ES2280402T3 - Discriminacion entre gnrh-i y gnrh-ii. - Google Patents
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Abstract
Péptido que comprende por lo menos dos secuencias de decapéptido de GnRH acopladas elegidas dentro del grupo formado por: *AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC , pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC pEHWSAkLRPGQHWAAkLRPGC , pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC , pEHWSYkLRAGQHWSyLRAAGC y pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC donde es amida y * es acetilo.
Description
Discriminación entre GnRH-I y
GnRH-II.
La invención se refiere a isoformas de GnRH. La
GnRH-I (descrita habitualmente en la literatura
como GnRH) es un pequeño péptido, con una longitud de 10 aminoácidos
(decapéptido), procedente del hipotálamo. La secuencia de
aminoácidos GnRH-I (SEQ ID NO:1) se puede presentar
por el siguiente código de tres letras:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2}
o el código correspondiente de una
letra, donde pE es ácido piroglutámico y # es
amida
pE H W S Y G L R P G#
La GnRH-I actúa en la hipófisis
induciendo un aumento de la liberación de Hormona Estimulante del
Folículo biológicamente activa (FSH) y de Hormona Luteizante (LH) en
la sangre, las cuales a su vez estimulan el desarrollo de los
testículos y la síntesis de esteroides testiculares en los animales
macho en crecimiento. En los animales hembra en crecimiento, se
estimula el desarrollo de los ovarios y los folículos en su
interior, la síntesis de esteroides ováricos y la ovulación.
Se sabe que la GnHR-I, cuando se
acopla a una proteína de soporte, puede utilizarse para vacunar
animales. Dicha vacunación puede realizarse por razones diferentes,
que están relacionadas con la función natural de la
GnHR-I. Como se sabe, una reducción drástica de la
LH y/o la FSH en la sangre inhiben la producción de esteroides
testiculares o andrógenos y de esperma en los testículos del macho,
y la formación de esteroides ováricos o progestágenos y de
estrógenos y la maduración del folículo en el ovario de las
hembras. Dicha reducción en las cantidades de andrógenos,
progestágenos y estrógenos en la sangre, hasta un nivel comparable
al que se puede obtener quitando los testículos o los ovarios
mediante castración, se puede conseguir inmunizando de modo efectivo
el animal contra la GnRH-I. En los animales machos,
en muchos casos, los testículos parecen desarrollarse lentamente o
no desarrollarse en absoluto, con ausencia de síntesis de
andrógenos (hormonas esteroideas masculinas) y ausencia de formación
de espermatozoides. En los animales hembra, la actividad de los
ovarios parece disminuir, con la ausencia de síntesis de estrógenos
y progestágenos (hormonas esteroideas femeninas), e inhibición de
la maduración de los folículos y la ovulación.
Recientemente se ha comunicado en un informe,
que se encuentra presente una segunda forma de GnRH
(GnRH-II) en el cerebro de primates (Lescheid et
al. Endocrinol. 138 (1997) 5618-5629) y que se
clonó un gen para esta segunda molécula de GnRH a partir de una
biblioteca genética humana (GnRH-II, (SEQ ID NO:2)
(White et al. PNAS USA 95 (1998) 305-309).
La GnRH-I de mamíferos (SEQ ID NO:1) apenas se
expresa fuera del cerebro. Se conocen al respecto unas pocas
excepciones. La GnRH I se encuentra presente en el endometrio de
mujeres con ciclo menstrual (Casan et al., Fértil. Steril.
1998, 70, 102-106) y se expresa durante el embarazo
en la placenta humana (Kelly et al. DNA cell Biol. 1991,
10,411-421). Se halló mARN de GnRH en ovarios,
testículos, timo, placenta e hipotálamo de la rata (Oikawa et
al., Endocrin., 1990, 127, 2350-2356). Se
detectó la expresión de GnRH en tejido inmune (bazo, timo y
linfocitos de cerdos (Weesner et al., Life Sci, 1997, 61,
1643-1649).
La GnRH-II se expresa en muchos
tejidos fuera del cerebro y se encuentra en concentraciones
especialmente elevadas en los riñones, la médula ósea y la próstata.
La presencia de GnRH-II en diversos tejidos
distintos del cerebro sugiere que la GnRH-II puede
tener múltiples funciones. Además, la estructura estrictamente
conservada del péptido de GnRH-II en diversas
especies de vertebrados sugiere que este neuropéptido posee
bioactividades vitales. Hasta la fecha sin embargo, las funciones de
GnRH-II son prácticamente desconocidas. Diversos
tipos de linfocitos diferenciados, como linfocitos T y B y
mastocitos, producen péptidos similares de GnRH y similares a GnRH.
Números importantes del último tipo de células se encuentran
presentes en los riñones, la medula ósea y la próstata,
contribuyendo quizás a la elevada expresión de
GnRH-II en estos tejidos. La
GnRH-II parece menos involucrada en la reproducción
que la GnRH-I. En el ratón hipogonadal, ratón que
carece del gen de GnRH-I, se encuentran presentes
células que producen GnRH-II en la misma
distribución que en el ratón normal, pero esto no es suficiente
para inducir un desarrollo gonadal normal en estos ratones (Chen
et al., FEBS Letters 435 (1998) 199-203). No
obstante, los macacos en fase luteal del ciclo menstrual mostraron
un notable aumento en las concentraciones de hormona luteinizante
del plasma tras la administración intravenosa de
GnRH-II, pero este incremento no se pudo inducir
durante la fase medio folicular (Lescheid et al. Endocrinol.
138 (1997) 5618-5629).
La invención presenta un péptido que comprende
por lo menos dos secuencias de decapéptidos de GnRH acopladas,
elegido dentro del grupo formado por:
donde # es amida y * es un acetilo
capaz de producir una respuesta inmunológica contra formas de
Hormona de Liberación de Gonadotropina (GnRH) que recibe también el
nombre de Hormona de Liberación de Hormona Luteinizante (LHRH). La
invención ofrece también composiciones y vacunas inmunogénenicas,
productos farmacéuticos y otros preparados medicinales basados en
dicho
péptido.
La invención ofrece además la utilización de
este tipo de vacuna o preparado medicinal en un método de
inmunización de un mamífero contra la GnRH para influir en las
características de comportamiento o reproducción de dicho mamífero,
y en un método para mejorar la calidad de la carne de los cerdos.
La invención también presenta un péptido, que puede inducir una
respuesta inmunogénica selectiva contra la GnRH-I o
la GnRH-II. Además, la invención presenta
anticuerpos contra la GnRH-I y/o
GnRH-II, composiciones que comprenden estos
anticuerpos y la utilización de los péptidos en composiciones
farmacéuticas o en la preparación de un medicamento para el
tratamiento del cáncer de próstata.
La invención permite ahora entender que con unas
secuencias peptídicas que permiten discriminar entre los diferentes
tipos de GnRH, se podrá hacer un uso más adecuado y eficiente de la
variación o diferencia en la respuesta inmunológica a los
diferentes tipos de GnRH. Más particularmente, la invención permite
entender que se pueden obtener mejoras en la eficacia y la
selectividad de las vacunas contra la GnRH-I. La
inmunización contra la GnRH-I es eficaz para
neutralizar la GnRH-I y su resultado son unos
niveles de gonadotropina reducidos y el bloqueo de la síntesis de
esteroides gonadales. No obstante, no se conoce nada sobre los
posibles efectos fisiológicos de los anticuerpos producidos contra
GnRH-I sobre la función de GnRH-II.
Como la GnRH-II se sintetiza y secreta
principalmente en los riñones, los anticuerpos cultivados contra
GnRH-I que interreaccionan con
GnRH-II pueden afectar la función renal. Para evitar
los posibles efectos secundarios de la inmunización contra
GnRH-I sobre la función renal, sería deseable
dirigir la respuesta antigénica de una vacuna de inmunocastración
específicamente hacia GnRH-I y evitar posibles
efectos secundarios nocivos debidos a neutralización de
GnRH-II no gonadal.
Si lo que se necesita es anular la capacidad
reproductora solamente, generalmente con el comportamiento sexual
acompañante de una especie, sería preferible pensar en una vacuna
de inmunocastración que neutralizara específicamente la
GnRH-I. De ahí el deseo de llegar a una inmunización
selectiva contra la(s) Hormona(s) de Liberación de
Gonadotropina, de preferencia selectiva contra
GnRH-I.
En la medicina veterinaria, una inmunización
eficaz al 100% contra la GnRH-I se podría utilizar
para la esterilización de, por ejemplos pequeños animales
domésticos, como gatos y perros, machos y hembras, o para el
tratamiento de la agresividad en perros y toros, vacunándolos
simplemente en lugar de someterlos a una cirugía drástica como la
castración o la ovariectomía. Otras de las razones en las que puede
pensarse para inmunizar contra la GnRH-I son la
prevención del celo en animales hembra tales como perros, gatos y
vacas y la agitación en animales machos que se van engordando para
el matadero.
En la sanidad humana, la inmunización contra la
GnRH-I y/o la GnRH-II se puede
utilizar en el tratamiento de cáncer de próstata y cáncer de mama, y
si es preciso, en el tratamiento de algunas formas de carcinoma de
pituitaria. En el cáncer de próstata, sería más deseable
neutralizar tanto la GnRH-I como la
GnRH-II ya que la última isoforma está también
altamente expresada en el tejido prostático.
Otros de los usos de la vacuna contra la
GnRH-I es el campo de la cría de ganado,
particularmente el engorde de cerdos para el matadero. La carne de
los cerdos macho, sexualmente maduros tiene un olor típico, el
denominado olor a verraco. En los testículos del cerdo sexualmente
maduro, se forman muchos
C19-delta-16 esteroides que se
almacenan en el tejido graso del animal (Patterson, J. Sci. Food
Agric 19 31-38 (1968); Brooks en Pearson, J.
Anim. Sci. 62, 632-645 (1986); Claus,
Zeitschrift. Tierzüchtg. Züchtungsbiol. 93,
38-47 (1976); Claus, Acta Endocrinol. (Copenh.)
91, Suple. 225, 432-433 (1979)). Estos
esteroides son principalmente responsables de la formación del olor
desagradable parecido al de la orina, cuando se calienta la carne
(Fuchs, Swedish J. Agric. Res. 1, 233-237
(1971); Bonneau, Livest. Prod. Sci. 9
687-705 (1982)). Debido a este olor desagradable,
la carne de los cerdos macho sexualmente maduros resulta por lo
general no adecuada para el consumo y no apta para la exportación.
Debido a que aproximadamente el 10% de los cerdos macho que llegan
a matadero son ya sexualmente maduros antes de la matanza, esto
supone una gran pérdida potencial para la industria de cría de
cerdos.
Con el fin de controlar y evitar estas perdidas,
casi todos los cerditos macho se castran cuando son jóvenes,
sometiéndolos a una operación quirúrgica que se ejecuta por lo
general sin ninguna forma de anestesia. Aparte del aspecto poco
agradable de esta castración para el animal, esto conduce también a
infecciones, inhibición del crecimiento y una calidad final de la
carne inferior a la de un animal intacto, por lo menos mientras
dicho animal intacto no ha desarrollado el olor a verraco (Walstra,
Livest. Prod. Sci. 1, 187-96 (1974)).
Una alternativa que tiene en cuenta al animal
consiste en la reducción de la concentración de
GnRH-I en la pituitaria del cerdo por medio de la
inmunización contra la GnRH-I, la denominada
inmunocastración. Esta reducción en los niveles de
GnRH-I conduce a una reducción en la concentración
de FSH y LH biológicamente activo que, a su vez, inhibirá el
desarrollo de los testículos en los animales en crecimiento e
inhibirán la síntesis de esteroides testiculares, inclusive
androstenona, testosterona y estrógenos. Este método evita la
aparición del olor a verraco en los cerdos macho en el momento de
la matanza y hace innecesaria la castración quirúrgica ya que los
niveles de androstenona se han reducido a niveles bajos o no
detectables (Oonk et al., 1995, Livestock production Science
42, 63-71).
Uno de los requisitos estrictos que tiene que
cumplir una vacuna aceptable contra el olor a verraco reside en
que, en casi todos los cerdos se retrasa el desarrollo de los
testículos de tal forma que la aparición del olor a verraco no se
habrá producido en el momento de la matanza y que, en el caso de
que la vacuna no reduzca el desarrollo de los testículos en un
animal, esto se puede detectar fácilmente al presentar unos
testículos de tamaño demasiado grande comparado con los cerdos
sometidos con éxito a inmunocastración.
En la bibliografía existente y en las
solicitudes de patente anteriores relacionadas con las propiedades
contra la fertilidad de las vacunas contra la
GnRH-I, los resultados de las vacunaciones a menudo
parecen ser variables. En la mayoría de los estudios descritos, un
pequeño porcentaje de los animales vacunados no responde a la
vacunación o se necesitan grandes dosis de vacuna, vacunaciones
múltiples o adyuvantes comercialmente inaceptables desde el punto
de vista comercial para producir el efecto deseado (Hoskinson
et al., 1990, Austr. J. Biotech. 4, 166-170;
Falvo et al., (1986) J. Anim. Sci. 63:
986-994; Clarke et al., 1998, Endocrinology
139, 2007-2014; Adams T.E. and B.M. Adams, Feedlot
performance of sters and bulls active immunized againts
Gonadotropine-Releasing Hormona, J. Anim. Sci. 1992,
70: 1691-1698; Brown et al., Immunization of
sheep againts GnRH-I early in life: effects of
reproductive function and hormones in rams, Journal of reproduction
and Fertility (1994) 101, 15-21; Ferro et
al., Immunological castration using a
Gonadotropine-releasing Hormona analogue conjugated
to PPD, Food and agricultura) immunology, 1995, 7,
259-272; US patent 4,608,251; Int. Patent appl. WO
88/05308).
Algunos estudios sugieren una eficacia del 100%
de una vacuna contra la GnRH-I, pero la vacuna no
se probó en un gran número de animales (Ladd et al., (1994),
Development of an antifertility vaccine for pets based on active
immunization againts Luteinizing Hormona releasing hormona, Biology
of Reproduction 51, 1076-1083; J.G. Manns and S.R.
Robbins (1997). Prevention of boar Saint with a recombinant based
GnRH vaccine, In: Boar Saint entire male pigs, Proceedings of a
meeting of the EAAP working group "Production and Utilisation of
Meat from Entire Male Pigs", EAAP Publication nº 92,
137-140;); otros estudios hablan de la eficacia de
la vacuna como valor medio de los animales tratados ya que los
valores individuales no muestran una diferencia clara entre los
controles inmunizados y los no tratados (Bonneau et al., J.
Anim. Sci 72 14-20 (1994); Hennesy et
al., 1997. Elimination of boar taint; a comercial boar taint
vaccine for male pigs. IN: Bonneau, M., Lundström, K. and Malmfors,
B. (Eds.), Boar taint in entire male. Wageningen Pers. Wageningen.
EAAP Publication nº 92., 141-145).
La dificultad en la preparación de este tipo de
vacunas probablemente se debe al fenómeno de tolerancia. Las
sustancias "propias" tales como las hormonas no se reconocen
como extrañas sino que son toleradas por el sistema inmune.
Normalmente, no se producen anticuerpos contra las sustancias
propias. Para que una vacuna tenga éxito, debe ser suficientemente
"extraña". Únicamente si la vacuna es suficientemente extraña
el sistema inmune no tolerará la vacuna y se inducirá la producción
de anticuerpos. Por el contrario, sin embargo, los anticuerpos deben
ser todavía capaces de reconocer la hormona y por consiguiente la
vacuna no puede ser demasiado "extraña".
Como estas son condiciones mutuamente
excluyentes, hasta hace poco se dudaba de que se pudieran preparar
tales sustancias. Un intento de producir vacunas peptídicas de
tipo GnRH consistió en el reemplazo de la Gly en la posición 6 del
decapéptido GnRH-I por un aminoácido dextro
rotatorio (D-Tryp; Chaffaux et al., Recueil
de Médicine Vétérinaire 161(2), 133-145,
1985). Sin embargo, se demostró que una preparación de vacuna que
contenía este péptido GnRH modificado tenía un rendimiento incluso
menor que el decapéptido GnRH-I normal (sol. patente
Europea 464,124 A).
Recientemente, se ha demostrado de modo
definitivo que es posible inducir una respuesta de anticuerpos
eficaz en todos los individuos vacunados contra la
GnRH-I (Meloen et al., Vaccine 12,
741-746 (1994). En estos experimentos, los cerdos
se vacunaron dos veces con una vacuna de GnRH-I que
se aparta del tipo clásico de vacuna de GnRH-I
(GnRH-I acoplada con una proteína de soporte, en
adyuvante de Freund), en particular la vacuna de
GnRH-I en tandem (Patente Europea 0464124). En dicha
publicación, se describe un péptido que se caracteriza porque
comprende al menos dos secuencias de GnRH-I en
tandem (SEQ ID NO:3) según la fórmula general
Z^{1}-Glx-His-Trp^{1}-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-X-Gln-His-Trp^{2}-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]_{n}Gly-Z^{2},
en la que los aminoácidos se
denominan de acuerdo con el código de tres letras, Trp^{1} y
Trp^{2} son triptófano (Trp) o triptófano formilados
(N(indol)-formil-triptófano),
n es un número que tiene un valor de al menos 1, X es un enlace
directo o un grupo espaciador entre los aminoácidos Gly y Gln,
Z^{1}-Glx es pGlu (ácido piroglutámico) o Gln que
tiene unida una cola que comprende uno o más aminoácidos
adicionales, y Gly-Z^{2} es
Gly-NH_{2} o Gly que tiene unida una cola que
comprende uno o más aminoácidos adicionales. En esta fórmula
general, Z puede ser un enlace directo entre los aminoácidos
glicina y glutamina, es decir, estos aminoácidos están
interconectados directamente sin un enlace intermedio (mediante el
enlace peptídico normal). La invención de la vacuna de
GnRH-I en tandem también comprende péptidos en los
que las secuencias de GnRH-I están interconectadas
mediante espaciadores. La naturaleza del grupo espaciador puede
variar en gran medida, desde uno o más aminoácidos a una cadena
hidrocarbonada más corta o más larga y otros grupos compuestos o
moléculas. En la fórmula general anterior,
Z^{1}-Glx preferiblemente representa pGlu (ácido
piroglutámico), pero también puede representar Gln que tiene unida
una cola que comprende uno o más aminoácidos adicionales, que se
usa, por ejemplo, para el acoplamiento del péptido a una proteína
de soporte. En la fórmula general anterior,
Gly-Z^{2} representa por ejemplo
Gly-NH_{2}, o Gly que tiene unida una cola que
comprende uno o más aminoácidos adicionales, que se utilizan por
ejemplo para el acoplamiento del péptido a una proteína de soporte.
De preferencia, Gly-Z^{2} representa
Gly-Cys-NH_{2}, añadiéndose la
cisteína C terminal en relación con un posible acoplamiento del
péptido a una proteína de
soporte.
Por el documento WO 96/40755 y por Oonk et
al., Vaccine 16 (11-12),
1074-1082, 1998, se sabe que el principio
dímero-tandem aplicado a una variante de la molécula
de GnRH-I dio como resultado una vacuna altamente
eficaz en diversos adyuvantes suaves, particularmente Specol y doble
emulsión de aceite y resultaba también eficaz en dosis reducidas. En
este caso, la variante de la molécula de GnRH-I
estaba formada por sustitución del sexto aminoácido Gly del
decapéptido por un aminoácido(D-) dextro rotatorio,
D-Lys tras lo cual el péptido resultante se
dimerizaba y acoplaba a un compuesto de soporte común, ovalbúmina.
Mientras tanto, una vacuna que utilizaba aminoácido D y
sustituciones de Gly en la posición 6 del original y un solo
decapéptido de GnRH-I con un aminoácido D disminuía
la inmunogenicidad comparado con la secuencia original de
GnRH-I (Chaffaux et al., Recueil de Medicine
Vétérinaire 161(2), 133-145, 1985), dichas
sustituciones con aminoácido D aplicadas a una vacuna de
GnRH-I dímero-tandem fueron capaces
de generar preparados de vacuna de GnRH-I todavía
más inmunogénicos. No obstante, el método de vacunación requería
una dosificación repetida de la vacuna para que fuera completamente
eficaz. La necesidad de una dosificación de refuerzo adicional para
conseguir esencialmente un 100% de eficacia en la vacunación de
mamífero contra la GnRH-I constituye una desventaja
de los péptidos conocidos. Comprobamos también que en algunos casos
la utilización del tandem-dímero
(D-Lys^{6}) GnRH-I (es decir el
tandem-dímero GnRH-I con y sin la
sustitución D-Lys^{6}) tuvo como resultado
cantidades muy reducidas aunque todavía medibles de testosterona, no
deseable y que supone una desventaja del
tandem-dímero
(D-Lys^{6})GnRH-I.
La presente invención presenta secuencias de
péptidos que comprenden por lo menos dos secuencias de decapéptido
de GnRH acoplados, elegidos dentro del grupo formado por:
donde # es una amida y * es acetilo
y que proporciona alternativas al D-Lys^{6}
GnRH-I en tandem cuando se aplica en vacunas que
dan como resultado vacunas eficaces para la
inmunocastración.
Uno de los aspectos de la presente invención es
la determinación de la medida en que los aminoácidos en la secuencia
de GnRH-I en tandem se pueden modificar, siendo la
GnRH-I en tandem sustituida resultante todavía capaz
de producir una respuesta inmunogénica a GnRH-I
suficiente para la inmunocastración. Por consiguiente, la invención
presenta la generación de una secuencia de péptidos que puede
inducir la producción de anticuerpos contra GnRH-I,
suficientemente competitivos también tanto en cantidad como en
actividad.
Otro aspecto de la presente invención es ofrecer
una secuencia de péptidos que induce selectivamente la producción
de anticuerpos contra la GnRH-I, al mismo tiempo que
no induce ninguna respuesta inmune o muy poca a la
GnRH-II. Una realización preferida de ésta es una
secuencia de péptidos que no solamente induce selectivamente la
producción de anticuerpos contra GnRH-I sino que
resulta también eficaz en la inmunocastración, quedando reducida o
inexistente una respuesta inmune a la GnRH-II.
Los presentes inventores han descubierto que en
la secuencia de péptidos de GnRH-I en tandem de la
invención se pueden sustituir varios aminoácidos, con el resultado
de una reducción en la semejanza a la auto-hormona,
al mismo tiempo que retiene o incluso aumenta la aptitud del
péptido para producir anticuerpos de fijación de
GnRH-I. Asimismo, algunas sustituciones de
aminoácidos en la secuencia de péptidos de GnRH-I
dan como resultado una respuesta inmune selectiva respecto de
GnRH-I y una respuesta inmune reducida o inexistente
a la GnRH-II.
En un aspecto de la invención, ciertas
secuencias de péptidos de GnRH-I en tandem
modificadas proporcionan vacunas que no solamente son capaces de
reducir el crecimiento de los testículos en los animales macho sino
que pueden también reducir esencialmente los niveles de testosterona
hasta un grado que no puede ser determinado por técnicas
convencionales.
Además, las vacunas preparadas a partir de estas
secuencias de péptidos expresan una actividad que en la mayoría de
los casos eliminaron la necesidad de la segunda inmunización de
refuerzo, como ocurre con la GnRH-I en tandem
D-Lys^{6} convencional, para conseguir una
actividad esencialmente del 100%. Una actividad o eficacia del 100%
en los términos de la presente invención se define como un nivel
de testosterona prácticamente indetectable con las técnicas
convencionales tras una sola vacunación.
Una de las características más notables de la
presente invención es que los anticuerpos producidos por estas
vacunas de GnRH-I alternativas discriminan entre
GnRH-I y GnRH-II. Por consiguiente,
los péptidos según la invención expresan una actividad incrementada
o retenida frente a GnRH-I, mientras que al mismo
tiempo se encuentra una respuesta inmune o inexistente a
GnRH-II. Esto permite el desarrollo de péptidos que
expresan un efecto inverso, es decir, que expresa una actividad
incrementada o retenida contra GnRH-II mientras que
al mismo tiempo expresan una respuesta inmune reducida o inexistente
a GnRH-I. Esta respuesta específica a
GnRH-II se podría utilizar para ayudar a suprimir
la embrio-implantación en mamíferos en los que la
preñez no es deseada o lo es muy poco. Además, utilizando una
respuesta específica GnRH-II de este tipo, se pueden
reducir por regulación los niveles de FSH con el resultado de una
fertilidad global reducida.
La invención se refiere en un aspecto a un
péptido que comprende una secuencia de decapéptidos de
GnRH-I en tandem modificada, donde la vacunación
con el péptido en una dosificación adecuada, permite un nivel de
testosterona prácticamente no detectable.
La invención se refiere también a un péptido que
comprende al menos dos secuencias de decapéptidos de
GnRH-I acoplados, opcionalmente acoplados mediante
un espaciador, que permite una respuesta inmunogénica que permite a
su vez la discriminación eficaz entre GnRH-I y
GnRH-II.
Los péptidos según la invención son bastante
similares a la hormona pero al mismo tiempo más "foráneos" al
sistema inmune y tienen una capacidad incrementada para inducir la
producción de anticuerpos dirigidos contra la hormona.
Una característica de la invención es que se
pueden dimerizar unidades tandem individuales para seguir
potenciando su inmunogenicidad sin perder la posibilidad de acoplar
el péptido o la composición de péptidos a una proteína compuesto de
soporte.
Se pueden utilizar las técnicas para la
dimerización y el acoplamiento del tandem a un soporte similar a
los descritos en el documento WO 96/40755. También se pueden
utilizar en la presente invención péptidos que contienen únicamente
una parte de las secuencias de péptidos GnRH-I ó
II. Como ejemplos de los mismos se pueden citar nonapéptidos y
undecapéptidos.
Los ligantes que se utilizan en los péptidos
según la invención se puede elegir entre los ligantes descritos en
otras partes de la presente solicitud o ligantes tales como ligantes
SMCC u otros conocidos en el estado de la técnica.
Se utilizan ligantes para acoplar dos o más
secuencias de péptidos dimerizados. El aminoácido que se utiliza
para sustituir el aminoácido en las secuencias de péptidos en tandem
es de preferencia un aminoácido relativamente sencillo como la
alanina. En una realización preferida, el aminoácido diferente es
alanina. También se pueden usar otros aminoácidos para sustituir el
aminoácido en la secuencia de decapéptidos en tandem. De
preferencia, únicamente se realizan sustituciones conservativas. Las
sustituciones conservativas son sustituciones de aminoácidos en las
cuales se sustituyen aminoácidos "bulky" por aminoácidos
"bulky", aminoácidos aromáticos por aminoácidos aromáticos
etc. Estos conceptos son conocidos por los expertos en la
materia.
Se pueden colocar espaciadores entre los
péptidos según la invención. Esto permite la formación de
multímeros. En el estado de la técnica se conocen espaciadores
adecuados.
Competición para fijar GnRH yodado con antisuero
por parte de GnRH (círculos abiertos), GnRH-II
(círculos sólidos), péptido de control (cuadrado sólido) y ningún
péptido (asterisco). El suero se diluye 1/10000 y se añaden
concentración crecientes de péptidos (0,25, 2,5 25 pmol) por
pocillo. En los gráficos A-C se muestran sueros con
capacidad creciente de fijación de GnRH-II. Eje
horizontal: cantidad de péptido (pmol por pocillo); eje vertical:
capacidad de fijación (recuentos por minuto).
Porcentaje de GnRH-I yodado
desplazado por GnRH-I (figura 2A) y
GnRH-II (figura 2B) para sueros de animales
individuales (cada barra representa un animal) tras la inmunización
con péptidos dímero-tandem G6k-GnRH
con sustituciones de alanina según se indica debajo de cada grupo
de barras. El antisuero obtenido tres semanas después de la
inmunización de refuerzo (10 semanas después de la vacunación) se
diluyó 1:100 a 1:10000. Se añadió GnRH-I y
GnRH-II para el desplazamiento en 250 pmol por ml de
concentración.
Figura
2A
- \quad
- Eje horizontal: péptidos utilizados para la inmunización
- \quad
- Eje vertical: porcentaje de desplazamiento de GnRH-I yodado por GnRH-I
Figura
2B
- \quad
- Eje horizontal: péptidos utilizados para la inmunización
- \quad
- Eje vertical: porcentaje de desplazamiento de GnRH-I yodado por GnRH-II
Porcentaje de GnRH-I yodado
desplazado por GnRH-I (figura 3A) y
GnRH-II (figura 3B) para sueros de animales
individuales (cada barra representa un animal) tras la inmunización
con péptidos
G6k-GnRH-tandem-dímero
con sustituciones de alanina tal como lo se indica debajo de cada
grupo de barras. El antisuero se obtuvo en el momento de la
inmunización de refuerzo (7 semanas después de la vacunación) y se
diluyó de 1:100 a 1:10000. Se añadió GnRH-I y
GnRH-II para el desplazamiento en una concentración
de 250 pmol por ml. No se incluyen datos de H2A y W3A ya que los
valores de anticuerpo eran demasiado bajos para medir el
desplazamiento.
Figura
3A
- \quad
- Eje horizontal: péptidos utilizados para la inmunización
- \quad
- Eje vertical: porcentaje de desplazamiento de GnRH-I yodado por GnRH-I
Figura
3B
- \quad
- Eje horizontal: péptidos utilizados para la inmunización
- \quad
- Eje vertical: porcentaje de desplazamiento de GnRH-I yodado por GnRH-II
Eficacia de inmunocastración de diversos grupos
de cerdos inmunizados con péptidos
GnRH-tandem-dímero
(62 \mug) conjugado con ovalbúmina Specol utilizados como adyuvante. El péptido inicial era GnRH tandem (Cys-OH) dímero (abreviado Cys-OH). De este péptido, se utilizaron para la inmunización todos los péptidos scan de alanina. La eficacia de la inmunocastración se determinó sobre una escala de 1 a 4 (1=no se produjo inmunocastración, 2=una minoría de los cerdos fue inmunocastrada, 3=una mayoría de los cerdos fue inmunocastrada, 4=todos los cerdos fueron inmunocastrados).
(62 \mug) conjugado con ovalbúmina Specol utilizados como adyuvante. El péptido inicial era GnRH tandem (Cys-OH) dímero (abreviado Cys-OH). De este péptido, se utilizaron para la inmunización todos los péptidos scan de alanina. La eficacia de la inmunocastración se determinó sobre una escala de 1 a 4 (1=no se produjo inmunocastración, 2=una minoría de los cerdos fue inmunocastrada, 3=una mayoría de los cerdos fue inmunocastrada, 4=todos los cerdos fueron inmunocastrados).
Porcentaje de GnRH-I yodado
desplazado por GnRH-I (fig. 5A) y
GnRH-II (fig. 5B) para sueros de animales
individuales (cada barra representa un animal) tras inmunización con
péptidos GnRH-tandem-dímero con
sustituciones de alanina según lo indicado por debajo de cada grupo
de barras. El antisuero obtenido 3 semanas después de la
inmunización de refuerzo (10 semanas después de la vacunación) se
diluyó 1:100 a 1:10000. Se añadió GnRH-I y
GnRH-II para el desplazamiento en concentración de
250 pmol por ml.
Figura
5A
- \quad
- Eje horizontal: péptidos utilizados para la inmunización
- \quad
- Eje vertical: porcentaje de desplazamiento de GnRH-I yodado por GnRH-I
Figura
5B
- \quad
- Eje horizontal: péptidos utilizados para la inmunización
- \quad
- Eje vertical: porcentaje de desplazamiento de GnRH-I yodado por GnRH-II
Los péptidos según la invención comprenden por
lo menos dos secuencias de decapéptidos GnRH acoplados, elegidos
dentro del grupo formado por
\vskip1.000000\baselineskip
donde # es amida y * es
acetilo.
Los péptidos según la invención están
relacionados con la fórmula general dada por (SEQ ID NO:4) o por el
siguiente código de una letra:
pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#
En esta fórmula general, Q representa Gln y
puede ir precedido de X, donde X representa un espaciador. Varios de
estos aminoácidos han sido sustituidos por otros aminoácidos. En
las fórmulas, se indica la posición de la sustitución. Las
mayúsculas en negrita y subrayadas representan aminoácidos
levorrotatorios, las letras en minúsculas representan aminoácidos
dextrorrotatorios, p. ejem. K:L-Lys;
k:D-Lys. Se ha determinado posteriormente su
respuesta inmunogénica cuando se acoplan a un soporte, por lo
general ovalbúmina, aunque se pueden utilizar otros soportes como
KLH, BSA.
Se puede ver claramente que la secuencia del
péptido GnRH-II (SEQ ID NO:2) determina cuál de los
aminoácidos puede sustituirse, de modo que sea todavía posible una
discriminación eficaz basada en la respuesta inmune entre las dos
secuencias GnRH-I y GnRH-II.
Para determinar si los anticuerpos obtenidos por
las vacunas GnRH según la presente invención discriminaban entre
GnRH-I y GnRH-II, se realizó un
ensayo de fijación de anticuerpo GnRH con el objeto de determinar
si se producían anticuerpos frente a péptido
GnRH-I-tandem-dímero
o si sus análogos de sustitución de alanina interaccionan con
GnRH-II o carecen de unión con
GnRH-II. Se pre-incubaron diluciones
de suero con GnRH-I, GnRH-II, un
péptido de control o ningún péptido. A continuación, se añadió
GnRH-I yodado para competir con los péptidos
pre-incubados para la fijación a los
anticuerpos.
Este procedimiento se realizó para el suero
recogido antes y después de la inmunización de refuerzo, ya que la
especificidad de los anticuerpos puede aumentar tras la inmunización
de refuerzo.
Cuando se utilizaron los péptidos según la
invención como el conjugado con ovalbúmina (OVA conjugado) y se
compararon con los controles, todos mostraron eficacia en la
inmunocastración de jóvenes cerdos macho. La comparación con el
conocido G6k-GnRH tandem dímero OVA conjugado (véase
tabla 1) mostró que los péptidos según la invención presentaban una
eficacia comparable o similar aunque había disminuido su semejanza
con la auto-hormona GnRH-I. Los
péptidos según la invención dan una respuesta inmunogénica que
permite la discriminación eficaz entre GnRH-I y
GnRH-II. Estos péptidos dieron como resultado unos
testículos pequeños y unos niveles bajos de testosterona. Más
específicamente, los péptidos que expresan un peso bajo de
testículos y un nivel bajo de testosterona, son R8A, G10A y S4A.
Los péptidos preferidos basados en la selectividad inmunológica
entre GnRH-I y GnRH-II son S4A y
pE1A.
En una realización preferida, el péptido se
elige dentro del grupo formado por
pEHWAYkLRPGHWAYkLRPGC# (SEQ ID NO:5),
pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC# (SEQ ID NO:6) y
pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# (SEQ ID NO:7).
Se elige todavía mejor dentro del grupo formado
por pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC # (SEQ ID NO:6); y
pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# (SEQ ID NO:7).
En los péptidos según la invención, la
dimerización puede realizarse por ejemplo a través del terminal
carboxilo o a través del terminal amino. Se pueden dimerizar por
ejemplo dos unidades tandem mediante un puente de disulfuro o
tioéter. Para dimerizar las secuencias tandem se puede utilizar el
Cys en la posición 21, o se puede sintetizar Cys antes que el ácido
glutámico en la posición 1. También se pueden encontrar en el
estado de la técnica otros métodos para dimerizar o multimerizar
las unidades tandem GnRH. Si el Cys en la posición 21 está
involucrado en la dimerización y por consiguiente no se encuentra
disponible para el acoplamiento, es probablemente posible utilizar
otro aminoácido del tandem que se pueda acoplar. Si la dimerización
o multimerización tiene por consecuencia la pérdida de zonas
accesibles donde se puede conjugar un compuesto de soporte, es
suficiente con restringir la elección de aminoácidos de sustitución
a unos aminoácidos con una cadena lateral apropiada. Este aminoácido
de sustitución puede ser por ejemplo L o D-Lys, L o
D-Glu u otro aminoácido que contiene una cadena
lateral que permite el acoplamiento a un compuesto de soporte. Se
han sometido a prueba tanto las sustituciones L como las D y se ha
visto que tienen el mismo efecto.
La invención ofrece además una composición que
comprende un péptido en forma inmunogénica. Como todo experto sabe,
existen varios métodos para producir una forma inmunogénica de una
sustancia que, por si misma no es inmunogénica. Una posibilidad
consiste en acoplar un péptido según la invención a una proteína de
soporte adecuada. Una proteína de soporte adecuada es la ovalbúmina,
KLH o BSA. En un péptido en tandem se puede utilizar adecuadamente
una cisteína en/o el Terminal-C para un
acoplamiento químico. En el péptido tandem-dímero,
el acoplamiento se puede realizar también utilizando la cadena
lateral sin más o la modificada de (D-)lisina, (D-)glutamina, u otro
aminoácido modificado que sustituye aminoácidos de la secuencia de
péptidos. Los expertos en la materia conocen bien los métodos de
acoplamiento así como las proteínas de soporte adecuadas.
Según la invención, se prefiere una composición
que se caracteriza porque comprende un conjugado inmunogénico de
una proteína, como ovalbúmina y un péptido o composición de
péptidos.
Se puede utilizar una composición según la
invención en forma de vacuna. Para ello, la composición se puede
producir en una forma que permita la administración. Con la
administración de una vacuna según la invención, se genera una
respuesta inmunogénica contra GnRH, de preferencia una respuesta
inmunogénica contra GnRH-I.
\newpage
La invención ofrece por lo tanto también un
método de inmunización de un mamífero contra
GnRH-I, mediante la vacunación del mamífero con una
vacuna según la invención. En una realización preferida, la
invención ofrece un método para la inmunización selectiva de un
mamífero contra GnRH-I, con una vacuna según la
invención.
La preparación de vacuna según la invención se
puede combinar, por supuesto, con al menos un inmunoadyuvante. Los
expertos en la materia conocen bien los inmunoadyuvantes adecuados.
Una realización preferida según la invención puede ser Specol o una
emulsión doble de aceite, pero se pueden utilizar otros adyuvantes
que no provocan ninguna reacción secundaria o solamente una
reacción suave. La invención se puede utilizar en métodos para la
inmunización de individuos elegidos dentro de una amplia gama de
vertebrados y particularmente mamíferos, contra la
GnRH-I. En una realización preferida de la
invención, la vacuna se puede administrar en una sola dosis, que
tiene la misma eficacia que las vacunas conocidas actualmente, que
se tienen que administrar en forma de dos dosis. La inmunización
contra la GnRH-I, de preferencia selectiva, se
podría utilizar por ejemplo para la esterilización de, por ejemplo,
pequeños animales domésticos como gatos y perros machos y hembras, o
para el tratamiento de la agresividad en perros machos y toros.
Otras razones de inmunización contra la GnRH-I con
la presente invención son la prevención del celo en animales
hembras como perros, gatos y vacas así como evitar o tratar la
agitación en animales machos que se están engordando para el
matadero. En la sanidad humana, se puede utilizar la inmunización
con GnRH, de preferencia selectiva contra GnRH-I o
GnRH-II en el tratamiento de cáncer de próstata y
cáncer de mama y, si es preciso, en el tratamiento de algunas formas
de carcinoma de la pituitaria.
Una realización preferida es un método para
mejorar la calidad de la carne de cerdos, donde se vacuna a los
cerdos con una preparación de vacuna según la invención. La
invención se ilustra en la siguiente parte experimental.
El acetonitrilo (ACN) era de calidad gradiente
HPLC-S, la N-metilpirrolidona
(NMP), diisopropiletilamina (DIEA), dimetilformamida (DMF), ácido
trifluoracético (TFA) y piperidina eran de calidad de síntesis de
péptidos y se obtuvieron todos en Biosolve (Valkenswaard, NL). Los
N-hidroxi-benzotriazoles (HOBt) y
2-(1H-benzotriazol-1-il-1,1,3,3-tetrametiluronio
hexafluorfosfato (HBTU) se obtuvieron en Richelieu Biotechnologies
Inc. (Hamon, Canadá). El
benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio
hexafluorfosfato (Py BOP) se obtuvo en Novabiochem (Laufefingen,
Suiza). El tioanisol (TA), etanoditiol (EDT), dimetilsulfóxido
(DMSO), pentano y dimetilaminopiridina (DMAP) eran de calidad
proanálisis y se obtuvieron en Merck (Darmstad, Alemania). El
dietileter se purificó sobre una columna de óxido de aluminio básico
activado. Los derivados y resinas de aminoácidos se obtuvieron en
Bachem Feinchemicalien AG (Bubendorf, Suiza).
Se programó un Hamilton MIcrolab 2200 para
suministrar disolventes de lavado y reactivos a un soporte para
tubos con 40 columnas individuales de 4 ml con filtro, que
contenían 30 mmol de resina para la síntesis peptídica. Las columnas
se drenaron después de cada etapa al vacío. El ciclo de acoplamiento
se basó en la química Fmoc utilizando etapas de acoplamiento
dobles:
1. Lavado NMP (1 ml)
2. 30% (v/v) piperidina/NMP (3 minutos, 0,5
ml)
3. 30% (v/v) piperidina/NMP (17 minutos, 0,5
ml)
4. Lavado NMP (5 x 1 ml)
5. Acoplamiento doble (2 x 30 minutos)
6. Lavado NMP (2 x 1 ml)
Etapa de acoplamiento: se trasladaron al
recipiente de reacción Fmoc-aminoácidos en NMP (0,4
M, 0,25 ml), HBTU/HOBt (0,45 M, 0,22 ml) en DMF, y DIEA (2 M, 0,2
ml) en NMP y se dejaron reaccionar durante 30-50
minutos. La mezcla de reacción se drenó y se repitió una vez el
proceso de acoplamiento.
Después del acoplamiento del último aminoácido,
el grupo Fmoc se separó con 30% piperidina/NMP, los péptidos se
lavaron, se acetilaron en 30 minutos, utilizando NMP/anhídrido
acético/DIEA 10/1/0,2, se lavaron nuevamente y se secaron. Los
péptidos se desprotegieron y separaron en dos horas en una mezcla
de 1,5 ml de TFA/fenol/TA/agua/EDT 10/0,75/0,5/0,5/0,25 (reactivo
K). La mezcla de separación se filtró, se lavó la resina con 0,5 ml
TFA y el péptido se precipitó añadiendo 13 ml de
pentano/dimetiléter 1/1. Tras la centrifugación, se extrajo el
precipitado nuevamente con pentanol/dietiléter. El precipitado se
secó, se disolvió en ACN/agua 1/1 y se liofilizó. Este
procedimiento proporciona, según el peso molecular, de 25 a 70 mg de
péptido.
En el cuadro 1 se recogen las secuencias
peptídicas sintetizadas en código de aminoácido de una sola
letra.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el análisis de péptidos usamos un sistema
(electrospray) LC-MS que consta de dos bombas Waters
modelo 510, un controlador de ardiente Waters modelo 680, un
autoinyector Waters CISP 712 y un detector de serie de fotodiodos
Waters 991. El espectrómetro de masas era un MIcromass Quatro II sq,
que se usó en modo ion positivo. Los productos se analizaron en un
gradiente lineal de 10% ACN/agua con 0,05% TFA hasta 70% ACN/agua
con 0,05% TFA en 30 minutos sobre una columna Waters Delta Pak
C18-100\ring{A} (3,9 X 150 mm, 5 mm) a un 1
ml/min y 215 nm. Todos los productos tenían una pureza comprendida
en 40 y 70% según superficie del pico.
Se dimerizaron productos crudos disolviendo los
productos en DMSO al 20% en agua. El pH se ajustó a
5-6 con NH4HCO3 al 1%, manteniendo una solución
transparente. La corrección del pH se hizo con ácido acético al 1%.
Después de agitar a temperatura ambiente durante al menos 5 horas,
se almacenaron los productos a -20ºC hasta la purificación.
Las purificaciones de péptidos se realizaron
usando un cromatógrafo líquido Waters Prep 4000, equipado con un
módulo Waters RCM con dos cartuchos PrePak más cartucho guard (40 x
210 mm ó 25 x 210 mm) rellenos de material delta-Pak
C18-100\ring{A} (15 mm). En general, las
purificaciones se realizaron utilizando los mismos eluyentes que en
el HPLC analítico, pero con una velocidad de gradiente de 0,5%
ACN/min y un caudal de 40 ó 100 ml/min. Se detectaron péptidos en
215-230 nm utilizando un espectrofotómetro Waters
586 con una célula preparativa. Los péptidos se liofilizaron y se
determinó la pureza que era de por lo menos 90%.
Para la conjugación por medio de
N-etil-N=-(3'-dimetilaminopropil)
carbodiimida hidrocloruro ("EDC") a albúmina de huevo de pollo
("OVA") se disolvió un peso igual del péptido y de la proteína
de soporte separado en agua milliQ y se mezclaron bien ambas
soluciones. Después se disuelve un exceso de 10 X basado en
equivalentes en peso, de EDC en agua milliQ. Posteriormente, se
añade lentamente esta solución a la solución de péptido/OVA,
agitando de forma continua; el pH de esta solución final es 5.
Después de al menos 6 horas de agitación lenta el producto se
dializó (límite de MP 10000) frente a un exceso (300 veces de agua
milliQ durante dos días. Se refrescó el agua dos veces al día. La
carga se calculó a partir de un análisis comparativo de los
aminoácidos del conjugado y la proteína de soporte. El análisis de
los aminoácidos se realizó utilizando un sistema Waters
Pico-Tag después de la hidrólisis en una estación de
trabajo Pico-Tag utilizando HCL 6N a 150ºC durante
1 hora, y derivación con isotiocianato de fenilo.
Según el análisis de los aminoácidos, los
conjugados contenían entre 0,3 y 0,5 mg de péptido por mg de
proteína de soporte, con la excepción del conjugado
P9A-GnRH-tandem-dímero
que contenía solamente 0,16 mg de péptido por mg de ovalbúmina.
La abreviatura del conjugado
P9A-GnRH-tandem-dímero
OVA es G6K-TD. Los conjugados con sustituciones de
alanina son abreviados por el aminoácido en la secuencia de GnRH
nativa que se sustituye. Su posición y un A por la sustitución de
alanina. Por ejemplo el conjugado
pE1A-G6k-GnRH-tandem-dímero
OVA es pE1A.
Se utilizó como fase oleosa (Bokhout et
al., 1981) Specol (Special Oil Phase, ID-DLO,
Lelystad, Países Bajos) constituido por dos detergentes en un
aceite mineral ligero. Las emulsiones de
agua-en-aceite (WIO) se prepararon
utilizando un Ultra Turrax (Janke y Kundel, Staufen, Alemania) con
una barra de agitación. La fase oleosa Specol (5 partes v/v) se
llevó a un recipiente de cristal de 25 ml y se añadió lentamente la
fase acuosa (4 partes v/v) que constituía el conjugado en agua
milli Q mientras se agitaba la emulsión. Después de añadir la fase
acuosa, la emulsión se agitó durante medio minuto con la misma
velocidad de rotación (15000 rpm). Las emulsiones se almacenaron
durante la noche a 4ºC para comprobar la estabilidad y se
administraron a los animales al día siguiente.
En el experimento participaron lechones machos,
de aproximadamente 10 semanas de edad. Los cerditos híbridos se
alojaron en espacios con semi-rendijas y se les
permitió acceso ad libitum a la comida y al agua.
Se asignaron aleatoriamente los cerditos a los
tratamientos, 6 o 7 cerditos por tratamiento. Se inyectó a todos
los animales 2 ml de emulsión que contenía los conjugados GnRH
tandem-dimerizados (es decir 62 \mug de péptido) o
una emulsión sin antígeno. Las inyecciones se administraron por
vía intramuscular en el cuello, al comienzo del experimento (día 0)
y 7 semanas más tarde (después de la vacunación). Trece semanas
después de la inmunización (después de la vacunación) se mataron
todos los animales.
Se pesaron los animales el día 0 y el día 7 y 13
semanas después de la vacunación. Se determinaron el tamaño de los
testículos midiendo la longitud de los testículos con un calibre
vernier el día 0 y 7, 10 y 13 semanas después. Los tamaños de los
testículos se registraron como media de ambos testículos.
Se tomaron muestras de sangre mediante punción
de la vena jugularis los mismos días que se midieron los tamaños
de testículos y también 4 semanas después de la inmunización
inicial. Las muestras de sangre se mantuvieron durante la noche a
4ºC y el día siguiente se obtuvo suero por centrifugación (1500 g,
15 minutos). Se almacenaron muestras de suero a -20ºC hasta el
ensayo.
Después de la matanza se extirparon los
testículos, se disecaron libres de epididimos y se pesaron. Se
registraron los pesos de los testículos como media de ambos
testículos.
Los anticuerpos de los péptidos utilizados para
la inmunización se determinaron con ELISA. Los péptidos se
recubrieron en los pocillos de una placa de microvaloración
utilizando glutardialdehído (GDA). Se recubrió el GDA hasta la
superficie de los pocillos por incubación con 0,2% GDA en tampón de
fosfato de 0,1 M (pH 5) durante 4 horas a temperatura ambiente. Las
placas se enjuagaron 3 veces durante 10 minutos con tampón de
fosfato 0,1 M (pH 8). Se recubrió 1 microgramo de péptido en 100 ml
de tampón de fosfato (0,1 M, pH 8) por pocillo, incubando durante 3
horas a 37ºC. Las placas se almacenaron a -20ºC hasta su
utilización. Las placas descongeladas se enjuagaron tres veces
durante 10 minutos con agua milli Q que contenía 8,2 g NaCl, 1,15 g
Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O, 0,20 g NaH_{2}PO_{4}.2H2O y 5 ml
de una solución Tween 80 al 10% en agua por litro de agua.
Se dejó reaccionar con los péptidos recubiertos
durante 1 hora a 25ºC diluciones de suero en serie de los sueros
antipeptídicos. Después de enjuagar 3 veces 10 minutos se introdujo
cabra-anticerdo IgG acoplado con peroxidasa de
rábano picante (Dako, Glastrup, Dinamarca) como segundo anticuerpo
durante 1 hora y se utilizó como sustrato ABTS (Boehringer,
Mannheim, Alemania) ((259 ml (2 g/100 ml) en 10 ml de tampón
sustrato con 20 ml H_{2}O_{2} (solución 3%)). Se midió la
absorción a 405 nm.
Se determinaron los anticuerpos de GnRH en la
forma descrita por Meloen et al (Vaccine 12, 741.746
(1994)). Se dejó interaccionar diluciones en serie de los
antisueros de cerdo con ^{125}I-GnRH. Los
valores/títulos se expresan con porcentaje de unión de
^{125}I-GnRH con una dilución de suero dada.
Se determinaron los niveles de testosterona en
el suero utilizando un kit
Coat-a-Count que se compró en DPC
laboratories, Los Angeles, CA.
Siete semanas después de la primera
inmunización, se pudieron observar ya los efectos de la
inmunocastración al medir el tamaño de los testículos. Tres
tratamientos (R8A, G10A y G6k-TD) a penas mostraron
incremento alguno (<10 mm) del tamaño medio de los testículos en
el momento del refuerzo. Estos tratamientos tuvieron éxito con pesos
de testículos en el momento de la matanza de 70 g o menos. Otros
tratamientos que fueron eficaces en términos de pesos reducidos de
testículos son: pE1A y S4A, mientras que en el grupo Y5A, L7A y
P9A, 2, 1 y 1 animales no respondieron a las inmunizaciones
respectivamente (Cuadro 2). El peso de los testículos individuales
de animales inmunocastrados no superaron los 70 g, lo cual supone
una diferencia clara entre los animales inmunocastrados y los no
inmunocastrados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores medios de anticuerpos contra los
péptidos utilizados para la inmunización se dan en el cuadro 3. El
valor medio de anticuerpos de cerdos tratados con H2A y P9A son
inferiores al valor de anticuerpo peptídico de otros
tratamientos.
Los valores de anticuerpos de animales
individuales contra los diversos péptidos oscilaron entre 2 y 4.
Dentro de un tratamiento, los animales que no fueron
inmunocastrados mostraron el valor antipeptídico inferior. Los
animales tratados con H2A y W3A no fueron inmunocastrados pero
había valores importantes de antipéptidos.
Los porcentajes de fijación de anticuerpos GnRH
en dilución de suero 1/2000 fueron indetectables o bajos en los
grupos H2A y W3A. No obstante, con una dilución de suero 1/200 se
podían detectar anticuerpos en los sueros de todos los animales del
grupo H2A y 3 animales del grupo W3A.
Los animales con valores medios bajo de
anticuerpo GnRH no fueron inmunocastrados. Los valores de
anticuerpos elevados dieron siempre como resultado animales
castrados con éxito. El peso de los testículos de animales con
valores de anticuerpos intermedios oscilaba entre 15 y 300 g.
Los valores medios de anticuerpos GnRH por
tratamiento mostraron una clara relación con el peso de los
testículos (media) por tratamiento (cuadro 3).
Los niveles de testosterona de animales tratados
con éxito eran bajos y disminuyeron después de la segunda
inmunización. No obstante una mayoría (n=31) de los animales
presentaba un efecto de la castración tan pronto como 4 semanas
después de la inmunización inicial, mostrando niveles no
detectables de testosterona. El peso de los testículos de estos
animales oscilaba entre 8 y 36 gramos.
La mayoría de los animales quedaron por tanto
inmunizados de modo eficaz tras la administración de una sola
dosis.
Aunque los niveles de testosterona en la matanza
eran bajos para todos los animales inmunocastrados, dos animales
con pesos de testículos de 65 y 70 gramos presentaban niveles
considerables de testosterona suero, de 3,80 a 1,18 pmol/ml
respectivamente.
Los péptidos que dieron como resultado un peso
de testículos bajo combinado con niveles no detectables de
testosterona se consideran los péptidos más eficaces para la
inmunocastración de cerdos. Estos péptidos son S4A, R8A y G10A.
Los niveles de testosterona en la matanza de
cerdos no inmunocastrados oscilaban entre 0,46 y 48,91 pmol/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sustituye D-lisina (k) en las
posiciones 6, 16, 27 y 37 en un dímero tandem por una
L-lisina (K) y se somete a prueba el péptido
resultante (Cuadro 4).
- G6k-GnRH-tandem: pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#
- (SEQ ID NO:9)
- G6k-GnRH-tandem: PEHWSYKLRPGQHWSYKLRPGC#
- (SEQ ID NO:14)
\vskip1.000000\baselineskip
La sustitución de D-lisina por
L-lisina no altera la eficacia del antígeno de la
vacuna.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un radioinmunoensayo competitivo de
fijación de anticuerpos GnRH con el objeto de determinar si los
anticuerpos producidos contra
G6K-GnRH-tandem (SEQ ID NO:9)
péptido dímero o sus análogos de sustitución de alanina interactúan
con GnRH-II o carecen de interacción con
GnRH-II. Se preincubaron diluciones de suero con
GnRH-I, GnRH-II, un péptido de
control o sin péptido. Seguidamente se añadió
GnRH-I yodado para competir con los péptidos
preincubados para interactuar con los anticuerpos.
Este procedimiento se realizó para suero
recogido antes y después de la inmunización de refuerzo, ya que la
especificidad de los anticuerpos puede aumentar después de la
inmunización de refuerzo debido a la maduración del anticuerpo.
Unas muestras de suero 7 semanas después de la
vacunación y de la extracción 10 semanas después de la vacunación
(3 semanas después de la inmunización de refuerzo) se diluyeron
1/100-1/10000 en PBS con BSA al 0,4% (tampón de
dilución). Se pusieron 50 \mul de dilución de suero en placas de
micropocillos y se añadieron 25 \mul de solución peptídica (0, 0,
25, 2,5 ó 25 pmol de péptido tampón de dilución por pocillo). Se
dejó que la mezcla incubara durante 24 horas a 4ºC. Al día siguiente
se añadieron 25 \mul de GnRH yodado (aproximadamente 13000 cpm) y
después de almacenar durante la noche (4ºC) se separó péptido no
ligado de péptido ligado con carbón vegetal. Después de la
centrifugación se separó el sobrenadante se recontó y se calculó el
porcentaje de GnRH yodado ligado a los anticuerpos.
Se determinó la fijación de anticuerpos
GnRH-I yodado para los sueros de todos los
tratamientos con excepción de H2A y W3A, sueros obtenidos a las 7
semanas tras la vacunación. La competición con
GnRH-I dio como resultado una reducción drástica de
la fijación de GnRH-I yodado (ver fig. 1), mientras
que el desplazamiento de GnRH-I yodado por
GnRH-II era altamente variable. Según lo esperado,
ninguno de los antisueros interaccionó con el péptido de
control.
Para los sueros de 10 semanas después de la
vacunación: en los sueros de casi todos los tratamientos, el
GnRH-I yodado fue desplazado por
GnRH-I en más de un 80% (figura 2A). La competición
por parte GnRH-II para la fijación de anticuerpos a
GnRH-I yodado dio como resultado un desplazamiento
total o parcial del GnRH-I yodado en casi todos los
sueros de los tratamientos R8A, P9A, G10A y G6k-TD y
en la mitad de los sueros de los tratamientos Y5A y L7A (figura
2B). No obstante, los anticuerpos de prácticamente la totalidad de
los animales del grupo pE1A, H2A, W3A y S4A carecían completamente
de interacción con GnRH-II y eran por lo tanto
específicos de GnRH-I.
Los resultados de los estudios de desplazamiento
de los sueros anteriores al refuerzo (7 semanas después de la
vacunación) eran diferentes de los de los sueros 10 semanas después
de la vacunación. Nuevamente, los sueros de todos los tratamientos
(con la excepción de H2A y W3A, debido a valores bajos de
anticuerpo) reconocieron la GnRH-I como determinada
por desplazamiento de GnRH-I yodado por
GnRH-I (figura 3A). Sin embargo, en contraste con
los sueros de 10 semanas después de la vacunación (figura 2) la
mayoría de todos los sueros de todos los tratamientos, inclusive
pE1A y S4A, reconocieron GnRH-II (figura 3B). Por
consiguiente, los sueros de 7 semanas después de la vacunación de
pE1A y S4A no son específicos de GnRH-I pero queda
plenamente establecida la especificidad para la
GnRH-I y no la GnRH-II a las tres
semanas después de la inmunización de refuerzo (10 semanas después
de la vacunación).
Los resultados de fijación de anticuerpo
obtenidos con los sueros anteriores al refuerzo fueron diferentes
de los sueros de 10 semanas después de la vacunación. Los
antisueros de los tratamientos pE1A y S4A han sido sometidos a
ensayo para determinar su aptitud para reconocer
GnRH-I o GnRH-II (ver figura 3).
Para los dos péptidos, los sueros de 10 semanas después de la
vacunación de 6 de cada 7 animales no fijaban
GnRH-II. De los sueros pE1A obtenidos antes de la
inmunización de refuerzo, 4 de cada 7 animales mostraron
fijación/interacción con GnRH-II. Dos sueros no
reconocieron GnRH-II y un suero no mostró ninguna
interacción con GnRH. Los resultados de los sueros al refuerzo S4A
contradicen los resultados de los sueros de 10 semanas después de la
vacunación. Los sueros anteriores al refuerzo de todos los animales
del grupo S4A reconocieron GnRH-II, siendo similar
tanto para GnRH-I como para GnRH-II
la inhibición de la capacidad de fijación de GnRH yodado.
De forma similar al scan de alanina descrito en
el Ejemplo I, se sintetizaron péptidos de sustitución de alanina del
péptido GnRH-tandem (Cuadro 5). Los péptidos se
dimerizaron, se purificaron y conjugaron con OVA según lo descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro o cinco cerdos por grupo se inmunizaron
con 62 \mug de equivalente peptídico de los conjugados en
adyuvante Specol. En la figura 4 se presenta la eficacia de la
inmunocastración de los conjugados.
Los valores de anticuerpos dirigidos contra los
péptidos, que se utilizaron para la inmunización, fueron bajos para
los cerdos tratados con pE1A, H2A y R8A mientras que se evaluaron
anticuerpos antipéptido elevados para los grupos W3A, S4A, Y5A y
G10A. Los valores de anticuerpo contra GnRH-I
concordaban con los valores de anticuerpo de antipéptido con la
salvedad de que los valores de anticuerpo de los cerdos tratados
con W3A; se determinaron en estos animales anticuerpo antipéptido
elevados; no obstante se comprobó que la capacidad de fijación de
los anticuerpos a GnRH-I yodado era reducida.
Se observó la fijación de anticuerpo de
GnRH-I yodado en un
radio-inmuno-ensayo para los sueros
10 semanas después de la vacunación (diluidos
1/10-1/10000) de todos los animales tratados con
los péptidos GnRH-tandem-dímero con
sustitución de alanina. La competición con GnRH-I
dio como resultado una drástica reducción de la fijación de
GnRH-I yodado. En los sueros de casi todos los
tratamientos, la GnRH-I yodada fue desplazada por
GnRH-I en más del 80% (figura 5A).
El desplazamiento de GnRH-I
yodada por GnRH-II fue muy variable entre los
grupos. Dio como resultado un desplazamiento total o parcial de la
GnRH-I yodada en casi todos los sueros de los
tratamientos Y5A, L7A, R8A, P9A y TD (figura 5B), mientras que para
la mayoría de los sueros dio los tratamientos restantes únicamente
se determino un desplazamiento parcial de GnRH-I
yodada por GnRH-II o incluso ningún desplazamiento
en absoluto.
<110> ID-Lelystad,
Instituut voor Dierhouderij en Diergozondheid B.V. Meloen, Robert
H. Oonk, Hendrica B. Turkstra, Jouwert A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Discriminación entre
GnRH-I y GnRH-II
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P20700PC10
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/NL01/00666
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-09-11
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/659,983
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-09-12
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Ver patente 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
la secuencia de aminoácidos de GnRH-I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="x en posición 1 representa
ácido piroglutámico, x en posición 11 representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<440> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de secuencia artificial:
vacuna tandem-GnRH-I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="X en posición 1 representa
ácido piroglutámico o Gln, X en posición 11 representa un enlace
directo o un grupo espaciador entre los aminoácidos Gly y Gln, X en
posición 21 representa Gly-NH_{2} o Gly"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Xaa
Gln His Trp Ser Tyr}
\sac{Gly Leu Arg Pro Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido según la invención
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="x en posición 1 representa
ácido piroglutámico, K en posición 6 y 16 son aminoácidos
levorrotatorios (L-Lys) o aminoácidos
dextrorrotatorios (D-Lys), X en posición 22
representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly Gln
His Trp Ser Tyr Lys}
\sac{Leu Arg Pro Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
realización preferida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="X en posición 1 representa
ácido piroglutámico, K representa D-Lys y X en
posición 22 representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ala Tyr Lys Leu Arg Pro Gly Gln
His Trp Ala Tyr Lys}
\sac{Leu Arg Pro Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
realización preferida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="X en posición 1 representa
ácido piroglutámico, K representa D-Lys y X en
posición 22 representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Tyr Lys Leu Ala Pro Gly Gln
His Trp Ser Tyr Lys}
\sac{Leu Ala Pro Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
realización preferida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="X en posición 1 representa
ácido piroglutámico, K representa D-Lys y X en
posición 22 representa amida".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Ala Gln
His Trp Ser Tyr Lys}
\sac{Leu Arg Pro Ala Cys Xaa}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
un
D-Lys^{6}-tandem-GnRH
dímero
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="x en posición 1 representa
amida, K representa D-Lys"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Glu His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly
Gln His Trp Ser Tyr}
\sac{Lys Leu Arg Pro Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
pE1A-G6k-GnRH-tandem
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="x en posición 1 representa
acetilo, K representa D-Lys y X en posición 22
representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly Ala
His Trp Ser Tyr Lys}
\sac{Leu Arg Pro Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Y5A-G6k-GnRH-tandem
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="x en posición 1 representa
ácido piroglutámico, K representa D-lisina, x en
posición 22 representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Ala Lys Leu Arg Pro Gly Gln
His Trp Ser Ala Lys}
\sac{Leu Arg Pro Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
L7A-G6k-GnRH-tandem
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="x en posición 1 representa
ácido piroglutámico, K representa D-lisina, X en
posición 22 representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Tyr Lys Ala Arg Pro Gly Gln
His Trp Ser Tyr Lys}
\sac{Ala Arg Pro Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
P9A-G6k-GnRH-tandem
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="X en posición 1 representa
ácido piroglutámico, K representa D-lisina, x en
posición 22 representa amida"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Ala Gly Gln
His Trp Ser Tyr Lys}
\sac{Leu Arg Ala Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
GnRH-tandem
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="X en posición 1 representa
ácido piroglutámico, y X en posición 22 representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gln
His Trp Ser Tyr Gly}
\sac{Leu Arg Pro Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
pE1A-GnRH-tandem
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="x en posición 1 representa
acetilo y X en posición 23 representa amida"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
Ala His Trp Ser Tyr}
\sac{Gly Leu Arg Pro Gly Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<223> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
H2A-GnRH-tandem
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
W3A-GnRH-tandem
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
S4A-GnRH-tandem
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial:
Y5A-GnRH-tandem
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<220>
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial:
G6A-GnRH-tandem
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<223> Descripción de secuencia artificial:
L7A-GnRH-tandem
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
R8A-GnRH-tandem
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<220>
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\sa{Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Ala Pro Gly Gln
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Descripción de secuencia artificial:
P9A-GnRH-tandem
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Descripción de secuencia artificial:
G10A-GnRH-tandem
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<221> SITIO
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<222> (1)..(22)
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\sa{Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Ala Gln
His Trp Ser Tyr Gly}
\sac{Leu Arg Pro Ala Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Péptido que comprende por lo menos dos
secuencias de decapéptido de GnRH acopladas elegidas dentro del
grupo formado por:
donde # es amida y * es
acetilo.
2. Péptido según la reivindicación 1, que
permite una respuesta inmunogénica que permite discriminar entre
diferentes tipos de GnRH, de preferencia entre
GnRH-I y GnRH-II.
3. Péptido según la reivindicación 1, que
permite un nivel de testosterona prácticamente no detectable después
de la vacunación con el péptido en una dosificación adecuada.
4. Péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, donde el péptido se elige
dentro del grupo formado por
donde # es
amida.
5. Péptido según la reivindicación
1-4, que está dimerizado o multidimerizado.
6. Péptido según la reivindicación 5, conjugado
con un compuesto de soporte.
7. Péptido según la reivindicación 6, donde el
compuesto de soporte es una proteína.
8. Vacuna que comprende un péptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Vacuna según la reivindicación 8, que
comprende además un adyuvante.
10. Vacuna según la reivindicación 9, donde el
adyuvante es una fase oleosa de emulsión
agua-en-aceite o una doble emulsión
de aceite.
11. Vacuna según las reivindicaciones
8-10 suficientemente activa para su administración
en una sola dosis para la inmunocastración esencial de cerdos.
12. Anticuerpos contra GnRH-II
que se pueden obtener mediante un método que comprende una etapa
donde se genera una respuesta inmune a un péptido según las
reivindicaciones 1-7.
13. Vacuna contra GnRH-II que
comprende un péptido según las reivindicaciones
1-7.
14. Composición para el tratamiento de cáncer de
próstata que comprende un péptido según la reivindicación
1-7.
15. Péptido según la reivindicaciones
1-7, que se utiliza como medicamento.
16. Utilización de un péptido como el definido
en las reivindicaciones 1-7 para la preparación de
un medicamento para el tratamiento de cáncer de próstata.
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