具体实施方式
本发明给出一个2拷贝分支肽的结构通式(XA-XB-XC-XD-X1)2>K-X2,如:
具体给出一个2拷贝分支肽的结构为:(TKLK)4>K2>K,经过试验证明该多肽具有提升免疫力和抗肿瘤的作用,其结构如:
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合实施例对依据本发明提出的2拷贝分支肽(TKLK)2>K的设计方式、具体应用、实施方式、特征及其功效做以下说明。
1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的羧基端氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性树脂上,树脂上结合的氨基酸的氨基端(N端)与有待连接的氨基酸的羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法。多肽合成的顺序是从多肽的羧基端(C端)开始逐个氨基酸缩合连接向肽段的氨基端(N端)方向不断延伸。当进行氨基酸的羧基接合反应时要将其氨基和侧链基团保护起来避免发生反应,目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法,因此每连接上一个氨基酸就要经历一次以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基的脱保护基并同过量的下一个有待连接的氨基酸的活化羧基发生缩合反应延长肽链。通过这样的步骤反复地多次地进行下去,即达到缩合->洗涤->去保护->中和和洗涤->下一轮缩合(再接上一个氨基酸),直至达到所需要合成的肽链长度。
多肽合成反应完成后采用TFA法将多肽从固相树脂上裂解下来,经过高效液相色谱(HPLC)C18反相色谱层析分离柱分离纯化后最终得到合成产物。基于以上的原理,多肽合成可以是手工操作合成,也可以采用多肽合成仪经过输入合成序列和程序自动化合成取得。如今固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术。本发明所述的多肽合成方式可采用但并不局限于固相合成方式。
这里需要说明的是2拷贝TKLK分支肽片段的合成方式是通过在赖氨酸上的2个活化氨基上同时进行氨基酸的缩合反应,并在以后的氨基酸加成缩合反应中同时得到延伸达到同时合成多拷贝分支肽的目的。在合成直链多肽的过程中使用的是只有一个 活化氨基的赖氨酸,其另一个氨基被保护起来所以不能发生缩合反应。当我们需要合成2拷贝分支肽时,选用两个氨基均被活化可进行缩合反应的赖氨酸可以缩合连接上2个氨基酸,本文中用>K-表示。
多肽分子是一类具有生物活性的分子,它们的氨基酸序列和结构决定了它们的生物学作用。多肽合成目前成为常用技术并已有商业化的服务公司可根据客户的需求提供合成产物。关于多肽合成及纯化的具体细节和原理我们在此不再累叙,请参见由盛树力主编,科学技术文献出版社(1998年)出版的“多肽激素的当代理论和应用”一书。本发明合成制备分支肽的方式可参照以上固相合成方式但并不局限于此方式。
实施例一
Thr-Lys-Leu-Lys(TKLK)是一个具有免疫增强活性的寡肽,为达到制备出高效免疫增强活性和抗肿瘤活性的多肽产物设计和制备出一种含有2拷贝TKLK分支肽(TKLK)2>K。
按照本发明所述,采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成法在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)合成,反应完成后得到的肽树脂采用TFA法将多肽从树脂上裂解下来。采用Waters高效液相色谱C18反相色谱分离柱分离纯化,收集流出峰溶液,经过冷冻干燥得到白色絮状多肽产物。
本实施例通过人工固相合成的方式得到多肽TKLK和2拷贝分支肽(TKLK)2>K,合成肽产物经高效液相色谱(HPLC)C18柱以流动相三氟乙酸/乙晴系统分离纯化可得到纯度>95.0%的合成产物。
实验目的:
观察比较合成产物2拷贝分支肽(TKLK)2>K与单拷贝寡肽TKLK的对小鼠黑色素细胞瘤(B16株)移植瘤的抑瘤效果。
药物:
合成产物(TKLK)2>K和TKLK为白色冻干粉剂,在-20℃避光保存。使用时用生理盐水溶解并稀释至所需浓度。
实验动物:
C57小鼠30只,雌雄各半随机分组,体重18-22克。饲养在有层流系统及屏蔽设备的层流柜中,室温20±2℃,相对湿度40-60%。自由饮水摄食,给予实验动物标准配方料块,饮用蒸馏水。
方法:
每只小鼠右前肢肩胛部位皮下接种2×106/0.2ml瘤细胞。
给药方式:
于接种后的次日开始每3天皮下注射给药一次,连续4次。末次给药后第3天采用颈椎脱臼处死小鼠,剥取肿瘤称重,称量体重。
表1:合成产物对小鼠移植性黑色素细胞瘤(B16)的抑瘤作用
组别 |
试验动物 始/终 |
给药剂量 |
试验结束动物 体重(x±SD,g) |
瘤重 (x±SD,g) |
抑制率 (%) |
P |
对照组 |
10/10 |
生理盐水 10ml/kg |
28.30±1.16 |
3.99±2.84 |
|
-- |
阳性组 |
10/10 |
TKLK 1ug/g体重 |
27.15±1.43 |
2.86±1.07 |
28.32 |
-- |
试验组 |
10/10 |
(TKLK)2>K 1ug/g体重 |
27.03±1.09 |
1.92±1.27 |
51.87 |
<0.05 |
结果评价:
实验过程中小鼠无死亡,体重均有增长,各组动物活动正常,药物注射部位无溃疡及红肿现象发生,提示受试药物无急性毒性作用。
实验显示2拷贝分支肽(TKLK)2>K不仅保留了单拷贝寡肽TKLK的生物活性,而且显示出更高的抑瘤活性。
实施例二
根据本发明提出的2拷贝分支肽设计通式(XA-XB-XC-XD-X1)2>K-X2制备出(TKLK)2>K,其结构如:
按照本发明所述,采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成法在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)合成,反应完成后得到的肽树脂采用三氟乙酸TFA法将多肽从树脂上裂解下来。采用Waters高效液相色谱仪C18反相色谱柱以流动相TFA/乙晴系统分离纯化,可得到纯度>95.0%的合成产物,经过冷冻干燥得到白色絮状固体多肽产物。
本实施例通过人工固相合成的方式分别得到TKLK和2拷贝分支肽(TKLK)2>K,纯度>95.0%的合成产物。
实验方法:
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)能够与鸡红细胞发生凝集现象,这是一种特异性的抗体中和反应,其原理是根据病毒的血凝素可凝集红细胞,但若先用特异性抗体与病毒作用,再加入红细胞,则不出现红细胞凝集,称为血凝抑制试验(HI),检测所用的抗血清稀释的最高倍数即是抗体的滴度。待测抗体的滴度越高说明免疫的效果越好。HI方法具有以下优点:①敏感性强,可以检测到微量的抗体,结果也较为准确,是较敏感的血清学反应之一;②特异性强,病毒凝集红细胞只能被特异的抗体所抑制;③检测速度快,1次HI试验只需2h左右,即可判定结果;④HI试验对环境要求不高,操作简单,1次还可检测大量的样品。因此细胞凝集抑制试验(HI)已经成为一种常用于检测禽类动物血清抗体的检测方法,具体细节请参见由郭鑫主编,中国农业大学出版社2007年出版的“动物免疫学实验教程”。
试验目的:
应用鸡新城疫灭活疫苗与2拷贝分支肽(TKLK)2>K联合使用并与TKLK做对照,接种SPF雏鸡检测HI抗体,观察二者是否具有免疫增强作用及差异。
材料与方法:
选取1月龄左右的SPF鸡分为5组,每组10只。在鸡的胸部肌肉接种鸡新城疫灭活疫苗(La Sota株)0.3ml。
试验组:
空白组:每只鸡胸部肌肉注射0.3ml生理盐水。
正常组:每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml。
试验组1:每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml,含有合成产物TKLK 1ug。
试验组2:每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml,含有合成产物(TKLK)2>K 1ug。
饲养方式:各组同时饲养在隔离器内。
采血:接种后第21天采血,分离血清进行HI试验。
结果:
检测结果表明疫苗中添加了合成产物TKLK或(TKLK)2>K试验组的HI抗体滴度比(TKLK)2>K组有明显提高,具体结果见下表:
表2:免疫后第21日HI结果
编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
均值X |
空白组 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
<1 |
正常组 |
3 |
2 |
4 |
3 |
3 |
1 |
4 |
3 |
3 |
4 |
3.0 |
试验组1 |
2 |
4 |
3 |
5 |
6 |
2 |
3 |
2 |
4 |
6 |
3.7 |
试验组2 |
4 |
3 |
3 |
5 |
4 |
6 |
6 |
4 |
4 |
5 |
4.4 |
结果评价:
以上试验结果显示合成产物2拷贝分支肽(TKLK)2>K和TKLK与疫苗联用均可提 高疫苗的抗体平均滴度,但相比之下(TKLK)2>K抗体滴度比TKLK明显提高,试验动物未见异常和毒副作用,提示合成产物2拷贝分支肽(TKLK)2>K具有显著的免疫增强作用。
总结:
以上2个实施例证明,按照本发明设计通式制备出的(TKLK)2>K分支肽不仅没有消除单拷贝寡肽TKLK的作用,而且更加提高了它的生物活性作用。由此证明按照此通式(XA-XB-XC-XD-X1)2>K-X2设计制备的肽类分子具有免疫增强活性和抗肿瘤活性,其可单独成为药物原料或通过加入制剂辅料制备成为临床用抑制肿瘤生长的药物、临床用免疫增强剂,或动物用免疫增强剂。
按照本发明设计通式产生的2拷贝分支肽采用如下的化学修饰产生的衍生物用于抗肿瘤和免疫增强领域的应用:
1.所述的2拷贝分支肽所带有的羟基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物。
2.所述的2拷贝分支肽所带有的巯基可形成但并不限于所形成的硫醚、硫苷,或与半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含二硫键的化合物。
3.所述的2拷贝分支肽所带有的氨基可形成但不限于所形成的酰化物,烃化物、与糖类物质所形成的苷类物质等。
4.所述的2拷贝分支肽所带有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺类化合物等。
5.所述的2拷贝分支肽所带有的亚氨基可形成但不限于所形成的苷、酰化物、烃化物等。
6.所述的2拷贝分支肽所带有的酚羟基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙类化合物,以及与有机碱或无机碱所形成的盐类化合物。
7.所述的2拷贝分支肽与有机酸或无机酸所形成的盐类化合物。
8.所述的2拷贝分支肽与金属离子所形成的配合物、络合物或螯合物。
9.所述的2拷贝分支肽所形成的水合物或溶剂。
本发明所述的2拷贝分支肽,例如(TKLK)2>K经过以上任意一种,或同时含有多种化学修饰所产生的化学衍生物可作为一种临床用抑制肿瘤生长的药物或一种免疫增强剂。