CN103554228B - 一种GnRH去势疫苗及并列体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的GnRH并列体，并在此基础上提供了一种GnRH去势疫苗。所述GnRH并列体结构如下：本发明提供的所述GnRH并列体，Cys并不处于抗原多肽序列的C端，而Cys与C端之间还存在至少一个非Cys氨基酸。本发明并列体合成过程中副反应少，并且能够于载体蛋白更好的进行偶联反应。
Description
技术领域
本发明涉及一系列GnRH并列体、以及所述并列体制成的疫苗，尤其涉及一系列易于与载体蛋白偶联的GnRH并列体、以及所述并列体制成的疫苗。
背景技术
几个世纪以来，除种用公畜外，大多数家畜的公畜一直采用手术去势，以减少动物在育肥阶段因性活动而引起的饲料损耗，减少发情和雄性动物的攻击性行为导致的受伤和死亡，并能够改善肉的品质（如膻味、异味减轻），还可以利用去势动物的生长特点令其增肥。因此，去势是家畜育肥生产过程中的重要技术环节。
然而，自发现去势的优势之后，畜牧生产中所用的去势技术一直是手术去势，对动物应激很大，一般需要7-10天才能恢复，而且有时候会因为伤口感染引起动物死亡。此外，对雌性动物的手术法去势，不仅感染风险较大，而且对操作人员的技术和体力均有很高的要求。此外，在很多国家和地区，动物福利中的激进分子一直施加压力以制止进行手术去势。
一种替代手术去势方法的选择是采用GnRH去势疫苗接种，消除促性腺激素释放因子（GnRH，也称为LHRH）在体内的影响，使动物体不能性成熟，能够得到更好的饲料效率，同时与手术去势相比，安全方便，减少感染机会，并且部分地保留性腺对动物生产性能的刺激作用。GnRH去势疫苗的抗原通式如下：
Z1-Glx-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-(Gly-X-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro)n-Gly-Z
其中，Trp1和Trp2分别为色氨酸或甲酰化色氨酸（N-吲哚-甲酰基-色氨酸）；X为直接连接键或Gly、Gln；Z1-Glx为pGlu或连接额外氨基酸的Glu；Glx-Z1为Gly-NH2或连接额外氨基酸的Gly。
早期GnRH疫苗的研究中，多采用GnRH单体，免疫用量大，需要多次注射，US4608251采用并列体免疫，结果显示免疫原性比单体要高，效果更好。US6284733B1将GnRH并列体进行二聚化，形成二聚物；序列为：
其中，*可以是Gly或D-Lys、D-Glu等氨基酸。研究结果表明，GnRH并列体二聚物为基本结构的免疫去势疫苗非常有效。
目前GnRH去势疫苗的生产基本上被国外公司垄断，国内在此方面所做研究以及研究成果非常有限，而随着中国经济水平的提高，人们对动物肉类产品的需求越来越大，再加上动物福利组织在中国影响的增加，动物养殖对GnRH疫苗的需求量也会进一步增加，在此境况下，研究新的GnRH疫苗具有非常重要的意义。
发明内容
针对目前国内缺乏新的GnRH并列体结构和疫苗的状况，本发明提供了一系列新的GnRH并列体，并在此基础上提供了一种GnRH去势疫苗。
本发明第一个目的是提供一种GnRH并列体，所述GnRH并列体结构如下：
其中：
Z1为p-Glu或Gln，并优选为p-Glu；
W1和W2分别独立地选自Trp或者甲酰化Trp（N-吲哚甲酰基Trp）；并且W1和W2可以相同或不同，并优选为Trp；
*和#分别独立地选自Gly或者D-氨基酸；并且*和#可以相同或不同；其中，*和#优选为D-氨基酸，所述D-氨基酸优选为选自D-Ala、D-Lys、D-Glu、D-Orn中的任意一种或几种；
&为Gly或Lys或者Gly-X，其中，X为Gly、Gln；并优选为Gly；
Z2为一个或多个氨基酸；
n为≥0的整数。
在本发明第一个目的所述的GnRH并列体的一种优选实施例中，Z2为1-5个氨基酸组成的序列，更优选为1-4个氨基酸组成的序列，更优选为1-2个氨基酸组成的序列，更优选为至少包括Gly、Glu、Asp、Orn、Lys中的任意一种氨基酸，更优选为Lys、Glu、Asp、Orn或它们组成的序列。
在本发明第一个目的所述的GnRH并列体的一种优选实施例中，Z2序列优选为至少一个氨基酸不是Cys，更优选为末端氨基酸不是Cys。
在本发明第一个目的所述的GnRH并列体的一种优选实施例中，n为0-10的整数，更优选为0-6，更优选为0-4，更优选为1-10的整数，更优选为1-6的整数，更优选为1或2，最优选为1。
在本发明第一个目的的一种优选实施例中，所述GnRH并列体结构如下：
在本发明第一个目的的另一种优选实施例中，所述GnRH并列体结构如下：
在本发明第一个目的的另一种优选实施例中，所述GnRH并列体结构如下：
在本发明第一个目的的另一种优选实施例中，所述GnRH并列体结构如下：
在本发明第一个目的的另一种优选实施例中，所述GnRH并列体结构如下：
本发明优选的GnRH并列体可以是上述优选实施例中的任意一种或几种的组合物。
本发明第二个目的是提供一种新GnRH去势疫苗，其中，所述疫苗GnRH包括本发明第一个目的所述的任意一种GnRH并列体。
在本发明第二个目的所述的GnRH去势疫苗中，优选地，所述GnRH并列体与载体蛋白偶联。
在本发明第二个目的所述的任意一种GnRH去势疫苗中，还可以包括至少一种或多种免疫佐剂。
应当理解的是，本发明中术语“氨基酸”的含义也包括连接到肽链上之后的氨基酸残基，这对于本领域技术人员来讲是显而易见的。
本发明提供的所述GnRH并列体，Cys并不处于抗原序列的C端，相反，Cys与C端之间还存在至少一个氨基酸。这种情况下，本申请提供的GnRH并列体能够更好的与载体蛋白偶联，使GnRH并列体与载体蛋白偶联物具有更好的抗原性，同时C端加入一个或多个额外氨基酸并未影响其抗原性；同时还能够有效抑制并列体合成过程中副反应的发生。
附图说明
图1为本发明合成实施例1中GnHR并列体MALDI-TOF-MS质谱图；
图2为本发明合成实施例2中GnHR并列体MALDI-TOF-MS质谱图；
图3为本发明合成实施例3中GnHR并列体MALDI-TOF-MS质谱图。
具体实施方式
Cys位于C端第一位时，在多肽合成过程容易发生如：β-Eliminate（β-消去）、Enantiomerization（对映异构化）、Piperidinylalanineformations（哌啶丙氨酸的形成）等副反应，申请人发现，在插入一个或多个非Cys的氨基酸后，能有效抑制上述反应的发生。
下面通过具体实施例对本发明所述的GnRH并列体及其制备的疫苗进行详细的介绍和描述，以使更好的理解本发明内容，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明的保护范围。
一、并列体的合成
合成实施例1
参照US6284733B1等现有的固相多肽的合成技术，合成得到GnRH并列体的单体：
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys-Gly-NH2
高效液相技术进行提纯，得到高纯度单体，每1g粗产物中提取得到515mg高纯度单体。
参照US6284733B1，通过定向氧化，在不同单体的Cys之间形成-S-S-键。高效液相技术提纯，得到高纯度并列体：
图1为本实施例并列体FOT-MS质谱图，检测结果与目的产物结构一致。
合成对比例1
除C不存在Gly之外，其它合成步骤与合成对比例1相同，高效液相技术进行提纯，每1g粗产物中提取得到433mg高纯度单体。
可以看出，C端加入至少一个氨基酸之后，粗产物中的副产物含量明显降低，这是因为Cys位于C端第一位时，在多肽合成过程容易发生如β-消去（β-Eliminate），对映异构化（Enantiomerization），哌啶丙氨酸的形成（Piperidinylalanineformations）等副反应，在插入一个或多个非Cys的氨基酸后，能有效抑制上述反应的发生。
合成实施例2
通过固相多肽的合成技术，合成得到GnRH并列体的单体：
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Lys-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-ALa-Leu-Arg-Pro-Lys-Cys-Gly-NH2
高效液相技术进行提纯，得到高纯度单体。高效液相技术进行提纯，得到高纯度单体，每1g粗产物中提取得到532mg高纯度单体。
通过定向氧化，在不同单体的Cys之间形成-S-S-键。高效液相技术提纯，得到高纯度并列体：
图2为本实施例并列体FOT-MS质谱图，检测结果与目的产物结构一致。
合成实施例3
本实施例GnRH并列体的单体多肽结构如下：
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-ALa-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys-Lys-NH2
本实施例GnRH并列体和疫苗合成方法如下：
合成GnRH并列体
以MBHA树脂为载体树脂，与Fmoc-Lys(BOC)-OH进行偶联反应，将Lys偶联到MBHA树脂上，得到Fmoc-Lys(BOC)-MBHAResin。20%哌啶和DMF存在下，去除Lys的保护基，得到NH2-Lys-MBHAResin。
在催化剂和偶联剂DIC+NMM+HOBT存在下，Lys的两个侧链上分别偶联Fmoc-rinkamidelinker，然后去除保护基，得到：
然后采用同样的方法与Fmoc-Lys(BOC)-OH进行偶联反应，去除Fmoc保护基，然后按照本实施例上述肽链结构依次偶联其它氨基酸，实现两个肽链的同时合成。
碘为催化剂，进行氧化反应在两个肽链的Cys氨基酸之间实现二硫键搭桥。应当注意的是，可以是同一个中间体的两个Cys之间形成-S-S-，或者不同中间体的两个Cys之间形成-S-S-。
95%(v/v)TFA+2.5%(v/v)水+2.5%(v/v)三异丙基硅烷存在下裂解，使多肽与树脂定点分离，在此条件下，同时还可以实现氨基酸侧链保护基的同步裂解。
制备型高效液相色谱仪进行提纯，收集纯度高于95%的产品，冻干。每1g粗产物中提取得到830mg高纯度并列体。图3给出了本实施例合成的并列体的TOF-MS质谱检测结果，谱图结果与本实施例目的产物一致。
本实施例并列体单体的合成路线如下：
合成实施例4
本实施例GnRH并列体的单体多肽结构如下：
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys-Gly-NH2
采用实施例1或3所述的方法，制备并列体：
每1g粗产物中提取得到507mg高纯度单体。
合成实施例5
本实施例GnRH并列体的单体多肽结构如下：
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys-Gly-NH2
采用实施例1或3所述的方法，制备并列体：
合成实施例6
本实施例GnRH并列体的单体多肽结构如下：
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys-Gly-NH2
采用实施例1或3所述的方法，制备并列体：
二、与蛋白质的偶联
通过EDC+HOBT法，将所得并列体与载体蛋白（如卵清蛋白或灭活大肠杆菌不耐热肠毒素）偶联，偶联方法如下：
将2mg的载体蛋白溶解于200μl偶联缓冲液中，2mg所述GnRH并列体溶于500μl偶联缓冲液中，将二者混合；10mgEDC溶解于1ml去离子水中，立即取100μl加入到载体－多肽混合溶液中，室温反应2h，通过截留分子量为35000Dalton的透析膜透析，得到并列体抗原。
三、免疫效果检测
效果检测实例1
为验证GnRH并列体的去势效果，本发明合成实施例3中GnRH并列体∶卵清蛋白按照质量比1∶1偶联后，制备的抗原，分别用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等体积充分乳化制成400μg/ml的疫苗。
免疫方法
雄性仔猪在15日龄时进行免疫，实验组各组分别于颈部肌肉注射2ml弗氏完全佐剂等体积充分乳化制成400μg/ml的疫苗，作为初始免疫，间隔4周后加强免疫，同法注射2ml弗氏不完全佐剂等体积充分乳化制成400μg/ml的疫苗。对照组雄性仔猪不作任何处理，对比例采用多肽序列C端Cys与NH2之间不含有额外氨基酸、其它序列与合成实施例3相同的并列体。
免疫效果测定
仔猪睾丸和体重的检测：23周龄后手术取每只公猪左、右两侧睾丸，除去附睾以及脂肪组织，用游标卡尺测量睾丸纵长，并用电子分析天平称重。结果如表2。
表2免疫组与对照组公猪睾丸重量大小的比较
从表2中可以看出，本发明GnRH去势疫苗免疫两次，能够有效激发GnRH抗体产生，中和体内内源性GnRH，能有效抑制睾丸的发育，显著降低睾丸的大小，达到去势的目的；同时，相比于C端不含有Gly的对比例1，去势效果更好，这很可能是因为本发明在C端加入Gly之后，并列体能够与载体蛋白更好的偶联所致。
效果检测实例2
本发明合成实施例3中的GnRH并列体∶灭活大肠杆菌不耐热肠毒素按照质量比1∶1偶联后，制备的抗原，用法国产206佐剂等体积充分乳化制成400μg/ml的疫苗。
免疫方法
试验组公猪在11周龄时进行免疫，试验组各组分别于颈部肌肉注射2ml疫苗，作为初始免疫，17周龄时加强免疫，同法注射2ml疫苗。阳性对照组（完整公猪）不作任何处理，阴性对照为阉割公猪（10日龄时阉割），对比例采用合成对与效果实施例1中相同的并列体。
免疫效果测定
试验组和对照组公猪分别在第11、17、23周龄采血测定血清中的GnRH和睾酮含量，GnRH测定法：猪GnRHELISA检测试剂盒；睾酮测定法：猪睾酮ELISA检测试剂盒。其结果见表3、4、5。
表3，免疫组与阴、阳对照组公猪血清GnRH平均值的比较
表4，免疫组与阴、阳对照组公猪血清睾酮平均值的比较
表5，免疫组与阴、阳对照组公猪的体重（kg）
从表3、4中可以看出，本发明GnRH去势疫苗免疫两次，能够有效激发GnRH抗体产生，中和体内内源性GnRH，能显著降低血液中睾酮的浓度，从表5中可以看出，屠宰时，免疫组和阉割公猪体重明显高于完整公猪，且在试验期间免疫公猪几乎无相互爬跨现象，性行为减少，达到去势的目。
同时，相比于C末端不含有额外氨基酸的对比例相比，本发明加入至少一个氨基酸之后，能够更有效的与载体蛋白偶联，从而得到更好的免疫效果。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种GnRH并列体，其特征在于，所述GnRH并列体结构如下：
其中：
Z1为p-Glu或Gln；
W1和W2分别独立地选自Trp或者甲酰化Trp；并且W1和W2可以相同或不同；
*和#分别独立地选自Gly或者D-氨基酸；并且*和#可以相同或不同；
&为Gly或Lys或者Gly-X，其中，X为Gly、Gln；
Z2为Gly；
n为≥0的整数。
2.根据权利要求1所述的GnRH并列体，其特征在于，所述D-氨基酸选自D-Ala、D-Lys、D-Glu、D-Orn中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述的GnRH并列体，其特征在于，n为0-10的整数。
4.根据权利要求3所述的GnRH并列体，其特征在于，n为1-6的整数。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的GnRH并列体，其特征在于，所述GnRH并列体选自如下并列体中的任意一种组合物：
6.一种GnRH去势疫苗，其特征在于，所述GnRH去势疫苗包括权利要求1所述的GnRH并列体。
7.根据权利要求6所述的GnRH去势疫苗，其特征在于，所述GnRH并列体与载体蛋白偶联。
8.根据权利要求6所述的GnRH去势疫苗，其特征在于，还包括至少一种免疫佐剂。
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