CN101330928B - 用于预防和治疗丙型肝炎的免疫刺激剂组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗丙型肝炎的免疫刺激剂组合，其特征在于包括：一种TLR3激动剂，一种CD40激动剂和丙型肝炎病毒的NS3蛋白。而且，本发明也涉及含有所述免疫刺激剂组合的药用组合物及其应用，及含有所述药用组合物的药盒。此外，本发明还涉及一种对丙型肝炎病毒产生免疫应答的方法和对抗所述病毒的疫苗。

Description

用于预防和治疗丙型肝炎的免疫刺激剂组合
发明领域
本发明涉及一种用于预防和治疗丙型肝炎的免疫刺激剂组合，其包括HCV的NS3蛋白及可诱导对HCV病毒特异的强效持久的CD8+和CD4+应答的佐剂。
发明背景
据估计，全世界有1亿7千万人感染丙型肝炎病毒，该病毒引起的感染现已成为公众健康的沉重负担。并且据推测在未来几年内这一发病率将持续不变。
HCV感染的特征为发展成慢性疾病的高倾向性。HCV可在70％被感染个体中继续存活，其中20％会发展成为肝硬化并且2.5％会发展成肝癌。
目前的参考治疗手段是基于干扰素使用的治疗方案。但是，这些抗病毒疗法价格昂贵，相对毒性较大并且只对50-60％接受治疗的病人有效。因此有必要并且希望研发新的、更有效并具有更好耐受性的治疗策略。
Nature(“Insights：Hepatitis C”.Nature 2005，Supplements；Vol.436，Nr.7053，pp 929-978)(《自然》(“洞察：丙型肝炎”自然2005，增刊，436卷，7053期，929-978页))中有对HCV的最新综述。
虽然很遗憾我们还没有找到对抗丙型肝炎病毒的有效疫苗，但是试验数据和现象使我们认为可以找到有效的疫苗。尽管抗病毒抗体是在对感染的应答中合成的，但是该慢性过程的特征为不存在细胞毒-T细胞(CD8+)和辅助T细胞(CD4+)的细胞免疫应答。所以我们推断HCV已具有可使其特异性侵袭抗病毒免疫应答的能力，其中细胞毒性T和辅助T应答的强度和质量决定了该病人是否可以康复(自动康复或经治疗)或它们是否将转化为慢性感染。
任何疫苗的主要目的都是刺激抗原特异性获得性免疫，其由B或T淋巴细胞介导。在这一情况下，抗原递呈细胞(APCs)在引发特异性免疫应答尤其是激活T淋巴细胞中发挥了重要作用。APCs主要为树状突细胞，它们可以在外周器官中捕获抗原并且在接受激活刺激之后迁徙至淋巴器官。在那里，树突状细胞将抗原(表位)降解后的肽产物(与主要组织相容性复合物MHC的实质分子结合)呈现在它们表面，它们同时产生趋化因子和细胞因子以吸引和激活T-细胞。树突状细胞激活过程(也称作成熟)的特征为高度表达MHC分子(信号1)，辅助刺激因子(信号2)和极化(polariser)细胞因子例如白介素12(IL-12)(信号3)。该成熟过程由例如病原体组分或宿主分子这些经常出现在炎症或细胞损伤过程中的因子诱导。这些因子通过来源于微生物的产物的特异性受体作用于树突状细胞，例如TLR型受体(Toll-样受体)、细胞因子受体(TNF-α、IL-1、IFN-α)或细胞表面配体的受体(例如CD40)。
APCs对不同种类T-细胞的刺激和激活一方面受到MHC分子类型的限制，另一方面受到与MHC分子形成复合物的表位特性的限制。例如，一些被鉴定为可特异性诱导细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)的激活的病毒蛋白质的片段，通常称它们为淋巴细胞表位或CD8+T细胞表位或CD8+表位；或可特异性诱导CD4+辅助T淋巴细胞(HTL)的激活的表位，通常称它们为CD4+表位。“HCV免疫学数据库”(http://hcv.lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html)搜集了T淋巴细胞(CD8+CTL和CD4+HTL)的表位，以丙型肝炎病毒不同菌株和分离体的病毒蛋白质为基础进行鉴定。
免疫方案的开发基于多肽形式表位的使用，因此需要预先筛选适合每个个体的肽，这取决于各个体呈现的MHC分子。这表明根据每个个体的MHC，必须选择肽的特定组合才能作为这一条件下的表位。使用大型抗原可解决这一问题，因为它们通常为多聚表位并且在它们的序列内可存在多种表位，包括CD8+CTL和CD4+HTL的表位，而这两者可由不同个体的MHC分子呈现。如此一来，一个单独的抗原就可在具有不同MHC的个体中用作疫苗了。
在HCV的不同蛋白质中，核心蛋白和NS3蛋白表现出强烈的免疫原性，在克服了感染的人群中可检测到针对它们的强效的CD8+CTL和CD4+HTL免疫应答。尽管如此，已有数据表明核心蛋白与免疫系统细胞接触时也会对它们产生有害作用，这表明使用核心蛋白作为疫苗策略中的抗原是不明智的。但是另一方面，NS3蛋白几乎没有这一类型的作用，因此NS3蛋白可作为诱导CD8+CTL和CD4+HTL免疫应答的良好候选抗原。
在这个意义上，WO 2002/014362A2公开了HCV NS3蛋白作为抗原在制备预防和治疗HCV感染的疫苗中的用途。NS3可以与辅药利巴韦林一起给药，两者可以共存于相同的药用组合物中，也可以分处于不同的药用组合物中。此外，辅药可以与抗原在相同或不同的时间给予。但是该文件没有说明利巴韦林能够增强针对NS3的CD8免疫反应。
CD4+HTL在获得性免疫，在APC激活、CTL激活和记忆诱导等作用机制中发挥重要作用。尤其是有文献描述HCV特异性CD4+细胞是维持抗病毒CTL所必需的(Grakoui A.等，“HCV persistenceand immune evasion in the absence of memory T-cell help(不存在记忆T辅助细胞情况下的HCV持续存在和免疫逃避)”；Science，2003；302：659-662)。因此，一种对抗丙型肝炎病毒的有效疫苗应提供CD8+CTL和CD4+HTL应答的最大诱导效力。因此这种疫苗需要筛选可提供这些免疫应答特异性抗原。
尽管如此，仅靠抗原组合自身似乎并不能提供针对HCV的有效疫苗。考虑到树突状细胞的成熟是T淋巴细胞有效起始和激活的必要条件，所以加入一些佐剂组成的免疫刺激剂组合有利于疫苗，该组合可刺激树突状细胞的成熟。TLR受体的配体、细胞因子受体的配体或针对已引用的胞间配体的受体的配体可用作佐剂，或者优选这些佐剂的协同性组合。
例如，Rouas等(International Immunology，May 2004，16(5)：767-773)公开了CD40L、IFN-γ和多聚(I:C)(一种TLR3的合成配体)的体外用途，在药用组合物中使用，用于产生成熟树突状细胞。结果表明用多聚(I:C)成熟化的树突状细胞是仅有的经CD40L刺激后分泌IL-12p70的细胞，而用IFN-γ成熟化不会出现这种情况。还公开了用CD40L和多聚(I:C)孵育时树突状细胞的成熟化作用。成熟树突状细胞在免疫反应中十分重要，因为它们分泌的IL-12激活Th1淋巴细胞和细胞毒T淋巴细胞两种细胞。
此外，US2004/0141950描述的免疫刺激剂组合包括TLR激动剂和肿瘤坏死因子(TNF)或其受体(TNFR)超家族分子的激动剂，还可包括一种抗原。在多种可能的组合中，CD40配体(抗CD40抗体)、多聚(I:C)配体形成的组合表现出对CD8+T淋巴细胞增殖的协同作用。同样地，Ahonen等(J.Exp.Med.2004；199：775-784)提供了有关TLR/CD40激动剂以独立于CD4+T淋巴细胞的方式诱导抗原专一性CD8+CTL增殖和分化的协同能力的数据。尽管这些研究描述了TLR/CD40激活CD8+T淋巴细胞抗原专一性记忆的能力，但是所述研究并不能确定这种TLR/CD40激动剂组合是否也能增强CD4+HTL免疫应答。
在被HCV感染的情况下，对比受感染的患者和已清除感染的患者可发现CD4+HTL免疫应答存在明显不同。尽管如此，虽然比治愈患者的强度低，但还是在受感染患者中检测到CD8+CTL免疫应答。因此，虽然CTL在清除HCV感染中是重要的效应细胞群体，但是CD4+细胞在控制疾病中也发挥了重要作用。此外，有文献描述诱导CD4+T淋巴细胞对于维持抗病毒CTL免疫应答是重要的(Grakoui A.等，“HCV persistence and immune evasion in the absence ofmemory T-cell help(不存在记忆T辅助细胞情况下的HCV持续存在和免疫逃避)”；Science，2003；302：659-662)。这些数据表明对于HCV引起的病毒性疾病的免疫和治疗，诱导CD8+和CD4+强效持久的抗病毒免疫应答是重要的。
因此，本发明的目标是筛选适用于预防和治疗丙型肝炎的抗原和佐剂组成的免疫刺激剂组合，该组合可提供对CD8+和CD4+免疫应答的刺激，并使之更加强效、完全和持久。
发明详述
本发明的首要目标涉及预防和治疗丙型肝炎的免疫刺激剂组合(以下称作本发明免疫刺激剂组合)，其中包含TLR3激动剂、CD40激动剂或其编码DNA序列，以及包含丙型肝炎病毒的NS3蛋白的多肽、或具有诱导CD8+和CD4+免疫应答能力的所述NS3蛋白片段。
“TLR3激动剂”指可与TLR3受体(“toll样受体3”)组合或结合并引起细胞免疫应答的配体。TLR3是双链RNA的受体，双链RNA可传导信号激活NF-κB、产生I型干扰素(IFN)(包括IFN-α和IFN-β)，后者可刺激树突状细胞的成熟。缺乏TLR3表达的小鼠对多聚(I:C)(与HCV型病毒复制时产生的双链RNA相似的TLR3配体)的免疫应答降低，在用D-半乳糖胺致敏时对多聚(I:C)的致死作用产生抗性，并且炎症细胞因子的产生减少(Alexopoulou等，Nature，2001，卷413，页码732-738)。在本发明一个具体实施方案中，所述TLR3配体可以是病毒双链RNA或聚肌苷酸-聚胞苷酸双链(多聚(I:C))。
“CD40激动剂”是指可与CD40受体组合或结合并引起细胞免疫应答的配体。CD40是一种在不同类型细胞的质膜中表达的分子，例如B淋巴细胞或抗原递呈细胞(巨噬细胞、树突状细胞等)。CD40(CD40L或CD154)的天然配体主要在抗原识别后被激活的T淋巴细胞中表达。CD40L与抗原递呈细胞中存在的CD40相互作用诱导CD40的成熟。这一现象以类似于病原体来源刺激的方式，致使抗原递呈细胞具有更强的诱导免疫应答能力。因此，本发明的免疫刺激剂组合中的CD40激动剂一方面指CD40L配体，另一方面指保留了CD40结合能力并诱导细胞或免疫应答的CD40L片段。在一个具体实施方案中，这一配体可以是CD40的特异性抗体(抗CD40)或其保留了CD40结合能力的片段。此外，CD40配体或其片段在免疫刺激剂组合中可以蛋白质形式或编码配体的重组核酸(DNA)形式存在，例如用于转染或基因治疗的病毒载体。
“抗原”是指任何能在个体生物体中诱导免疫应答(包括体液免疫和细胞免疫)、或能在与免疫细胞接触时诱导细胞免疫应答(增殖、激活和/或催熟免疫细胞、产生细胞因子或抗体)的物质。具体而言，抗原可以是病毒蛋白质、肽或所述病毒蛋白质的片段、所述病毒蛋白质的重组蛋白质或能诱导免疫应答的合成多肽。
“CD8+诱导表位”是指能特异性诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活的抗原的片段或部分多肽链。“CD4+诱导表位”是指能特异性诱导CD4+辅助T淋巴细胞(HTL)激活的抗原的部分多肽链的片段。
“NS3蛋白”是指丙型肝炎病毒的非结构蛋白NS3，它是一种分子量为67kDa的蛋白，含有2个结构域，一个是包含N末端189个氨基酸的丝氨酸-蛋白水解酶，另一个是含有C末端442个氨基酸的具有螺旋酶-腺苷三磷酸酶活性的域。本发明的免疫刺激剂组合多肽中包含的NS3蛋白的序列可与丙型肝炎病毒的任一株系和分离体相符。在一个具体实施方案中，可由重组技术获得含NS3蛋白的多肽。在本发明的一个具体非限制性实施方案中，重组NS3蛋白使用的序列为SEQ ID.NO：1(参见Genebank登录号DQ068198.1和AAY84763.1，VRL 28-NOV-2005)。我们还使用了另一个重组蛋白序列SEQ ID.NO：2(参见Genebank登录号D90208)。
在本发明的另一可选实施方案中，也可使用含有NS3蛋白片段的多肽，所述片段能诱导CD4+和CD8+免疫应答。因此，所述片段须含有至少一个CD8+诱导表位和一个CD4+诱导表位。
在一个具体实施方案中，本发明的免疫刺激剂组合包括多聚(I:C)、抗CD40抗体以及含有NS3蛋白的多肽。
在本发明一个优选实施方案中，免疫刺激剂组合包括所有能组成相同药用组合物一部分的组分，其中每中组分均为药学可接受量。此外，本发明也涉及所述药用组合物。
在本发明的另一个具体实施方案中，免疫刺激剂组合的组分可形成至少两种药用组合物的一部分。同样地，本发明涉及所述免疫刺激剂组合的用途，其特征在于同时给予所述药用组合物。在本发明另一个实施方案中，所述免疫刺激剂组合的特征在于在不同时间通过相同或不同的给药途径给予所述药用组合物。所以，本发明的一个具体实施方案涉及用于给予上述免疫刺激剂组合的药盒，其特征为包含至少两中不同的药用组合物。
在另一方面，本发明涉及产生针对丙型肝炎病毒免疫应答的方法，其特征为包括给予有效量的以上定义的免疫刺激剂组合以诱导免疫应答。在一个优选的实施方案中，本发明方法包括预防性处理。在一个更优选的实施方案中，本发明方法包括治疗性处理。
最后，本发明也涉及对抗丙型肝炎病毒的疫苗，其特征为包括以上定义的免疫刺激剂组合从并达成本发明的目标。
附图简述
图1.用抗CD40、多聚(I:C)与NS3蛋白一起免疫诱导多表位CD4+和CD8+T应答。给HHD小鼠(每组两只)腹腔注射50g抗CD40。四小时后，给它们静脉注射50g多聚(I:C)并腹腔注射500g重组NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1)。六天后，处死动物并提取脾细胞用于不同抗原的体外刺激和所诱导免疫应答的分析。(A)在IL-2存在的情况下，用表位CD8+1073、1406或1038(10μM)刺激细胞。然后，在每一组脾细胞中检测对加载(多肽；黑色条形)或未加载(对照；白色条形)相应多肽的靶细胞的溶解反应。所得结果以效应细胞∶靶细胞为100∶1的比例显示。(B)以相同的方式将脾细胞与不同浓度(0.1-10μM)的多肽1073(黑圆圈)、1406(白三角)或1038(黑三角)一起培养，刺激48小时后取培养上清，用ELISA法检测IFN-γ的含量。(C)又用5或1μg/ml的免疫中使用的NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1)与1μg/ml的细菌生产的NS3蛋白(SEQ.ID.NO：3)或与培养基(对照)一起刺激脾细胞48小时，以检测CD4+应答。在这一时间段之后，收集上清并用ELISA方法检测IFN-γ的产生量。
图2.检测在与多聚(I:C)和抗CD40一起免疫时诱导CD4+和CD8+T应答的NS3蛋白的必需量。用NS3蛋白(SEQ ID.NO：1)(500、250、125或25μg/小鼠)与多聚(I:C)和抗CD40一起免疫HHD小鼠(每组两只)，其方案如图1所述。还包括一个用相同方法免疫的对照组，其使用5μg NS3(SEQ.ID.NO：1)、50μg多肽1073和1038作为抗原与多聚(I:C)和抗CD40一起免疫。六天后，处死动物并提取脾细胞用不同抗原刺激(A)。为检测诱导的溶解反应，用表位CD8+1073(10μM)和IL-2刺激细胞5天。之后，将不同量的效应细胞与固定量的加载多肽的靶细胞温育检测该反应。此外，通过测定IFN-γ产生量分析所诱导的CD8+应答。为此，用不同浓度的多肽1073(B)和1038(C)刺激细胞。也使用NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1)(D)刺激细胞以定量CD4+应答。48小时后检测上清中IFN-γ的含量。
图3.用多聚(I:C)和抗-CD40与NS3蛋白一起在具有不同MHC的其它品系小鼠中诱导CD4+和CD8+应答。按照图1指出的方案用100μg NS3(SEQ.ID.NO：1)与多聚(I:C)和抗-CD40一起免疫C57BL6小鼠(MHC分子为H-2b型)(每组两只)一次(白色方框)或两次(黑色方形)。六天之后，处死动物并将脾细胞与不同抗原温育以检测被诱导的CD4+和CD8+应答。用限制表位H-2Db1629-1637(GAVQNEVTL)(SEQ.ID.NO：7)刺激脾细胞并检测CD8+应答(A)。NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1)(B)用作测定CD4+应答的刺激物。经过两天温育之后，收集上清并测定IFN-γ的产生量。
图4.NS3蛋白与多聚(I:C)和抗-CD40一起诱导可识别表达HCV蛋白细胞的CD8+应答。如图1所示，给(A)HHD小鼠(每组两只)注射100μg蛋白(SEQ.ID.NO：2)及多聚(I:C)和抗-CD40。六天之后，将动物处死并在IL-2存在下用经丝裂霉素处理过的T1/HCVcon细胞(转染了表达HCV蛋白的T1细胞)刺激它们的脾细胞。经过五天刺激之后，在溶解活性检测中测定该脾细胞识别T1/HCVcon细胞的能力。在这一检测中，将不同数量的脾细胞与固定数量的T1/HCVcon细胞(黑色圆形)或未转染的T1对照细胞(白色圆性)温育。
图5.用多聚(I:C)和抗-CD40与NS3蛋白一起诱导T CD4+和CD8+应答。如图1所示，给HHD小鼠(每组两只)注射100μgNS3蛋白(SEQ.ID.NO：2)及多聚(I:C)和抗-CD40。两周后，在相同的条件下二次免疫动物。二次免疫六天之后将动物处死并提取它们的脾细胞用于研究CD8+和CD4+T应答的持久性。(A)用表位CD8+1073(10μM)或在不含抗原的情况下刺激脾细胞，48小时之后收集培养液上清以检测IFN-γ的生成量。(B)将该脾细胞与表位1073(10μM)和IL-2一起温育5天，然后研究它们溶解加载多肽1073的靶细胞的能力。为此，将不同数量的效应细胞与固定数量的加载多肽1073(黑色圆圈)或未加载多肽(白色圆圈)的靶细胞温育。(C)通过用NS3蛋白(1μg/ml)(SEQ.ID.NO：2)或在不存在抗原的情况下刺激该脾细胞研究CD4+应答。48小时后，收集上清并检测IFN-γ的生成量。
本发明的具体实施方案的实施方式
以下实施例旨在展示形成本专利申请的具体实施方案，不具有任何限制性。
相关材料和方法
表位、抗原和试剂
使用Fmoc chemistry(Wellings DA.and Atherton E.MethodsEnzymol 1997；289：44-67)的多步肽合成仪人工合成所使用的肽或表位。用Kaiser茚三酮试验对每一步进行监测。在合成结束时，将其剪接并用三氟乙酸脱保护，用二乙基醚洗涤。经HPLC检测任何时间所得的肽纯度均大于90％。
表1.实施例中合成和使用的肽和表位
  肽或表位   序列
  1038-1047   GLLGCIITSL；SEQ.ID.NO：4
  1073-1081   CVNGVCWTV；SEQ.ID.NO：5
  1406-1415   KLVALGINAV；SEQ.ID.NO：6
  1629-1637   GAVQNEVTL；SEQ.ID.NO：7
肽或表位的编号指其相对HCVH位置，以常被作为原型的人丙型肝炎H株中完全序列作为参照(GeneBank登录号M67463)。因此，例如数据库“HCV免疫学数据库”(http://hcv.lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html)搜集了用丙型肝炎病毒不同株系和分离体的病毒蛋白中鉴定出的T-淋巴细胞(包括细胞毒性T-淋巴细胞和辅助T-淋巴细胞)表位，全部按照相对于GeneBank中提供的该病毒H株系的相对位置排序。
使用具655个氨基酸的重组多肽作为免疫原，其含有NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1；Genebank登录号AAY84763.1，VRL 28-NOV-2005；631个氨基酸)的完全序列。除了NS3蛋白的631个氨基酸之外，该多肽还含有一个用于检测抗-myc的单克隆抗体的c-myc序列和一个组氨酸尾部。已可使用巴斯德毕赤酵母中生产该蛋白。其可悬浮保存在含有Tris 22.5mM、尿素3.76M、NaCl 300mM的溶液中。可使用镍柱色谱纯化该蛋白。
另一种重组多肽也被用作免疫原，其含有635个氨基酸，包含了NS3蛋白(SEQ.ID.NO：2；Genebank登录号D90208)的完全序列。除了与NS3对应的氨基酸之外，该多肽还含有用于纯化的组氨酸尾部。通过Sal I和Not I消化质粒gWIZ可得到与NS3对应的DNA序列，该质粒含有NS3序列(由Dr.G.Inchauspe，Lyon，France提供)。在质粒pET-45(+)(Novagen，Madison WI)的BsrG I和Not I位点之间克隆该消化产物。该产物可在大肠杆菌(E.Coli)中表达，先使用镍柱亲和色谱然后使用离子交换色谱可将其纯化。
相似的，体外检测中使用一种重组多肽(Mikrogen；目录编号94302)作为抗原，其含有非结构蛋白NS2末尾的20个氨基酸和HCV的NS3蛋白(SEQ.ID.NO：3)起始的508个氨基酸。
使用购自Amersham的多聚(I:C)(目录编号27-4732-01)作为TLR3激动剂。
使用抗-CD40抗体作为CD40激动剂，纯化自杂交瘤FGK-45(Rolink A.等，免疫1996.5：319-330)
经鲎变形细胞(Bio Whittaker)溶胞物QCL-1000检测，所有试剂内毒素的含量均小于1单位/mg产品。
小鼠
六至八周大的C57B1/6小鼠购自Harlan。也使用HHD小鼠，其含有人HLA-A2.1(Pascolo S.et al.，J.Exp.Med.1997.185：2043-2051)分子的转基因。所有的动物均在无病原条件下饲养，并按照该机构的规定处理。
细胞系
使用T2细胞(Salter R.等.免疫遗传学，198521：235-246)作为铬释放测定的靶细胞，测定中使用来自HHD小鼠的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)。
使用转染了HCV编码区载体质粒的T1细胞(T1/HCVcon细胞)，用于表达HCV蛋白细胞的识别检测。这些细胞由D.Moradpour博士(Freiburg，德国；Volk B.等.，J Gen Virol.2005；86：1737-1746)提供。使用未转染的T1细胞(ATCC，目录编号.CRL-1991)作为对照。
所有细胞均在完全培养基中生长(RPMI 164010％小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和50μM 2-巯基乙醇)。T1/HCVcon系的培养基还含有2mg/ml of G418(Gibco)。
免疫
用50μg抗-CD40腹腔途径免疫两组小鼠。四小时后，给它们注射50μg多聚(I:C)(静脉)和不同量的抗原：NS3蛋白或NS3蛋白与肽的混合物(腹腔)。
刺激脾细胞产生细胞因子
将脾细胞重悬于完全培养基并在含有或不含有肽或重组HCVNS3蛋白的条件下以8x105细胞/孔在U-形底96孔板中加入0.2ml培养液。
两天后收集上清，根据生产商的使用说明用ELISA(BD-Pharmingen)检测IFN-γ的存在。
检测CTL的溶解活性
为了检测CTL应答，将来自被免疫动物的脾细胞与肽(10μM)37℃温育2h，洗涤两次并以7.5x106细胞/孔加入24-孔板。在检测识别T1/HCVcon细胞的实验中，将7.5x106HDD小鼠脾细胞与之前经丝裂霉素C(Sigma)处理过的7.5x105T1/HCVcon细胞一起培养。在所有情况下，两天后向各孔加入2.5U/ml IL-2(Boehringer-Mannheim GmbH，Germany)，5天后回收细胞以进行铬释放试验。
存在或不存在肽(靶)的情况下，将不同数量的效应细胞与3000个已加载51Cr的T2靶细胞温育4小时。在用T1/HCVcon刺激细胞的情况下，将效应细胞与已加载51Cr的T1/HCVcon或T1温育。温育4小时后收集培养物上清。
根据下式计算特异性溶解百分比：(实验cpm—自发cpm)/(最大cpm—自发cpm)x100，其中自发溶解(测量值记录为自发cpm)与在无效应细胞条件下温育的靶细胞对应，用5％Tritonx100温育靶细胞得到最大溶解(最大cpm)。
实施例1
抗-CD40和多聚(I:C)与NS3蛋白一起免疫诱导多重表位的CD4+和CD8+T应答。
用抗CD40和多聚(I:C)免疫本身显示出它们可通过使用代表CD8+细胞表位的合成多肽作为免疫原非常有效地诱导CD8+应答。虽然这一方法可诱导强烈的应答，但研究表明，当用可诱导CD4+应答的低剂量NS3蛋白(5μg/小鼠)一起免疫时，其提高CD8+应答的强度，并可增强高亲和CD8+应答(也即能识别低浓度抗原的应答)。此外，用肽免疫仅对那些与选定表位具有相同限制性的HLA分子的个体有效。为了解决这两点，人们进行了研究以确定用更大剂量重组NS3蛋白进行的免疫是否不仅能诱导CD4+应答也能诱导CD8+应答。为此，用NS3与抗多聚(I:C)和CD40一起免疫小鼠，然后研究诱导的应答。于是，给HHD小鼠(每组两只)腹腔注射50μg抗CD40。四小时后，给它们静脉注射50μg多聚(I:C)以及腹腔注射500μg重组NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1)。六天后，处死小鼠并提取脾细胞。为分析NS3效价，当使用多聚(I:C)+抗CD40诱导CD8+和CD4+T应答时用可特异激活脾细胞群的不同抗原体外刺激脾细胞。(A)为分析CD8+应答，在第一个试验中，在IL-2存在的条件下，用表位CD8+1073、1406或1038刺激脾细胞5天。然后，对于经肽刺激的每一组细胞，检测它们溶解加载了相应肽的靶细胞(黑色条形)或未加载肽的对照靶细胞(白色条形)的能力。图1A显示了效应细胞∶靶细胞为100∶1所得到的结果。(B)还通过研究针对相同CD8+表位的IFN-γ产生量分析NS3免疫后诱导的CD8+应答。为此，用不同剂量的1073(黑色圆圈)、1406(白色三角)、1038(黑色三角)与脾细胞一起培养。培养48小时后，收集上清，检测IFN-γ的含量。(C)为分析诱导的CD4+应答，用免疫中使用的NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1)刺激脾细胞。也使用商品化的细菌来源NS3蛋白(SEQ.ID.NO：3)刺激细胞。以与前一点相同的方法，通过IFN-γ产生量检测激活程度。
首先，可以检测出该抗原可诱导CD8+应答，这可通过铬释放测定法(图1A)和诱导IFN-γ产生法(图1B)检测。此外，该应答是多重表位的，可对应多种CD8+表位，而NS3序列包含了这些表位的特征(例如：多肽1073、1406和1038)。最后，确定它也能诱导CD4+应答，CD4+应答可识别免疫中使用的NS3蛋白和商品化细菌来源的NS3蛋白(图1C)。对后者的应答较低，可能是因为两种蛋白序列间存在差异及细菌表达的蛋白较短，使其缺失了一些CD4+T淋巴细胞可识别的表位。
实施例2
将25μg重组NS3与多聚(I:C)和抗CD40一起给药足以诱导CD4+和CD8+T应答。
从之前的试验我们可以得知，5μg NS3可诱导CD4+应答而不可诱导CD8+应答，因此我们希望可以找到足以诱导CD8+应答的NS3最低剂量。为此，用500、250、125、25μg NS3(SEQ.ID.NO：1)免疫HHD小鼠。还包括用CD8+表位对应多肽(可诱导CD8+应答)附加5μg NS3(SEQ.ID.NO：1)(可诱导CD4+应答)免疫的对照组。为此，在用一剂量的NS3免疫的每一组动物中，分析其CD8+应答和CD4+应答。可通过溶解加载表位CD8+1073的靶细胞的能力(图2A)及对不同浓度表位CD8+1073(图2B)和1038(图2C)产生IFN-γ的能力来分析CD8+应答。通过对不同浓度NS3(SEQ.ID.NO：1)产生IFN-γ的能力检测CD4+应答。本试验表明，所有被检测NS3剂量均可诱导CD8+反应，在多肽1073的溶解细胞反应研究中(图2A)，25μg的剂量可诱导最微弱程度的应答。而且，所有剂量均可诱导对表位1073(图2B)和1038(图2C)的IFN-γ的产生，这表明即使剂量减少仍可保持其诱导多表位应答的能力。最后，如我们预期，它们均可诱导CD4+反应。考虑到在大多数情况下，使用25μg NS3会降低诱导的应答，所以在之后的试验中选择100μg/小鼠的剂量，从该剂量开始未观察到诱导应答的增强。
实施例3
多聚(I:C)和抗-CD40与NS3蛋白一起免疫具有不同MHC的其它品系小鼠诱导CD4+和CD8+应答
如果一个抗原和NS3蛋白一样大，其有可能存在可被MHC的不同分子递呈的CD4+和CD8+表位，我们研究了这一免疫方案在具有不同MHC的其它品系小鼠中诱导CD4+和CD8+应答的能力。为此，用100μg NS3(SEQ.ID.NO：1)免疫具有H-2b限制MHC分子的C57/B16小鼠。为了加强这一应答，一组小鼠接受单次免疫，另一组接受二次加强免疫。首先通过抗肽1629-1637(SEQ.ID.NO：7)IFN-γ的产生检测CD8+应答，该肽含有可被IH-2Db类MHC分子递呈的CD8+表位。由图3可以看出，在两组小鼠中均诱导了可检测的应答，尽管接受两次免疫(黑色方形)的动物组应答水平显著高于只接受一次免疫的动物组(白色方形)。由抗重组NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1)的产生检测CD4+应答，结果也显示两次免疫(黑色方形)的应答强于单次免疫(白色方形)。
实施例4
NS3蛋白与多聚(I:C)和抗-CD40一起诱导可识别表达HCV蛋白细胞的CD8+应答
为了研究使用NS3蛋白与多聚(I:C)和抗-CD40一起免疫是否可以诱导可能杀死被HCV感染的细胞应答，使用转染了可表达HCV蛋白的质粒的靶细胞(T1/HCVcon)体外模型。这些细胞表达属于I类MHC分子的相同肽，与被HCV感染的细胞表达的一样；因此，针对它们的任何应答可假定为针对后者的应答。图1-3的实验使用的NS3蛋白(SEQ.ID.NO：1)对应于一种与T1/HCVcon细胞中的病毒株不同的病毒株。这两种株系与目前为止所研究的CD8+表位有所不同。为了优化对T1/HCVcon细胞中CD8+表位的识别能力，在这一实验中使用NS3蛋白(SEQ.ID.NO：2)作为免疫原，其序列比T1/HCVcon细胞中的蛋白同源性更高。用100μgNS3免疫HHD小鼠六天之后，用T1/HCVcon细胞刺激小鼠脾细胞。在溶解活性检测中分析对T1/HCVcon细胞的识别能力。为此，将T1/HCVcon细胞和T1对照细胞与被刺激的脾细胞温育。如图4所示，用NS3免疫诱导的应答溶解表达HCV蛋白的T1细胞的能力(白色圆圈)比裂解T1对照细胞的能力(黑色圆圈)更强。
实施例5
多聚(I:C)和抗-CD40与NS3蛋白一起免疫诱导持续性T CD4+和CD8+应答
一种免疫方案必须具备的主要性质之一为诱导持续免疫应答，从而使免疫所带来的保护可以持续较长时间。为了研究抗-CD40和多聚(I:C)与NS3蛋白一起是否可以诱导该类应答，根据实施例1中描述的方案用100μg NS3蛋白免疫HDD小鼠。为了强化这一反应，15天之后在相同的条件下给动物进行加强免疫。二次免疫六天后处死动物并用不同抗原刺激它们的脾细胞以分析当时持续的CD8+和CD4+T应答。为了研究CD8+T应答，用表位1073刺激细胞并检测IFN-γ的产生和溶解活性。如图5A所示，二次免疫六天后，当用肽1073刺激经抗-CD40和多聚(I:C)与NS3蛋白一起免疫的小鼠脾细胞时可以产生大量的IFN-γ，但是不存在抗原则不可。而且，这些细胞可以溶解经肽1073刺激的靶细胞(黑色圆圈)而不能溶解不含有抗原的靶细胞(白色圆圈)(图5B)。最后，用免疫中使用的NS3蛋白作为抗原研究CD4+应答。图5显示这一免疫方案也可诱导强效持久并特异性识别NS3的CD4+应答。
                    序列表
                  SEQUENCE LISTING
<110>PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA S.L.
<120>IMMUNO-STIMULANT COMBINATION FOR PROPHYLAXIS AND TREATMENT OFHEPATITIS C
<130>05009
<160>7
<170>PatentIn Version 31
<210>SEQ.ID.NO.：1
<211>631
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>非结构性NS3蛋白
<400>1
Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys
1               5                   10                  15
Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu
            20                  25                  30
Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile
        35                  40                  45
Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Lys Thr Ile
    50                  55                  60
Ala Ser Ser Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln
65                  70                  75                  80
Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro
                85                  90                  95
Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp
            100                 105                 110
Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser
        115                 120                 125
Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu
    130                 135                 140
Cys Pro Ala Val His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr
145                 150                 155                 160
Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Gly Leu Glu
                165                 170                 175
Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Ser Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala
            180                 185                 190
Val Pro Gln Ser Tyr Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser
        195                 200                 205
Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys
    210                 215                 220
Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala
225                 230                 235                 240
Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Ile Ile Arg Thr Gly Val
                245                 250                 255
Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys
            260                 265                 270
Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile
        275                 280                 285
Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Asp
    290                 295                 300
Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Thr Val Leu
305                 310                 315                 320
Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile
                325                 330                 335
Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys
            340                 345                 350
Ala Ile Pro Leu Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys
        355                 360                 365
His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu
    370                 375                 380
Gly Val Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile
385                 390                 395                 400
Pro Ala Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr
                405                 410                 415
Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val
            420                 425                 430
Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr
        435                 440                 445
Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly Arg
    450                 455                 460
Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu
465                 470                 475                 480
Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp
                485                 490                 495
Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Arg
            500                 505                 510
Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu  Pro Val Cys Gln Asp His
       515                 520                 525
Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala
    530                 535                 540
His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly Glu Asn Leu Pro Tyr Leu
545                 550                 555                 560
Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro
                565                 570                 575
Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu
            580                 585                 590
His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu
        595                 600                 605
Ile Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser
    610                 615                 620
Ala Asp Leu Glu Val Val Thr
625                  630
<210>SEQ.ID.NO.：2
<211>635
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>非结构性NS3蛋白
<400>2
Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys
1               5                   10                  15
Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Asp Gly Glu
            20                  25                  30
Val Gln Val Leu Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val
        35                  40                  45
Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu
    50                  55                  60
Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln
65                  70                  75                  80
Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser Met Thr Pro
                85                  90                  95
Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp
            100                 105                 110
Val Val Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser
        115                 120                 125
Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu
    130                 135                 140
Cys Pro Ser Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr
145                 150                 155                 160
Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Ser Met Glu
                165                 170                 175
Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala
            180                 185                 190
Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser
        195                 200                 205
Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys
    210                 215                 220
Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala
225                 230                 235                 240
Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Glu Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val
                245                 250                 255
Arg Thr Ile Thr Thr Gly Gly Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Cys Lys
            260                 265                 270
Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile
        275                 280                 285
Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu Gly Ile Gly
    290                 295                 300
Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu
305                 310                 315                 320
Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Ile Thr Val Pro His Pro Asn Ile
                325                 330                 335
Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys
            340                 345                 350
Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile  Phe Cys
        355                 360                 365
His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Thr Gly Leu
    370                 375                 380
Gly Leu Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile
385                 390                 395                 400
ProThr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr
               405                 410                 415
Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val
            420                 425                 430
Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr
        435                 440                 445
Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ala Gln Arg Arg Gly Arg
    450                 455                 460
Thr Gly Arg Gly Arg Ser Gly Ile Tyr Arg Phe Val Thr Pro Gly Glu
465                 470                 475                 480
Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr Asp
                485                 490                 495
Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Ser Val Arg
            500                 505                 510
Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp His
        515                 520                 525
Leu Glu Phe Trp Glu Ser Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp Ala
    530                 535                 540
His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Leu Pro Tyr Leu
545                 550                 555                 560
Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro
                565                 570                 575
Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu
            580                 585                 590
His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu
        595                 600                 605
Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Ala Cys Met Ser
    610                 615                 620
Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val
625                 630                 635
<210>SEQ.ID.NO.：3
<211>528
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>得自丙型肝炎病毒NS2和NS3蛋白的嵌合重组蛋白
<400>3
Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Ala Ser Lys Gly
1               5                   10                  15
Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly
            20                  25                  30
Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln
        35                  40                  45
Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Pro Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu
    50                  55                  60
Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly
65                  70                  75                  80
Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Ser
                85                  90                  95
Asn Val Asp Lys Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg
           100                 105                 110
Ser Leu Ala Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Lys His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly
    130                 135                 140
Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Pro Leu Leu Cys Pro Val Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala
                165                 170                 175
Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Ala Asp Phe Ile Pro Val
            180                 185                 190
Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser
        195                 200                 205
Ser Pro Pro Val Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala
    210                 215                 220
Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala
225                 230                 235                 240
Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu
                245                 250                 255
Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile
            260                 265                 270
Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser
        275                 280                 285
Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Tyr
    290                 295                 300
Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile
305                 310                 315                 320
Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Gly Glu Thr Ala Gly Ala Lys
                325                 330                 335
Leu Val Val Phe Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro
            340                 345                 350
His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro
        355                 360                 365
Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His
    370                 375                 380
Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Arg Lys Cys Asp Glu Leu Ala Thr Lys
385                 390                 395                 400
Leu Val Ala Met Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp
                405                 410                 415
Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp
            420                 425                 430
Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys
        435                 440                 445
Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe
    450                 455                 460
Thr Ile Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln
465                 470                 475                 480
Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val
                485                 490                 495
Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys
            500                 505                 510
Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu
        515                 520                 525
<210>SEQ.ID.NO.：4
<211>10
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>对应于NS3病毒蛋白的表位1038-1047
<400>4
Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu
1               5                   10
<210>SEQ.ID.NO.：5
<211>9
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>对应于NS3病毒蛋白的表位1073-1081
<400>5
Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val
1               5
<210>SEQ.ID.NO.：6
<211>10
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>对应于病毒蛋白的表位1406-1415
<400>6
Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val
1               5                   10
<210>SEQ.ID.NO.：7
<211>9
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>7
Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu
1               5

Claims (16)

1.一种用于预防和治疗丙型肝炎的免疫刺激剂组合，其特征在于包括：
a)用作TLR3激动剂的多聚(I:C)，
b)CD40激动剂，其选自抗-CD40抗体和CD40L，及
c)包含丙型肝炎病毒NS3蛋白的多肽，或具有诱导CD8+和CD4+应答能力的所述NS3蛋白的片段。
2.权利要求1的免疫刺激剂组合，其特征在于所述CD40激动剂是抗-CD40抗体。
3.权利要求1的免疫刺激剂组合，其特征在于包括：
a)多聚(I:C)，
b)抗-CD40抗体，及
c)含有NS3蛋白的多肽。
4.权利要求3的免疫刺激剂组合，其中NS3蛋白由SEQ ID.NO：1或SEQ ID.NO：2组成。
5.权利要求1至4中任一项的免疫刺激剂组合，其特征在于所有组分形成单一药用组合物的一部分。
6.权利要求1至4中任一项的免疫刺激剂组合，其特征在于所有组分形成至少两种不同药用组合物的一部分。
7.权利要求1-6中任一项定义的免疫刺激剂组合在制备预防和治疗丙型肝炎的药物中的用途。
8.权利要求7的免疫刺激剂组合的用途，其特征在于所述药物包含至少两种适于同时给药的药用组合物。
9.权利要求7的免疫刺激剂组合的用途，其特征在于药用组合物适于在不同的时间给药。
10.权利要求7的免疫刺激剂组合的用途，其特征在于所述药用组合物适于通过不同给药途径给药。
11.一种药用组合物，含有权利要求1至4中任一项描述的免疫刺激剂组合，其特征在于每一种组分都以药学上可接受的量存在。
12.一种药盒，用于给予权利要求1至4中任一项描述的免疫刺激剂组合，其特征在于含有至少两种不同的药用组合物。
13.权利要求1至6中任一项定义的免疫刺激剂组合在制备对丙型肝炎病毒产生免疫应答的药物中的用途。
14.权利要求13的免疫刺激剂组合的用途，其特征在于所述药物用于预防性治疗。
15.权利要求13的免疫刺激剂组合的用途，其特征在于所述药物用于治疗性治疗。
16.一种对抗丙型肝炎病毒的疫苗，其特征在于包括权利要求1至6中任一项定义的免疫刺激剂组合。
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