KR19990022538A

KR19990022538A - X황체호르몬방출호르몬에대한향상된펩티드,면역원성조성물및백신또는의학용제제,동물을면역시키는방법,및황체호르몬방출호르몬 직렬반복펩티드의유사체및백신으로서이들의용도

Info

Publication number: KR19990022538A
Application number: KR1019970709019A
Authority: KR
Inventors: 로버트 한스 멜로엔; 헨드리카 베렌디나 온크
Original assignee: 스티칭 인스티튜트 부어 디에르하우데리 엔 디에르게존데이드
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1999-03-25
Also published as: DE69615026D1; KR100335320B1; BRPI9609411B8; BR9609411A; ATE205219T1; EP0832107A1; CA2221129C; WO1996040755A1; DK0832107T3; HU226293B1; HK1014963A1; MX9709669A; JP3959746B2; HUP0001431A3; DE69615026T2; AU710778B2; ES2163631T3; JP2002504886A; RU2147307C1; CA2221129A1

Abstract

본 발명은 직렬 단위를 구성하는 1 또는 2개의 LHRH 데카펩티드의 위치(6)에 있는 아미노산 글리신이 담체 화합물이 결합될 수 있는 측쇄를 포함하는 우선회 아미노산에 의해 치환되는 개조된 직렬 LHRH-펩티드 백신 제제에 관한 것이다. 또한, 직렬 LHRH는 GnRH(고나도트로핀 방출 호르몬)으로 언급되는 LHRH(황체 호르몬 방출 호르몬)에 대해 효과적인 백신을 제조하고, 면역학적 거세에 적합한 직렬-이량체 형태로 되어, 일반적으로 척추동물과 가축 동물과 특히 수컷에서 생식 기능을 억제하거나 영향을 주고 또는 행동에 영향을 미칠 수 있다.

Description

황체 호르몬을 방출시키는 호르몬에 대한 향상된 펩티드, 면역원성 조성물 및 백신 또는 의학용 제제, 동물을 면역시키는 방법, 및 황체 호르몬을 방출시키는 호르몬 직렬 반복 펩티드의 유사물 및 백신으로서 이들의 용도

LHRH는 시상하부에 있는 작은 10개의 아미노산의 긴 펩티드(데카펩티드)이다. LHRH의 아미노산 서열(대개는, 왼쪽은 아미노 말단 아미노산, 오른쪽은 카르복시 말단 아미노산)은 아미노산이 3개 문자 코드로 코딩된: pGlu-His-Trp-Ser- Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, 또는 #E H W S Y G L R P G@에 따르는 1개 문자 코드로 코딩된 식에 따르고, 여기서 #E는 파이로글루탐산이고 G@은 글리신 아미드이다.

LHRH는 혈액 내에서 생물학적으로 활성인 FSH(소포-자극 호르몬)와 LH(황체 호르몬)의 방출을 증가시키는 뇌하수체에서 작용하며, 또한 성장하는 수컷 동물에서 고환의 발달과 고환 스테로이드의 합성을 자극한다. 성장하는 암컷 동물에서는, 난소의 발달 및 그 속에 소포 발달, 난소 스테로이드의 합성 및 배란이 자극받는다.

LHRH가 담체 단백질에 결합되면 동물을 백신 접종하는데 사용될 수 있다는 것이 알려져 있다. 이러한 백신 접종은 LHRH의 본래 기능과 전적으로 관련되어 있는 다른 이유들로 실시될 수 있다. 알려져 있다시피, 혈액 내에서 LH와 FSH의 철저한 감소는, 수컷의 고환에서 고환 스테로이드 또는 안드로겐 및 정자의 생성을, 암컷의 난소에서는 난소 스테로이드 또는 프로게스타겐 및 에스트로겐과 소포 성숙의 형성을 억제한다. 거세를 통해 고환 또는 난소를 제거함으로써 얻어질 수 있는 정도와 비교될 정도로 혈액내에서 안드로겐, 프로게스타겐 및 에스트로겐의 양의 감소는, 동물을 LHRH에 대해 효과적으로 면역시킴으로써 얻어질 수 있다. 많은 경우에, 수컷 동물에서 고환은 천천히 발달하거나 전혀 발달되지 않고(안드로겐(남성 스테로이드 호르몬)이 합성되지 않고 정자가 형성되지 않음), 암컷 동물에서 난소통의 활성은 감소하게 된다(에스트로겐과 프로게스타겐(여성 스테로이드 호르몬)의 합성, 소포의 성숙과 배란이 억제된다).

수의학에서, LHRH에 대한 100% 효과적인 면역은 수컷 및 암컷 고양이와 개 등의 작은 가축 동물의 불임에, 또는 수컷 개와 황소의 공격성을 거세 또는 난소척제술 등의 심한 수술에 의하는 대신 간단히 백신 접종하여 치료하는 데 사용될 수 있다. LHRH에 대한 면역의 다른 가능한 이유는 개, 고양이 및 암소 등의 암컷 동물에서 발정을 방지하고, 도살용으로 살찌운 수컷 동물의 정력을 억제하는 것이다. 사람의 건강 문제에서, LHRH에 대한 면역이 전립선암과 유방암의 치료에 사용될 수 있고, 요구된다면, 몇몇 형태의 하수체암의 치료에 사용될 수 있다.

LHRH에 대한 백신의 다른 용도는 가축사육, 특히 도살용으로 돼지를 살찌우는 분야에서이다. 성적으로 성숙한 수퇘지(거세하지 않은 수퇘지) 고기는 특유의 냄새, 소위 거세하지 않은 수퇘지의 테인트(taint) 또는 거세하지 않은 수퇘지의 냄새를 갖는다.

성적으로 성숙한 돼지의 고환에는 동물의 지방 조직에 저장되는 많은 C19-△16 스테로이드가 형성된다(Patterson, J. Sci. Food Agric. 19, 31-38(1968); Brooks en Pearson, J. Anim. Sci. 62, 632-645(1986); Claus, Zeitschrift. Tierzuchtg. Zuchtungsbiol. 93, 38-47(1976); Claus,. Acta Endocrinol. (Copenh.) 91, Suppl. 225, 432-433(1979)). 이들 스테로이드는 대개는 고기가 가열될 때 불쾌한 뇨-비슷한 냄새를 형성시킨다(Fuchs, Swedish J. Agric. Res. 1, 233-237(1971); Bonneau, Livest. Prod. Sci. 9, 687-705(1982)). 이러한 불쾌한 냄새 때문에, 성적으로 숙성한 수컷 돼지의 고기는, 소비용으로 거의 적합하지 않고 수출용으로 부적합하다. 도살한 수컷 돼지의 약 10%는 도살 시점 이전에 이미 성적으로 숙성되어 있기 때문에, 이것은 잠재적으로 돼지 사육 산업에 막대한 손실을 일으킬 수 있다.

이러한 손실을 조절하고 방지하기 위해, 거의 모든 수컷 돼지 새끼는 이들이 어릴 때, 마취도 하지 않고 일반적으로 실시되는 수술로 거세된다. 이러한 거세라는 동물 비우호적 면을 떠나서, 거세는 또한 감염, 성장 저해를 유발하고 최종 육질은 손대지 않은 동물(최소한 손대지 않은 동물이 성장된 아직 거세되지 않은 수퇘지의 테인트를 갖지 않는 한)의 육질보다 못하게 된다(Walstra, Livest. Prod.Sci. 1, 187-96(1974)).

좋은 육질과 함께 동물 우호적인 다른 방법은 LHRH에 대한 면역에 의해 어린 동물의 하수체에서 LHRH 농도를 감소시키는 것으로 이루어진다. LHRH 농도의 감소는 생물학적으로 활성인 FSH와 LH의 농도의 감소를 유발하고, 또한 성장하는 동물의 고환의 발달을 억제하고 고환 스테로이드중 C19-△16 스테로이드의 합성을 저해할 것이다. 동물에게 비우호적인 거세는 불필요해진다: 확실히 최종 육질이 적어도 거세후 만큼은 되면서 감염과 성장 억제가 방지된다. 또한 이 방법은 도살 시점 전에 수퇘지에서 거세하지 않은 수퇘지의 테인트 발생을 방지한다.

그러나, 거세하지 않은 수퇘지의 테인트에 대한 우수한 백신의 엄격한 요구조건은 모든 돼지에서 고환의 발달이, 심지어는 매우 많은 수의 돼지에서 시험될 때에도 도살 시점 전에 어떠한 경우에도 거세하지 않은 수퇘지의 테인트가 발생하지 않는 정도로 지체되는 것이다.

LHRH에 대한 백신의 항-생식 특성에 대한 존재하는 문헌과 이전의 특허출원에서, 백신 접종의 결과는 종종 다양하게 나타나며, 예를 들면, 몇몇 백신 접종된 동물은 거의 백신 접종에 반응하지 않고, 또는 바람직한 효과를 위해 상업적으로 허용할 수 없는 다량의 보조액이 필요하다(Chaffaux et al., Recueil de Medicine Veterinaire 161(2), 133-145(1985); Caraty et al., C.R. Acad. Sc. Paris, t.303, Serie III, No. 16, 673-676(1986); Falvo et al., J. Anim. Sci. 63,986-994(1986); Goubau et al., Domest. Anim. Endocrinol. 6, 339-347(1989a); Goubau et al., Theriogenology 32, 557-567(1989b); Hoskinson et al, Austr. J. Biotech. 4, 166-170(1990); Bonneau et al., J. Anim. Sci. 72, 14-20(1994); U.S. 특허 4,608,251; 국제 특허출원 WO 88/05308). 문헌의 데이터에 따르면, 거세하지 않은 수퇘지의 냄새 문제를 완전히 방지하기 위해 충분히 초기 단계에서, LHRH에 대한 백신 접종을 사용하여, 각각 개별적으로 면역된 돼지에서 고환 발달을 억제하는 것은 불가능하다. 성공할 퍼센트는 20 내지 80%이다. 이것은 불충분하고 사육현장에서 현재의 LHRH-백신을 쓸모없게 한다.

이러한 형태의 백신을 제조하는데 있어 어려움은 대개는 내성 현상에 의해 유발된다. 호르몬 등의 자체 물질은 인식되지 않지만 면역 시스템에 의해 확실하게 내성이 된다. 보통은 자체 물질에 대해 유도된 항체는 없다. 따라서, 성공적인 백신은 상기 호르몬과 충분히 비슷한 물질을 사용하지만, 동시에 항체의 생성을 유도하기 위해 충분히 이질인 것이 필요하다. 이들은 상호 배타적인 상태에 있기 때문에, 최근까지는 이러한 물질이 모두 준비될 수 있다 할지라도, 확실하지 않았다. LHRH-유사 펩티드 백신을 제조하기 위한 한가지 시도는 LHRH 데카펩티드의 위치 6에서 Gly를 우선회(右旋回) 아미노산으로 교체하는 것으로 이루어졌다(D-Tryp; Chaffaux et al., Recueil de Medicine Veterinaire 161(2), 133-145, 1985). 그러나, 이 개조된 LHRH-펩티드를 함유하는 백신 제제는 보통의 LHRH 데카펩티드보다 효능이 훨씬 덜하다는 것이 밝혀졌다(EP 0 464 124).

그러나, 최근, 본 발명자들은 LHRH에 대해 백신 접종된 모든 개체에서 효과적인 항체 반응을 유도하는 것이 명백히 가능하다는 것을 밝혀 내었다(Meloen et al., Vaccine 12, 741-746(1994)). 이들 실험에서 돼지는 LHRH 백신의 표준 형태로부터 나온 LHRH 백신(프로인트 보조액 내에서 담체 단백질에 결합된 LHRH), 즉 직렬-LHRH 백신(유럽특허 제0464124호)으로 2번 접종하였다. 직렬-LHRH 백신의 발명에 따르면, 일반식(왼쪽은 아미노 말단 아미노산, 오른쪽은 카르복시 말단 아미노산)Z¹-Glx-His-Trp¹-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-X-Gln-His-Trp²-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]_n-Gly-Z²에 따라 직렬로 2 이상의 LHRH 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩티드가 바람직하며, 여기서, 아미노산은 3개의 문자 코드에 따라 표시되고, Trp¹과 Trp²는 트립토판(Trp) 또는 포르밀화 트립토판(N_(인돌)-포르밀-트립토판)이며, n은 1 이상의 값을 갖는 수이고, X는 아미노산 Gly와 Gln 간의 직접 결합 또는 간격을 띄기 위한 그룹이며, Z¹-Glx는 1 이상의 추가의 아미노산으로 이루어진 테일이 부착되어 있는 pGlu(파이로글루탐산) 또는 Gln이고, Gly-Z²는 1 이상의 추가의 아미노산으로 이루어진 테일이 부착되어 있는 Gly-NH₂또는 Gly이다. 상기 일반식에서, X는 아미노산 글리신과 글루타민 간의 직접적인 결합일 수 있는데, 즉, 이들 아미노산은 중간 고리(보통의 펩티드 결합을 통해)없이 직접 연결된다. 직렬-LHRH 백신 발명은 또한 LHRH 서열이 간격자를 통해 상호 연결된 펩티드로 이루어진다. 간격을 띄우기 위한 그룹의 성질은 더 짧은 또는 더긴 탄화수소 사슬과 다른 화합물 그룹 또는 분자로 1 이상의 아미노산과 대단히 다를수 있다. 상기 일반식에서, Z¹-Glx는 바람직하기로는 pGlu(파이로글루탐산)이지만, 예를 들면, 담체 단백질에 펩티드가 결합되는데 사용되기 위해, 1 이상의 추가의 아미노산으로 이루어진 테일이 부착된 Gln 일수도 있다. 상기 일반식에서, Gly-Z²는, Gly-NH₂또는, 예를 들면 담체 단백질에 펩티드가 결합되는데 사용되기 위해, 1 이상의 추가의 아미노산으로 이루어진 테일이 부착된 Gly이다. 바람직하기로는, Gly-Z²는 담체 단백질에 펩티드의 가능한 결합과 관련하여 C 말단 시스테인이 첨가된 Gly-Cys-NH₂이다.

좀 더 상세히는, 직렬-LHRH 백신 발명은 일반식(왼쪽은 아미노 말단 아미노산, 오른쪽은 카르복시 말단 아미노산) pGlu-His-Trp¹-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro [-Gly-Gln-His-Trp²-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]_n-Gly-Cys-NH₂에 따라 직렬로 2 이상의 LHRH 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩티드를 제공하며, 여기서, 아미노산은 3개의 문자 코드에 따라 표시되고, Trp¹과 Trp²는 Trp 또는 N-포르밀-Trp이며, n은 1 이상의 값을 갖는 수이다.

상기 직렬-LHRH 백신은 고환 성장과 고환에서 스테로이드-생성(라이디히) 세포의 발달을 완전히 억제하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이 백신은 사용시 덜 현실적이게 하는 많은 단점을 갖고 있다. 한가지 단점은 성공적인 면역거세를 위해 백신 접종시 적용되는 투여량이 높아야 하고, 원하는 반응을 유도하기 위해 돼지에 대해 1㎎ 이상이 필요하며, 이것은 돼지 산업에서 대량으로 백신을 사용하는 데에 비용이 많이들게 한다.

상기 백신 제제의 다른 중요한 단점은 이 백신이 완전 프로인트 보조액과의 조성물에서만 꽤 효과적이라는 것이다. 이러한 거친 보조액의 사용은 그 비스코스 성질로 인해 조제와 적용이 어려운 많은 원치않는 부작용을 유도한다. 또한 적용자체가 동물에게 매우 고통스러울수 있고, 보조액의 잔류물과 주사 부위에서 근육의 보조액 관련 농양 등의 보조액에 대한 만성 염증 반응의 가능한 발달이 주사된 동물의 육질을 저하시킬 수 있다.

본 발명은 황체 호르몬을 방출시키는 호르몬(LHRH, 고나도트로핀 방출 호르몬, GnRH로도 언급됨)에 대해 효과적인 백신을 제조하는데 적합한 펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 펩티드를 기본으로한 면역원성 조성물 및 백신 또는 의학용 제제(백신 및 제약) 및 LHRH에 대해 포유동물을 면역시켜 그 포유 동물의 생식 또는 행동 특성에 영향을 미치는 방법 및 돼지의 육질을 향상시키는 방법에 이러한 백신 또는 의학용 제제를 사용하는 것에 관한 것이다.

그러나, 본 발명은, LHRH에 대해 작용하는 다른 존재하는 백신과 비교하여, 직렬-LHRH 펩티드의 효과적인 백신 접종의 이익이 되는 장점을 잃지 않으면서, 직렬-LHRH 펩티드 제제로 LHRH에 대한 상기 기재된 백신 예방의 바람직하지 못한 부작용에 대한 해법을 제공한다.

담체 단백질 KLH 없이 완전 프로인트 보조액과 직렬-LHRH 백신의 단량체(monomer) 형태는, 돼지에서 고환 성장과 거세하지 않은 수퇘지의 냄새를 억제하는 데 완전히 효과적이며, 완전 프로인트 보조액 대신에 완화된 불완전 프로인트 보조액을 사용한 직렬-LHRH 백신의 이량체(dimer) 형태는 꽤 높은 효능을 나타낸다고 밝혀졌다. 놀랍게도, 데카펩티드의 6번째 아미노산 Gly가 우선회(D-) 아미노산, D-Lys로 치환된 후, 생성된 펩티드가 보통의 담체 화합물에 결합된(여기서, 오발부민이 사용되었다) LHRH 분자의 변종에 적용된 직렬-성분이 몇몇 완화 보조액, 즉 스페콜(Specol)과 이중유유제(double oil emulsion)에 매우 효과적이고, 또한 적은 투여량에서 효과적인 백신을 생성시킨다는 것이 밝혀졌다. 따라서, D-아미노산으로 본래의 그리고 단일 LHRH 데카펩티드의 위치 6에서 Gly의 D-아미노산 치환을 사용한 백신이 본래의 LHRH 서열과 비교하여 면역원성을 감소시키는 반면, 직렬-LHRH 백신에 적용된 D-아미노산과의 이러한 치환은 훨씬 많은 면역원성 LHRH 백신 제제를 생성시킬 수 있었다. 또한 직렬 단위를 구성하는 하나 또는 각각의 LHRH 데카펩티드의 위치 6에서 Gly를 다른 우선회 아미노산으로 치환하는 것은 백신을 입증하지 못하게 할 수 있다고 예상될 수 있다. 또한, 예를 들면, 치환 아미노산으로 D-Lys를 사용할 때, 이것은 담체 화합물에 펩티드 조성물이 결합되는 가능성을 잃지 않으면서 직렬 펩티드의 이량중합(dimerisation) 또는 다량중합(multimerisation)을 가능하게 해준다. C-말단 시스테인이 시스틴 결합 형성을 통해 이량중합에 활용되어 더 이상 담체 화합물에 결합될 수 없다고 할지라도, 아미노산 치환의 측쇄는 여전히 담체 화합물에 결합하는데 사용될 수 있다. 물론, 적당한 측쇄(D-Glu 등, 그러나 다른 가능한 치환 아미노산을 운반하는 적당한 측쇄가 또한 보통의 기술자에게 알려져 있다)을 함유하는 다른 아미노산으로의 치환은 또한 담체 화합물에 추가의 결합 가능성을 제공해줄 것이다.

[D-Lys⁶]-LHRH가 과도활성 LHRH 동근(動筋)(Seprodi et al., J. Med. Chem. 21, 276-280 (1978))으로서, LHRH-방사선면역에 사용된 다른것들 중(Heber en Odell, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 158, 643-646(1978)), LHRH-수용기 연구에서 형광 리간드로서 기재되었고(Conn et al., J. Biol. Chem. 256, 1098-1100(1981); Naor et al., J. Biol. Chem. 256, 3049-3052(1981); Childs et al., Peptides 4, 549-555(1983)), 암 성장을 저지하기 위해 세포독소 래디칼에 결합된다. [D-Lys⁶]-LHRH는 LHRH-백신으로서 이전에 사용되지 않았었다.

본 발명은 본래의 LHRH 데카펩티드 서열의 6번째 아미노산 Gly가 D-아미노산으로 치환된 직렬의 2 이상의 LHRH 서열로 이루어진 펩티드 또는 펩티드 조성물에 관한 것이다. 위치 6에서 Gly는, LHRH 직렬 단위가 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 추가로 포함하는 기능 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 이 펩티드는 사용되는 펩티드 합성 기술에 따라, C-말단으로 아미노화되거나 되지 않을 수 있다. 또한, 이 펩티드는 이량중합 또는 다량중합될 수 있고, 이어서 이량체 또는 다량체에서 1 이상의 직렬-LHRH 펩티드 서열이 본래의 LHRH 데카펩티드의 위치 6에서 기능 아미노산 치환을 포함할 것이다.

본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 조성물은 다음 일반식에 따라 표현될 수 있는 연속 서열을 포함한다:

1 6 16 21

#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC

상기에서, *는 Gly를 LHRH 직렬 단위가 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 추가로 포함하는 우선회 아미노산으로 치환될 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 첫 번째 특징은, 이 펩티드 또는 펩티드 조성물에서 직렬 단위 내에서 LHRH 데카펩티드에 대해 6번째 아미노산, Gly가 치환될 수 있는 가능한 교체 아미노산 또는 아미노산(따라서 상기 일반식의 위치 6 및/또는 16)이, 예를 들면 적합한 면역원성을 잃지 않으면서 면역 시스템에 의해 인식되는 보통의 LHRH 서열과 충분히 다른 펩티드를 발생시키는 D-아미노산에 의해 치환된다는 것이다.

또한, 본 발명의 두 번째 특징은, 개개의 직렬 단위가, 담체 화합물 단백질에 펩티드 또는 펩티드 조성물이 결합되는 가능성을 잃지 않으면서 그 면역원성을 더 향상시키기 위해 이량중합되는 것이다. 이 펩티드 또는 펩티드 조성물에서 이러한 직렬 단위의 이량중합은, 예를 들면 카르복실-종점 또는 아미노-종점을 통해 발생될 수 있고, 2개의 직렬 단위는 예를 들면 시스틴 또는 티오에테르 결합에 의해 이량중합될 수 있다. 이 목적을 위해 위치 21에서 Cys가 사용될 수 있고, 또는 위치 1에서 글루탐산 전에 Cys가 합성될 수 있지만, LHRH-직렬 단위를 이량중합 또는 다량중합하기 위한 다른 방법은 또한 종래 기술에서 발견될 수 있다. 이량중합 또는 다량중합이 담체 화합물이 결합될 수 있는 접근 가능한 부위의 손실을 초래하는 경우에, 위치 6 및/또는 16에서 Gly를 교체하는 D-아미노산의 선택은 적당한 측쇄를 갖는 아미노산으로 제한하는 것으로 충분하다. 이러한 교체 아미노산은 예를 들면 D-Lys, D-Glu 또는 담체 화합물에 결합시켜주는 측쇄를 포함하는 다른 우선회 아미노산일 수 있다.

좀 더 상세히는, 본 발명에 따른 이러한 바람직한 펩티드의 구체적인 예는, 다음 식에 따른 D-Lys⁶-직렬-LHRH 이량체이다.

본 발명에 따른 이러한 바람직한 펩티드의 다른 구체적인 예는, 다음 식에 따른 D-Glu⁶-직렬-LHRH 이량체이다.

그러나, 위치 6 및/또는 16 및/또는(이량체 형태에 대한 마지막 2개의 예에서 처럼) 위치 27 및/또는 37에서 D-아미노산 치환을 포함하는 이량중합 또는 다량중합된 LHRH 직렬 단위가 있는 다른 펩티드 또는 펩티드 조성물은 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명은 또한 면역원성 형태가 되는 펩티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 숙련된 기술자들이 알다시피, 그 자체는 면역원성이 아니지만 면역원 형태로 되는 물질을 발생시키는 다른 방법들이 있다. 첫 번째 가능성은 본 발명에 따른 펩티드를 적당한 담체 단백질에 결합시키는 것이다. 직렬 펩티드에서, N- 또는 C-종점에서의 시스테인은 화학 결합을 위해 적당하게 사용될 수 있다. 직렬-이량체 펩티드에서, 결합은 D-라이신, D-글루타민, 또는 위치 6 및/또는 16 및/또는 27 및/또는 37에서 글리신을 대체한 어떠한 다른 개조된 아미노산의 평면 측쇄 또는 개조된 측쇄를 사용하여 실시될 수 있다. 이 기술에서 숙련된 자들은 어떠한 결합 방법과 어떠한 담체 프로테인이 적당한지를 잘 알고 있다. 본 발명에 따라 오발부민 등의 단백질의 면역원성 포합체, 및 본 발명에 따른 펩티드 또는 펩티드 조성물로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물이 바람직하다. 물론, 본 발명에 따른 백신 제제는 1 이상의 면역 보조액과 결합될 수 있다. 적당한 면역 보조액은 이 기술의 숙련자들에게 알려져 있다. 본 발명에 따른 바람직한 보조액은 스페콜 또는 이중유유제일 수 있지만, 부반응을 유도하지 않거나 완화된 부반응만을 유도하는 다른 보조액이 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 넓은 범위의 척추동물, 좀 더 상세하게는 포유동물에서 선택된 개체를 LHRH에 대해 면역시키기 위한 방법에 사용될 수 있다. LHRH에 대한 면역법은 예를 들면 수컷과 암컷 고양이와 개 등의 작은 가축 동물의 불임, 또는 수컷 개와 황소의 공격성 치료에 사용될 수 있다. LHRH에 대한 면역의 다른 가능한 이유는 개, 고양이 및 암소 등의 암컷 동물에서 발정을 방지하고, 도살용으로 살찌운 수컷 동물의 정력을 억제하는 것이다. 사람의 건강 문제에서, LHRH에 대한 면역이 전립선암과 유방암의 치료에 사용될 수 있고, 요구된다면, 몇몇 형태의 하수체암의 치료에 사용될 수 있다.

바람직한 구현예는 본 발명에 따른 이러한 백신 제제로 백신 접종된 돼지의 육질을 향상시키는 방법이다. 본 발명은 다음의 실험 부분에서 예시된다.

거세하지 않은 수퇘지의 성공적인 거세는 도살시 고환 중량이 150g 미만으로 정의된다. 이 목표는 치료 그룹 내의 모든 동물에 있어 현저히 작은 고환이다. 고환 중량은 테스토스테론과 거세하지 않은 수퇘지의 테인트 스테로이드의 생성에 직접적으로 관련된 것으로 여겨진다. 고환 중량이 60g 미만일 때 고환은 조직학적으로 완전히 불활성이고(Meloen et al., Vaccine 12, 741-746(1994)) 혈청에서 테스토스테론이 감지될 수 없다. 본 발명자들은 고환의 크기, 특히 중량과 등 부분의 지방에서의 안드로스테논의 농도 간에 뚜렷한 상관관계가 존재한다는 것을 밝혔다(Oonk et al., Livest. Prod. Sci. 42, 63-71(1995)). 중량이 150g 미만인 면역된 동물의 고환이 거세하지 않은 수퇘지의 테인트가 존재하지 않는데 대한 명확한 지표가 되는 것으로 여겨진다. 등 부분의 지방에서의 안드로스테논이, 항상 등부분 지방 1g에 대해 0.5㎍ 미만으로 존재한다 할지라도, 대개는 감지되지 않을 만큼 저농도로 존재한다. 문헌에서 이 값은, 비록 다른 문헌은 충분히 낮은 농도로서 등부분 지방 1g에 대해 1㎍로 보고될 지라도, 거세하지 않은 수퇘지의 테인트를 인식할 수 있는 안전한 하한선으로 언급된다. 본 발명자들은 가장 낮은 값을 하한선으로 간주하여, 이 아래를 성공적으로 면역거세된 돼지로 간주한다. 이 관계는 100 이상의 돼지를 측정한 것이다. 실험에서 대조 동물의 고환 중량은 200 내지 350g 내에 있다고 밝혀졌다. 최종적으로 주입 변환과 고기/지방 비는 거세한 수퇘지(어렸을 때 수술로 거세한)와 비교하여 면역거세가 향상됨이 밝혀졌다.

방법:

펩티드 합성은 약 60분 동안의 사이클 타임으로 0.25mmole 스케일로 FastMoc 사이클을 사용하여 ABI 430A 펩티드 합성자에 대해 실시하였다(자동화 Fmoc 고체상 펩티드 합성을 위한 Fields CG, Lloyd DH, Macdonald RL, Otteson KM, Noble RL HBTU 활성. Peptide Research 4, 95-101(1991); User Bulletin #32, Applied Biosystems(1990)).

펩티드 정제: 정제는 델타-팩(Delta-Pak) C18(15㎛, 100A) 물질과 보호 칼럼으로 채워진 와터스 프렙팩 카트리지(25㎜×100㎜)가 장착된 와터스 프렙LC4000 시스템을 사용하여 실시하였다.

HPLC 분석을 위해, 본 발명자들은 2개의 와터스 펌프 모델 510, 와터스 그레디언트 콘트롤러 모델 680, 와터스 자동주입기 모델 WISP 712, 및 와터스 포토다이오드 어레이 감지기 모델 991을 사용하였다. 생성물은 215nm에서 1㎖/분으로 와터스 델타 팩 C18-100A(3.9×150㎜, 5㎛) 칼럼에 대해 60분에서 0.1% TFA가 있는 물 대 0.1% TFA가 있는 물 내의 60% 아세토니트릴의 직선 기울기로 분석하였다. 모든 생성물은 피크 표면에 따라 순도 95%이었다.

아미노산 분석은 와터스 피코택 시스템으로 실시하였다. 생성물은 아미노산 서열에 따라 예상된 값과 일치하였다.

이량중합 방법: 생성물은 생성물을 물 내의 20% 다이메틸설폭사이드로 용해함으로써 이량중합되었다. pH는 1% 또는 2% NH₄HCO₃로 조절되어야 한다. 용액은 깨끗하게 있어야 한다. 너무 높은 pH는 1 내지 10% 아세트산으로 중화될 수 있다. 5시간 이상 실온에서 교반하였다. 생성물을 HPLC를 사용하여 직접 정제하였다.

D-Lys⁶-직렬-이량체의 오발부민에 대한 결합: {사용되는 무게 등량: 오발부민 1㎎과 D-Lys⁶-직렬-이량체 1㎎을 밀리큐(milliQ)-물 내의 ECDI 10㎎을 사용하여 결합시켰다}. 우선, 펩티드와 오발부민을 밀리큐-물에 용해하였다(A=펩티드 용액; B=오발부민 용액). A와 B를 잘 혼합하였다. 이어서, 무게 등가에 기초하여 10배 과량으로 카르보디이미드(ECDI)를 밀리큐 물에 용해하였다(C=ECDI 용액). 이어서 계속적으로 교반하면서 C를 A+B 용액에 천천히 첨가하였다. 6시간 후 생성물을 물에대해 투석하였다(MW cut-off 10,000).

로딩 결정: 로딩은 펩티드와 담체 단백질 결합과 분리의 아미노산 비교 분석으로부터 계산하였다. 아미노산 분석에 따라 결합체는 오발부민 ㎎에 대해 0.5㎎ 펩티드를 함유한다.

백신 제제: 백신은 펩티드를 보조액과 혼합함으로써 제조하였다(스페콜에서 세부사항 참조).

시험된 보조액은 완전 프로인트 보조액(CFA), 불완전 프로인트 보조액(IFA), 스페콜 오일, 및 이중유유제(d.o.e.)이었다.

-CFA 또는 IFA는 펩티드 용액 대 안정한 에멀젼 1:1로 혼합하였다.

-이중유유제(W/O/W):

10부 제 1 수층 : PBS(포스페이트 완충된 염수) 내의 항원

11부 오일층 : 10% 만니드 모노올레이트(아라셀)가 있는 마르콜 52(Esso)

10부 제 2 수층 : 2% 몬타녹스 80(=트윈 80)이 있는 PBS

-스페콜(특수 오일층)은 연구 목적을 위해 유중수유제의 생성에 적합한 물질이다.

조성물: 10㎖에 대해: 0.453g 트윈85(ICI), 0.532g 스팬85(ICI), 9㎖ 마르콜 52(Esso Belgium).

스페콜에서 에멀젼의 제조: 울트라터랙스(ultraturrax)(볼택싱이 매우 적당하다)로 강하게 혼합하면서 오일층(스페콜)에 수층을 매우 천천히 첨가하면서 항원을 함유하는 물층 4부와 5부 스페콜(v/v)을 혼합하였다. 공기의 도입은 가능한한 많이 방지하였다. 세척제가 남지않은 깨끗한 유리그릇을 사용하였다. 저장: 스페콜은 바람직하기로는 4 내지 8℃에서 저장된다(참고: B.A. Bokhout et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 2, 491-500(1981); W. Hall et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 22, 175-186(1989); W.J.A. Boersma et al., Res. Immunol. 143, 503-511(1992)).

백신 접종 프로토콜: 각 백신에 대해, 그리고 동물에 대해, 상기 기재된 대로 제조된, 펩티드 1㎎(로딩으로부터 계산한 바와 같이), 또는 지시된 바대로 더 적은 양을 포스페이트 완충된 염수(PBS) 1㎖에 용해하고 지시된 보조액으로 유화하였다. 손대지 않은 수퇘지는 실험 시작시 첫 번째 백신 접종을 받았을 때 약 10주 정도된 것이었다. 첫 번째 백신 접종 후 8주에 투여된 부스터는 동일한 조성물을 가졌다.

평가: 돼지 고환의 크기는 캘리퍼스를 사용하여 외부적으로 측정하였다. 첫 번째 백신 접종 후 약 12주로부터 고환의 크기는 LHRH의 농도가 낮춰지고 돼지에서 더 증가(또는 심지어는 감소)하지 않았다. 항-LHRH-역가와 테스토스테론의 결정을 위해 혈청 샘플을 취하였다. GnRH에 대한 항체는¹²⁵LHRH에 대한 돼지 항혈청의 연속 희석의 결합에 의해 결정하였다. 동물은 첫 번째 백신 접종 16주 후 도살하였다. 도살 후, 고환의 무게를 재고, ELISA(Ridascreen)를 사용하여 거세하지 않은 수퇘지의 테인트 스테로이드 안드로스테논을 결정하기 위해 등 부분의 지방 샘플을 취하였다. 또한 육질을 결정하였다.

실험 1

이 실험에서 다른 펩티드 구조가 결합되지 않은 형태로 실험되었다. 각 펩티드는 보조액으로 IFA를 사용하여 1㎎의 양으로 10주와 18주 나이에서 2번 투여하였다. 시험된 구조는 카르복시-말단 이량중합된 LHRH-단량체, 카르복시-말단 이량중합된 LHRH-직렬, 아미노-말단 이량중합된 LHRH-직렬, 카르복시-말단 이량중합된 [D-Nal(2)⁶]-LHRH(Nafarelin^R)-단량체, 카르복시-말단 이량중합 [D-Nal(2)⁶]-LHRH (Nafarelin^R)-직렬, 카르복시-말단 이량중합 [D-Lys⁶]-LHRH-단량체 및 카르복시-말단 이량중합 [D-Lys⁶]-LHRH-직렬이다.

1) C-단량체-LHRH-이량체의 펩티드 식 :

그룹 2, 3과 7에서, 70 내지 80%의 동물이 성공적으로 면역거세되었음이 밝혀졌다. 이들 반응 동물에서 가장높게 측정된 고환 중량은 86g 이었지만, 비반응 동물의 고환 중량은 193g 또는 그보다 더 높았다. 이들 결과로부터 결합되지 않은 펩티드와의 제조법에서 완전 프로인트 보조액을 불완전 프로인트 보조액으로 교체하는 것이 효율의 손실을 초래하는 것이 밝혀졌다. 또한, 첫째로 직렬 성분이 백신의 활성에 필수적이며, 둘째로, 이량중합이 카르복시 또는 아미노말단을 통해 발생할 수 있고, 셋째로, 모든 아미노산 치환이 허용되는 것은 아니라는 것이, 백신으로서 Nafarelin^R-유사물의 비효율성의 관점에서 특히 밝혀졌다.

실험 2

첫 번째 백신 접종에 대해서는 CFA 내에서 그리고 두 번째 백신 접종에 대해서는 IFA 내에서 키홀 림핏 헤모시아닌(KLH)에 결합된 직렬-LHRH 펩티드에 기초한 이미 알려진 성공적인 백신을 담체 단백질에 결합시키지 않고, 단일 및 이량체 형태로, CFA/IFA 및 2xIFA 내에서, 1㎎과 100㎍의 양으로 시험하였다. 10주 및 18주된 돼지를 2번 백신 접종하였다.

1) 직렬-LHRH의 펩티드 식 :

1 21

pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC

2) 직렬-LHRH-이량체의 펩티드 식 :

단일 또는 이량체 형태의 직렬-LHRH 백신은, 돼지에서 고환 성장과 거세하지 않은 수퇘지 테인트를 억제하는 데 담체 단백질 KLH가 완전히 존재하지 않는데도, 실질적으로 완전히 효과적임이 밝혀졌다. 그러나, 이 백신의 중요한 단점은 매우 높은 효과가 단지 완전 프로인트 보조액과의 조성물이면서 높은 투여량일 때만이 달성된다는 것이다. 또한, 적당한 항-LHRH Ab 역가(백신접종후 8주에서 취해진 혈정의 % 결합으로 표현됨)는 1㎎의 복용량으로 CFA/IFA 내에서 직렬-LHRH 또는 직렬-LHRH 이량체와만 달성되었다.

실험 3

담체 단백질에의 결합체의 효과는 IFA를 완화된 보조액 스페콜과 이중유유제(d.o.e.)로 교체하여 조합하여 시험하였다. 글리신이 위치 6, 16, 27과 37에서 D-라이신으로 교체된 이량중합 직렬-LHRH-펩티드를 오발부민에 결합시키고 2개의 다른 보조액, 스페콜과 이중유유제 내에서 유화시켰다. 돼지를 보조액 내의 1㎎ 펩티드 포합체로, 10주와 18주 되었을 때 2번 백신 접종하였다. 결합 효율은 50%이므로, 실제로 투여된 항원의 양은 500㎍이다.

[D-Lys⁶]-직렬-LHRH-이량체의 펩티드 식 :

항원 고환 중량이 150g인 고환 중량

돼지의 수/그룹 크기 (평균±표준편차)

1) 스페콜에서[D-Lys⁶]-직렬- 9/9 19±12

LHRH-이량체-ova

2) d.o.e.에서[D-Lys⁶]-직렬- 8/8 43±46

LHRH-이량체-ova

통상 사용되는 담체 단백질에의 포합체는, 매우 완화된 보조액이 사용될 때에라도, 백신의 효능을 매우 향상시킨다.

실험 4

이어서 많은 실험에서, 본 발명자들은 투여량이 어느 정도로 낮춰질 수 있는 지를 시험하였다. 펩티드 항원은 [D-Lys⁶]-직렬-LHRH-이량체이었다. 이것을 오발부민에 결합시키고 결합체를 보조액 스페콜의 에멀젼으로 투여하였다. 돼지를 10주와 18주 되었을 때 2번 백신 접종하였다.

스페콜 내의 [D-Lys⁶]-직렬-LHRH-이량체-오발부민 포합체를 사용하여 필요한 백신 투여량의 현저한 감소가 얻어질 수 있다. 125㎍ 포합체(=62.5㎍ 펩티드)로 백신 접종된 43번 돼지에서 효율은 100% 이었다. 고환이 150g보다 더 작은 돼지의 등부분의 지방에서 어느 경우에도 등 부분의 지방 1g에 대해 안드로스테논이 0.5㎍을 넘지 않았다(Oonk et al., Livest. Prod. Sci. 42, 63-71(1995));

대부분의 경우에, 안드로스테논 농도는 ELISA에서 감지되는 농도이하였다(0.111㎍/g 등부분의 지방). 10 내지 100㎍ 포합체의 복용량으로 비반응 동물에 대한 증가되는 위험이 있고, 10㎍ 미만의 복용량은 효과적이지 않다. 항-LHRH 항체 역가는 실험 내에서만 비교된다. 결과는 직렬-LHRH 또는 직렬-LHRH-이량체를 사용하여 얻어진 결과와 대조적인 낮은 투여량의 백신이 높은 투여량과 같은 비슷한 역가를 유도해낼 수 있다는 것을 명백히 밝혀준다. 실험내에서, 낮은 평균 역가와 큰 표준 편차는 백신에 대해 완전히 반응하지 않거나 비반응인 돼지로부터 발생한다.

실험 5

손대지 않은 거세하지 않은 수퇘지의 대조군에서 고환 중량과 안드로스테논을 결정하였다.

수 고환 중량 안드로스테논

(평균±표준편차) (㎍/g 등부분 지방)

1. 10 217±38 0.68±0.42

2. 6 233±41 2.04±1.55

3. 5 231±58 2.05±0.70

(Oonk et al., Livest. Prod. Sci. 42, 63-71(1995)).에서 보고된 바와 같이, 안드로스테논 농도는 손대지 않은 다자란 수컷 돼지 개체에서 심하게 변한다.

Claims

LHRH 데카펩티드를 구성하는 1 이상의 위치 6에서 아미노산 글리신이 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 갖는 우선회 아미노산으로 교체된, 2 이상의 인접한 LHRH 데카펩티드 서열로 이루어진 펩티드.
제 1항에 있어서, 다음 구조로 이루어진 아미노산 서열로된 것을 특징으로 하는 펩티드.

1 6 16 21

#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC

상기에서, 위치 6 또는 16에서 아미노산 *는 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 갖는 우선회 아미노산이며, 다른 아미노산 *는 글리신 또는 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 갖는 우선회 아미노산이다.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 이량중합 또는 다량중합된 펩티드.
제 3항에 있어서, 다음 구조로 이루어진 펩티드.

상기에서, 위치 6 또는 16 또는 27 또는 37에서 아미노산 *은 D-라이신 또는 D-글루타민 또는 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 갖는 다른 우선회 아미노산이며, 다른 아미노산 *는 글리신 또는 D-라이신 또는 D-글루타민 또는 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 갖는 다른 우선회 아미노산이다.
제 3항에 있어서, 다음 구조로 이루어진 펩티드.

상기에서, 위치 6 또는 16 또는 27 또는 37에서 아미노산 *은 D-라이신 또는 D-글루타민 또는 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 갖는 다른 우선회 아미노산이며, 다른 아미노산 *는 글리신 또는 D-라이신 또는 D-글루타민 또는 담체 화합물에 결합될 수 있는 측쇄를 갖는 다른 우선회 아미노산이다.
제 1항 내지 제 5항중 어느 하나의 항에 따른 펩티드가 담체 화합물에 결합된 조성물.
제 6항에 있어서, 담체 화합물이 단백질인 조성물.
제 7항에 있어서, 담체 화합물이 KLH 또는 오발부민인 조성물.
제 1항 내지 제 8항중 어느 하나의 항에 있어서, 완화 보조액을 추가로 포함하는 조성물.
제 9항에 있어서, 완화 보조액이 유중수유제 또는 이중유유제의 오일상인 조성물.
제 1항 내지 제 10항중 어느 하나의 항에 따른 조성물로 이루어진 백신.
제 13항에 따른 백신을 동물에게 접종하는 방법.
제 12항에 있어서, 유효량이 약 1㎎ 미만인 백신을 동물에게 접종하는 방법.
제 12항 또는 제 13항에 따라 상기 동물이 백신 접종된 것을 특징으로 하는, 동물의 1이상의 생식 또는 행동 특성에 영향을 주는 방법.
제 12항 또는 제 13항에 따라 상기 돼지가 백신 접종된 것을 특징으로 하는, 돼지의 면역 거세 방법.