JPH11514380A

JPH11514380A - ＧｎＲＨ／シュードモナス還元型菌体外毒素結合体

Info

Publication number: JPH11514380A
Application number: JP9516769A
Authority: JP
Inventors: トルマン，リチヤード・エル; ロンバード，ビクトリア・ケイ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1999-12-07
Also published as: CA2235510A1; EP0859624A1; WO1997015317A1; AU7471796A

Abstract

(57)【要約】 GnRHの結合体はGnRHあるいはその類似体、還元型シュードモナス菌体外毒素あるいはその変異体および独特な性質をもつ結合基から構成されている。雄あるいは雌の動物に対して避妊のために、あるいは増殖に性ステロイドホルモンを必要とする腫瘍を抑制するためにこれら結合体を投与する。以上より、本発明の結合体は避妊薬および抗癌薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 GnRH/ シュードモナス還元型菌体外毒素結合体発明の背景動物の不妊処置法に対しては少なからぬ関心がよせられている。特に動物医療や畜産農業、中でも犬、猫、牛、ひつじ、馬、ブタ、などの家畜の不妊処理において関心がよせられている。不妊処理は主に雄における攻撃性や、雌における発情など、性腺ステロイドホルモンによって誘発される好ましくない挙動を制御するため、あるいはブタや牛など食用家畜の肉質向上、未去勢雄豚の肉質低下予防のために行われている。不妊処理には長年にわたって様々な方法が開発されている。たとえば、雄牛においては性的なあるいは攻撃的な行動を抑制するために去勢手術による断種処理が最も広く用いられている。この断種処理には精索をつぶしたり、精巣を鼠径管に停留させる、またはゴムバンドを陰嚢の根元あたりに固定して陰嚢や睾丸が腐り落ちるようにする等の方法がとられている。しかし、このような“物理的な” 去勢手術の多くはいくつかの点において好ましくない事が明らかになっている。たとえば、１）傷をともなう、２）麻酔および特殊器材を使用することによる危険性、３）感染症にかかる危険性、４）手術に習熟した人間が必要であるなどである。さらに、これら全ての外科的去勢手術は睾丸を完全に摘出することになり、このことは睾丸で生成され、成長や蛋白合成を刺激するステロイドホルモンの合成代謝作用をも完全に抑制することになる。これら外科的処理の欠点から不妊薬の使用などの様々な不妊技術が考案されている。しかし、不妊薬の使用には利点と欠点がある。有利な面では、不妊薬の使用により外科手術に伴うストレスや危険を避ける事ができる。更に不妊薬は体内を循環する性ホルモンを低レベルで存続させることによりこれら性ホルモンの合成代謝作用を維持することが可能である。この点は循環する性ホルモンが成長や、食餌の代謝、蛋白質の蓄積を促進させることから食用動物において特に有効である。しかし、不幸にして不妊薬にはいくつかの好ましからざる点がある。例えば、不妊薬の作用は永久的ではなく一時的なものである。更に非常に重篤な、時として致死的な副作用を持つ場合もある。 Nettの国際公開第9009799号において、ある種のGnRH類似体は2-イミノチオラン、SPDP(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ／プロピオネート)、ビス-ジアザベンジジンおよびグルタルアルデヒドの任意の結合基を介して様々な毒素とカップリングすることが記載されている。これら化合物は性腺を選択的に傷害することにより効果を生ずる不妊薬であると明記されている。更に、Myersらは、Biochemical Journal 227：1.343（1985）においてGnRH類似体とジフテリア毒素のＡ鎖およびアメリカヤマゴボウ（pokeweed）の抗ウイルス毒素がSPDPを介してカップリングすることを報告している。国際公開93/15751号においてもGnRHのキメラ分子あるいはその類似体および細胞毒素が開示されている。そのキメラ分子ではGnRHペプチドが、修飾型シュードモナス菌体外毒素分子に直接結合している。ペプチドの毒素分子結合部位にはそれぞれGnRHペプチド一分子のみが結合している。これらキメラ分子の投与により GnRH受容体を発現している下垂体内の細胞が障害を受け、これに伴い性ホルモンの分泌が減少することが報告されている。この過程の最終的な結果は化学的避妊およびステロイド依存性腫瘍増殖の抑制である。英国出願No．2,282,812においてGnRHがMAP（multiple antigen peptide）あるいはlysine treeと名づけられた多くのリジンを含んだユニットを有する環状骨格に結合すること、およびその骨格自体はシュードモナス菌体外毒素などの細胞毒素に結合することが教示されている。多リジン骨格を利用することにより、１つの細胞毒素結合部位に一分子より多くのGnRHを結合させることが可能になる。しかし、所与の閾値を超えてGnRH分子がキャリアーに結合することでより有効なワクチンが得られるのか否かが明らかなっていないこと、更にMAP結合体は一般的に疎水性、親水性溶媒に難溶性であるため、処方が困難になることから、MAPを用いた方法が必ずしも有効であるとは言えない。動物を不妊にする別の方法は、GnRHワクチンを利用するもの、即ち免疫学的不妊法である。一般に、GnRH分子はそれ自身わずかな免疫原性しか持たないので、その免疫原性を高めるために蛋白質などの免疫原性を有する高分子とカップリングさせる。あるいは、同様の目的でGnRH分子と免疫原性を有するペプチドとを含んだ融合蛋白質を構築してもよい。免疫結合体あるいは融合蛋白質を投与された動物はGnRHに対する抗体を産生し、本抗体がGnRHの作用をダウンレギュレーションすることにより、性ホルモンの量が急激に減少し、ホルモン依存性の臓器が萎縮する。ワクチンとしての使用に適した多くのGnRH免疫結合体あるいは融合蛋白質が報告されている。現在、商業用GnRHワクチンがオーストラリアにおいてArthur に販売されている（R．M．HoskinsonらAust.J.Bioltechnol.,1990，4：166等参照）。本ワクチンはGnRHと卵白アルブミンとの複合体から構成されていると報告されているが、その免疫原性は低い[説明書では牛１頭あたり3mgの投薬を二回行うことが薦められており、その有効率は決して100％ではないことが示唆されている]。本ワクチンは鉱油およびDEAE-デキストランを含んでいるが，注射部位において激しい痛みと組織の障害を伴う。米国特許第 4,975,420 号明細書には、1，6あるいは10番目のアミノ酸がシステインに置換されたGnRH類似体とキャリア蛋白質との結合体による免疫不妊法が開示されている。国際公開第88/05308号において天然型GnRHのペンタ、ヘキサ、あるいはヘプタペプチド断片と免疫原性蛋白質との複合体を含む免疫学的去勢用組成物が開示されている。国際公開第93/08290号においてはGnRHとロイコトキシンポリペプチドをふくむ融合蛋白質が記述されている。このロイコトキシンは抗原の免疫原性を高めるためのキャリアー蛋白として機能している。 EP578,293において大腸菌P-フィンブリアルフィラメントの一部とGnRHを含む融合蛋白質が開示されている。本キャリアー系はGnRHに対する免疫応答を飛躍的に亢進させることができ、また、ワクチンとして使用したときにはフロイント完全／不完全アジュバント（CFA/IFA）のような強力なアジュバントを用いる必要は無いと述べられている。国際公開第92/19746号においてGnRHと少なくとも一つのＴ細胞エピトープおよび精製部位を含む組み換えポリペプチドが教示されている。 WO90/02187においてＢ型肝炎表面抗原およびGnRHを含む融合蛋白質が開示されている。構築体はアジュバントや多数の追加免疫を必要としない十分な免疫原性を有すると報告されている。 US5,324,512においてN-末端グルタミンを介してキャリアー蛋白質に結合しているGnRHが教示されている。本複合体は抗受精ワクチンとして、また前立腺癌の治療において有効であるとされている。 WO94/25060においてGnRH、Ｔ細胞エピトープおよび任意に逆位領域を含んだ免疫原性ペプチドについて記述されている。本ペプチドは抗受精ワクチンとして、またアンドロケン依存性カルシノーマの治療に有効である。 UK2,228,262において[D-Lys⁶]GnRH (すなわち天然型GnRHの６番アミノ酸(グリシン)がD-Lysに置換されている)がD-Lysのε-アミノ基を介してキャリア蛋白質と結合している結合体が報告されている。本結合体は受精の制御あるいは前立腺癌の治療に有用であると考えられる。米国特許4,545,985においてシュードモナス菌体外毒素Ａは抗体あるいは表皮増殖因子と化学的に結合することが可能であると報告されている。更に本特許ではこれらの結合体はヒト腫瘍細胞を傷害するのに使用できるが、これら化学的に連結された毒素は望ましくない非特異的なレベルの活性を有することが示されている。 Allured ．ら，“PNAS USA”83：1320-1324 (1986)ではシュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質の３次元構造が記載されている。 Hwang ら，“Cell”48：129-136（1987）では、シュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質が、それぞれ哺乳類の細胞に結合する、毒素蛋白質にリソゾームの膜を通過させる、および哺乳類細胞内でのADP−リボシル化延長因子２、の３つの異なった機能を有するドメインに分断することができると報告されている。さらに本論文においてこれらの機能を有するドメインはシュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質の異なった領域に対応していることが教示されている。 1988年３月30日に公開された欧州特許出願0261671において、シュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質から、完全なシュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質の細胞結合機能は欠損しているが完全なシュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質（分子量66,000 ）の転位およびADPリボシル化機能は保持している一断片部分を生成させることができることが報告されている。この完全なシュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質の転位およびADPリボシル化機能を保持している部分はPE-40（分子量40,000）と命名されている。PE-40はGrayら,PNAS USA 81：2645−2649 1984にて示されたようにシュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質の全アミノ酸配列のうち252から613番までのアミノ酸残基から構成されている。この特許出願では更に、DNA組替え技術により、PE-40をα型トランスフォーミング増殖因子と連結させ、細菌を用いてハイブリッド融合蛋白質を産生することが可能であると報告されている。 Chaudharv ら，“PNAS USA”84：4538-4542（1987）は組替えDNA技術を用いることで細菌により合成された、PE-40とα型トランスフォーミング増殖因子とのハイブリッド融合蛋白質が上皮増殖因子受容体を有しているヒト腫瘍細胞に結合し、これらの細胞を傷害するであろうことを示唆している。 Bailon，“Biotechnology”, pp.1326-1329 11月（1988）ではDNA組替え技術を用いることで細菌により合成されたPE-40とIL-2とのハイブリッド融合蛋白質はIL-2受容体を有しているヒト株化細胞を傷害することを示唆している。 Edwards ら，“Mol.Cell.Biol.”９:2860-2867（1989）では膀胱癌細胞の治療効果を有する修飾型TGF-アルファ-PE40融合分子の合成について報告されている。 Heimbrook ら“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”87:4697-4701（1990）はin vivo投与により修飾型TGF-アルファ-PE40がヒト腫瘍細胞を移植したマウスにおいて顕著な延命効果を示したことを報告している。本願発明ではGnRH，結合基および修飾型シュードモナス菌体外毒素Ａ蛋白質（ PE）から成る様々な構築体を用いる。従来の構築体は何分子のGnRHペプチドが毒素と結合しているかを明確にする方法が無いためアミノ酸組成を解析することが困難であったが、本発明の結合基は分析測定時に非天然型アミノ酸から成る特異的マーカーを放出する。このマーカーを定量することによりペプチド基と毒素の正確な比率を容易に計算することが可能である。発明の概要本発明は投与された宿主に抗GnRH抗体を産生させることができる薬剤に関するものである。詳細には本薬剤はGnRH分子の一部と修飾型シュードモナス菌体外毒素を含んでいる。これら二つの部分は、シュードモナス菌体外毒素とGnRHとの結合比率を分析しやすくなるよう改善された特殊な結合基によって結合されている。これら新規のキメラ結合体は動物の免疫学的不妊法、繁殖の制御やステロイドホルモン依存性腫瘍治療などのためのワクチンとして有用である。発明の詳細な説明本発明の結合体は以下の構造式により示される。本構造式においてＳは硫黄、rPEはチオール-S-基を介してＬ₁と連結している還元型シュードモナス菌体外毒素、Ｘ¹はLeuまたはNle（ノルロイシン）；ＹはP roまたは４−ヒドロキシ-Pro；ＺはGly-NH₂，D-Ala-NH₂，NH-Et，NH-PrまたはAz a-Gly-NH₂；ＱはPyroGlu-His-Trp，N-アセチル-4-Cl-Phe^1・2-Trpまたは3-インドリルプロピオニルである。PyroGluはである。Ｗは以下の構造式で示されるＤまたはＬ体アミノ酸である。本構造式においてｒは１または２；ｍは１から４までの整数；ｎは０か１；Ｂは CH₂，O，SまたはN；Ｒ¹は水素、炭素数１から６のアルキルまたは炭素数３から８のシクロアルキル;（アミノ酸）nは天然型L-アミノ酸またはそのD-立体異性体；（Ｘ¹），（Tyr）および（Ｌ₁）はＸ¹，TyrおよびＬ₁のＷへの結合部位を示す。Ｌ₁は各々独立してである。Ｘ²は炭素数１から５のアルキレン，フェニルあるいは炭素数５から６のシクロアルキレン；（Ｗ）および（Ｓ）はそれぞれＷおよびＳのＬ₁への結合部位を示す。本発明の化合物の一例は以下の構造式で示される。本構造式において10個のアミノ酸から成るペプチド（すなわちデカペプチド）は本来の６位アミノ酸（Ｗ＝Gly）が欠失し、代わりにＤ-あるいはＬ-LysまたはＤ -0rnで置換されたGnRHである。Ｄ-あるいはＬ-Lys⁶-GnRHを用いるのが好ましいが、宿主において抗-GnRH抗体を産生させるLys⁶-GnRH変異体が依然、本発明において有用である事は判るであろう。満たされなければならない条件は、６位のアミノ基をもつこと、そのペプチドの残りの部分が免疫原性を保持していることである。上記構造式中のＺはGly-NH₂，エチルアミドあるいはArg-Gly-NH₂、ＹはProまたは4-ヒドロキシ-Proである。Ｌ₁は各々独立してである。Ｘ²は炭素数１から５のアルキレン，フェニルあるいは炭素数５あるいは６のシクロアルキレン、“rPE”は還元型シュードモナス菌体外毒素NlysPE38QQRあるいはその変異体である。 4-ヒドロキシプロリンにはＤ-，Ｌ-異性体およびシス、トランス体の存在が可能である点は、当業者には容易に判るであろう。本発明はそれらの異性体およびＤ，Ｌラセミ混合物を全て含むものである。特に断らない限り、以下の用語は下記に定義される意味をもつものとする。 “GnRH”は天然型GnRH、並びに、本発明に従って宿主に投与したとき抗GnRH抗体を産生させることができ、かつ以下に示す構造式の範囲にある類似体および誘導体を含む。 Q-Ser-Tyr-W-X¹-Arg-Y-Z 本構造式においてＱ，Ｗ，Ｘ¹，ＹおよびＺは先に定義されている。特定のGnRH 分子を指す場合は、そのアミノ酸配列を明示する。黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）とも呼ばれる天然型GnRHはpGlu-His-T rp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂のアミノ酸配列を有する10個のアミノ酸からなるデカペプチドである。pGluはピログルタミン酸である。本発明において用いられる用語“還元型シュードモナス菌体外毒素（rPE）” はCys²⁶⁵とCys²⁸⁷の間のジスルフィド結合が還元されたシュードモナス菌体外毒素である。ジスルフィド結合の還元には通常用いられる試薬、例えばジチオトレイトールをエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩などのキレート剤の存在下で用いる。キレート剤はチオールを酸化させる原因になる金属を除くために用いる。 ”シュードモナス菌体外毒素”との用語は天然型シュードモナス菌体外毒素とその修飾体とを含む。シュードモナス菌体外毒素は３つのメジャードメインと１つのマイナードメインの配列からなる613個のアミノ酸により構成される蛋白質である。使用が望ましいシュードモナス菌体外毒素は毒性が減弱化された変異体である。実例をあげれば、結合ドメインあるいはADP-リボシル化ドメインの欠損、部分欠損、アミノ酸の挿入、置換により結合活性あるいはADP-リボシル化活性が、減弱あるいは消失しているシュードモナス菌体外毒素のセグメント、あるいは光不活性化等によりＰＥホロトキシンを不活性化したシュードモナス菌体外毒素の部分断片などである。PE免疫結合体の有効性はPEの毒性の強さとは無関係である。弱毒化されたシュードモナス菌体外毒素の一例として、結合領域の大半あるいは全てを占める1-252番アミノ酸配列を欠損しており、細胞内転移領域および毒性領域を含む253-613番アミノ酸配列を保持しているシュードモナス菌体外毒素があげられる。本シュードモナス菌体外毒素断片はPE-40（Hwangら、後掲、KondoらJ.Biol.Chem 263 9470-9475 (1988),Chaudharyら,PNAS-USA，87 308-312(1990),Pastanらの米国特許4892827 ）として同定されている。シュードモナス菌体外毒素断片PE-40を365-380番アミノ酸配列を除くことによりさらに修飾してPE-38とした。PE-40およびPE-38はそのN-末端にリジンを含むオリゴペプチドを付加することにより更に修飾することもできる。９つのアミノ酸からなるペプチド、（Ｍ）ＡＮＬＡＥＥＡＦＫ（メチオニンから始まる“Lys ”ペプチド）をPE-40及びPE-38のN-末端に付加することによりそれぞれLysPE-40およびLysPE-38と呼ばれるシュードモナス菌体外毒素が合成される。１０のアミノ酸からなるペプチド、（Ｍ）ＬＱＧＴＫＬＭＡＥＥ（“NLys”ペプチド）を付加することによりNLysPE-40及びNLysPE-38と呼ばれるシュードモナス菌体外毒素がそれぞれ合成される。 PE-38の590と606番目のリジンをグルタミに、613番目のリジンをアルギニンに置換することにより、PE-38QQRと呼ばれるシュードモナス菌体外毒素が産生される。LysPE-38QQRおよびNLysPE-38QQRはそれぞれN-末端に“Lys”と“NLys”ペプチドが付加されている。様々なシュードモナス菌体外毒素断片がバイオテクノロジーおよび組替えDNA の技術を用いて作製され、これらはDebinskiおよびPastan，Bioconjug.Chem．19 94，5(1):40-46、または本論文中の引用文献において論述されている。 NLysPE-38QQRのアミノ酸配列を以下に示す[配列番号：１]。下線を引いた４アミノ酸残基はPE-38のＮ-末端アミノ酸をしめす。本発明においては還元型NLysPE-38QQRの使用が好ましい。反応経路１反応経路１（続き）反応経路１において最初の反応はGnRHとL₁の反応であり、実例としてそれぞれ D-Lys⁶-GnRHおよびマレイミドイルアルカノイル基で示してある。D-Lys⁶-GnRHは既知のペプチド合成法により合成する。とくに固相ペプチド合成法を用いることが望ましい。“Et”はエチル“NεH₂”はリジンのイプシロンアミノ基である。 L₁-D-Lys⁶-GnRH合成反応はマレイミドイルアルカノイル基の活性エステルを用いて行う。マレイミドイルアルカン酸とN-ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノールあるいはp-ニトロフェノールより合成されたエステルの使用が望ましい。これらの中でN-ヒドロキシスクシンイミドにより合成したエステルがもっとも好ましい。反応は（ａ）N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）などの非求核性有機塩基か（ｂ）炭酸ナトリウムや炭酸カリウムのような無機弱塩基のいずれかから選択される塩基を含んだ極性溶媒中で行う。極性溶媒はN,N-ジメチルフォルムアミド，水，アセトニトリルあるいはこれらの混合液が用いられる。これらの中ではN,N-ジメチルフォルムアミドの使用が好ましい。反応は０から 25℃で行い、室温で行うのが望ましく、一般的には10から90分間で反応は完了する。反応の終了時にはまずトリフルオロ酢酸などの酸を添加して塩基を中和し、混液のpHを約2-4にする。生成物の単離は当業者に知られている方法を用いて行う。二番目の反応はPEのジスルフィド結合の還元反応であり、ｐＨ約８の水性緩衝液中で行う。本反応経路ではジスルフィド結合の還元反応は非限定例としてNLys PE38QQRを用いて示す。反応混合物にはジチオトレイトールおよび／またはエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩を含ませることが望ましい。これら試薬は一般にNLysPE38QQRのCys^265,287ジスルフィド結合を還元するのに必要な量よりかなり過剰に加える。過剰量の試薬はこれら反応性基が類似の基とジスルフィド結合を形成することを抑える。同様の理由から反応は一般的には窒素ガスで置換することにより完全に酸素を除いた状態で行う。反応は０から25℃で行い、特に室温で行うのが望ましく一般的に５から18時間で完了する。還元型シュードモナス菌体外毒素をL₁-D-Lys⁶-GnRHと結合させる前に、ジチオトレイトール（DTT）あるいはエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩を除く必要がある。そのために反応液は次の反応に進む前にこれら反応試薬を除去する。最も簡便な方法は反応液を透析することである。透析により不要な試薬を除去した溶液は他の処理を行うことなく次の反応に使用する。最後の反応はL₁-D-Lys⁶-GnRHと還元したシュードモナス菌体外毒素とのカップリング反応であり、本反応は窒素ガス存在下、pH8から10の条件で過剰量のL₁-D- Lys⁶-GnRHを反応させる。一般的にはシュードモナス菌体外毒素のチオール置換基１当量に対し２から20当量のGnRHを用いる。一般的に反応は非常に速く進行し、1-5分で完了するが、さらに２時間以上継続しても悪影響は認められていない。カップリングしたD-Lys⁶-GnRHL₁-シュードモナス菌体外毒素の単離は、当業者に知られている方法を用いて行う。反応混合物の透析処理は不要な生成物を除去する簡便な方法であることが判明している。生成された結合体は一般には注射により投与されるため最終的な透析溶液はろ過滅菌し直接皮下投与に用いてもよい。他のリンカーＬ₁も同様に本結合体を作製するために用いてもよい。例えば、反応経路１ではさらにアルカノイル型リンカーを用いた反応が示してある。即ち、GnRHをブロモ酢酸無水物と反応させて６の化合物を生成し、さらにこの化合物を還元型NlysPE38QQRと反応させて結合体７を生成させる。中間体２および６は次の構造である。本構造式においてＬ₁はである。構造式においてＸは炭素数１から５のアルキレン，フェニルあるいは炭素数５から６のシクロアルキレンである。haloはヨウ素、臭素あるいは塩素である。結合基L₁はD-Lys⁶-GnRHの利用可能な第一級アミンおよび還元型PE，好ましくはNLysPE38QQRと結合している。還元されたPEでは複数のチオールが結合に利用可能であり、そのためPEに対して複数のＬ基が反応する。 GnRHの誘導体のうちで最も望ましいものはD-Lys⁶-GnRHであり、よって本発明において最も望ましい反応中間体はである。独特の結合基を介してGnRH類似体と還元型PEを結合させた本発明の結合体は、毒素結合体を作製、解析するうえで優れた利点を供するものである。しばしば起きることであるが、得られた結合体が実際には、PE分子にいろいろな数のGnRH類似体が結合した結合体の混合物である場合にはさらなる混乱が生ずる。GnRH-PE 結合体の分析は一般にアミノ酸分析により行うが、GnRHおよびシュードモナス菌体外毒素はともに全て正常型アミノ酸に分解されるためPEに結合したGnRH分子の数を決定するには非常に長い工程を経なければならない。しかし、本発明の結合基はアミノ酸分析において非天然型アミノ酸であるβ- アラニンに分解される。このことからアミノ酸分析によりβ-アラニンに対するリジンの比率が決定され、この比率により結合の程度が明らかとなる。これは結合程度を知る上ではるかにより直接かつ正確な方法であり、化学的不妊治療薬としての毒素結合体の利用を飛躍的に容易ならしめるものである。ブロモあるいはクロロアセチル化ペプチドを用いて調製した結合体の分解により新規なアミノ酸、S-カルボキシルメチルシステイン（SCMC）が生成する。本分子は結合体合成反応が正しく起きている場合にのみ生成する。本発明の結合体は動物医療同様ヒトの医療においても非常に有用である。このことはヒトに去勢あるいは不妊薬を用いるいくつかの重要な生物学的理由があることからも支持される。例えば、乳癌と前立癌のみではあるがこれらは性ステロイドホルモン依存性腫瘍であり、そのようなホルモン治療によって治療効果が認められる。現在、ステロイドホルモン依存性腫瘍増殖の抑制に明らかに有効な治療法は抑制ホルモン（例えば、前立腺癌におけるDES），性ステロイドホルモン結合抑制剤（例えば、乳癌におけるタモキシフェン）の投与あるいは外科的去勢手術のみである。そのため、化学的去勢剤の医療における将来的な利用の範囲は非常に広くまた多彩である。例えば、前立腺癌は依然癌による重大な死亡原因であり、男性において２番目に多い癌である。現在、進行性の前立腺癌において苦痛を軽減するための治療として外科的去勢手術により血清中テストステロン／DHT濃度を低下させる方法がとられている。特にヒトにおいて疾病あるい妊娠の制御のためには、他の治療法と併存させて、脳下垂体の性腺刺激ホルモンを抑えるために本出願人の化合物を使用することが望ましいであろう。例えば、女性への黄体ホルモンおよび卵胞ホルモン、男性へのアンドロゲンの長期投与は性的な特徴、行動の消失あるいは骨粗鬆症を予防するために必要であると考えられている。しかし、本明細書において開示されている化合物を用い、特に適切な性ステロイド投与と併用することにより、十分に期待される不妊効果が得られる。ヒトの医療における他の利用領域は子宮内膜症の治療である。女性の腹膜および骨盤内での痛みを伴う子宮内組織の増殖を特徴とする本疾患も性ステロイドホルモンの合成抑制により治療効果が得られる。また、今回開示された化合物が性ステロイドホルモン分泌を一部抑制し、さらに成長刺激作用を維持しながらもホルモンが関与している行動の異常が軽減あるいは消失し得ることは、当業者には理解できるであろう。これら化合物の使用に伴う量および時期は極めて広範囲に調節が可能であり、処置する動物種、用いるGnRHおよび／またはキャリアー、アジュバント、動物の年齢、ならびに求めるワクチン接種の効果など、様々な要因に応じて適した条件が異なると考えられる。一般的には結合体を哺乳動物の皮下あるいは筋肉内に、一回あたり１μｇから1000μｇ投与する。不妊には本発明の結合体の一回投与で十分であるが、１から６週間間隔で複数回投与する方法も可能である。さらに不妊薬として投薬する場合、本結合体は性的成熟期の前あるいは後で使用することが可能である。こうすることで、不妊を遅らせることが可能であり、この事は特に畜産業において有用である。畜産業においては非外科的不妊法を用いる時期を調節することで、ホルモンの同化作用が食餌効率、肉の量および質の向上に寄与する。豚において本化合物は不快なにおいや雄の肉特有の味を除く一方で、雄性成長および肉質を最大限に向上させる。これは成長期終了後に1、2回筋肉内あるいは皮下に投与することで十分な効果が得られる。簡便で効率的な投与計画の例では、成長用／仕上げ用の飼育施設に収容する時点（9-16週齢）で最初の接種を行い、成長期の終わり（18-22週齢）に追加免疫を行う。各免疫には約１μｇから約1 000μｇの結合体を使用するが、約 10μｇから約100μｇの使用が望ましい。１回だけの投与で免疫を行う場合には、一般に、２回あるいはそれ以上投与する場合よりも多い量の結合体を投与する。放牧牛において豚同様の方法で処置が可能であろう。すなわち、放牧に出す時点で免疫し、それ以外にもメスの避妊、オスの成長を最大に促すなど目的に応じて追加免疫を行う。妊娠を避けるためには、雄と同じ畜舎にいれる前に完全に免疫されている必要があるが、雄と分けて飼育しながら、ワクチン接種した雌は約４から１２週間で発情を抑えるに十分な免疫が成立する。雄牛は食餌効率を最大にするためにはできるだけ遅くワクチン接種するべきであるが、攻撃性を抑えたり、霜降り肉を作るためにはできるだけ早期にワクチン接種するべきである。犬や猫のようなペットでは、GnRHワクチンは一般的なワクチン接種が行われる時期（生後６から２１週間に免疫し、その６ヶ月後に追加免疫し、さらにその後は１年に一回の追加免疫）に皮下あるいは筋肉内注射による投与が可能であろう。犬、猫および馬などのすでに成長した動物の去勢には２から８週間隔で二回接種し、その後は一年に一回の免疫で十分である。実際の投与量や処方は未定であるが、使用する結合体に応じて変わるであろう。しかし、アラムをアジュバントとして用いた本発明の結合体１から2000μg、望ましくは約500μｇを1-3ml投与することで、先に記述したように投与したとき、十分な有効性が得られるものと考えられる。ヒトにおいて、本発明の結合体は性ステロイドホルモン応答性腫瘍の治療に利用可能である。一回あたり１から1000μｇのワクチン接種を２から８週間隔で２回、その後はホルモン療法で腫瘍が縮小するかあるは消失するまで、６〜12ヶ月に追加免疫することが可能である。本発明の結合体は、接種部分に障害を起こし、食用動物の品質を低下させるフロイント完全アジュバントなどのような強力なアジュバントを用いずに上記の用途に使用することが可能である。本発明に適したアジュバントは、重大な副作用を有さずに免疫原に対する哺乳動物の免疫学的応答を高めることが本業界においてすでに認められている物質のいずれかであり、たとえばアルミニュウム化合物やフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）のような油中水滴型エマルジョンなどがある。望ましい具体例としては、代謝可能な油、ポリオキシプロピレン(POP )-ポリオキシエチレン（POE）ブロック重合体のような非イオン性界面活性剤、乳化剤を含み、また次式１で示される免疫応答亢進剤を任意に加えた水中油滴エマルジョンとして本発明の免疫結合体を投与する。本構造式において、Ｒ¹は水素，炭素数２から８のアルケニル、炭素数１から８のアルキル、ベンジル、フェニルあるいはＣＯＲ⁴である。ここでＲ⁴は、水素、炭素数１から８のアルキル、炭素数２から８のアルケニル、ベンジルあるいはフェニルであり、これらのフェニル部分はヒドロキシ、炭素数１から４のカルボキシ、ハロゲン、炭素数１から４のアルコキシ、炭素１から４のアルキルおよび炭素数２から４のアルケニル、Ｍが水素、ナトリウムあるいはカリウムであるSO₃ MあるいはPO₃Mから成る群のなかから選択される３つまでの置換基を有していてもよい。Ｒ²は水素あるいはＯＲ¹ Ｒ³はＯＲ¹であるか、あるいはＲ³はＲ⁴とともにオキソを形成する。Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷はそれぞれ水素あるいはメチルである。ただし、Ｒ³がＲ⁴とともにオキソを形成する場合には、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷およびＲ²はいずれも水素である。また、Ｒ²が水素である場合、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷も水素であり、Ｒ³はＯＲ¹である。ワクチン組成物に含まれる、代謝可能な油は炭素原子を６から３０含む油でよく、アルカン、アルケン、アルキンおよびこれらに対応する酸およびアルコール、これらのエーテルおよびエステル、ならびにこれらの混合物がある。油はアジュバントを投与された動物の体内で代謝され得、かつその生体に対して毒性を有さない植物油、魚油、動物油あるいは合成油のいずれでもよい。例えば植物油では、ピーナッツ油、大豆油、椰子油、オリーブ油、サフラワーオイル、綿実油、ひまわり油、ごま油およびコーン油などである。動物性油は一般に生体温では固体であるが、部分的あるいは完全にトリグリセリドを加水分解することにより脂肪酸を遊離させ、動物脂から脂肪酸をえることができる。ほとんどの魚には容易に回収し得る代謝可能な油が含まれている。例えば、鱈の肝油、鮫の肝油および鯨蝋のような鯨油が魚油としてあげられる。多くの枝別れ構造を有する油がC5−イソプレン単位から生化学的に合成され、このものは一般にテルペノイドとよばれている。鮫肝油はスクワレンとして知られている枝別れした不飽和テルペノイドを含んでいる。飽和型のスクワレン類似体、スクワランは本発明において特に使用が望ましい油である。本発明のアジュバント組成物およびワクチン中に油成分は一般には１から10％含有されるが、2.5から5％の含有量が望ましい。 “ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロック重合体”との用語は酸化プロピレン次いで酸化エチレンを低分子量の反応性化合物、一般にはプロピレングリコールに連続的に付加することにより合成されるポリマーを指す。これらブロック重合体はLunstedのU.S.Pat.No.2,674,619による方法によりている。これらブロック重合体の性質はPOP核の分子量および生成物中に占めるP OEの割り合いで決定される。POP部分はブロック重合体に疎水性の性質を与えるのに対して、POE部分は親水性の性質を与える。ア数字で表現される。接頭文字（Ｌ，ＰあるいはＦ）はそれぞれの重合体の物理的形態（液体、ペースト状、薄片化しやすい固体）を示す。始めの１つあるいは２つのアラビア数字はPOPベースの平均分子量を示し、最後の数字はPOEの量を示す。例レンベースとその分子の末端にポリオキシエチレンを10％含有する液体である。ブロック重合体は約15°から40℃の温度範囲で液体状のものが望ましい。さらに、液体およびペースト、液体、ペーストと薄片化しやすい固体のポリマー混合物、あるいは薄片化しやすい固体と液体の混合物などで、特定の温度範囲では液体であるものも本発明において利用可能である。望ましいブロック重合体は分子量が約2250から4300のPOPベースおよび約１から30％のPOEを含んだものである。より好ましいものは、POPの分子量が3250から 4000で、POE成分 L101，L121およびL122がこの条件に当てはまる。最も好ましいものはPOPの分子量が4000で、POEが総量の10％を占めるもの、あるいはPOPの分子量が3250で、PO Eが10％を占める重合体L121、L101である。ブロック重合体は総量の0.001から10％で使用するのが望ましく、総量の0.001から5％での使用が最も望ましい。 “乳化剤”との用語はエマルジョンを安定化させることができる非毒性界面活性剤を指す。数多くの乳化剤および懸濁剤が製剤学の分野で広く一般に使用されている。これらには天然の素材、たとえばゴム、植物性蛋白、アルジネート、セルロース誘導体、リン脂質（天然、合成とも）などが含まれる。例えば、ポビドン、ポリビニルアルコールおよびグリコールエーテルをベースとする化合物など、ポリマー骨格に親水性置換基を持つある種のポリマーは乳化活性を有する。長鎖脂肪酸から得られた化合物は本発明に使用できる乳化、懸濁化剤の３つめの重要なグループである。非毒性であればこれらのいかなる乳化剤も使用可能であるが、グリコールエーテルをベースとする乳化剤の使用が望ましい。望ましい乳化剤は非イオン性である。これらには、ポリエチレングリコール（特にPEG200，30 0，400，600 （これらは全てICIAmerica.,Wilmington,Del.から入手可能である）、ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪酸エーテル、ポリオキシエチレンを含む蜜蝋の誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド、グリセロール脂肪酸エステルあるいはその他のポリオキシエチレン酸アルコール、または炭素数12-21の長鎖脂肪酸のエーテル誘導体がある。上記の乳化剤も毒性が無いことが確認されれば使用に適するが、現在のところ使用が望ましい乳化剤はレン20ソルビタンモノオレエートの名前で知られている）である。乳化剤は一般には総量の約0.05から約5.0％で用いられ、約0.2から1％での使用が望ましい。本発明のアジュバント組成物のうち水性部分は緩衝された等張生理的食塩水が望ましい。これらの水溶液は投与後の腫れや、組成物と体液とのイオン濃度の違いにより、組成物が急速に吸収されてしまうことを避けるために、正常な体液と浸透圧がほぼ同じになるよう作製することが望ましい。また、生理的食塩水は、正常な生理状態と適合するpHを維持するために緩衝化させることも望ましい。さらに、グリコペプチドなどある種の成分の安定のために特定のpHに保つことが必要な場合もある。生体に投与可能な緩衝剤であれば使用可能であるが、リン酸緩衝液の使用が最も簡便であることが確認されている。酢酸、トリス，重炭酸、炭酸緩衝液などの他の許容可能な緩衝剤もリン酸緩衝液の代わりに使用が可能である。リン酸緩衝化生理的食塩水あるいはリン酸と酢酸混和による緩衝化生理的食塩水の使用が望ましい。化合式１の免疫応答増強剤は当業界で広く知られたもの（例えば、デヒドロエピアンドロステロン）あるいは、R.M.Loriaの米国特許5,277,907あるいはNeuroc rine BiosciencesのＷＯ95/10527の開示に準じて作製される化合物である。ワクチン組成物の望ましいものには、免疫強化作用をもつすべての免疫応答増強剤が含まれる。使用がより望まれる免疫応答増強剤は化学式１であらわされる化合物のうち、R¹，R²，R⁵，R⁶およびR⁷がそれぞれ水素で、R³およびR⁴がともにオキソ基を形成するもの、すなわちデヒドロエピアンドロステロンあるいはDHEAである。に、免疫応答増強剤としてDHEAを含有したワクチンの使用がより望ましい。アジュバント組成物は均一なエマルジョンを形成するためにミキサーを使用して乳化させることによって作成する。一般的には免疫応答増強剤を含んだアジュバント組成物は、GnRH−結合体を添加する前に微流体化する。エマルジョンはマイクロフリューダイザを用いて約２-20回循環させた後、GnRH−結合体をアジュバント組成物に加え、エマルジョン中の油滴がほとんど全て直径約0.03μmから0 .5μm、望ましくは0.05μmから0.2μmになるまで、一般に２から１０回マイクロフリューダイザ中を循環させる。以下の実験操作において全ての試薬は市販の物を用いた。溶媒は、可能な場合はHPLC−グレードの物を使用した。HPLC（二成分グラジエント）は調整可能なU. V.検出器Waters484（検出スケールでAufs＝0.1、調製スケールでAufs＝2.0）を備えたWaters600Eシステムを用いて行い、Waters746 Data Moduleを用いて記録した。WatersWISP^TM712 オートサンプラー（200μＬサンプルループ）を分析検体に用いた。Rheodyne7125マニュアルインジェクションポート（5000μL サンプルループ）を検体処理に用いた。Ａ＝H₂O，0.1％TFA；B=CH₃CN，0.1％TFA。マススペクトルはFinnegan MAT90スペクトロフォトメーター（陽イオン、NBAマトリックス）を用いた。略語：標準アミノ酸略号を用いる。ＲＴ，室温；DCC，1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド；HOBT，1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール；TFA，トリフルオロ酢酸；DIEA，N,N-ジイソプロピル-エチルアミン；MPS，β-マレイミドプロピオン酸； N-ヒドロキシスクシンイミドエステル；GnRH，性腺刺激ホルモン放出ホルモン；PBS リン酸緩衝生理的食塩水；DTT，ジチオトレイトール；EDTA-2Na，エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩；NBA，3-ニトロ-ベンジルアルコール。出発材料の調製１．DLys⁶-GnRH，1:PyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Lue-Arg-Pro-Gly-NH₂ ：本ペプチドは、Rinkアミド MBHA樹脂（0.25mmol，Nova Biochem）上での固相ペプチド合成法(SPPS)にて、ABI model431A合成器およびシングルカップリング（DCC/HOBT）を用いて合成した。試薬Ｒ（1mL／100mg樹脂、TFA/チオアニソール /エタンジチオール/アニソール，90：5：3：2）を用いて（2時間、ＲＴ）ペプチドを樹脂より切り離した。ジエチルエーテルを用いてペプチドを濃縮解裂混合液から沈殿させ、分取用逆相 HPLC 10-20％Ｂ，0-20分間；その後20-35％Ｂ，20-40分間；λ＝230nm）。 6-D-Lys-GnRH：FAB-MS（陽イオン、ＮＢＡマトリックス）計算値Ｍ＋1 1254.44 ；実測値Ｍ＋1＝1254.4 ２．（Ｎ_ε-マレイミドプロパノイル）-DLys⁶-GnRH,2:PyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr -（Ｎ_ε-マレイミドプロパノイル）-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂： DLys⁶-GnRH（10 mmol，12.5 mg）をN,N-ジメチルホルムアミド（O.5 mL/mg）に溶解した後、DIEA（50 mmol，９μL）を加えた。混液は室温にて短時間攪拌した後、β−マレイミドプロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MPS ；20 mmol，5.2 mg）を一度に加えた。30分間の反応の後、反応液に10μLのTFA を加え、溶媒を減圧除去した。ペプチドは逆相HPLCを 10mL/min；10-25％B，0-30 min；その後25% B,30-35min； λ＝230nm）。FAB-M S（陽イオン、ＮＢＡマトリックス）計算値Ｍ＋１：1405.56；実測値Ｍ＋１＝1405.6 ３．（Ｎ_ε-ブロモアセチル）-6-Ｄ-Lys−GnRH ブロモ酢酸無水物は3.35mgのブロモ酢酸と1.5mlのジクロロメタン，4.9mgのジシクロヘキシルカルボジイミドを３時間反応させて合成した。先に合成されたDLys⁶-GnRHペプチド（12.3mg）を1mlの乾燥脱気したDMFに溶解し20μlのジイソプロピルエチルアミン（Hunigの塩基）を加えた。ブロモ酢酸無水物溶液（ジシクロヘキシルカルボジイミドを除くためにろ過済み）をペプチド溶液に加えた。30分間の反応の後、反応を停止させるために0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含んだ100μlの水を加えた。反応混液を減圧濃縮し、残留物を0.1 ％TFAを含む10％アセトニトリル水溶液2.5mlに溶解させた。反応生成物をWaters 分取用クロマトグラフィーカラムにて分離精製し3.2ｍｇの生成物を得た。マススペクトルではFABにより分子イオンピークが認められた。Ｍ＋Ｈ＝1346.6。４．N-Ac-1,2-ジ-p-クロロ-Phe-Dlys⁶-GnRH,Ac-4-Cl-Phe-4-Cl-Phe-Trp-Ser-Tyr -DLys-Lue-Arg-Pro-Gly-NH₂: 本ペプチドはABI model 431A 合成器および、4-Cl-Phe にはダブルカップリング（DCC/HOBT），その他の残基にはシングルカップリングを用いて、固相ペプチド合成法（Fmocchemistry）によりRinkアミドMBHA 樹脂（0.25mmol，Nova Biochem）上にて合成される。樹脂ビーズがアミンの存在を検出するKaiser試験で陰性を示すまで（0.5-８時間）無水酢酸（5-10mL）で処理することにより、アミノ末端をキャッピングする。ペプチドは試薬Ｒ（O.5mL-３mL ／100 mg樹脂,TFA/チオアニソール/エタンジチオール/アニソール，90：5：3：2 ）を用い樹脂から切り離す（2-4時間、室温）。ペプチドは分離処理した反応液よりジエチルエーテルを用いて沈殿させ、分取用逆相HPLCにより精製した後FAB- MSにより解析を行う。５．DLys⁶-DAla¹⁰-GnRH,H-Pgl-His-Trp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-Da1a-NH₂ 本ペプチドはABI model 431A合成器およびシングルカップリング（DCC/HOBT ）を用いて、固相ペプチド合成法（Fmocchemistry）によりRinkアミドMBHA樹脂（0.25mmol，Nova Biochem）上にて合成した。試薬Ｒ（2.0mL／100mg 樹脂、TFA /チオアニソール/エタンジチオール/アニソール，90：5：3：2）を用いて（３時間、室温）樹脂よりペプチドを切り離した。ジエチルエーテルを用いてペプチドを濃縮解裂混合液から沈殿させ、逆相HPLCにより精製した。FAB-MSによる6-D-Lys-10-D-Ala-GnRHの特性（陽イオン、NBAマトリックス）計算値（m＋1）＝1268.5；実測値（m+1）＝1267.5 ６．Dlys⁶-Pro⁹-NHEt-GnRH,H-Pgl-His-Trp-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-NHEt ：本ペプチドはABI model 431A 合成器およびシングルカップリング（DCC/HO BT）を用いて、固相ペプチド合成法（Bocchemistry）によりOximeあるいはMerri field樹脂上にて合成される。ペプチドは無水エチルアミンを用いて（２-72時間、室温）樹脂より切り離す。保護基が付加された未精製のペプチドはジエチルエーテルを用いて沈殿させ、吸引ろ過により回収し、一晩乾燥させる（P₂O₅上にて）。アニソール（0.2-2mL）およびホスホン酸ジメチル（0.1-１mL）存在下で無水フッ化水素と反応させることにより（O℃、0.5-２時間、5-30mL）、乾燥させたペプチドから保護基を除く。減圧下で過剰量のフッ化水素を除いた後、残留物はジエチルエーテルにより粉体化させる。ペプチドは分取用逆相HPLCにより精製し、FAB-MSにより解析を行う。７． Dorn⁶-GnRH,H-Pgl-His-Trp-Ser-Tyr-DOrn-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ ：本ペプチドはABI model 431A 合成器およびシングルカップリング（DCC/HO BT）を用いて、固相ペプチド合成法（Fmocchemistry）によりRinkアミドMBHA樹脂（0.25mmol，Nova Biochem）上にて合成した。ペプチドは試薬Ｒ（2.0mL／100 mg樹脂、TFA/チオアニソール/エタンジチオール/アニソール,90：5：3：2）を用いて（３時間、室温）樹脂より切り離した。ペプチドは濃縮解裂混合液よりジエチルエーテルにより沈殿させ、分取用逆相HPLCにより精製した。FAB-MSによる6- D-Orn-GnRHの特性（陽イオン、NBAマトリックス）計算値（m+1）＝1239.4；実測値（m+1）＝1239.5 ８．3-インドリルプロピオニル-Dlys⁶-GnRH,3-インドリルプロピオニル-Ser-Tyr -DLys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ 本ペプチドはABI model 431A 合成器およびシングルカップリング（DCC/HO BT）を用いて、固相ペプチド合成法（Fmocchemistry）によりRinkアミドMBHA 樹脂（0.25mmol，Nova Biochem）上にて合成した。ペプチドは試薬Ｒ（2.0mL／1 00mg樹脂、TFA/チオアニソール/エタンジチオール/アニソール,90： 5：3：2）を用いて（３時間、室温）樹脂より切り離した。ペプチドは濃縮解裂混合液よりジエチルエーテルを用いて沈殿させ、分取用逆相HPLCにより精製した。FAB-MSによる3-インドリルプロピオニル-6-D-Lys-GnRHの特性（陽イオン、NBA マトリックス）計算値（m+1）＝990.2；実測値（m+1）＝990.7 ９．3-インドリルプロピオニル-Dlys⁶-Pro⁹_-NHEt-GnRH,3-インドリルプロピオニル-Ser-Tyr-DLys-Leu-Arg-Pro-NHEt：本ペプチドはABI model 431A 合成器およびシングルカップリング（DCC/HO BT）を用いて、固相ペプチド合成法（Bocchemistry）によりOximeあるいはMerri field 樹脂上にて合成した。3-インドリルプロピオニル基は3-インドールプロピオン酸として導入した。ペプチドは無水エチルアミンにより（2-72時間、室温）樹脂より切り離した。保護基が結合した未精製のペプチドはジエチルエーテルにより沈殿させ、吸引ろ過により回収し、一晩乾燥させた（P₂O₅上にて）。アニソール（0.2-2 mL），ホスホン酸ジメチル（0.1-1 mL)存在下で無水フッ化水素にて処理（0℃、0.5-2時間、5-30mL）することにより、乾燥させたペプチドから保護基を除く。減圧処理により過剰量のフッ化水素を除き、残留物はジエチルエーテルにより粉体化させた。ペプチドは分取用逆相HPLCにより精製した。Dlys⁶-Pro⁹-NHEt-GnRH（陽イオン、NB Aマトリックス）のFAB-MSによる解析ではＭ＋１＝1223.9であった。10 ．NLysPE38QQRの調製プラスミド PJH4（Hwang.J．“Cell”（1987,48；129-136）参照）はPE_1-613 のコード配列を含む。Sambrook,Fritch＆ManiatisによるMolecular Cloning，第二版（1989）（Co1d SpringHarbor）15.51-15.73に記載されているオリゴヌクレオチドによる変異はPE分子において欠損/変異を起こさせる簡便な方法として用いられている。PJH4をNde IおよびHindIIIで切断することにより、構造が線形化し、PEをコードする配列のATG開始コドンを含む１２塩基対の断片が切り出される。二つの相補性オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングし、Nde IおよびHindIIIで切断された部位に連結させる。オリゴマーは以下のヌクレオチド配列を有する：Ｉ-5’TAT GCT GCA GGG TAC CAAGCT TAT GGC CGA AGA３’および II−５’AGC TTC TTC GGCCAT AAG CTT GGT ACC CTG CAG CA３’。修飾されたPE 挿入部分はＮ末端にMLQGTKLMAEEの配列を持つ。本プラスミドはPJH42と命名する。プラスミドPJH42をAvaIにより部分的に切断する。線形DNAを単離し、HindIII により完全に切断することにより、5.1Kbの断片が分離される。ライゲーションを行うためにブラントエンドができるよう、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して連結用の平滑末端を形成した後、再度環状化させ、得られたプラスミドはPJH43と命名する。この操作により4-252番目のアミノ酸が欠損したPEが生成する。 SalIおよびBamHlで切断されたプラスミドPJH43の553bpの断片はM13mp19においてクローニングされる。5'GGC GTC GCCGCT GTC CGC CGG GCC GTT GGC CGC GCC G GC CTC GTC GTT GC3'の配列を有する50のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを合成し、一本鎖M13ベクターとアニーリングすることにより、PE挿入部の3 65-380番目のアミノ酸が欠損し、結果的に下記の配列が生じるような変異の誘導を容易に行うことができる。 M13において複製された変異DNAから505bpの SalI，BamH1切断断片が得られ、S al1，BamH1で切断された3.7kbのプラスミドPJH43断片と連結する。この新たなプラスミドをPJH44と命名する。 PJH44をBamH1およびEcoR1で切断することにより460ヌクレオチドの断片が得られ、M13mp19を用いてクローニングされる。本断片はコーディング配列のC末端に位置する３つのリジンのヌクレオチド配列が変異を起こしている。590、606番目のリジンはグルタミンに、613番目のリジンはアルギニンに変異している。オリゴ指示性変異はそれぞれのリジンに変異を起こさせることが可能である。リジン590-5'GCT GAT CGC CTG TTC TTG GTC GGG GAT GCT GGA C3'リジン606-5'G TC CTC GCG CGG CGG TTG GCC GGG CTG GCT G3'リジン613-5'CGG TCG CGG CAG TT A ACG CAG GTC CTC GCG CGG3' M13中の変異DNAの複製体をBamH1およびEcoR1で切断し、得られた断片をBamHＩおよびEcoR1で切断した3.4kbのプラスミドPJH44の断片と連結する。線状のプラスミドは連結することにより再度環状化し、PJH45と命名、Bethesda Research Laboratories より入手可能な市販大腸菌株，HB101を用いて、 LysPE38Ｍとして同定される修飾型PEの発現に利用される。LysPE38Mはすでに公表されているWO93/15751（Merck＆Co.,Inc）において記述されている。１１．還元型NLsPE38QQR 毒素NLysPE38QQRを12.8mg含有する溶液10mlを、pH8の緩衝塩175mgを加えることにより、pH8に調節した。EDTA二ナトリウム塩二水和物（372.24mg）およびジチオトレイトール154.25mgを添加し、毒素の265および287システインのジスルフィド結合が完全に還元されるまで、乾燥窒素ガスのもと、室温で一晩攪拌した。溶液を透析袋に移し、窒素ガスを通気しながら、0.1Ｍリン酸溶液に対して、室温で約８時間透析を行った。還元された毒素溶液をさらに0.01Mリン酸緩衝液で窒素ガスを通気しながら、室温で一晩透析を行った。透析処理終了時、反応液はチオール含量を計るための標本として、透析袋から滅菌済みプラスチック遠心チューブに移し、精製還元された毒素ジチオールは次の反応まで保存した。以下の実施例は、本発明者が意図する本発明の実施の実例であり、これらは本発明の範囲および趣旨を限定するものではない。実施例１ DLys⁶-GnRH/NLys-PE38QQR結合体の生成法先に合成された還元NLysPE38QQRの溶液5ml（SH力価を0.286マイクロモル含む）に、上記調製２で記述したN-マレイミドプロパノイル-6-D-Lys-GnRH誘導体1.2mgを加えた。反応混液は乾燥した窒素ガスの下で、室温にて一晩撹拌した。反応液を透析袋に移し、４℃にて0.01Ｍ pH7のリン酸緩衝液に対して一晩透析した。その後、さらにリン酸緩衝生理的食塩水6/Nで一晩透析を行った。化合物はクロマトグラフィーにより確認した。実施例２結合実施例４の還元された毒素ジチオール溶液5mlに1.24mgのピリジンジチオールを添加し、室温で一晩震振混和した。反応液は１）0.01ＭｐＨリン酸緩衝液、その後２）滅菌水に対して室温で一晩透析を行った。化合物はクロマトグラフィーによって確認した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/04 Ｃ０７Ｋ 14/21 Ｃ０７Ｋ 7/06 14/59 14/21 17/06 14/59 Ａ６１Ｋ 37/43 17/06 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロンバード，ビクトリア・ケイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．次式を有する結合体［ここで、Ｓは硫黄であり、 rPEはチオール-Ｓ-基を介してＬ₁と連結しているシュードモナス還元菌体外毒素であり、Ｘ¹はロイシンあるいはノルロイシンであり、Ｙはプロリンあるいは4-ヒドロキシプロリンであり、ＺはGly-NH₂，D-Ala-NH₂，NH-Et，NH-PrあるいはAza-Gly-NH₂であり、ＱはPyroGlu-His-Trp，N-アセチル-4-Cl-Phe^1,2-Trpあるいは3-インドリルプロピオニルであり｛ここで、PyroGluはであり、 N-アセチル-4-Cl-Phe^1,2-Trpはである。｝Ｗは以下の構造のＤ-あるいはＬ-アミノ酸であり、（ここで、ｒは１あるいは２であり、ｍは１から４までの整数であり、ｎは０あるいは１であり、ＢはCH₂，O，SあるいはＮであり、Ｒ¹は水素、炭素数１から６のアルキルあるいは炭素数３から８のシクロアルキルであり、（アミノ酸）_nは天然型Ｌ-アミノ酸あるいはそのＤ立体異性体であり、（Ｘ¹），（Tyr）および（Ｌ₁）はＷへのＸ¹，TryおよびＬ₁の結合部位を示す。）、Ｌ₁はである（ここで、Ｘ²は炭素数１から５のアルキレン、フェニル、あるいは炭素数５から６のシクロアルキレンであり、（Ｗ）および（Ｓ）はＷおよびＳの結合部位を示す。）２．次式を有する請求項１の結合体ここで、ＷはＤ-あるいはＬ-Lysであり、Ｙ，Ｚ，Ｌ₁およびrPEは請求項１において定義した通りである。３．シュードモナス菌体外毒素がその結合領域が部分的あるいは完全に欠損しているよう修飾されている請求項２の結合体。４．シュードモナス菌体外毒素がその1-252番アミノ酸が欠損し253-613番アミノ酸が保持されるように修飾されている請求項３の結合体。５．以下の構造を有する請求項１の結合体。ここでrPEはNLysPE38QQRである。６．以下の構造を有する請求項１の結合体。ここでrPEはNLysPE38QQRである。７．次式［ここで、Ｑ，Ｗ，Ｘ¹，ＹおよびＺは請求項１において定義した通りであり、Ｌ₁は（ただし、Ｘ²は請求項１において定義したとおりであり、haloはBr，ClあるいはＩである。）］を有するGnRH誘導体を、少なくとも一つの結合していないチオール基を有する請項１に記載の還元化シュードモナス菌体外毒素で処理することを含む請求項１の化合物の製法。８．GnRH誘導体が以下の構造を有する請求項７の方法。ここで、ＷはＤ-あるいはＬ-Lysであり、Ｙ，ＺおよびＬ₁は請求項７において定義した通りである。９．GnRH誘導体がＤ-Lys⁶-GnRHである請求項７の方法。１０．シュードモナス還元菌体外毒素が還元化NLysPE38QQRである請求項７の方法。１１．請求項１の結合体を有効量動物に投与することを含む動物の不妊処置法１２．不活性キャリアーと有効量の請求項１の結合体からなる動物の不妊処置に有用な組成物。