PT1317478E - Distinção entre a gnrh-i e a gnrh-ii - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO "DISTINÇÃO ENTRA A GNRH-I E A GNRH-II" A invenção relaciona-se com isoformas da GnRH. A GnRH-Ι (na literatura geralmente representada como GnRH) é um péptido pequeno com 10 aminoácidos de comprimento (decapéptido) do hipotálamo. A sequência de aminoácidos da GnRH-Ι (SEQ ID NO: 1) pode ser representada pelo seguinte código de três letras: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ou pelo correspondente código de uma letra em que pE é o ácido piroglutâmico e # é amida: pEHWSYGLRPG#. A GnRH-Ι actua na hipófise para provocar um aumento na libertação da Hormona Fulículo-Estimulante (FSH) e da Hormona Luteinizante (LH) biologicamente activas para o sangue, as quais por sua vez estimulam o desenvolvimento dos testículos nos machos em crescimento e a síntese de esteróides masculinos. Nas fêmeas em crescimento é estimulado o desenvolvimento dos ovários, assim como é o desenvolvimento de folículos no ovário, a síntese de esteróides femininos e a ovulação.
Sabe-se que a GnRH-Ι, se acoplada a uma proteína portadora, pode ser utilizada para vacinar animais. Uma tal vacinação pode ser efectuada por várias razões, as quais estão todas relacionadas com a função natural da GnRH-Ι. 2
Como se sabe, uma redução drástica da LH e/ou FSH no sangue inibe a produção de esteróides masculinos ou androgénios e de esperma nos testículos do macho e a formação de esteróides femininos ou progestagénios e estrogénios e a maturação de folículos no ovário da fêmea. Uma tal redução nas quantidades de androgénios, progestagénios e estrogénios no sangue, a um nível comparável ao obtido pela remoção dos testículos ou ovários por castração, pode ser conseguida por imunização eficaz do animal contra a GnRH-I. Nos machos, em muitos casos os testículos desenvolvem-se então lentamente ou não se desenvolvem de todo, não ocorrendo a síntese de androgénios (hormonas esteróides masculinas) nem a formação de espermatozóides. Nas fêmeas, a actividade dos ovários diminui, não ocorrendo a síntese de estrogénios e progestagénios (hormonas esteróides femininas) e ocorrendo a inibição da maturação dos folículos e da ovulação.
Recentemente foi descrita a presença de uma segunda forma de GnRH (GnRH-II) no cérebro de primatas (Lescheid et al. Endocrinol. 138 (1997) 5618-5629) tendo sido clonado um gene desta segunda molécula de GnRH a partir de uma biblioteca genómica humana (GnRH-II, (SEQ ID NO: 2) (White et al. PNAS USA 95 (1998) 305-309). A GnRH-Ι mamífera (SEQ ID NO 1) é raramente expressada fora do cérebro. Conhece-se contudo algumas excepções a este respeito. A GnRH-Ι está presente no endométrio de mulheres com um ciclo menstrual (Casan et al. Fértil. Steril. 1998, 70, 102-106) e é expressada na placenta humana durante a gravidez (Kelly et al. DNA cell Biol. 1991, 10, 411-421). O ARNm de GnRH foi encontrado nos ovários, testículos, timo, placenta e hipotálamo da ratazana (Oikawa et al., Endocrinology, 1990, 127, 2350-2356). A expressão de GnRH foi detectada em 3 tecido imunológico (baço, timo e linfócitos) de suinos (Weesner et al., Life Sei, 1997, 61, 1643-1649). A GnRH-ll é expressada em muitos tecidos fora do cérebro e está presente em concentrações especialmente elevadas nos rins, medula óssea e próstata. A presença de GnRH-II em vários tecidos que não o cérebro sugere que a GnRH-II pode ter várias funções. Além disso, a estrutura rigorosamente conservada do péptido GnRH-II ao longo de várias espécies de vertebrados sugere que este neuropéptido possui bioactividades vitais. No entanto, até à data, as funções da GnRH-II eram praticamente desconhecidas. Vários tipos de linfócitos diferenciados, tais como linfócitos T e B, e mastócitos, produzem GnRH e péptido do tipo GnRH. Um número significativo do último tipo de células está presente no rim, medula óssea e próstata, contribuindo eventualmente para a expressão elevada de GnRH-II nestes tecidos. A GnRH-II parece estar menos envolvida na reprodução em comparação com a GnRH-Ι. No ratinho hipogonadal, ratinho que carece do gene da GnRH-Ι, as células produtoras de GnRH-II estão presentes com a mesma distribuição que no ratinho normal, mas isto não é suficiente para provocar desenvolvimento gonadal normal nestes ratinhos (Chen et al. FEBS Letters 435 (1998) 199-203). No entanto, os macacos na fase lútea do ciclo menstrual apresentaram um aumento acentuado das concentrações da hormona luteinizante no plasma após administração intravenosa de GnRH-II, mas este aumento não pôde ser induzido durante a fase folicular média (Lescheid et al. Endocrinol. 138 (1997) 5618-5629.) 4 A invenção proporciona um péptido que compreende pelo menos duas sequências decapeptidicas de GnRH acopladas seleccionadas do grupo consistindo de: *AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#, pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#, pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC# e pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#, em que # é amida e * é acetilo, adequado para viabilizar uma resposta imunológica contra formas da Hormona de Libertação de Gonadotrofinas (GnRH) também chamada de Hormona de Libertação da Hormona Luteinizante (LHRH). A invenção também proporciona composições e vacinas, formulações farmacêuticas, e outras preparações medicinais imunogénicas baseadas num tal péptido. A invenção proporciona ainda a utilização de uma tal vacina ou preparação medicinal num método de imunização de um mamifero contra a GnRH para influenciar caracteristicas reprodutivas e comportamentais desse mamifero e num método para melhorar a qualidade da carcaça de porcos. A invenção também proporciona um péptido adequado para induzir uma resposta imunogénica selectiva contra a GnRH-Ι ou GnRH-II. Além disso, a invenção proporciona anticorpos contra a GnRH-Ι e/ou a GnRH-ii, composições que compreendem estes anticorpos e a utilização dos péptidos em composições farmacêuticas ou na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro da próstata. A invenção proporciona agora a ideia que proporcionando sequências peptidicas que permitem distinguir entre os diferentes tipos de GnRH, se pode fazer uma utilização mais adequada e eficiente da variação ou das 5 diferenças na resposta imunológica aos diferentes tipos de GnRH. Mais particularmente, a invenção proporciona a ideia que se podem conseguir melhoramentos na eficácia e selectividade das vacinas contra a GnRH-ι. A imunização contra a GnRH-Ι é eficaz na neutralização de GnRH-Ι e resulta em niveis reduzidos de gonadotrofinas e bloqueamento da sintese de esteróides gonadais. No entanto, nada se sabe sobre quaisquer efeitos fisiológicos dos anticorpos desenvolvidos contra a GnRH-Ι no funcionamento da GnRH-II. Uma vez que a GnRH-II é sintetizada e segregada principalmente nos rins, os anticorpos desenvolvidos contra a GnRH-Ι que reajam com a GnRH-II podem afectar a função renal. Para evitar possiveis efeitos secundários da imunização contra a GnRH-Ι na função renal seria desejável dirigir a resposta antigénica de uma vacina de imunocastração especificamente para a GnRH-Ι, bem como para evitar possíveis efeitos secundários prejudiciais devido à neutralização da GnRH-II não gonadal.
Se for necessário anular apenas a capacidade reprodutora, frequentemente com o seu comportamento sexual concomitante, de uma espécie, seria preferido visar uma vacina de imunocastração que neutralizasse especificamente a GnRH-Ι. Daqui a pretensão de se chegar a uma imunização selectiva contra a(s) Hormona(s) de Libertação de Gonadotrofinas, preferencialmente selectiva contra a GnRH-I.
Em medicina veterinária, 100% de imunização eficaz contra a GnRH-Ι poderia ser utilizada para a esterilização, por exemplo, de pequenos animais domésticos tais como gatos e cães machos e fêmeas, ou para o tratamento da agressividade em cães machos e touros, simplesmente por 6 vacinação em vez de cirurgia drástica tal como castração ou ovariectomia. Outras razões concebíveis para imunização contra a GnRH-l são a prevenção de calores em fêmeas, tais como cães, gatos e vacas, e a agitação de machos em engorda para abate.
Em cuidados de saúde humana, a imunização contra a GnRH-I e/ou GnRH-Il pode ser utilizada no tratamento de cancro da próstata e cancro da mama e, se necessário, no tratamento de algumas formas de carcinoma pituitário. No caso do cancro da próstata pode ser mais desejável neutralizar tanto a GnRH-l como a GnRH-II, já que a última isoforma está também extremamente expressada no tecido da próstata.
Outra utilização de uma vacina contra a GnRH-l é na área de criação de gado, em particular na engorda de porcos para abate. A carne de porcos machos, sexualmente adultos, (varrascos) tem um odor típico, o chamado odor sexual a varrasco ou odor a varrasco. Nos testículos do porco sexualmente adulto formam-se muitos esteróides C19-delta-16 os quais são guardados no tecido adiposo do animal (Patterson, J. Sei. Food Agric. 19_, 31-38 (1968); Brooks en Pearson, J. Anim. Sei. 6_2, 632-645 (1986); Claus, Zeitschrift. Tierzuchtg. Zuchtungsbiol. 93_, 38-47 (1976); Claus, Acta Endocrinol. (Copenh.) 9jL, Supl. 225, 432-433 (1979)). Estes esteróides são principalmente responsáveis pela formação do odor desagradável semelhante a urina quando a carne é aquecida (Fuchs, Swedish J. Agric. Res. 1, 233-237 (1971); Bonneau, Livest. Prod. Sei. 9,687-705 (1982)). Devido a este odor desagradável, a carne de porcos machos, sexualmente adultos é geralmente inadequada para consumo e não apropriada para exportação. Uma vez que cerca 7 de 10% dos porcos machos abatidos já são sexualmente adultos antes do momento do abate, isto acarreta um grande prejuízo para a suinicultura. A fim de controlar e evitar estes prejuízos, quase todos os leitões machos são castrados quando são jovens, com um procedimento cirúrgico que é geralmente executado sem qualquer forma de anestesia. Além do aspecto não amigável para o animal de uma tal castração, a castração também conduz a infecções, inibição do crescimento e uma qualidade final da carcaça inferior à de um animal intacto, pelo menos enquanto esse animal intacto não tiver desenvolvido o odor a varrasco (Walstra, Livest. Prod. Sei. 1, 187-96 (1974)) .
Uma alternativa amigável para o animal consiste na redução da concentração de GnRH-I na pituitária do porco por meio de imunização contra a GnRH-I, a chamada imunocastração. Esta redução nos níveis de GnRH-I conduz a uma redução nas concentrações das FSH e LH biologicamente activas, o que por sua vez inibirá o desenvolvimento dos testículos nos animais em crescimento e inibirá a síntese de esteróides testiculares, incluindo androstenona, testosterona e estrogénios. Este método evita o aparecimento do odor a varrasco em porcos machos na altura do abate e torna de castração cirúrgica desnecessária já que os níveis de androstenona são reduzidos a níveis baixos ou indetectáveis (Oonk et al., 1995, Livestock production Science 42, 63-71).
Um requisito rigoroso para uma vacina aceitável contra o odor a varrasco é que em quase todos os porcos o desenvolvimento dos testículos seja retardado de modo a que 8 o odor a varrasco não tenha surgido na altura do abate, e que no caso de a vacina não reduzir o desenvolvimento dos testículos no animal, tal possa ser facilmente detectado num tamanho de testículos demasiado grande em comparação com os porcos imunocastrados com sucesso.
Na literatura existente e em pedidos de patente anteriores no que se refere às propriedades de antifertilidade das vacinas contra a GnRH-I, os resultados da vacinação são frequentemente variáveis. Na maioria dos estudos descritos, uma pequena percentagem dos animais vacinados não respondem à vacinação ou são necessárias doses grandes de vacina, vacinações múltiplas ou adjuvantes comercialmente inaceitáveis para produzir o efeito desejado (Hoskinson et al., 1990, Austr. J. Biotech. 4,166-170; Falvo et al., (1986) J. Anim. Sei. 63: 986-994; Clarke et al., 1998, Endocrinology 139, 2007-2014; Adams T.E. e B.M. Adams, Feedlot performance of steers and bulis active immunized against Gonadotrofinase-Releasing Hormone, J. Anim. Sei. 1992, 70: 1691-1698; Brown et al., Imunização of sheep against GnRH-I early in life: effects of reproductive function and hormones in rams, Journal of reproduction and Fertility (1994) 101, 15-21; Ferro et al., Immunological castration using a Gonadotrofinase-releasing Hormone analogue conjugated to PPD, Food and agricultural immunology, 1995, 7, 259-272; patente U.S. 4 608 251; pedido de patente Internacional WO88/05308).
Alguns estudos sugerem uma eficácia de 100% de uma vacina contra a GnRH-I, mas a vacina não foi testada num grande número de animais (Ladd et al. (1994), Development of an antifertility vaccine for pets based on active imunização against Luteinizing Hormone releasing hormone, 9
Biology of Reproduction 51, 1076-1083; J.G. Manns e S. R. Robbins (1997) . Prevention of boar taint with a recombinant based GnRH vaccine, In: Boar taint in entire male pigs, Proceedings of a meeting of the EAAP working group "Production and Utilisation of Meat from Entire Male Pigs", EAAP Publication No. 92 137-140;); outros estudos descrevem a eficácia da vacina como um valor médio dos animais tratados, uma vez que os valores individuais não mostraram uma diferença clara entre controlos imunizados e não tratados (Bonneau et al., J. Anim. Sei. 72/ 14-20 (1994); Hennesy et al., 1997. Elimination of boar taint: a commercial boar taint vaccine for male pigs. In: Bonneau, M., Lundstrõm, K. e Malmfors, B. (Eds.), Boar taint in entire male pigs. Wageningen Pers, Wageningen, EAAP Publication No. 92 141-145). A dificuldade da preparação deste tipo de vacinas é provavelmente provocada pelo fenómeno de tolerância. As substâncias próprias, tais como as hormonas, não são reconhecidas como estranhas mas são, antes pelo contrário, toleradas pelo sistema imunitário. Normalmente não são induzidos anticorpos contra substâncias próprias. Para que uma vacina tenha sucesso ela tem de ser suficientemente estranha. Só quando a vacina é suficientemente estranha é que o sistema imunitário não tolerará a vacina e induzirá a produção de anticorpos. No entanto, por outro lado, os anticorpos têm ainda de ser capazes de reconhecer a hormona e deste modo a vacina não pode ser demasiado 'estranha'.
Uma vez que estas condições parecem ser reciprocamente exclusivas não era certo, até à data, que essas substâncias pudessem ser alguma vez preparadas. Uma tentativa para produzir vacinas peptidicas de tipo GnRH consistiu na 10 substituição da Gly na posição 6 do decapéptido GnRH-I por um aminoácido dextro-rotatório (D-Tryp; Chaffaux et al., Recueil de Medicine Vétérinaire 161 (2), 133-145, 1985). No entanto foi demonstrado que a preparação de vacina contendo este péptido GnRH modificado tenha um desempenho inferior ao do decapéptido GnRH-Ι normal (Pedido de Patente Europeia-464 124 A).
Recentemente, nós demonstramos definitivamente que é possível induzir uma resposta de anticorpos eficaz em todos os indivíduos vacinados contra a GnRH-Ι (Meloen et al., Vaccine 12, 741-746 (1994)). Nestas experiências vacinou-se porcos duas vezes com uma vacina contra a GnRH-Ι que se afasta do tipo clássico de vacina contra a GnRH-Ι (GnRH-I acoplada a uma proteína portadora, em adjuvante de Freund), nomeadamente a vacina GnRH-I tandem (Patente Europeia n° 0464124). Nesta publicação é descrito um péptido o qual se caracteriza por compreender pelo menos duas sequências GnRH-ι em tandem (SEQ id NO: 3) de acordo com a fórmula geral Z1-Glx-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-X-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly—Leu-Arg-Pro ] n-Gly-Z2, no qual os aminoácidos são designados segundo o código de três letras, Trp1 e Trp2 são triptofano (Trp) ou triptofano formilado (N(índole)-formil-triptofano), n é um número tendo um valor de pelo menos 1, X é uma ligação directa ou um grupo espaçador entre os aminoácidos Gly e Gin, z1-Glx é pGlu (ácido piroglutâmico) ou Gin possuindo nele ligado uma cauda compreendendo um ou mais aminoácidos adicionais e Gly-Z2 é Gly-NH2 ou Gly possuindo nele ligado uma cauda compreendendo um ou mais aminoácidos adicionais. Nesta 11 fórmula geral, X pode ser uma ligação directa entre os aminoácidos glicina e glutamina, isto é estes aminoácidos estão interligados directamente sem um grupo de ligação intermediário (através de uma ligação peptidica normal). A vacina GnRH-I tandem da invenção também compreende péptidos nos quais as sequências GnRH-I estão interligadas através de espaçadores. A natureza do grupo espaçador pode variar muito, desde um ou mais aminoácidos até uma cadeia hidrocarboneto mais curta ou mais longa e outros grupos de compostos ou moléculas. Na fórmula geral acima, Z1-Glx representa preferencialmente pGlu (ácido piroglutâmico), mas também pode representar Gin possuindo nele ligado uma cauda compreendendo um ou mais aminoácidos adicionais, por exemplo, para ser utilizada na condensação do péptido a uma proteina portadora. Na fórmula geral acima, Gly-Z2 representa, por exemplo, Gly-NH2, ou Gly possuindo nele ligado uma cauda compreendendo um ou mais aminoácidos adicionais, por exemplo, para ser utilizada na condensação do péptido a uma proteína portadora. Preferencialmente, Gly-Z2 representa Gly-Cys-NH2, sendo a cisteina C-terminal adicionada relativamente a uma possível condensação do péptido a uma proteína portadora. A partir de WO 96/40755 sabe-se que o principio do dímero tandem aplicado a uma variante da molécula de GnRH-I origina uma vacina que é extremamente eficaz em vários adjuvantes suaves, nomeadamente Specol e uma emulsão dupla de óleo, e que também é eficaz em doses baixas. Neste caso, a variante da molécula de GnRH-I foi preparada substituindo o sexto aminoácido Gly do decapéptido por um (D-)aminoácido dextro-rotatório, D-Lys, após o que o péptido resultante foi dimerizado e condensado com um composto portador corrente, ovalbumina. Assim, enquanto uma vacina utilizando 12 substituições da Gly por D-aminoácidos na posição 6 do original e um único decapéptido GnRH-I com um D-aminoácido diminuiu a imunogenicidade relativamente à sequência GnRH-I original (Chaffaux et al., Recueil de Medicine Vétérinaire 161 (2), 133-145,1985), tais substituições com um D- aminoácido aplicadas a uma vacina do dimero tandem da GnRH-I foram capazes de produzir preparações de vacina de GnRH-I ainda mais imunogénicas. Mesmo assim, o método de vacinação requeria uma dosagem repetida da vacina para ser completamente eficaz. A necessidade de uma dosagem de reforço adicional para se conseguir praticamente 100% de vacinação eficaz dos mamíferos contra a GnRH-I é uma desvantagem dos péptidos conhecidos. Nós também observamos que em determinados casos a utilização do dimero tandem de (D-Lys6)GnRH-I (isto é o dimero tandem de GnRH-I, com e sem a substituição de D-Lys6) originou quantidades muito pequenas mas ainda mensuráveis de testosterona, o que é indesejável e uma desvantagem do dimero tandem (D-Lys6) GnRH-I. A presente invenção proporciona sequências peptidicas que compreendem pelo menos duas sequências decapeptidicas GnRH condensadas seleccionadas do grupo consistindo de: *AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#, pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#, pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC# e pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#, em que # é amida e * é acetilo, e que proporcionam alternativas ao D-Lys6 GnRH-I tandem quando aplicadas em vacinas, e que originam vacinas que são eficazes para imunocastração. 13
Um aspecto da presente invenção é determinar até que ponto os aminoácidos na sequência de GnRH-I tandem podem ser modificados conservando a GnRH-I tandem resultante a capacidade de produzir uma resposta imunogénica à GnRH-I suficiente para imunocastração. Assim, a invenção proporciona a preparação de uma sequência peptidica que pode induzir a produção de anticorpos contra a GnRH-I, os quais também são suficientemente competitivos, tanto em quantidade como em actividade.
Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar uma sequência peptidica que induz selectivamente a produção de anticorpos contra a GnRH-I, ao mesmo tempo que induz uma resposta pequena ou nenhuma resposta contra a GnRH-II. Uma forma de realização preferida desta é um sequência peptidica que não só induz selectivamente a produção de anticorpos contra a GnRH-I mas é também eficaz na imunocastração, ao mesmo tempo que a resposta contra a GnRH-ll é diminuída ou inexistente.
Os actuais inventores determinaram que na sequência peptidica da GnRH-I tandem podem ser substituídos vários aminoácidos, resultando numa diminuição da semelhança com a hormona do organismo, ao mesmo tempo que retém ou até aumenta a aptidão do péptido para induzir anticorpos de ligação à GnRH-I. De igual modo, determinadas substituições de aminoácidos na sequência peptidica da GnRH-I resultam numa resposta imunológica selectiva contra a GnRH-I e numa resposta imunológica reduzida ou inexistente contra a GnRH-II.
Num aspecto da invenção, determinadas sequências peptídicas de GnRH-I tandem modificada proporcionam vacinas 14 que são não só capazes de reduzir o crescimento dos testículos em machos mas são também capazes de reduzir consideravelmente os níveis de testosterona até um nível que não pode ser determinado por técnicas convencionais.
Além disso, as vacinas preparadas a partir destas sequências de péptidos expressam uma actividade que na maioria dos casos elimina a necessidade de um segunda imunização de reforço, como ocorre com a D-Lys6 GnRH-I tandem convencional, para se atingir fundamentalmente 100% de actividade. Uma actividade ou eficácia de 100 % nos termos da presente invenção é definida como um nível de testosterona que é essencialmente não detectado por técnicas convencionais após uma única vacinação.
Uma das particularidades mais notáveis da presente invenção é que os anticorpos gerados por estas vacinas alternativas de GnRH distinguem entra GnRH-I e GnRH-II. Assim, os péptidos de acordo com a invenção expressam uma maior actividade ou a mesma actividade contra a GnRH-I, enquanto apresentam ao mesmo tempo uma resposta imunológica reduzida ou inexistente à GnRH-II. Isto permite o desenvolvimento de péptidos que expressam um efeito inverso, isto é, eles expressam uma maior actividade ou a mesma actividade contra a GnRH-II enquanto expressam ao mesmo tempo uma resposta imunológica reduzida ou inexistente contra a GnRH-ι. Estas resposta específicas para a GnRH-II poderiam ser utilizadas para ajudar a suprimir o implante de embriões em mamíferos quando a gravidez não é desejada ou pouco desejada. Além disso, utilizando uma tal resposta específica para a GnRH-II, os níveis de FSH podem ser regulados negativamente, levando a uma menor fertilidade global. 15 A invenção relaciona-se, num aspecto, com um péptido que compreende uma sequência tandem do decapéptido GnRH-l modificado de acordo com o que a vacinação com o péptido numa dosagem adequada permite um nivel de testosterona que é essencialmente não detectado. A invenção também se relaciona com um péptido que compreende pelo menos duas sequências acopladas do decapéptido GnRH-I, opcionalmente acopladas através de um espaçador, o qual induz uma resposta imunogénica que permite a distinção eficaz entre a GnRH-I e GnRH-ll.
Os péptidos de acordo com a invenção são suficientemente semelhantes à hormona mas ao mesmo tempo mais 'estranhos' ao sistema imunitário e têm uma maior capacidade para induzir a produção de anticorpos dirigidos contra a hormona.
Uma particularidade da invenção é que as unidades tandem individuais podem ser dimerizadas para intensificar ainda mais a sua imunogenicidade sem se perder a possibilidade de condensar o péptido ou composição peptidica a uma proteína portadora.
Pode utilizar-se técnicas para dimerização e condensação do tandem a um veículo semelhantes às descritas em WO 96/40755. Concebe-se também que possam ser utilizados péptidos contendo apenas uma parte das sequências peptídicas da GnRH-I ou II na presente invenção. São exemplos daqueles os nonapéptidos e undecapéptidos.
Os grupos de ligação utilizados nos péptidos de acordo com a invenção podem ser seleccionados dos grupos de 16 ligação descritos noutra parte deste pedido ou de grupos de ligação tais como grupos de ligação SMCC ou outros grupos de ligação conhecidos na técnica.
Os grupos de ligação são utilizados para ligar duas ou mais sequências peptidicas dimerizadas. 0 aminoácido que é utilizado para substituir o aminoácido nas sequências peptidicas tandem é preferencialmente um aminoácido que seja relativamente simples, tal como alanina. Assim sendo, numa forma de realização preferida o aminoácido diferente é alanina. Também se pode utilizar outros aminoácidos para substituir o aminoácido na sequência decapeptidica tandem. Preferencialmente são realizadas apenas substituições conservadoras. As substituições conservadoras são substituições de aminoácido nas quais os aminoácidos volumosos são substituídos por aminoácidos volumosos, os aminoácidos aromáticos por aminoácidos aromáticos etc. Estes conceitos são bem conhecidos dos especialistas na técnica.
Pode colocar-se espaçadores entre os péptidos de acordo com a invenção. Isto permite formar multimeros. Os espaçadores adequados são conhecidos na técnica.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: Competição para a ligação de GnRH iodada com anti-soro pela GnRH (circulos em branco), GnRH-ll (círculos a cheio), péptido de controlo (quadrados a cheio) e sem péptido (asterisco). 0 soro é diluído a 1/10000 e adiciona-se concentrações crescentes de péptido (0,25, 2,5 25 pmol) por poço. Nos gráficos A-C são apresentados soros com capacidade de ligação crescente para o GnRH-II. Eixo 17 horizontal: quantidade de péptido (pmol por poço); eixo vertical: Capacidade de ligação (contagens por minuto).
Figura 2: Percentagem de GnRH-i iodada substituída por GnRH-I (Figura 2A) e GnRH-II (Figura 2B) em soros de animais individuais (cada barra representa um animal) após imunização com péptidos diméricos G6k-GnRH com substituições de alanina como se indica por baixo de cada grupo de barras. 0 anti-soro, obtido 3 semanas após a imunização de reforço (lOsav) foi diluido a 1:100 até 1:10000. Adicionou-se GnRH-I e GnRH-II para substituição em concentrações de 250 pmol por ml.
Figura 2A
Eixo horizontal: Péptidos utilizados para imunização Eixo vertical: Percentagem de substituição da GnRH-I iodada pela GnRH-I
Figura 2B
Eixo horizontal: Péptidos utilizados para imunização Eixo vertical: Percentagem de substituição da GnRH-I iodada pela GnRH-I
Figura 3: Percentagem de GnRH-I iodada substituída por GnRH-I (Figura 3A) e GnRH-II (Figura 3B) em soros de animais individuais (cada barra representa um animal) após imunização com péptidos diméricos G6k-GnRH com substituições de alanina como se indica por baixo de cada grupo de barras. O anti-soro, foi obtido na altura da imunização de reforço (7sav) e foi diluido a 1:100 até 1:10000. Adicionou-se GnRH-I e GnRH-II para substituição em concentrações de 250 pmol por ml. Não foram incluídos os 18 dados dos soros H2A e W3A, uma vez que os títulos de anticorpo foram demasiado baixos para medir a substituição.
Figura 3A
Eixo horizontal: Péptidos utilizados para imunização Eixo vertical: Percentagem de substituição da GnRH-I iodada pela GnRH-I
Figura 3B
Eixo horizontal: Péptidos utilizados para imunização Eixo vertical: Percentagem de substituição da GnRH-I iodada pela GnRH-I
Figura 4: Classificação da eficácia de imunocastração de vários grupos de porcos imunizados com péptidos diméricos de GnRH tandem (62 μg) conjugados com ovalbumina e Specol utilizado como um adjuvante. 0 péptido de partida foi o dímero de GnRH tandem (Cys-OH) (abreviado Cys-OH). Deste péptido utilizou-se todos os péptidos de exploração de alanina para imunização. A eficácia de imunocastração foi classificada numa escala de 1 até 4 (1 = não houve imunocastração, 2 = uma minoria dos porcos sofreu imunocastração, 3 = uma maioria dos porcos sofreu imunocastração, 4 = todos os porcos sofreram imunocastração).
Figura 5: Percentagem de GnRH-I iodada substituída por GnRH-I (Figura 5A) e GnRH-II (Figura 5B) em soros de animais individuais (cada barra representa um animal) após imunização com péptidos diméricos GnRH tandem com substituições de alanina como se indica por baixo de cada grupo de barras. 0 anti-soro, obtido 3 semanas após a imunização de reforço (lOsav) foi diluído a 1:100 até 19 1:10000. Adicionou-se GnRH-I e GnRH-II para substituição em concentrações de 250 pmol por ml.
Figura 5A
Eixo horizontal: Péptidos utilizados para imunização Eixo vertical: Percentagem de substituição da GnRH-I iodada pela GnRH-I
Figura 5B
Eixo horizontal: Péptidos utilizados para imunização Eixo vertical: Percentagem de substituição da GnRH-I iodada pela GnRH-I
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA
Os péptidos de acordo com a invenção compreendem pelo menos duas sequências do decapéptido GnRH acopladas, seleccionadas do grupo consistindo de: 20 destes aminoácidos foram substituídos por outros aminoácidos. Nas fórmulas a posição da substituição está representada a negrito e sublinhado, As maiúsculas representam aminoácidos levo-rotatórios, as minúsculas representam aminoácidos dextro-rotatórios, por exemplo K: L-Lys; k: D-Lys. Subsequentemente determinou-se a respectiva resposta imunogénica quando acoplado a um veículo, geralmente ovalbumina, mas pode utilizar-se outros veículos tais como KLH, BSA.
Será evidente que a sequência do péptido GnRH-II (SEQ ID NO: 2) determina qual dos aminoácidos pode ser substituído de modo a que continue a ser possível uma distinção eficaz com base na resposta imunológica entre as duas sequências GnRH-I e GnRH-II.
Para se determinar se os anticorpos gerados pelas vacinas contra a GnRH de acordo com a presente invenção distinguiam entre a GnRH-Ι e a GnRH-II, realizou-se um ensaio de ligação de anticorpo contra a GnRH para determinar se os anticorpos gerados contra o péptido dimérico de GnRH-Ι tandem ou os seus análogos de substituição de alanina se ligavam à GnRH-II ou careciam da ligação à GnRH-II. Pré-incubou-se diluições de soro com GnRH-Ι, GnRH-II, um péptido de controlo ou sem péptido. Em seguida adicionou-se GnRH-Ι iodada para competir com os péptidos pré-incubados para ligação aos anticorpos.
Este procedimento foi realizado para soro recolhido antes e depois da imunização de reforço, já que a especificidade dos anticorpos pode aumentar após a imunização de reforço. 21
Quando os péptidos de acordo com a invenção foram utilizados como conjugados com ovalbumina (conjugado com OVA) e comparados com os controlos, todos eles apresentaram eficácia na imunocastração de porcos machos, jovens. A comparação com o conjugado OVA do dimero tandem G6k-GnRH (ver, Quadro 1), mostrou que os péptidos de acordo com a invenção apresentam uma eficácia comparável ou semelhante apesar da sua semelhança com a hormona GnRH-l do organismo ter diminuido. Os péptidos de acordo com a invenção originam uma resposta imunogénica que permite a distinção eficaz entre GnRH-l e GnRH-II. Estes péptidos originaram testículos pequenos e niveis baixos de testosterona. Mais especificamente, os péptidos que expressam um peso de testículos baixo e um nivel de testosterona baixo são R8A, G10A e S4A. Os péptidos preferidos com base na selectividade imunológica entre a GnRH-l e a GnRH-II são o S4A e o pElA.
Numa forma de realização preferida, o péptido é seleccionado do grupo consistindo de pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC# (SEQ ID NO: 5), pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC# (SEQ ID NO: 6) e pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# (SEQ ID NO: 7) i . Ele é mais preferencialmente seleccionado do grupo consistindo de pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#; (SEQ ID NO: 6); e pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# (SEQ ID NO: 7) .
Nos péptidos de acordo com a invenção, a dimerização das unidades tandem pode ocorrer, por exemplo, via a extremidade carboxilo ou via a extremidade amino. Duas unidades tandem podem ser, por exemplo, dimerizadas por meio de uma ponte de dissulfureto ou tioéter. Para se dimerizar as sequências tandem pode utilizar-se a Cys na 22 posição 21 ou a Cys pode ser sintetizada antes do ácido glutâmico na posição 1. Outros métodos para dimerizar ou multimerizar as unidades GnRH tandem também podem ser encontrados na técnica precedente. Se a Cys na posição 21 está envolvida na dimerização e, consequentemente, não está disponível para acoplamento, é também possivel utilizar outro aminoácido do tandem que possa ser acoplado. Se a dimerização ou multimerização originar a perda de sitios acessíveis onde pode ser conjugado um composto portador é suficiente restringir a escolha dos aminoácidos de substituição a um aminoácido com uma cadeia lateral apropriada. Um tal aminoácido de substituição pode ser, for exemplo, L ou D-Lys, L ou D-Glu ou outro aminoácido contendo uma cadeia lateral que permita o acoplamento a um composto portador. Ambas as substituições, L e D, foram testadas e determinadas terem o mesmo efeito. A invenção proporciona ainda uma composição a qual compreende um péptido colocado numa forma imunogénica. Como é conhecido do especialista, existem vários métodos para produzir uma forma imunogénica de uma substância que não seja em si mesmo imunogénica. Uma possibilidade consiste em acoplar um péptido de acordo com a invenção a uma proteína portadora adequada. Uma proteína portadora adequada é ovalbumina, KLH ou BSA. Num péptido tandem pode utilizar-se adequadamente uma cisteína na extremidade C para um acoplamento químico. No péptido dimérico tandem, o acoplamento também pode ser realizado utilizando a cadeia lateral simples ou modificada de (D-) lisina, (D-) glutamina, ou de quaisquer outros aminoácidos de substituição modificados da sequência peptídica. Os métodos de acoplamento e proteínas portadoras adequados são bem conhecidos dos técnicos médios na matéria. 23
De acordo com a invenção existe uma composição preferida a qual é caracterizada por compreender um conjugado imunogénico de uma proteína, tal como ovalbumina, e um péptido ou composição peptidica.
Pode utilizar-se uma composição de acordo com a invenção na forma de uma vacina. Para este fim a composição pode ser produzida numa forma que seja adequada para administração. Através da administração de uma vacina de acordo com a invenção, gera-se uma resposta imunogénica contra a GnRH, preferencialmente uma resposta imunogénica contra a GnRH-I.
Por conseguinte, a invenção também proporciona um método para imunizar um mamifero contra a GnRH-I, através da vacinação do mamifero com uma vacina de acordo com a invenção. Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um método para imunizar selectivamente um mamifero contra a GnRH-ι, com uma vacina de acordo com a invenção.
Evidentemente, a preparação de vacina de acordo com a invenção pode ser combinada com pelo menos um imunoadjuvante. Os imunoadjuvantes adequados são conhecidos dos especialistas na técnica. Um adjuvante preferido de acordo com a invenção pode ser o Specol ou uma emulsão dupla de óleo, mas também podem ser utilizados outros adjuvantes que não induzam nenhuma reacção secundária ou apenas reacções secundárias suaves. A invenção pode ser utilizada em métodos para imunizar indivíduos seleccionados de uma gama alargada de vertebrados, e particularmente mamíferos, contra a GnRH-I. Numa forma de realização preferida da invenção, a vacina pode ser administrada numa 24 dose única, a qual tem a mesma eficácia que as vacinas presentemente conhecidas as quais têm de ser administradas na forma de duas doses. A imunização contra a GnRH-I, preferencialmente selectiva, poderia ser, por exemplo, utilizada para a esterilização, por exemplo, de animais domésticos pequenos tais como gatos e cães machos e fêmeas, ou para o tratamento da agressividade em cães macho e touros. Outras razões concebíveis de imunização contra a GnRH-I com a presente invenção são a prevenção de calores em fêmeas tais como cães, gatos e vacas, e evitar ou tratar a agitação em machos em engorda para abate. Nos cuidados de saúde humana, a imunização contra a GnRH, preferencialmente selectiva contra a GnRH-I ou a GnRH-II, pode ser utilizada no tratamento de cancro da próstata e cancro da mama e, se necessário, no tratamento de algumas formas de cancro da pituitária.
Uma forma de realização preferida é um método para melhorar a qualidade da carcaça de porcos, em que os porcos são vacinados com uma preparação de vacina de acordo com a invenção. A invenção é ilustrada na parte experimental que se segue. I. Imunocastração de porcos MATERIAIS e MÉTODOS Materiais
Acetonitrilo (AON) foi de pureza gradiente HPLC-S, N-metilpirrolidona (NMP), diisopropiletilamina (DIEA) dimetilformamida (DMF), ácido trifluoroacético (TFA) e piperidina foram de pureza adequada para síntese de péptidos e foram todos obtidos de Biosolve (Valkenswaard, 25 NL) . N-hidroxibenzotriazole (HOBt) e hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il-1,1,3,3-tetrametilurónio (HBTU) foram obtidos de Richelieu Biotechnologies Inc. (Hamon, Canada). hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio (PyBOP) foi obtido de Novabiochem (Laufelfingen, Suíça). Tioanisole (TA), etanoditiol (EDT), sulfóxido de dimetilo (DMSO), pentano e dimetilaminopiridina (DMAP) foram de pureza pró-análise e foram obtidos de Merck (Darmstad, Alemanha). 0 éter dietílico foi purificado sobre uma coluna de óxido de alumínio básico, activado antes de ser utilizado. Os derivados de aminoácido e resinas foram obtidos de Bachem Feinchemicalien AG (Bubendorf, Suíça). Síntese múltipla de péptidos (MPS)
Programou-se uma Hamilton Microlab 2200 para fornecer solventes de lavagem e reagentes a um suporte com 40 colunas individuais de 4 ml com filtro, contendo 30 mmol de resina para síntese de péptidos. As colunas foram drenadas após cada passo utilizando vácuo. O ciclo de acoplamento baseou-se na química de Fmoc utilizando passos de acoplamento duplo: 1. Lavagem com NMP (1 ml) 2. piperidina a 30% (v/v)/NMP (3 min, 0,5 ml) 3. piperidina a 30% (v/v)/NMP (17 min, 0,5 ml) 4. lavagem com NMP (5 x 1 ml) 5. acoplamento duplo (2 x 30 min) 6. lavagem com NMP (2 x 1 ml)
Passo de acoplamento: Transferiu-se Fmoc-aminoácido em NMP (0,4 M, 0,25 ml), HBTU/HOBt (0,45 M, 0,22 ml) em DMF e DIEA (2 M, 0,2 ml) em NMP para o recipiente reaccional e deixou-se reagir durante 30-50 min. Drenou-se a mistura 26 reaccional e repetiu-se mais uma vez o procedimento de acoplamento.
Após condensação do último aminoácido, eliminou-se o grupo Fmoc com piperidina a 30%/NMP, lavou-se os péptidos, acetilou-se em 30 min. utilizando NMP/anidrido acético/DlEA 10/1/0,2, lavou-se novamente e secou-se. Desprotegeu-se os péptidos e clivou-se em 2 h numa mistura de 1,5 ml de TFA/fenol/TA/água/EDT 10/0,75/0,5/0,5/0,25 (reagente K). Filtrou-se a mistura clivada, lavou-se a resina com 0,5 ml de TFA e precipitou-se o péptido adicionando 13 ml de pentano/éter dietilico 1/1. Após centrifugação, extraiu-se o precipitado novamente com pentano/éter dietilico. Secou-se o precipitado, dissolveu-se em ACN/água 1/1 e liofilizou-se. Este procedimento produz, dependendo do peso molecular, 25 até 70 mg de péptido.
As sequências peptidicas sintetizadas, representadas em código de uma letra de aminoácidos, estão resumidas no Quadro 1. QUADRO 1: Sequência de aminoácidos em código de uma letra dos péptidos sintetizados péptido sequência de aminoácidos G6 k-GnRH-tandem1 pElA-G6k-GnRH-tandem S4A-G6k-GnRH-tandem Y5A-G6k-GnRH-tandem L7A-G6k-GnRH-tandem R8A-G6k-GnRH-tandem pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC# (SEQ ID NO: 9) *AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC# (SEQ ID NO: 10) pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC# (SEQ ID NO: 5) pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC# (SEQ ID NO: 11) pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC# (SEQ ID NO: 12) pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC# (SEQ ID NO: 6) P9A-G6k-GnRH-tandem pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC# (SEQ ID NO: 13) G10A-G6k-GnRH-tandem pEHWS Yk LRPAQHWS Yk LRPAC # (SEQ ID NO: 7) pE = ácido piroglutâmico; * = acetilo; # = amida; k = d-lisina; G6k = Gly na posição 6 da sequência nativa de GnRH substituída por d-Lisina Apenas para efeitos ilustrativos 27 HPLC analítica
Para a análise de péptidos, nós utilizamos um sistema de LC-MS (electropulverização), o qual consiste de duas bombas Waters modelo 510, um controlador de gradiente Waters modelo 680, um autoinjector Waters WISP 712 e um detector Waters 991 de matriz de fotodiodos. O espectrómetro de massa foi um Micromass Quattro II sq, o qual foi utilizado no modo de iões positivos. Os produtos foram analisados com um gradiente linear de 10% de ACN/água com 0,05% de TFA até 70% de ACN/água com 0,05% de TFA em 30 min numa coluna Waters Delta Pak C18-100Ã (3,9x150 mm, 5 mm) a 1 ml/min a 215 nm. Todos os produtos tinham entre 40-70 % de pureza de acordo com a área do pico.
Dimerização
Dimerizou-se produtos em bruto dissolvendo os produtos em DMSO a 20% em água. Ajustou-se o pH até 5-6 com NH4HC03 a 1%, mantendo uma solução transparente. A correcção do pH foi efectuada com ácido acético a 1%. Depois de agitar à temperatura ambiente durante pelo menos 5 h, conservou-se os produtos a -20 °C até à purificação. HPLC preparativa
As purificações dos péptidos foram realizadas utilizando um cromatógrafo liquido Waters Prep 4000, munido com um módulo Waters ROM com dois cartuchos preparativos PrepPak e pré-cartuchos (40x210 mm ou 25x210 mm) empacotados com delta-Pak C18-100Ã (15 mm) . Em geral, as purificações foram realizadas utilizando os mesmos eluentes que na HPLC analítica, mas uma velocidade de gradiente de 0,5% de ACN/min e um caudal de 40 ou 100 ml/min. Os péptidos foram detectados a 215-230 nm utilizando um 28 espectrofotómetro Waters 486 com uma célula preparativa. Os péptidos foram liofilizados e a pureza foi determinada como sendo de pelo menos 90%.
Preparação do conjugado
Para conjugação via cloridrato de N-etil-N=-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida ("EDO") a albumina de ovo de galinha ("OVA") dissolveu-se separadamente uma massa igual do péptido e da proteina portadora em água milliQ e misturou-se bem ambas as soluções. Em seguida dissolveu-se um excesso de 10 vezes, com base em equivalentes em peso, de EDO em água milliQ. Subsequentemente, adicionou-se lentamente esta solução à solução de péptido/OVA sob agitação continua, o pH desta solução final é de 5. Após pelo menos 6 h de agitação lenta, dialisou-se o produto (limiar de corte de PM 10 000) contra um excesso de 300 vezes de água milliQ durante dois dias. A água foi renovada duas vezes ao dia. Calculou-se a carga a partir da análise comparativa de aminoácidos do conjugado e da proteína portadora. A análise de aminoácidos foi realizada utilizando um sistema Waters Pico-Tag, após hidrólise numa estação de trabalho Pico-Tag utilizando HC1 6N a 150 °C durante 1 h, e derivatização com fenilisotiocianato.
De acordo com a análise de aminoácidos os conjugados continham entre 0,3 e 0,5 mg de péptido por mg de proteína portadora, com excepção do conjugado dimérico tandem de P9A-G6k-GnRH o qual continha apenas 0,16 mg de péptido por mg de ovalbumina. O conjugado do dimero tandem G6k-GnRH com a OVA é abreviado por G6k-TD. Os conjugados com substituições de alanina são abreviados pelo aminoácido da sequência nativa 29 da GnRH que está substituído, pela sua posição e um A para a substituição por Alanina. Por exemplo o conjugado do dímero tandem pElA-G6k-GnRH com a OVA é pElA.
Preparação da emulsão
Utilizou-se Specol (Fase Oleosa Especial, ID-DLO, Lelystad, Países Baixos) consistindo de dois detergentes num óleo mineral leve como fase oleosa (Bokhout et al., 1981). As emulsões de água-em-óleo (WIO) foram preparadas utilizando um Ultra Turrax (Janke e Kunkel, Staufen, Alemanha) com uma barra de agitação. Colocou-se a fase oleosa de Specol (5 partes v/v) num recipiente de 25 ml em vidro e adicionou-se lentamente a fase aquosa (4 partes v/v) consistindo de conjugado em água milliQ enquanto se agitava a emulsão. Depois de se ter adicionado a fase aquosa, agitou-se a emulsão durante meio minuto à mesma velocidade de rotação (15000 rpm). Conservou-se as emulsões dum dia para o outro a 4 °C para verificar a estabilidade e administrou-se aos animais no dia seguinte.
Animais
Nesta experiência utilizou-se leitões machos, com aproximadamente 10 semanas de idade. Os leitões cruzados foram alojados em recintos semi-gradeados e tiveram acesso ad libitum a ração e água.
Imunização
Os leitões foram distribuídos aleatoriamente pelos tratamentos, 6 ou 7 leitões por tratamento. Todos os animais foram injectados com 2 ml de emulsão contendo os conjugados dimerizados de GnRH tandem (isto é, péptido de 62 μg) ou uma emulsão sem antigénio. As injecções foram administradas por via intramuscular no pescoço no início da 30 experiência (dia 0) e 7 semanas mais tarde (7sav). Treze semanas após a imunização inicial (13 sav) os animais foram todos abatidos.
Medições e colheita de sangue
Pesou-se os animais no dia 0 e às 7 e 13 sav. Determinou-se o tamanho dos testículos medindo o comprimento do testículo com uma craveira com nónio no dia 0, e às 7, 10 e 13 semanas. Os tamanhos dos testículos foram registados como a média de ambos os testículos.
Colheu-se amostras de sangue por punção da veia jugular nos mesmos dias em que se mediu os tamanhos dos testículos, e também 4 semanas após a imunização inicial. As amostras de sangue foram mantidas dum dia para o outro a 4 °C e no dia seguinte obteve-se o soro por centrifugação (1500 g, 15 min). As amostras de soro foram conservadas a -20 °C até à análise.
Avaliação após abate
Após o abate retirou-se os testículos, dissecou-se eliminando os epidídimos e pesou-se. Registou-se os pesos dos testículos como a média de ambos os testículos.
Anticorpos contra o péptido
Os anticorpos para os péptidos utilizados para imunização foram determinados por um ELISA. Revestiu-se os péptidos nos poços de uma placa microtítulo utilizando glutardialdeído (GDA). O GDA foi aplicado na superfície dos poços por incubação com GDA a 0,2% em tampão de fosfato 0,1 M (pH 5) durante 4 horas à temperatura ambiente. Lavou-se as placas 3 vezes durante 10 minutos com tampão de fosfato 0,1 M (pH 8). Aplicou-se 1 micrograma de péptido em 100 ml 31 de tampão de fosfato (0,1 M, pH 8) por poço incubando durante 3 horas a 37 °C. Conservou-se as placas a -20 °C até serem utilizadas. Lavou-se as placas descongeladas 3 vezes durante 10 minutos com água milli-Q contendo 8,2 g de NaCl, 1,15 g de Na2HP04.2H20, 0,20 g de NaH2PO4.2H20 e 5 ml de uma solução a 10 % de Tween 80 em água por litro de água.
Deixou-se reagir diluições sucessivas dos soros antipeptidicos com os péptidos aplicados durante 1 hora a 25 °C. Depois de lavar 3 vezes durante 10 minutos, introduziu-se igG de cabra anti-porco acoplada a peroxidase de rábano-silvestre (Dako, Glastrup, Dinamarca) como anticorpo secundário durante 1 hora e utilizou-se ABTS (Boehringer, Mannheim, Alemanha) ((250 ml (2 g/100 ml) em 10 ml de tampão de substrato ao qual se adicionou 20 ml de H202 (solução a 3%)) como substrato. Mediu-se a absorção a 405 nm.
Anticorpos para a GnRH
Os anticorpos para a GnRH foram determinados como descrito por Meloen et al. (Vaccine 12, 741-746 (1994)).
Deixou-se ligar diluições sucessivas do anti-soro de porco
v 1 9 S
Serial a Ι-GnRH. Os títulos são exprimidos como a percentagem de ligação da 125I-GnRH a uma dada diluição de soro.
Testosterona
Os níveis de testosterona no soro foram determinados utilizando um estojo "Coat-a-Count" adquirido de DPC laboratories, Los Angeles, CA.
RESULTADOS 32
Tamanho do testículo e peso do testículo
Sete semanas a pós a primeira imunização já se podiam observar os efeitos da imunocastração medindo o tamanho do testículo. Três tratamentos (R8A, G10A e G6k-TD) não apresentaram praticamente incremento (clOmm) do tamanho médio do testículo na altura do reforço. Estes tratamentos foram bem-sucedidos com pesos de testículos no abate de 70 grama ou menos. Outros tratamentos que foram eficazes em termos de pesos de testículos baixos foram os pElA e S4A, enquanto no grupo Y5A, L7A e P9A, respectivamente 2, 1 e 1 animais não responderam à imunização (Quadro 2) . Os pesos dos testículos individuais de animais imunocastrados não excederam 70 grama, resultando numa diferença clara entre animais imunocastrados e não imunocastrados. QUADRO 2: Eficácia dos vários tratamentos de acordo com o peso dos testículos (g) tratamento peso individual do testículo (g) peso do testículo (g) (mediana(gama)) número de reactivos/número total G6k-TD 10,10, 10,12,16,70 11 (10-70) 6/6 pElA 16,18, 33,36,53,55,65 36 (16-65) 7/7 S4A 10,14, 15,36,40,43,69 36 (10-69) 7/7 Y5A 15,19, 34,44,69,210,235 44 (15-235) 5/7 L7A 12,13, 15,20,24,29,195 20 (12-195) 6/7 R8A 10,10, 12,15,17,19,19 15 (10-19) 7/7 P9A 8,9,20 ,23,31,57,300 23 (8-300) 6/7 G10A 11,13, 14,14,15,30,39 14 (11-39) 7/7 Controlos 150,173,204,206,236 204 (150-236) 0/5
Resposta do anticorpo
Os títulos médios dos anticorpos contra os péptidos utilizados para imunização são dados no quadro 3. O título 33 médio do anticorpo de porcos tratados com H2A e P9A são inferiores ao titulo de anticorpo para o péptido de outros tratamentos.
Os titulos de anticorpo de animais individuais contra os vários péptidos variaram desde 2 até 4. Num tratamento, os animais que não foram imunocastrados apresentaram o titulo antipéptido mais baixo. Os animais tratados com H2A e W3A não sofreram imunocastração, mas estavam presentes titulos significativos de antipéptido.
As percentagens de ligação anticorpo-GnRH a uma diluição de soro de 1/2000 não eram detectáveis ou eram baixas nos grupos H2A e W3A. No entanto a uma diluição de soro de 1/200 os anticorpos eram detectáveis nos soros de todos os animais do grupo H2A e em três animais do grupo W3A.
Os animais com titulos médios baixos de anticorpo para a GnRH não sofreram imunocastração. Titulos elevados de anticorpo resultaram sempre em animais castrados com sucesso. Os pesos de testículo de animais com títulos intermédios de anticorpo variaram desde 15 até 300 grama.
Os títulos médios de anticorpo para a GnRH por tratamento mostraram uma relação clara com o peso de testículo (mediana) por tratamento (Quadro 3).
Testosterona
Os níveis de testosterona de todos os animais tratados com sucesso foram baixos e diminuíram após a segunda imunização. No entanto, a maioria (n=31) dos animais evidenciou um efeito de castração tão cedo quanto às quatro 34 semanas após a imunização inicial ao apresentar níveis de testosterona não detectáveis. 0 peso de testículo destes animais variou de 8-36 grama. A maioria dos animais foi assim imunizada de modo eficaz após a administração de uma única dose.
Apesar dos níveis de testosterona no abate terem sido baixos para todos os animais imunocastrados, dois animais com pesos de testículos de 65 e 70 grama tinham níveis significativos de testosterona no soro de 3,80 e 1,18 pmol/ml respectivamente.
Os péptidos que originaram pesos de testículos baixos combinados com níveis de testosterona não detectáveis são considerados os péptidos mais eficazes para a imunocastração de porcos. Estes péptidos são S4A, R8A e G10A.
Os níveis de testosterona no abate de porcos que não estavam imunocastrados variaram entre 0,46 e 48,91 pmol/ml. QUADRO 3: Efeito de vários tratamentos no peso médio de testículo, no título de anticorpo para o péptido, na percentagem de ligação anticorpo-GnRH e níveis de LH e testosterona no soro. Trata peso de título ligação testosterona mento testículo antipéptido à GnRH (pmol/ml) às 13 sav (mediana(gama)) às 10 sav (média) (mediana(gama)) G6k-TD 11 (10-70) 3,32 17, 2 n.d. (n.d.-1,18) pElA 36 (16-65) 3,24 15, 7 n.d. (n.d.-3,80) S4A 36 (10-69) 3,19 16, 9 n.d. (n.d.) 35
Trata peso de título ligação testosterona mento testículo antipéptido à GnRH (pmol/ml) às 13 sav (mediana(gama)) às 10 sav (média) (mediana(gama)) Y5A 44 (15-235) 2,92 11,3 n.d. (n.d.-9,44) L7A 20 (12-195) 3,52 17, 6 n.d. (n.d.-48,91) R8A 15 (10-19) 3,34 17,7 n.d. (n.d.) P9A 23 (8-300) 2,62 15, 8 n.d. (n.d.-11,57) G10A 14 (11-39) 3,19 17,6 n.d. (n.d.) sav = semanas após vacinação; n.d. = não detectável II. Substituição de of D-aminoácido por L-aminoácido A D-lisina (k) nas posições 6, 16, 27 e 37 num dímero tandem é substituída por uma L-lisina (K) e o péptido resultante testado (Quadro 4). G6k-GnRH-tandem: pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#; (SEQ ID NO: 9) G6K-GnRH-tandem: pEHWSYKLRPGQHWSYKLRPGC#; (SEQ ID NO: 14)
Quadro 4:
Trata mento peso de testículo (g) mediana(gama) número de reactivos/ total tii antipéptido às 10 sav ligação à GnRH (média) testosterona pmol/ml, às 13 sav, (mediana e gama) G6k-TD 11 (10-70) 6/6 3, 32 17, 2 n.d. (n.d.-1,18) G6K-TD 21 (9-175) 5/6 2, 70 15, 6 n.d. (n.d.- 5, 26) Contro los 204 (150-236) 0/5 n.d. n.d. 2,05 (0,65-9,35) n.d.: não detectável. 36 A substituição de D-lisina por L-lisina não altera a eficácia do antigénio da vacina. III. Distinção entre GnRH-l e GnRH-ll
Efectuou-se um radioimunoensaio competitivo de ligação GnR-anticorpo para determinar se os anticorpos gerados contra o péptido dimérico G6k-GnRH-tandem (SEQ ID NO: 9) ou contra os seus análogos de substituição de alanina se ligam à GnRH-II ou carecem da ligação à GnRH-II. Pré-incubou-se diluições sucessivas de soro com GnRH-I, GnRH-II, um péptido controlo ou sem péptido. Em seguida adicionou-se GnRH-l iodada para competir com os péptidos pré-incubados para ligação aos anticorpos.
Este procedimento foi realizado em soro colhido antes e depois da imunização de reforço, já que a especificidade dos anticorpos pode aumentar após a imunização de reforço devido à maturação do anticorpo.
Materiais e métodos
Diluiu-se amostras de soro colhidas às 7 sav e de sangue colhido às 10 sav (3 semanas após a imunização de reforço) a 1/100-1/10000 em PBS com 0,4% de BSA (tampão de diluição) . Colocou-se 50 μΐ de diluição de soro em placas de micropoço e adicionou-se 25 μΐ de solução de péptido (0, 0,25, 2,5 ou 25 pmol de péptido em tampão de diluição por poço) . Deixou-se que esta mistura incubasse durante 24 horas a 4 °C. No dia seguinte, adicionou-se 25 μΐ de GnRH iodada (aproximadamente 13000 cpm) e após conservação dum dia para o outro (4 °C) separou-se o péptido não ligado do péptido ligado com carvão. Após centrifugação, separou-se o 37 sobrenadante, contou-se e calculou-se a percentagem de GnRH iodada ligada aos anticorpos.
Resultados
Observou-se a fixação da GnRH-Ι iodada pelo anticorpo nos soros de todos os tratamentos excepto para os soros de H2A e W3A obtidos às 7 sav. A competição com a GnRH-l resultou numa redução acentuada da ligação da GnRH-Ι iodada (ver figura 1), ao passo que a substituição de GnRH-I iodada pela GnRH-II foi extremamente variável. Como esperado, nenhum dos anti-soros se ligou ao péptido de controlo.
Para os soros às 10 sav: Nos soros de quase todos os tratamentos, a GnRH-Ι iodada foi substituída pela GnRH-Ι em mais do que 80% (figura 2A) . A competição da GnRH-II relativamente à ligação de anticorpo à GnRH-Ι iodada resultou numa substituição total ou parcial da GnRH-I iodada em quase todos os soros dos tratamentos R8A, P9A, G10A e G6k-TD e em metade dos soros dos tratamentos Y5A e L7A (figura 2B). No entanto, os anticorpos de praticamente todos os animais dos grupos pElA, H2A, W3A e S4A careceram completamente de ligação à GnRH-II e foram, desse modo, específicos para a GnRH-I.
Os resultados dos estudos de substituição dos soros pré-reforço (7sav) foram diferentes dos soros às 10 sav. Mais uma vez, os soros de todos os tratamentos (excepto H2A e W3A, devido aos títulos de anticorpo baixos) reconheceram a GnRH-I como se determinou através da substituição da GnRH-I iodada pela GnRH-I (figura 3A) . No entanto, em contraste com os soros às 10 sav (figura 2), a maioria dos soros de todos os tratamentos, incluindo pElA e S4A, 38 reconheceram a GnRH-II (figura 3B) . Assim, os soros às 7 sav de pElA e S4A não são específicos para a GnRH-I, mas a especificidade para a GnRH-I e não para a GnRH-II está totalmente estabelecida às 3 semanas após a imunização de reforço (10 sav).
Os resultados de ligação de anticorpo obtidos com os soros pré-reforços foram diferentes dos soros às 10 sav. Os anti-soros dos tratamentos pElA e S4A foram testados em relação à sua capacidade para reconhecer a GnRH-I ou GnRH-II (ver Figura 3) . Para ambos os péptidos, os soros às 10 sav de 6 dos 7 animais não se ligaram à GnRH-II. Dos soros pElA obtidos antes da imunização de reforço, 4 dos 7 animais apresentaram ligação à GnRH-II. Dois soros não reconheceram a GnRH-II e um soro não apresentou qualquer ligação à GnRH iodada. Os resultados dos soros S4A pré-reforço são contraditórios com os resultados dos soros às 10 sav. Os soros pré-reforço de todos os animais do grupo S4A não reconheceram a GnRH-II, sendo a inibição da capacidade de ligação da GnRH iodada semelhante para ambas, a GnRH-I e a GnRH-II. IV. Imunocastração de porcos com conjugados diméricos de GnRH-tandem
De modo semelhante à exploração de Alanina descrita no Exemplo I, sintetizou-se péptidos de substituição de Alanina do péptido GnRH-tandem (Quadro 5) . Os péptidos foram dimerizados, purificados e conjugados com OVA como se descreveu atrás. 39
Quadro 5. Sequências de aminoácidos dos péptidos péptido
GnRH-tandem1: pElA-GnRH-tandem1 H2A-GnRH-tandem1 W3A-GnRH-tandem1 S4A-GnRH-tandem1 Y5A-GnRH-tandem1 G6A-GnRH-tandem1 L7A-GnRH-tandem1 R8A-GnRH-tandem1 P9A-GnRH-tandem1 sequência de aminoácidos pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC# *A---------A----------# -A---------A---------# —A---------A--------# ---A---------A-------# ----A---------A------# -----A---------A-----# ------A---------A----# -------A---------A—# --------A---------A—#
GlOA-GnRH-tandem2 1 ---------A---------A-# 1 listado apenas para efeitos ilustrativos
Imunizou-se quatro ou cinco porcos por grupo com a quantidade de conjugados equivalente a 62 μg de péptido em adjuvante Specol. A eficácia da imunocastração dos conjugados é mostrada na Figura 4.
Os titulos de anticorpo dirigidos contra os péptidos, que foram utilizados para imunização, foram baixos para os porcos tratados com pElA, H2A e R8A, tendo-se detectado niveis elevados de anticorpos antipéptido para os grupos W3A, S4A, Y5A e G10A. Os títulos de anticorpo contra a GnRH-i estavam concordantes com os títulos de anticorpo antipéptido, excepto para os títulos de anticorpo dos porcos tratados com W3A: determinou-se níveis elevados de anticorpos antipéptido nestes animais, no entanto 2 pE = ácido piroglutâmico; * = acetilo; # = amida; - = o aminoácido nesta posição não difere do aminoácido na mesma posição do GnRH-tandem. 40 constatou-se que a capacidade de ligação dos anticorpos à GnRH-I iodada era baixa. V. Distinção entre GnRH-I e GnRH-ll de anti-soros de dímeros de GnRH-tandem
Observou-se a fixação de GnRH-I iodada pelo anticorpo num radioimunoensaio dos soros às 10 sav (diluidos a 1/100— 1/10000) de todos os animais tratados com os péptidos diméricos de GnRH- tandem com substituições de alanina. A competição com a GnRH-I resultou numa redução dramática da ligação da GnRH-I iodada. Nos soros de quase todos os tratamentos, a GnRH-I iodada foi substituída pela GnRH-I em mais de 80% (figura 5A). A substituição de GnRH-I iodada pela GnRH-II foi extremamente variável entre grupos. Ela resultou numa substituição total ou parcial da GnRH-I iodada em quase todos os soros dos tratamentos com Y5A, L7A, R8A, P9A e TD (figura 5B), ao passo que para a maioria dos soros dos tratamentos remanescentes foi determinada uma substituição apenas parcial da GnRH-I iodada pela GnRH-II, chegando mesmo a não ocorrer qualquer substituição.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. Meloen, Robert H. Oonk, Hendrica B. Turkstra, Jouwert A.
<120> Distinção entre GnRH-I e GnRH-II <130> P20700PC10 <140> PCT/NL01/00666 <141> 2001-09-11 41 <150> US 09/659 983 <151> 2000-09-12 <160> 22 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >
<223> Descrição de Sequência Artificial: a sequência de aminoácidos da GnRH-I < 2 2 0 > <221> SÍTIO <222> (1)..(11) <223> /nota="x na posição 1 representa ácido piroglutâmico, x na posição 11 representa amida" <400> 1 Xââ His Trp Str Jyr Gly leu Arg Pr© <sly xaa 1 5 10
<210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: vacina de GnRH-I tandem <220>
<221> SÍTIO <222> (1)..(21) 42 <223> /nota="X na posição 1 representa ácido piroglutâmico ou Gin, X na posição 11 é uma ligação directa ou um grupo espaçador entre os aminoácidos Gly e Gin, X na posição 21 representa Gly-NH2 ou Gly" <400> 2 xaa His Trp ser Tyr Gly Leu Arq Pro Gly xaa Gin His rrp ser Tyr 1 5 10 15
Gly Leu Arg pro xaa 20
<210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: péptidos de acordo com a invenção < 2 2 0 > <221> SÍTIO <222> (1)..(22) <223> /nota="x na posição 1 representa ácido piroglutâmico, K na posição 6 e 16 são aminoácidos levo-rotatórios (L-Lys) ou aminoácidos dextro-rotatórios (D-Lys), X na posição 22 representa amida" <400> 3 xaa His rrp ser Tyr Lys Leu Arg pro Gly Gin His Trp ser Tyr iy$ 15 10 15
Leu Arg Pro Gly Cys Xaa 20
<210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial 43 < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: forma de realização preferida < 2 2 0 > <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 1 representa ácido piroglutâmico, K representa D-Lys, X na posição 22 representa amida" <400> 4
Xaa His Trp Ala Tyr Lys teu Arg ργο Gly Gin His irp Ala Tyr Lys i 1 S 10 15 leu Arg Pro Gly Cys Xaa 20
<210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: forma de realização preferida < 2 2 0 > <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 1 representa ácido piroglutâmico, K representa D-Lys e x na posição 22 representa amida" <400> 5
Xaa Mis Trp ser Tyr Lys Leu Ala Pro Gly Gin His Trp Ser Tyr Lys 1 5 10 15
Leu Ala Pro Gly Cys Xaa 20 44
<210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: forma de realização preferida < 2 2 0 > <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="x na posição 1 representa ácido piroglutâmico, K representa D-Lys e X na posição 22 representa amida" <400> 6
Xaa His Trp Ser Tyr Ly$ Leu Arg Pro Ala Gin His Trp Ser Tyr Lys 15 10 15
Leu Arg Pro Ala cys xaa 20
<210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: um dímero de D-Lys6-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="x na posição 1 representa amida, K representa D-Lys " 45 < 4 Ο Ο > 7 xaa <5lu His Tfp ser Tyr Lys Leu Arg Gly Gin His Trp ser Tyr 1 5 10 15
Lys teu Arg pro Gly cys 20
<210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: pElA-G6k-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="x na posição 1 representa acetilo, K representa D-Lys e X na posição 22 representa amida" <400> 8
Ala His Trp Ser Tyr Lys Leu Arg Pro Gly Ala His Trp Ser Tyr Lys 1 5 10 1$
Leu Arg Pro Gly Cys Xaa 20
<210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Y5A-G6k-GnRH tandem <22 0> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) 46 <223> /nota-"x na posição 1 representa ácido piroglutâmico, K representa D-Lisina, x na posição 22 representa amida" <400> 9 xaa His Trp Ser Alá Lys leu Arg Pro Gly Gin His Trp ser Ala Lys 1 5 10 15
Leu Arg Pro Gly cys xaa 20
<210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: L7A-G6k-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1)..(22) <223> /nota="x na posição 1 representa ácido piroglutâmico, K representa D-Lisina e X na posição 22 representa amida" <400> 10 xaa His Trp Ser Tyr Lys Ala Arg Pro Gly Gin His Trp ser Tyr Lys 1 5 10 15
Ala Arg Pro Gly cys xaa 20
<210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: P9A-G6k-GnRH tandem 47 <220>
<221> SÍTIO <222> (1)..(22) <223> /nota="X na posição 1 representa ácido piroglutâmico, K representa D-Lisina e x na posição 22 representa amida" <400> 11
Xaa His Trp ser Tyr Lys Leu Arg Ala Gly Gin His Trp Ser Tyr Lys 1 5 10 15 Lêu Arg Ala Gly Cys xaa 20
<210> 12 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 1 ácido piroglutâmico e X na posição 22 representa amida" <400> 12
Xaa His Trp ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gin His Trp Ser Tyr Gly 1 5 10 15
Leu Arg Pro Gly cys xaa 20
<210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 48 <223> Descrição de Sequência Artificial: ρΕΙΑ-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (23) <223> /nota="x na posição 1 representa acetilo e X na posição 23 representa amida" <400> 13 xaa Ala His Trp ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Ala His Trp Ser Tyr 1 5 10 15
Gly Leu Arg Pro Gly cys xaa
<210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: H2A-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="x na posição 22 representa amida" <400> 14
Leu Arg Pro Gly Cys Xaa <210> 15
<211> 22 <212> PRT 49 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: W3A-GnRH tandem <22 0> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 22 representa amida" <400> 15
Glu His Ala ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gin His Ala ser ryr Gly 15 10 15 teu Arg Pro Gly Cys xaa 20
<210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: S4A-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 22 representa amida" <400> 16
Glu His Trp Ala Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gin His Trp Ala Tyr Gly 15 10 15 teu Arg pro Gly cys xaa <210> 17 <211> 22 50
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Y5A-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 22 representa amida" <400> 17
Glu His Trp Ser Ala Gly teu Arg Pro Gly Gin His Trp Ser Ala Glv 1 5 10 15
Leu Arg Pro Gly cys xaa 20
<210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: G6A-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 22 representa amida" <400> 18
Glu His Trp Ser Tyr Ala Leu Arg Pro Gly Gin His Trp ser Tyr Ala 15 10 15
Leu Arg Pro Gly Cys xaa 51
<210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: L7A-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) posição 22 representa amida" Tyr çly Ala Arg Pro Gly Gin His Trp Ser Tyr Gly 5 10 15 Cys xaa <223> /nota="X na <400> 19
Glu Hls Trp Ser 1
Ala Arg Pro Gly 20 <210> 20 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: R8A-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 22 representa amida" <400> 20 52
Glu His Trp ser Tyr Gly Leu Ala Pro Gly Gin His Trp Ser Tyr Gly 15 10 15
Leu Ala Pro Gly Cys xaa 20
<210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: P9A-GnRH tandem <220> <221> SÍTIO <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 22 representa amida" <400> 21
Glu His Trp ser Tyr Gly Leu Arg Ala Gly Gin His Trp Ser Tyr Gly 1 5 10 15
Leu Arg Ala Gly cys xaa 20
<210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: GlOA-GnRH tandem <220>
<221> SITIO 53 <222> (1) . . (22) <223> /nota="X na posição 22 representa amida" <400> 22
Glu His Trp ser lyr Gly Leu Arg pro Ala Gin His Trp Ser Tyr Gly 15 10 15
Leu Arg Pro Ala Cys Xaa 20
Lisboa, 7 de Março de 2007
Claims (16)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido que compreende pelo menos duas sequências decapeptídicas GnRH acopladas, seleccionadas do grupo consistindo de: *AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#, pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#, pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC# e pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# em que # é amida e * é acetilo.
2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 o qual induz uma resposta imunogénica que permite distinguir entre tipos diferentes de GnRH, preferencialmente entre a GnRH-Ι e a GnRH-II.
3. Péptido de acordo com a reivindicação 1 o qual induz um nivel de testosterona que é essencialmente não detectado após vacinação com o péptido numa dosagem adequada.
4. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 em que o péptido é seleccionado do grupo consistindo de: pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#, pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, e pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#, preferencialmente seleccionado do grupo consistindo de pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#, e pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC# 9 em que # é amida.
5. Péptido de acordo com as reivindicações 1-4, que está dimerizado ou multimerizado.
6. Péptido de acordo com a reivindicação 5, conjugado com um composto portador.
7. Péptido de acordo com a reivindicação 6, em que o composto portador é uma proteina.
8. Vacina compreendendo um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7.
9. Vacina de acordo com a reivindicação 8, compreendendo adicionalmente um adjuvante.
10. Vacina de acordo com a reivindicação 9, em que o adjuvante é uma fase oleosa de uma emulsão de água-em-óleo ou uma emulsão dupla de óleo.
11. Vacina de acordo com as reivindicações 8-10 que é suficientemente activa para administração numa única dose para a imunocastração essencial de porcos.
12. Anticorpos contra a GnRH-ll obteníveis por um método compreendendo um passo em que é induzida uma resposta imunológica para um péptido de acordo com as reivindicações 1-7.
13. Vacina contra a GnRH-II compreendendo um péptido de acordo com as reivindicações 1-7. 3
14. Composição para o tratamento de cancro da próstata compreendendo um péptido de acordo com as reivindicações 1-7.
15. Péptido de acordo com as reivindicações 1-7 para ser utilizado como um medicamento.
16. Utilização de um péptido como definido nas reivindicações 1-7 para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancro da próstata. Lisboa, 7 de Março de 2007
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