CN105085637A - 一种多肽化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种多肽化合物及其应用，涉及生物医药领域，所述的多肽化合物的结构式为(TKPR)4>K2>KHG；或者(TKPR)4>K2>KHG-NH2；其中：T为苏氨酸(Thr,T)，K为赖氨酸(Lys,K)，P为脯氨酸(Pro，P)，R为精氨酸(Arg，R)；H为组氨酸(His,H)，G为甘氨酸(Gly,G)。本发明实施例提供的多肽化合物通过将Tuftsin和Bursin两种免疫促进分子的共价连接，得到一种新的多肽化合物，该多肽化合物不但保持了寡肽Tuftsin及Bursin的生物学活性，而且，由于二者的协同作用，进一步提高了两个寡肽的生物活性，从而进一步提升了化合物抑制肿瘤生长的药理学效果。

Description

一种多肽化合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种由4拷贝Tuftsin及单拷贝Bursin共价连接形成的多肽化合物分子，及该化合物在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的应用。
背景技术
生物体的遗传基因被存储在多聚脱氧核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，一般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸，通常较为常见的是4个以上的功能小肽。
由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，将会有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。蛋白质的功能片段通常是指被发现具备某种特定生物学功能的直链多肽片段，它们通常是几十个至两个氨基酸组成的肽类片段，被鉴定和发现的蛋白质功能片段可通过人工合成的途径制备。现已开发并在临床上得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多肽药物“奥曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只有二个氨基酸组成的多肽片段，它们为人工合成多肽功能片段并将它们投入应用奠定了基础。
在蛋白质、多肽或寡肽中，单一氨基酸的缺失、增加或被替换；氨基端(N端)或羧基端(C端)被封闭；序列中或游离端被添加化学基团都会使得蛋白质、多肽或寡肽原有的生物活性发生改变。设计、筛选和发现具有新的功能肽段或寻找高效肽段是药物开发的一个重要环节。
Tuftsin是美国TuftsUniversity科学家NajjarVA发现的一种来源于人体脾脏的活性4肽，其氨基酸序列为Thr-Lys-Pro-Arg(即TKPR)。实验证明Tuftsin能使脾内脾小体增多，生发中心生长活跃，增强粒细胞、单核细胞、巨噬细胞，自然杀伤细胞的趋化、游离、吞噬和产生细胞毒等作用，提高淋巴系统的细胞免疫功能。Tuftsin不仅促进单核吞噬细胞的MHC非限制性功能，还促进其限制性的抗原递呈功能，提高细胞毒作用,具有抑制肿瘤生长的作用。
AudhyaT等于1986年从鸟类的腔上囊提取液中发现了一种3肽免疫促进分子Lys-His-Gly-NH2(即KHG-NH2)，被命名为Bursin。在以后的研究中进一步发现，Bursin不仅分布在鸟类动物的腔上囊中，还存在于胸腺、Hassall小体、哈德氏腺、脾脏及骨髓中，而且也分布在哺乳动物的骨髓及肝胆管上皮中，且以Tuftsin和Bursin前体14肽的形式存在，其序列组成：Phe-Phe—Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg(AudhyaT,1990,1991)。研究表明Bursin具有促进淋巴细胞转化率，促进B细胞分化和增殖，提高抗体水平且无种属差异。
本发明涉及设计和制备一种含有4拷贝Tuftsin分子与单拷贝Bursin分子联接的多肽分子，用以提高机体的体液免疫和细胞免疫能力从而抑制肿瘤的生长，从而开发一种可在临床应用的抗肿瘤药物。
发明内容
为了解决现有技术的问题，一方面，本发明提供了一种多肽化合物，其为由4拷贝Tuftsin分子与单拷贝Bursin分子共价连接构成一种新的多肽分子，所述多肽化合物的氨基酸序列及结构式为：(TKPR)4>K2>KHG；或者(TKPR)4>K2>KHG-NH2；其中：Tuftsin分子的氨基酸序列为Thr-Lys-Pro-Arg(即TKPR)，T为苏氨酸(Thr,T)，K为赖氨酸(Lys,K)，P为脯氨酸(Pro，P)，R为精氨酸(Arg，R)；Bursin分子的氨基酸序列为Lys-His-Gly或者Lys-His-Gly-NH2，H为组氨酸(His,H)，G为甘氨酸(Gly,G)。结构式为(TKPR)4>K2>KHG的多肽化合物，其羧基端通过酰胺化处理能够形成结构式为(TKPR)4>K2>KHG-NH2的多肽化合物。
本发明提供的上述多肽化合物，其形式为将4拷贝的Tuftsin分子和单拷贝Bursin分子连接，其氨基酸序列依然维持哺乳动物体内Tuftsin与Bursin连接的天然顺序，即Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly,其通过Tuftsin和Bursin两种免疫促进分子的共价连接，形成作用加成效果，不但保持了寡肽Tuftsin及Bursin的生物学活性，而且，由于二者的协同作用，进一步提高了两个寡肽的生物活性，从而进一步提升了化合物抑制肿瘤生长的药理学效果。
本发明提供的上述多肽化合物，通过在4拷贝Tuftsin分子的羧基端共价连接单拷贝Bursin分子KHG或KHG-NH2，其中的组氨酸(His，H)为进行分子的同位素碘I125或I131标记提供了位点，克服了以往肽分子难以进行同位素标记追踪的重大缺陷，为示踪该化合物分子在机体内部的组织分布和追踪代谢途径提供了便利和可实施性；尤其是结构式为(TKPR)4>K2>KGH-NH2的多肽化合物，与结构式为(TKPR)4>K2>KGH的化合物相比，其相当于通过将结构式为(TKPR)4>K2>KGH的化合物的羧基端进行酰胺化-NH2处理形成，即封闭了分子的羧基端，降低生理环境下羧肽酶对该化合物羧基端经行的降解，保护了靠近羧基端的组氨酸(His，H)不易被很快地降解脱离化合物分子，延长碘标记分子的追踪时间。
上述两种结构的多肽化合与有机酸或无机酸反应形成的盐类化合物，包括醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐、盐酸盐等化合物，或与有机盐形成的盐类化合物，包括或苹果酸盐、柠檬酸盐、延胡索酸盐等盐类化合物；上述两种结构的多肽化合物其结构式两端的氨基或羧基通过人为的、附加的化学修饰，例如：添加羟基进行羟基化，添加甲基、乙基等进行烷基化，乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化，或者添加氨基酸或者其他任意的化学元素或基团等形成的化合物；上述两种结构的多肽化合物，其结构式所包含的氨基酸的侧链基团，添加羟基进行羟基化，添加甲基、乙基等进行烷基化，乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化，或者添加氨基酸或者其他任意的化学元素或基团等形成的化合物；由于均具有Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly序列，以上化合物均有与上述两种结构的多肽化合相同或相似的性质，具有与上述两种结构的多肽化合相同或相似的抑制肿瘤生长的药理学效果。
另一方面，本发明提供了一种用于抑制肿瘤生长的药物，其包括上述多肽化合物。
该多肽化合物不仅进一步提高了Tuftsin、Bursin和四拷贝Tuftsin肽分子的生物活性，提升了化合物抑制肿瘤生长的药理学效果，而且具有同位素标记位点便于进行药物代谢与组织分布的同位素追踪和研究，克服了以往Tuftsin、Bursin和四拷贝Tuftsin肽分子的作为临床药物成药性差，存在药物代谢研究难以克服的缺点及不足，为该化合物在临床上用于制备抑制肿瘤生长的药物开发提供了可行性和便利性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
为更进一步阐述为达到本发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例对依据本发明提出的由4拷贝Tuftsin分子与单拷贝Bursin分子共价连接构成结构式为(TKPR)4>K2>KHG或者(TKPR)4>K2>KHG-NH2的多肽化合物的设计方式、具体应用、实施方式、特征及其功效做以下说明。
本发明提供的多肽化合物可采用如下技术方案制得：
采用人工合成的方式制备本发明提供的多肽化合物：(TKPR)4>K2>KHG,其合成线路如下：
采用人工合成的方式制备本发明提供的多肽化合物：(TKPR)4>K2>KHG-NH2,其合成线路如下：
1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的羧基端氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端(N端)与有待连接的氨基酸的羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法。多肽合成的顺序是从多肽的羧基端(C端)开始逐个氨基酸缩合连接向肽段的氨基端(N端)方向不断延伸。当进行氨基酸的羧基接合反应时要将其氨基和侧链基团保护起来避免发生反应，目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基的脱保护基并同过量的下一个有待连接的目标氨基酸进行活化羧基发生缩合反应延长肽链。通过这样的步骤反复多次地进行下去，每进行一个循环，即：缩合—>洗涤—>去保护—>中和—>洗涤—>再进入下一轮缩合(再接上一个目标氨基酸)，直至达到所需要合成的目标肽链长度。
在合成直链多肽的过程中使用的是只有一个活化氨基的赖氨酸，其另一个氨基被保护所以不能发生缩合反应。当我们需要合成4拷贝Tuftsin(TKPR)化合物时，合成方式是通过在赖氨酸上的2个活化氨基上同时进行氨基酸的缩合反应(本文中用“>K”表示)，并在以后的氨基酸加成缩合反应中同时得到延伸得以实现的。
多肽合成目前成为常规技术并有商业化服务公司可根据客户的需求提供合成服务。关于多肽合成及纯化的具体细节和原理我们在此不再赘述，合成原理和操作参见由盛树力主编，科学技术文献出版社(1998年)出版的“多肽激素的当代理论和应用”一书的第三章“多肽的化学合成和纯化”。本发明合成制备多肽化合物的方式可以参照以上固相合成方式，但并不局限于此合成方式。
多肽化合物是一类具有生物活性的分子，它们的氨基酸序列和结构决定了它们的生物学作用。单一氨基酸在蛋白质或肽序列中的改变或蛋白质，肽分子结构的任何改变都有可能产生不可预测的生物学活性的改变，下面通过具体实施例来对本发明提供的多肽化合物的生物活性及其功效进行详细阐述。
实施例
本发明实施例提供了两种4拷贝Tuftsin分子及单拷贝Bursin分子共价联接而得的多肽化合物，其结构式分别为：(TKPR)4>K2>KHG和(TKPR)4>K2>KHG-NH2，这两种化合物分别通过上述合成路线合成，具体操作如下：
本发明实施例提供的两种多肽化合物均采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成法。
合成肽酸类分子，包括TKPR、(TKPR)4>K2>KG、(TKPR)4>K2>KHG采用“WANG树脂”在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸,合成完成后采用TFA法将目的多肽从树脂上裂解下来。
合成肽酰胺类分子，包括KHG-NH2、(TKPR)4>K2>KHG-NH2采用“RINK树脂”在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸,合成完成后采用TFA法将目的多肽从树脂上裂解下来。
采用色谱柱型号DaisoC18(10μm,,50x250mm)，色谱操作流动相A为(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。收集流出峰溶液，经过冷冻干燥得到白色絮状固体多肽产物。
其中：
Tuftsin分子，TKPR分子式为C21H40N8O6，理论分子量为500.60，合成质谱分子量为501.79；
Bursin分子，KHG-NH2分子式为C14H25N7O3,理论分子量为339.4合成质谱分子量为339.57；
(TKPR)4>K2>KG分子式为C104H193N39O25,,理论分子量为2389.94，合成质谱分子量为2389.88；
(TKPR)4>K2>KHG分子式为C110H200N42O26，理论分子量为2527.09，合成质谱分子量为2528.97；
(TKPR)4>K2>KHG-NH2分子式为C110H201N43O25，理论分子量为2526.10，合成质谱分子量为2527.39。
本发明实施例提供的(TKPR)4>K2>KHG及(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物分子经高效液相色谱(HPLC)C18柱以流动相TFA/乙晴系统分离纯化可得到纯度>99.0％的合成产物，经过冷冻干燥得到白色絮状固体多肽产物，经密封包装后放入冰箱保存待用。
对比例1
通过实施例中提供的人工固相合成方法得到TKPR分子，TKPR分子式为C21H40N8O6，理论分子量为500.60，合成质谱分子量为501.79，该分子经高效液相色谱(HPLC)C18柱以流动相TFA/乙晴系统分离纯化可得到纯度>99.0％的合成产物，经过冷冻干燥得到白色絮状固体产物，经密封包装后放入冰箱保存待用。
对比例2
通过实施例中提供的人工固相合成方法得到的结构式为KHG-NH2的肽分子，KHG-NH2分子式为C14H25N7O3,理论分子量为339.4合成质谱分子量为339.57，该分子经高效液相色谱(HPLC)C18柱以流动相TFA/乙晴系统分离纯化可得到纯度>99.0％的合成产物，经过冷冻干燥得到白色絮状固体产物，经密封包装后放入冰箱保存待用。
对比例3
通过实施例中提供的人工固相合成方法得到的结构式为(TKPR)4>K2>KG的肽分子，(TKPR)4>K2>KG分子式为C104H193N39O25,理论分子量为2389.94，合成质谱分子量为2389.88；该分子经高效液相色谱(HPLC)C18柱以流动相TFA/乙晴系统分离纯化可得到纯度>99.0％的合成产物，经过冷冻干燥得到白色絮状固体产物，经密封包装后放入冰箱保存待用。
实施例、对比例1、对比例2及对比例3提供的肽化合物进行抑制肿瘤试验，具体试验方法及结果如下：
一、实体荷瘤小鼠残瘤模型验证：
肿瘤发生的早期无明显症状，被确诊的肿瘤患者绝大多数已处于中晚期。肿瘤患者面临的治疗首选方案是手术切除以减少肿瘤负荷。但是肿瘤中晚期患者手术往往很难将肿瘤完全剔除干净，弥撒、转移在其它部位的微小瘤灶肉眼难以发现。临床观察表明，术后残瘤的生长速度比原发瘤灶生长更快，造成肿瘤复发来势汹汹难以控制的境况。肿瘤患者术后接受的放化疗措施产生的毒副作用给患者造成更加严重的伤害，许多中晚期肿瘤患者术后的生存期可能更短。对于恶性实体瘤患者的治疗重点在于消除残存瘤灶避免肿瘤的复发。本文所述的小鼠术后残瘤模型已公开发表(贾娜等.小鼠术后残瘤模型的建立及T肽抑制术后残瘤生长的初步研究,解放军药学学报,2010；26(5):377-80)。
肿瘤免疫逃逸理论认为，肿瘤组织会在其周围形成免疫抑制包围圈，肿瘤微环境造成免疫细胞进入其中不能发挥正常的免疫识别和清除功能，由此造成肿瘤组织逃逸免疫监视，瘤组织继续生长扩张。“小鼠术后残瘤模型”模仿中晚期患者手术切不净的状态，检测抗瘤药物抑制残瘤生长的效果。
该模型的实施步骤如下：
扩增小鼠肿瘤细胞达到一定数量后，制成小鼠肿瘤细胞悬液，通常按照每只小鼠接种200-400万个细胞，于小鼠腋部皮下。待肿瘤体积达到约400-500mm3范围内时，将小鼠麻醉后，在无菌条件下，手术切除大部瘤块，存留残瘤体积约50-60mm3，术后缝合手术切口。24小时后，将术后小鼠按照残瘤体积进行分组给药。
每2-3天，测量各组肿瘤体积的变化和体重。根据对照组肿瘤生长状况，确定试验结束时间。试验结束时，采取颈部脱臼处死荷瘤小鼠，仔细剥离小鼠肿瘤，称重。根据小鼠肿瘤重量、体积，血液中与机体免疫功能相关的各细胞组分和细胞因子的变化等，确定受试药物的抗癌效果。根据小鼠体重、死亡状况、日常活动，以及主要脏器组织切片的检查、血液生化指标等，确定受试药物的毒性评价。
另外，在上述基础上，还可以观察小鼠的生存期为指标，确定受试药物各给药组的生存延长期，作为抗癌效应的评价指标。
采用以上建立的荷瘤小鼠残瘤模型评价抑瘤药物的抑瘤作用。
I、肽类化合物对小鼠S180肉瘤移植瘤术后残瘤生长的抑制作用：
1、试验目的
评价实施例及对比例提供的肽化合物对S180肉瘤昆明小鼠移植瘤手术后残瘤生长的影响。
2、实验动物和肿瘤细胞株
昆明小鼠，SPF级，4-6周龄，16-19g，雌性。小鼠肉瘤S180细胞株，由中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所肿瘤药理室传代、培养、保存。
3、实验环境条件、仪器设备等
实验动物饲养于无菌、独立送风IVC笼具中，每笼10只小鼠，饲以专门为小鼠配制的饲料，自由饮水。动物实验室内温度保持在25℃左右，相对湿度保持在40-70％，每日光照12小时。
4、实验方法及药物处理
无菌条件下，取3只荷S180肉瘤小鼠的腹水，大约8mL，用无菌生理盐水以1：3的比例稀释，肿瘤细胞浓度约为8.2×106个/ml，给予小鼠右侧腋部皮下接种0.2mL。接种肿瘤细胞数为1.64×106个/只。小鼠接种肿瘤细胞一周，肿瘤体积大约有500mm3时，腹腔注射0.5％的无菌戊巴比妥钠溶液(0.15mL/20g体重)麻醉动物，无菌条件下切开荷瘤处小鼠的皮肤，手术去除大部瘤块，剩余肿瘤体积大约为50-60mm3，缝合皮肤，然后进行后续试验。
分组方式：
以《抗肿瘤药效学指导原则(讨论稿)》及《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》为指导，设各试验组以10只小鼠为一组，分别为：(TKPR)4>K2>KHG肽给药组、(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽低剂量给药组、(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽中剂量给药组、(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽高剂量给药组、TKPR对照组、KHG-NH2对照组、(TKPR)4>K2>KG对照组、环磷酰胺阳性对照组(CTX100mg/kg)和空白对照组。
给药方式：
(TKPR)4>K2>KHG给药组、(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽低剂量给药组、(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽中剂量给药组、(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽高剂量给药组、TKPR给药组、KHG-NH2给药组每两天一次皮下注射给药，分别于手术后第1、3、5、7、9、11天给药；
环磷酰胺阳性对照组每两天一次腹腔给药，分别于手术后第1天、第3天和第5天给药；
空白对照组仅给予等量生理盐水；
评价方式：
每隔一天称小鼠体重、用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积。给药10天后结束给药，颈部脱臼处死动物，剥离取出瘤块称重，依据瘤块重量和测量体积评价药物疗效。
数据用表示；肿瘤生长抑制率(瘤重)＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；肿瘤生长抑制率(瘤体积)＝(对照组瘤体积－给药组瘤体积)/对照组瘤体积×100％；肿瘤体积计算方法，肿瘤体积V：V＝1/2×a×b2(a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径)。用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。
5、试验结果
试验数据参见表1：
表1(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽高、中、低剂量对S180肉瘤昆明小鼠移植瘤术后残瘤生长的影响对照表
*：P<0.05vs空白对照组；**：P<0.01vs空白对照组；***：P<0.001vs空白对照组；NS:生理盐水。
表2实施例及对比例提供的肽对S180肉瘤昆明小鼠移植瘤术后残瘤生长的影响数据表
*：P<0.05vs空白对照组；**：P<0.01vs空白对照组；***：P<0.001vs空白对照组
结论：
表1试验结果说明，本发明所涉及的肽化合物(TKPR)4>K2>KHG-NH2对小鼠S180肉瘤的移植瘤术后抑制残瘤生长的作用随着给药剂量的升高而加强，对小鼠S180肉瘤残瘤的生长显示出正相关的明显抑制作用；按照肿瘤体积得出的抑制率范围为69.9-82.4％，按照瘤重得出的抑制率范围为68.1-86.0％，可以看出本发明所涉及的肽化合物(TKPR)4>K2>KHG-NH2对肿瘤有明显的抑制作用，有统计学意义；各剂量(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物试验组在给药后均未见急性毒性反应，各组动物活动正常，与空白对照组相比体重无明显变化，提示受试肽化合物无明显毒副作用；环磷酰胺阳性药物组试验结束时，死亡动物4只，受试动物体重明显减轻，显示出较强的毒副作用。
表2试验结果显示，在相同给药剂量的条件下(TKPR)4>K2>KHG和(TKPR)4>K2>KHG-NH2显示出明显抑制残瘤生长的作用，与对比例Tuftsin(TKPR)、Bursin(KHG-NH2)和(TKPR)4>K2>KG相比，抑制肿瘤生长率具有明显提升。
II、肽类化合物对小鼠肝癌H22瘤株移植昆明小鼠术后残瘤生长的抑制作用：
1、试验目的
评价本发明实施例提供的肽化合物对小鼠肝癌H22瘤株移植昆明小鼠手术后残瘤生长的影响。
2、实验动物和肿瘤细胞株
昆明小鼠，SPF级，4-6周龄，16-19g，雌性。小鼠肝癌H22细胞株由中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所肿瘤药理室传代、培养、保存。
3、实验环境条件、仪器设备等
实验动物饲养于无菌、独立送风IVC笼具中，每笼10只小鼠，饲以专门为小鼠配制的饲料，自由饮水。动物实验室内温度保持在25℃左右，相对湿度保持在40-70％，每日光照12小时。
4、实验方法及药物处理
扩增小鼠肝癌H22瘤株制成小鼠肿瘤细胞悬液，按照每只小鼠接种200-400万个细胞于昆明小鼠腋部皮下。小鼠接种肿瘤细胞一周，肿瘤体积大约有500mm3时，腹腔注射0.5％的无菌戊巴比妥钠溶液(0.15mL/20g体重)麻醉动物，无菌条件下切开荷瘤处小鼠的皮肤，手术去除大部瘤块，剩余肿瘤体积大约为50-60mm3，缝合皮肤，然后进行后续试验。
以《抗肿瘤药效学指导原则(讨论稿)》及《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》为指导，设(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组、环磷酰胺阳性对照组(CTX100mg/kg)和空白对照组，其中(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组包括低、高、中三个剂量的组别。小鼠手术24h后，称量小鼠体重，测量肿瘤体积，按瘤体积分组，开始首次给药。
(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组每两天一次皮下注射给药，分别于手术后第1、3、5、7、9、11天给药；环磷酰胺阳性对照组每两天一次腹腔给药，分别于手术后第1天、第3天和第5天给药；空白对照组不做任何给药处理；每隔一天称小鼠体重、用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积。给药10天后结束给药，颈部脱臼处死动物，剥离取出瘤块称重，依据瘤块重量和测量体积评价药物疗效。
数据用表示；肿瘤生长抑制率(瘤重)＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；肿瘤生长抑制率(瘤体积)＝(对照组瘤体积－给药组瘤体积)/对照组瘤体积×100％；肿瘤体积计算方法，肿瘤体积V：V＝1/2×a×b2(a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径)。用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。
5、试验结果
试验数据参见表3：
表3本发明实施例提供的肽化合物各剂量对H22小鼠肝癌昆明小鼠移植瘤术后残瘤生长的影响
**p<0.01，***p<0.001(与空白对照组比较，t检验)
结论：
表3结果显示，本发明所涉及的肽化合物(TKPR)4>K2>KHG-NH2对小鼠H22肝癌移植昆明小鼠的术后抑制残瘤生长的作用随着给药剂量的升高而加强，对H22肝癌残瘤的生长显示出正相关的明显抑制作用。按照肿瘤体积得出的抑制率范围为74.9-83.9％，按照瘤重得出的抑制率范围为74.5-84.8％，可以看出本肽化合物对肿瘤有明显的抑制作用，有统计学意义。各剂量(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组在给药后均未见急性毒性反应；各组动物活动正常，与对照组相比，体重无明显变化，提示受试肽化合物无明显毒副作用；环磷酰胺阳性对照组(CTX)试验结束时死亡动物4只，受试动物体重明显减轻，显示出较强的毒副作用。
二、人癌细胞实体瘤移植免疫缺陷小鼠残瘤模型验证：
扩增人癌细胞达到一定数量后，制成肿瘤细胞悬液，通常按照每只动物接种200-400万个细胞，于裸鼠或者SCID小鼠腋部皮下。无菌条件下，取5只保种裸鼠的肿瘤块，用手术刀将其切割成2mm3的瘤块，用手术剪与裸鼠右侧背部开一小口，用套管针将瘤块接种与裸鼠右侧肩部皮下。
待肿瘤体积达到约400-500mm3范围内时，将动物麻醉后，在无菌条件下，手术切除大部瘤块，存留残瘤体积约50-60mm3，术后缝合手术切口。24小时后，将术后小鼠按照残瘤体积进行分组给药。
每2-3天，测量各组肿瘤体积的变化和体重。根据对照组肿瘤生长状况，确定试验结束时间。试验结束时，处死荷瘤小鼠，仔细剥离小鼠肿瘤，称重。根据小鼠肿瘤重量、体积，血液中与机体免疫功能相关的各细胞组分和细胞因子的变化等，确定受试药物的抗癌效果。根据小鼠体重、死亡状况、日常活动，以及主要脏器组织切片的检查、血液生化指标等，确定受试药物的毒性评价。
另外，在上述基础上，还可以观察小鼠的生存期为指标，确定受试药物各给药组的生存延长期，作为抗癌效应的评价指标。
I、肽类化合物对人结肠癌HT29裸鼠移植瘤术后残瘤生长的抑制作用：
1、试验目的
本发明实施例提供的肽化合物人结肠癌HT-29移植裸鼠后对术后残瘤生长的影响。
2、实验动物和肿瘤细胞株
Nu/nu裸鼠，SPF级，4-6周龄，18-22g，雌性。人源结肠癌HT-29细胞株由中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所肿瘤药理室传代、培养、保存。
3、实验环境条件、仪器设备等
实验动物饲养于无菌、独立送风IVC笼具中，每笼10只小鼠，饲以专门为小鼠配制的饲料，自由饮水。动物实验室内温度保持在25℃左右，相对湿度保持在40-70％，每日光照12小时。
4、实验方法及药物处理
无菌条件下，取5只保种裸鼠的肿瘤块，用手术刀将其切割成2mm3的瘤块，用手术剪与裸鼠右侧背部开一小口，用套管针将瘤块接种与裸鼠右侧肩部皮下。裸鼠接种肿瘤细胞一周，肿瘤体积大约有400mm3时，用0.5％戊巴比妥钠溶液，按0.1ml/20g腹腔注射，将裸鼠麻醉，手术去除大半体积的瘤块，剩余肿瘤体积大约为60-100mm3，然后进行后续试验。
以《抗肿瘤药效学指导原则(讨论稿)》及《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》为指导，设(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组、5-氟尿嘧啶阳性对照组(5-Fu30mg/kg)和空白对照组，其中(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组包括低、高、中三个剂量的组别。裸鼠手术后，称量动物体重，测量肿瘤体积，按瘤体积分组，手术24h后给药。
(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组两天一次皮下注射给药，给药七次。5-氟尿嘧啶阳性对照组两天一次尾静脉注射给药，给药五次。空白对照组不做任何给药处理。每隔三天称小鼠体重、用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积。给药16天后结束给药，颈部脱臼处死动物，剥离取出瘤块称重，依据瘤块重量和测量体积评价药物疗效。
数据用表示；肿瘤生长抑制率(瘤重)＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；肿瘤生长抑制率(瘤体积)＝(对照组瘤体积－给药组瘤体积)/对照组瘤体积×100％；肿瘤体积计算方法，肿瘤体积V：V＝1/2×a×b2(a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径)。用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。
5、试验结果
试验数据参见表4：
表4本发明实施例提供的肽化合物各剂量对人结肠癌HT-29移植裸鼠手术后残瘤生长的影响
**p<0.01，***p<0.001(与空白对照组比较，t检验)
结论：
本实验采用裸鼠建立“瘤术后残瘤”模型，由于裸鼠是一种缺少胸腺组织，T淋巴细胞功能缺失的遗传变异小鼠，所以人源癌组织可移植到裸鼠体内生长。
表4结果证明，本发明实施例提供的肽化合物对人结肠癌HT-29移植裸鼠术后残瘤的抑制作用随着给药剂量的提高呈现明显的正相关抑制作用。按照肿瘤体积得出的抑制率为52.0-71.7％％，按照瘤重得出的抑制率为56.4-74.5％，可以看出该肽化合物给对肿瘤有明显的抑制作用，有统计学意义(P<0.05)。
本发明实施例提供的肽化合物试验组在给药后均未见急性毒性反应；各组动物活动正常，与对照组相比体重一致；试验期间本发明实施例提供的肽化合物给药组受试动物未发生死亡；提示受试肽化合物无明显毒副作用。5-氟尿嘧啶阳性给药组(5-Fu)裸鼠死亡5只，试验观察受试动物的体重明显低于对照组，提示有明显的毒副作用。
II、肽类化合物对人肝癌HepG2移植裸鼠术后残瘤生长的抑制作用
1、试验目的
评价本发明实施例提供的肽化合物对人肝癌HepG2移植裸鼠术后残瘤生长的影响。
2、实验动物和肿瘤细胞株
Nu/nu裸鼠，SPF级，4-6周龄，18-22g，雌性。人肝癌HepG2细胞株由中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所肿瘤药理室传代、培养、保存。
3、实验环境条件、仪器设备等
实验动物饲养于无菌、独立送风IVC笼具中，每笼10只小鼠，饲以专门为小鼠配制的饲料，自由饮水。动物实验室内温度保持在25℃左右，相对湿度保持在40-70％，每日光照12小时。
4、实验方法及药物处理
无菌条件下，取5只保种裸鼠的肿瘤块，用手术刀将其切割成2mm3的瘤块，用手术剪与裸鼠右侧背部开一小口，用套管针将瘤块接种与裸鼠右侧肩部皮下。裸鼠接种肿瘤细胞一周，肿瘤体积大约有400mm3时，用0.5％戊巴比妥钠溶液，按0.1ml/20g腹腔注射，将裸鼠麻醉，做手术，去除大半体积的瘤块，剩余肿瘤体积大约为60-100mm3，然后进行后续试验。
以《抗肿瘤药效学指导原则(讨论稿)》及《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》为指导，设(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组、5-氟尿嘧啶阳性对照组(5-Fu30mg/kg)和空白对照组，其中(TKPR)4>K2>KHG-NH2肽化合物给药组包括低、高、中三个剂量的组别。裸鼠手术后，称量动物体重，测量肿瘤体积，按瘤体积分组，手术24h后给药。
肽化合物各给药组两天一次皮下注射给药，给药七次。5-氟尿嘧啶阳性药物对照组两天一次尾静脉注射给药，给药五次。空白对照组不做任何处理。每隔三天称小鼠体重、用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积。给药16天后结束给药，颈部脱臼处死动物，剥离取出瘤块称重，依据瘤块重量和测量体积评价药物疗效。
数据用表示；肿瘤生长抑制率(瘤重)＝(对照组瘤重－给药组瘤重)/对照组瘤重×100％；肿瘤生长抑制率(瘤体积)＝(对照组瘤体积－给药组瘤体积)/对照组瘤体积×100％；肿瘤体积计算方法，肿瘤体积V：V＝1/2×a×b2(a为肿瘤的长径，b为肿瘤的短径)。用EXCEL软件中t-检验程序进行组间统计学分析。
5、试验结果
试验数据参见表5：
表5本发明实施例提供的肽化合物各剂量对HepG2肝癌裸鼠移植瘤手术后残瘤生长的影响
**p<0.01，***p<0.001(与空白对照组比较，t检验)
结论：
表5结果表明，本发明实施例提供的肽化合物给药组对人肝癌HepG2移植裸鼠术后残瘤生长产生明显的抑制作用，且随给药剂量的升高而提高，显示出显著的剂量正相关依赖关系。按照肿瘤体积得出的抑制率为56.0-63.3％，按照瘤重得出的抑制率为60.6-69.0％，可以看出该肽化合物对肿瘤有明显的抑制作用，有统计学意义(P<0.05)。
上述各肽化合物试验组在给药后均未见急性毒性反应；各组动物活动正常，与对照组相比体重一致；试验期间受试药组动物未发生死亡；提示受试药物无明显毒副作用。5-氟尿嘧啶阳性对照组裸鼠死亡5只，受试动物体重明显低于对照组，提示有显著的毒副作用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种多肽化合物，其特征在于，其结构式为：
(TKPR)4>K2>KHG；或者
(TKPR)4>K2>KHG-NH2；
其中：T为苏氨酸(Thr,T)，K为赖氨酸(Lys,K)，P为脯氨酸(Pro，P)，R为精氨酸(Arg，R)；H为组氨酸(His,H)，G为甘氨酸(Gly,G)。
2.根据权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于，其与有机酸或无机酸形成的盐类化合物。
3.根据权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于，其结构式两端的氨基或羧基通过羟基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、添加氨基酸或其他化学元素或基团形成的化合物。
4.根据权利要求1所述的多肽化合物，其特征在于，其结构式所包含的氨基酸的侧链基团，通过羟基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、添加氨基酸或其他化学元素或基团形成的化合物。
5.一种用于抑制肿瘤生长的药物，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项提供的多肽化合物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106866793A (zh) * 2015-12-14 2017-06-20 韩苏 一种多肽化合物及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995005195A1 (fr) * 1993-08-13 1995-02-23 Laboratoires Dolisos Compositions pharmaceutiques immunoadjuvantes ou immunostimulantes
CN101607984B (zh) * 2008-06-18 2012-04-25 北京中天康泰生物科技有限公司 一种多拷贝多肽及其应用
CN102153654B (zh) * 2009-12-31 2012-10-10 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 以免疫活性肽为载体的分支多肽及其衍生物与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1249240C (zh) * 2002-06-25 2006-04-05 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 表达载体pBVTB及其构建方法和在HCV疫苗研究中的应用
CN100503634C (zh) * 2006-01-24 2009-06-24 北京中天康泰生物科技有限公司 一种t4合成产物及其用途
CN101307097A (zh) * 2007-05-17 2008-11-19 北京中天康泰生物科技有限公司 一种增强肽段免疫活性的制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995005195A1 (fr) * 1993-08-13 1995-02-23 Laboratoires Dolisos Compositions pharmaceutiques immunoadjuvantes ou immunostimulantes
CN101607984B (zh) * 2008-06-18 2012-04-25 北京中天康泰生物科技有限公司 一种多拷贝多肽及其应用
CN102153654B (zh) * 2009-12-31 2012-10-10 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 以免疫活性肽为载体的分支多肽及其衍生物与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. NISHIOKA: "ANTI-TUMOUR EFFECT OF THE PHYSIOLOGICAL TETRAPEPTIDE,TUFTSIN", 《BR. J. CANCER》 *
汪琼等: "促吞噬肽衍生物T 肽抑制小鼠移植瘤和术后残瘤生长的药效学研究", 《军事医学》 *
邹承鲁: "《当代生物学》", 3 April 2000, 中国致公出版社 *
顾琴龙等: "Tuftsin抗肿瘤作用及其机理研究", 《中华实验外科杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106866793A (zh) * 2015-12-14 2017-06-20 韩苏 一种多肽化合物及其制备方法与应用

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