CN102190713A - 一种合成肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种4拷贝分支肽及其应用。该分支肽的结构通式为(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₃该分支肽在动物试验中显示出明显的抑制肿瘤生长和免疫增强作用，具有开发成为临床抗肿瘤药物和免疫增强剂的潜力。

Description

一种合成肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物医药领域中的多肽药物的开发，具体涉及到设计和制备一种4拷贝分支肽在临床上可用于抑制肿瘤生长和免疫增强方面的用途。

背景技术

生物体的遗传基因被存储在多聚核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸，通常较为常见的是4个以上的功能小肽。

由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，将会有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。蛋白质的功能片段通常是指被发现具备某种特定生物学功能的直链多肽片段，它们通常是几十个至两个氨基酸组成的肽类片段，被鉴定和发现的蛋白质功能片段可通过人工合成的途径制备。现已开发并在临床上得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多肽药物“奥曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只有二个氨基酸组成的多肽片段，它们为人工合成多肽功能片段并将它们投入应用奠定了基础。

在蛋白质、多肽或寡肽中，单一氨基酸的缺失、增加或被替换；氨基端（N端）或羧基端（C端）被封闭；序列中或游离端被化学基团修饰都会使得蛋白质、多肽或寡肽原有的生物活性发生不可预知的改变。设计、筛选和发现具有新的功能肽段或寻找高效肽段是药物开发的一个重要环节。

Tuftsin是美国科学家发现的一种来源于脾脏的活性4肽Thr-Lys-Pro-Arg或TKPR（Life Science,1981,26(10):1081-1091）。实验证明Tuftsin能使脾内脾小体增多，生发中心生长活跃，增强粒细胞、单核细胞、巨噬细胞，自然杀伤细胞的趋化、游离、吞噬和产生细胞毒等作用，提高淋巴系统的细胞免疫功能。Tuftsin不仅促进单核吞噬细胞的MHC非限制性功能，还促进其限制性的抗原递呈功能，提高细胞毒作用。

本发明涉及设计和制备一种含有4拷贝TKPR片段的肽类分子用以高效提高其免疫功能及抗肿瘤活性，开发一种可在临床应用的抗肿瘤药物和免疫增强剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种4拷贝分支肽及其在抑制肿瘤生长的药物和免疫增强剂方面的应用，所要解决的技术问题是使该4拷贝分支肽不仅保留功能寡肽的生物学活性而且显著提高其生物学活性。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本发明提出一种4拷贝分支肽，是将具有该氨基酸序列特征组成的寡肽片段通过具有2个游离活化氨基可供进行氨基酸加成缩合反应的赖氨酸(Lys，用>K-表示)连接的桥梁链制备成4拷贝分支分子，其结构通式为：(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₃，其中，X_A和X_c代表极性不荷电氨基酸，包括丝氨酸（Ser,S）、苏氨酸（Thr，T）、半胱氨酸（Cys，C）、脯氨酸（Pro，P）、谷氨酰胺（Gln，Q）、天门冬酰胺（Asn，N）；X_B和X_D代表碱性氨基酸包括组氨酸（His，H）、赖氨酸（Lys，K）、精氨酸（Arg，R）；K为具有2个活化氨基可供进行氨基酸加成缩合反应的赖氨酸；X₁和X₂分别代表由0-5个任意氨基酸所构成的氨基酸序列, X₁和X₂可以是相同氨基酸序列也可以是由不同的氨基酸组成的序列，其中X₁和X₂可以不存在，而X₃为含有1-4个任意氨基酸组成的序列。

根据发明提出的4拷贝分支肽(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₃所制备出来的TKPR分支肽(TKPR)₄>K₂>K-G在动物实验中显示具明显的免疫增强抑制肿瘤生长的作用。

根据本发明提出的4拷贝分支肽设计通式制备出来的(TKPR)₄>K₂>K-TKPR在动物实验中具显著的免疫增强作用。

按照本发明设计通式制备出来的4拷贝分支肽(TKPR)₄>K₂>K-G或(TKPR)₄>K₂>K-TKPR克服了直链寡肽TKPR进入体内易被降解的缺点，不仅保持了TKPR片段的免疫增强活性和抗肿瘤作用，而且与TKPR寡肽相比显著提高了其生物学活性。按照此方式制备的活性多肽开发成为药物在体内的最终降解产物为游离氨基酸，可被机体直接吸收，没有明显的药物残留和毒副作用，作为药物具有良好的安全性，在临床应用上具有开发潜力。

本发明所提出的4分支肽(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₃的优点在于：

1．4拷贝分子在进入机体后在酶的作用下将会降解产生更小的寡肽片段，使其成为单拷贝分子发挥作用。

2．从合成工艺的角度出发在固相树脂上制备4拷贝分支肽在分支肽分子的启始羧基端（C端）接上1个氨基酸或含有几个氨基酸的单链寡肽，即本发明给出的分子通式(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₃所代表的分支肽，其中的X₃氨基酸序列的存在如“臂”的作用增加分支肽与固相树脂间的距离，降低固相树脂上紧密分布的分支肽分子间的空间位阻，有助于提高合成效率。

3．采用此设计通式制备的合成产物经过试验鉴定发现：4拷贝分支肽的羧基端（C端）在连接上1至4个氨基酸后不仅没有屏蔽或降低了4分支活性肽的生物活性，而且比单纯4拷贝分支肽的活性有所提高。

具体实施方式

本发明给出一个4拷贝分支肽的结构通式(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₃，如:

具体给出一个4拷贝分支肽的结构为：（TKPR）₄>K₂>K-G，经过试验证明该多肽具有提升免疫力和抗肿瘤的作用,其结构如：

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合实施例对依据本发明提出的4拷贝分支肽(TKPR)₄>K₂>K-G的设计方式、具体应用、实施方式、特征及其功效做以下说明。

1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的羧基端氨基酸的羧基端（C端）固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端（N端）与待连接的氨基酸的羧基端进行加成缩合反应达到延长肽链的固相合成法。多肽合成的顺序是从多肽的羧基端（C端）开始逐个氨基酸缩合连接向肽段的氨基端（N端）方向不断延伸。当进行氨基酸的羧基接合反应时要将其氨基和侧链基团保护起来避免发生反应，目前常用的有叔丁氧羰基（Boc）保护法和芴甲氧羰基（Fmoc）保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基的脱保护基并同过量的下一个有待连接的氨基酸的活化羧基发生缩合反应延长肽链。通过这样的步骤反复地多次地进行下去，即达到缩合—> 洗涤—> 去保护—> 中和和洗涤—>下一轮缩合（再接上一个氨基酸），直至达到所需要合成的肽链长度。

多肽合成反应完成后采用TFA法或HF法将多肽从固相树脂上裂解下来，经过高效液相色谱（HPLC）C18反相色谱层析分离柱分离纯化后最终得到合成产物。基于以上的原理，多肽合成可以是手工操作合成，也可以采用多肽合成仪通过输入合成序列和程序自动化合成取得。如今固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术。

这里需要说明的是4拷贝TKPR分支肽片段的合成方式是通过在赖氨酸上的2个游离活化氨基上同时进行氨基酸的缩合反应，并在以后的氨基酸加成缩合反应中同时得到延伸达到同时合成多拷贝分支肽的目的。在合成直链多肽的过程中使用的是只有一个活化氨基的赖氨酸，其另一个氨基被保护起来所以不能发生缩合反应。当我们需要合成多拷贝肽段时，选用两个游离氨基未被保护均可被活化进行缩合反应的赖氨酸（用>K-表示）通过加成缩合连接上2个氨基酸。如果被连接上的是2个赖氨酸(>K-)，又可以继续往下连接4个氨基酸，依次往下继续进行氨基酸加成缩合反应就可以得到多拷贝分支多肽分子。

多肽分子是一类具有生物活性的分子，它们的氨基酸序列和结构决定了它们的生物学作用。多肽合成目前成为常用技术并已有商业化的服务公司可根据客户的需求提供合成产物。关于多肽合成及纯化的具体细节和原理在此不再累叙，请参见 “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach ”；W. C. Chan (Editor), Peter D. White (Editor)；Publisher: Oxford University Press，New York，USA；1 Edition (March 2, 2000) 。本发明合成制备分支肽的方式可参照以上固相合成方式但并不局限于此方式。

实施例一

Tuftsin是脾脏产生的一个具有免疫增强活性，具有显著抗肿瘤活性的4肽Thr-Lys-Pro-Arg (TKPR)活性寡肽，为达到制备出高效免疫增强活性和抗肿瘤活性的多肽产物设计和制备出一种含有TKPR片段的4拷贝分支肽（TKPR）₄>K₂>K-G 。

按照本发明所述，采用ABI433A型多肽固相合成仪，合成原料为Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Pro，Fmoc-Avg(Pbf)，Fmoc-Lys(Fmoc),Fmoc-Gly，选用的固相树脂为王树脂（100-200目）。多肽的合成从羧基端（C端）开始向氨基端（N端）逐个氨基酸缩合连接延伸。在2分支出和4分支处的Lys采用Fmoc-Lys(Fmoc)，其余直链部位的Lys采用Fmoc-Lys(Boc)。当肽链合成完毕并脱去末端的Fmoc保护后，用TFA/水将肽链从树脂上裂解下来，通过减压蒸除TFA后用HPLC反相C18柱，流动相为水/TFA/乙晴做梯度洗脱、分离纯化，所得多肽产物经冷冻干燥后呈白色絮状固体。

本实施例通过人工固相合成的方式得到多肽TKPR（分子量500.6道尔顿）和4拷贝分支肽(TKPR)₄>K₂>K-G（分子量2389.97），合成肽产物经高效液相色谱(HPLC)C18柱以流动相水/TFA/乙晴系统分离纯化可得到纯度>98.0%的合成产物。

检测本发明分支肽的抑瘤作用

1．试验目的：

评价分支肽（TKPR）₄>K₂>K-G对H22肝癌昆明小鼠移植瘤生长的影响。

实验动物：昆明小鼠，SPF级，4-6周龄，15-20g，雌性，每组10只。

2．实验方法及药物处理：

无菌条件下，取2只H22荷瘤小鼠的腹水大约6ml，用无菌生理盐水以1：5的比例稀释，瘤细胞浓度约为1.76×10⁷ 个/ml，给予小鼠右前肢腋部皮下接种0.2ml。接种细胞数约为3.52×10⁶个/只。小鼠接种肿瘤细胞后，称量小鼠体重，按体重分级，随机分组，接种肿瘤24h后给药。

试验组设置：

空白对照组：生理盐水200ul/次，

阳性对照组： TKPR  2mg/kg，

试验组：（TKPR）₄>K₂>K-G  2mg/kg，

各组动物隔日腹腔注射给药，分别于接种肿瘤后的第1天、第5天、第7天、第9天、第11天给药。每隔一天称小鼠体重、用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积。给药12天后结束给药，颈部脱臼处死动物，剥离取出瘤块和脾脏称重，依据瘤块重量和测量体积评价药物疗效。

3  结果：

试验组的结果表示，（TKPR）₄>K₂>K-G对昆明小鼠肝癌H22移植瘤生长产生明显的影响,按照瘤重得出的抑制率为48.4%,按照肿瘤体积得出的抑制率为55.9%,显示对肿瘤有明显的抑制作用，具有统计学意义(P<0.001)。

试验期间试验组动物未出现死亡,未见急性毒性反应,各组动物活动正常。试验组动物体重增长与空白对照组一致；各组动物的脾脏重量无明显差异，提示受试药物（TKPR）₄>K₂>K-G无明显毒副作用。各组数据，详见表1、表2和表3。

实施例二

根据本发明提出的4拷贝分支肽设计通式(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₄，采用ABI433A型多肽固相合成仪，合成原料为Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Pro，Fmoc-Avg(Pbf)，Fmoc-Lys(Fmoc),Fmoc-Gly，选用的固相树脂为王树脂（100-200目）。多肽的合成从羧基端（C端）开始向氨基端（N端）逐个氨基酸缩合连接延伸。在2分支出和4分支处的Lys采用Fmoc-Lys(Fmoc)，其余直链部位的Lys采用Fmoc-Lys(Boc)。当肽链合成完毕并脱去末端的Fmoc保护后，用TFA/水将肽链从树脂上裂解下来，通过减压蒸除TFA后用HPLC反相C18柱，流动相为水/TFA/乙晴做梯度洗脱、分离纯化，经冷冻干燥后呈白色絮状固体。结构如：

本实施例通过人工固相合成的方式得到多肽TKPR（分子量500.6道尔顿）、(TKPR) ₄>K₂>K（分子量2332.92道尔顿）、(TKPR)₄>K₂>K-G（分子量2389.97道尔顿）和4拷贝分支肽(TKPR)₄>K₂>K-TKPR（分子量2815.51道尔顿），合成肽产物经高效液相色谱(HPLC)C18柱以流动相水/TFA/乙晴系统分离纯化可得到纯度>98.0%的合成产物。

实验方法：

新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）能够与鸡红细胞发生凝集现象，这是一种特异性的抗体中和反应，其原理是根据病毒的血凝素可凝集红细胞，但若先用特异性抗体与病毒作用，再加入红细胞，则不出现红细胞凝集，称为血凝抑制试验（HI），检测所用的抗血清稀释的最高倍数即是抗体的滴度。待测抗体的滴度越高说明免疫的效果越好。HI方法具有以下优点：①敏感性强，可以检测到微量的抗体，结果也较为准确，是较敏感的血清学反应之一；②特异性强，病毒凝集红细胞只能被特异的抗体所抑制；③检测速度快，1次HI试验只需2 h左右，即可判定结果；④HI试验对环境要求不高，操作简单，1次还可检测大量的样品。因此细胞凝集抑制试验（HI）已经成为一种常用于检测禽类动物血清抗体的检测方法，具体细节请参见由郭鑫主编，中国农业大学出版社2007年出版的“动物免疫学实验教程”。

试验目的：

应用鸡新城疫灭活疫苗与不同的合成产物4拷贝分支肽（TKPR）₄>K₂>K-G和（TKPR）₄>K₂>K-TKPR联合使用并与（TKPR）₄>K₂>K做对照，接种SPF雏鸡检测HI抗体，观察合成产物（TKPR）₄>K₂>K-G与（TKPR）₄>K₂>K-TKPR对雏鸡是否具有免疫增强的作用,并与（TKPR）₄>K₂>K的差异。

材料与方法：

选取1月龄左右的SPF鸡分为5组，每组10只。在鸡的胸部肌肉接种鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株）0.3ml。

试验组：

空白组：  每只鸡胸部肌肉注射0.3ml生理盐水。

正常组：  每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml。

试验组1： 每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml，含有合成产物TKPR）₄>K₂>K  1ug。

试验组2： 每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml，含有合成产物（TKPR）₄>K₂>K-G 1ug。

试验组3： 每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml，含有合成产物（TKPR）₄>K₂>K-TKPR 1ug。

饲养方式：各组同时饲养在隔离器内。

采血：    接种后第28天采血，分离血清进行 HI试验。

结果：

检测结果表明疫苗中添加了合成产物（TKPR）₄>K₂>K-G和（TKPR）₄>K₂>K- TKPR试验组的HI抗体滴度比（TKPR）₄>K₂>K组有明显提高，具体结果见下表：

结果评价：

以上试验结果显示合成产物4拷贝分支肽（TKPR）₄>K₂>K-G和（TKPR）₄>K₂>K-TKPR与疫苗联用可显著提高疫苗的抗体平均滴度，与（TKPR）₄>K₂>K相比抗体滴度明显提高，试验动物未见异常和毒副作用,提示合成产物4拷贝分支肽（TKPR）₄>K₂>K-G和（TKPR）₄>K₂>K-TKPR与（TKPR）₄>K₂>K相比具有更加显著的免疫增强作用。

总结：

以上2个实施例证明，按照本发明设计通式制备出的（TKPR）₄>K₂>K-G和（TKPR）₄>K₂>K-TKPR产物，分支肽的羧基端（C端）的-X₃分别被氨基酸G和TKPR取代，X₃所代表的任意氨基酸的数目分别为1和5，说明在本通式4分支肽的羧基端连接氨基酸或短肽（1）不仅没有消除单拷贝寡肽TKPR的作用，可依然保留单拷贝寡肽TKPR原有的生物活性；(2)比单纯4拷贝分支肽（TKPR）₄>K₂>K的生物活性作用显著提高。由此证明按照此通式(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₃设计制备的肽类分子具有免疫增强活性和抗肿瘤活性，它们可单独成为药物原料或通过加入常用的制剂辅料制备成为临床用抑制肿瘤生长的药物或临床用免疫增强剂。

按照本发明设计通式产生的4拷贝分支肽经过如下的化学修饰产生的化学衍生物应用于临床用免疫增强和或抗肿瘤领域：

1．所述的4拷贝分支肽所带有的羟基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物。

2．所述的4拷贝分支肽所带有的巯基可形成但并不限于所形成的硫醚、硫苷或与半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含二硫键的化合物。

3．所述的4拷贝分支肽所带有的氨基可形成但不限于所形成的酰化物，烃化物、与糖类物质所形成的苷类物质等。

4．所述的4拷贝分支肽所带有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺类化合物等。

5．所述的4拷贝分支肽所带有的亚氨基可形成但不限于所形成的苷、酰化物、烃化物等。

6．所述的4拷贝分支肽所带有的酚羟基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙类化合物，以及与有机碱或无机碱所形成的盐类化合物。

7．所述的4拷贝分支肽与有机酸或无机酸所形成的盐类化合物。

8．所述的4拷贝分支肽与金属离子所形成的配合物、络合物或螯合物。

9．所述的4拷贝分支肽所形成的水合物或溶剂物。

本发明所述的4拷贝分支肽，例如（TKPR）₄>K₂>K-G和（TKPR）₄>K₂>K-TPRR，经过以上任意一种或同时含有多种化学修饰所产生的衍生物用于临床抑制肿瘤生长的抗肿瘤药物，或作为临床免疫增强用途。

Claims (16)

1.一种4拷贝分支肽，其特征在于，该多肽的结构通式为：

 (X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄>(K-X₂)₂>K-X₃，其中，

X_A和X_c代表极性不荷电氨基酸；

X_B和X_D代表碱性氨基酸；

通常用做多肽合成的赖氨酸（Lys，K）只有1个游离氨基被活化进行氨基酸加成缩合反应，具有2个游离氨基可被活化并能进行氨基酸加成缩合反应的赖氨酸用>K-表示，

X₁和X₂分别代表由0-5个任意氨基酸组成的氨基酸序列，X₁和X₂之间的氨基酸序列可以相同，也可以互不相同，X₃为1-4个任意氨基酸所组成的序列。

2.根据权利要求1所述的4拷贝分支肽，其特征在于，所述的极性不荷电氨基酸是丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或天门冬酰胺。

3.根据权利要求1所述的4拷贝分支肽，其特征在于，所述的碱性氨基酸是组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

4.根据权利要求1所述的4拷贝分支肽，其特征在于，X_A为苏氨酸（Thr，T），X_B为赖氨酸(Lys，K)，X_C为脯氨酸(Pro，P)，X_D为精氨酸(Arg，R)，X₁和X₂为零，X₃为甘氨酸（Gly，G），所述的4拷贝分支肽结构式为（TKPR）₄>K₂>K-G。

5.根据权利要求1所述的4拷贝分支肽，其特征在于，X_A为苏氨酸，X_B为赖氨酸，X_C为脯氨酸，X_D为精氨酸，X₁和X₂为零，X₃为苏氨酸－赖氨酸－脯氨酸－精氨酸，所述的4拷贝分支肽结构式为（TKPR）₄>K₂>K-TKPR。

6.根据权利要求1-5任一项所述的4拷贝分支肽，其特征在于所述的多肽所带有的羟基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等化合物。

7.根据权利要求1-5任一项所述的4拷贝分支肽，其特征在于所述的多肽所带有的巯基可形成但不限于所形成的硫醚、硫苷或与半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含有二硫键的化合物。

8.根据权利要求1-5任一项所述的4拷贝分支肽，其特征在于所述的多肽所带有的氨基可形成但不限于所形成的酰化物、烃化物，与糖类物质所形成的苷类物质等。

9.根据权利要求1-5任一项所述的4拷贝分支肽，其特征在于所述的多肽所带有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺类化合物等。

10.根据权利要求1-5任一项所述的4拷贝分支肽，其特征在于所述的多肽所带有的亚氨基可形成但不限于所形成的苷、酰化物、烃化物等。

11.根据权利要求1-5任一项所述的4拷贝分支肽，其特征在于所述的多肽所带有的酚羟基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙类化合物，与有机碱或无机碱所形成的盐类化合物。

12.根据权利要求1-5所述的4拷贝分支肽，其特征在于所述的多肽与有机酸或无机酸所形成的盐类化合物。

13.根据权利要求1-5任一项所述的4拷贝分支肽，其特征在于所述的多肽与金属离子所形成的配合物、络合物或螯合物。

14.根据权利要求1-5任一项所述的4拷贝分支肽，其特征在于该多肽所形成的水合物或溶剂物。

15.一种临床用于抑制肿瘤生长的药物，其特征在于该药物包括权利要求1-14任一项所述的4拷贝分支肽及其化学衍生物。

16.一种临床用于免疫增作用的药物，其特征在于该免疫增强药物包括权利要求1-14任一项所述的4拷贝分支肽及其化学衍生物。