 295 300Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Aia Gly Ala Arg Leu Val Val Leu305 310 315 320

Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Ile Thr Val Pro His Pro Asn Ile325 330 335

Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys340 345 350

Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys355 360 365

His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Thr Gly Leu370 375 380

Gly Leu Asn Ala Val Aia Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile38b 390 395 40C

Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Me- Thr405 410 415

Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val420 425 430

Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr435 440 445

Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ala Gln Arg Arg Gly Arg450 455 460

Thr Gly Arg Gly Arg Ser Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu465 470 475 480

Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp485 490 495

Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg500 " 505 510

Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His515 520 525

Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala530 535 540His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Leu Pro Tyr Leu545 550 555 560

Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Aia Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro565 570 575

Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thx Leu580 585 590

His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu595 60G 605

Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Mét Ala Cys Met Ser610 615 620

Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val625 630 635

<210> SEQ. ID. NO.: 3<211> 528<212> FRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<2 2 3 > Proteína de recombinação quimérica obtida a partir de proteínas NS2 e NS3 dovírus da hepatite C

<400> 3

Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Ala Ser Lys Gly15 10 15

Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly20 25 30

Le u Leu Gly Cys Ile Ile Thir Ser Leu Thr Gly Airg Asp Lys Asn Gln35 40 45

Val C-Iu Gly Glu Val Gln Ile Val Pro Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu50 55 60

Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly65 70 75 80Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Ser85 90 95

Asn Val Asp Lys Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg100 105 110

Ser Leu Ala Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr115 120 125

Lys His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly130 135 140

Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly145 150 155 160

Gly Pro Leu Leu Cys Pro Val Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala165 170 175

Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Ala Asp Phe Ile Pro Val180 185 190

Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser195 200 205

Ser Pro Pro Val Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala210 215 220

Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala225 230 235 240

Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu245 250 255

Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile260 265 270

Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser275 280 285

Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Tyr290 295 300

Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile305 310 315 320Leu Gly Tle Gly Thr Val Leu Asp Gln Gly Glu Thr Ala Gly Ala Lys

325 330 335

eu Val Val Phe Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro340 345 350

His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro355 360 365

Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His370 375 380

Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Arg Lys Cys Asp Glu Leu Ala Thr Lys385 390 395 400

Leu Val Ala Met Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp

405 410 415

Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp420 425 430

Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys435 440 445

Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe450 455 460

Thr Ile Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln465 470 475 480

Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val

485 490 495

Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys500 505 510

Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu515 520 525

<210> SEQ- ID. NO.: 4<211> 10<213> Vírus da hepatite C

<220>

<221> configuração-misc

<223> Epítope 1038-1047 correspondente à proteínaNS3 viral

<400> 4

Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu15 10

<210> SEQ. ID. NO.: 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Vírus da hepatite C

<220>

<221> configuração-misc

<223> Epítope 1073-1081 correspondente à proteínaNS3 viral

<4 00> 5

Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val

1 5

<210> SEQ. ID. NO.: 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Vírus da hepatite C

<220>

<221> configuração-misc

<223> Epítope 1406-1415 correspondente à proteína viral<400> 6

Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val1 5 10

<210> SEQ. ID. NO.: 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Vírus da hepatite C

<400> 7

Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu1 5

Claims

1. - Combinação imuno-estimulante para aprofilaxia e tratamento de hepatite C, caracterizadapelo fato de compreender:a) um agonista de TLR3,b) um agonista de CD4 0 ou uma seqüência de DNA queo codifica, ec) um polipeptidio, que compreende a proteína NS3do vírus da hepatite C, ou um fragmento da ditaproteína NS3 com capacidade para induzir res-postas de CD8+ e CD4+.

2. - Combinação imuno-estimulante, de acor-do com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato deque o agonista de TLR3 é poli(I:C).

3 - Combinação imuno-estimulante, de acor-do c.om a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fatode que o agonista de CD40 é selecionado a partir de en-tre um anticorpo anti-CD40, CD40L, e fragmentos dosmesmos, que conserva sua capacidade de junção a CD40.

4. - Combinação imuno-estimulante, de acor-do com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato deque o agonista de CD40 é um anticorpo anti-CD40.

5. - Combinação imuno-estimulante, de acor-do com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato decompreender:a) poli(I:C),b) um anticorpo anti-CD40, ec) um polipeptidio que contém a proteína NS3.

6. - Combinação imuno-estimulante, de acor-do com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fatode que o polipeptidio que contém a proteína NS3 é umpolipetídio com SEQ ID. NO: 1.

7. - Combinação imuno-estimulante, de acor-do com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato deque o agonista de que todos os componentes formam partede uma única composição farmacêutica.

8. - Combinação imuno-estimulante, de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracte-rizada pelo fato de que todos os componentes formamparte de pelo menos duas composições farmacêuticas di-ferentes.

9. - Utilização de uma combinação imuno-estimulante de acordo com a reivindicação 8, caracteri-zada pelo fato de que as ditas composições farmacêuti-cas são administradas simultaneamente.

10. - Utilização de uma combinação imuno-estimulante de acordo com a reivindicação 9, caracteri-zada pelo fato de que as ditas composições farmacêuti-cas são administradas em momentos diferentes.

11. - Utilização de uma combinação imuno-estimulante de acordo com a reivindicação 9, caracteri-zada pelo fato de que as ditas composições farmacêuti-cas são administradas por meio de vias de administraçãodiferentes.

12. - Composição farmacêutica que contémuma combinação imuno-estimulante de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fatode que cada um dos componentes está presente em quanti-dades farmaceuticamente aceitáveis.

13. - Kit para administração de uma combi-nação imuno-estimulante de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de queele compreende pelo menos duas composições farmacêuti-cas diferentes.

14. - Método para produzir uma resposta i-mune ao virus da hepatite, caracterizado pelo fato deque consiste em administrar uma combinação estimulantede acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, emuma quantidade efetiva para induzir uma resposta imune.

15. - Método, de acordo com a reivindicação14, caracterizado pelo fato de que consiste de um tra-tamento profilático.

16. - Método, de acordo com a reivindicação14, caracterizado pelo fato de que consiste de um tra-tamento terapêutico.

17. - Vacina contra o virus da hepatite,caracterizada pelo fato de que compreende uma combina-ção imuno-estimulante definida em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 8.