CN104672302A

CN104672302A - 一种多肽菌素、其制备方法及其应用

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Publication number: CN104672302A
Application number: CN201410794864.5A
Authority: CN
Inventors: 吕志成; 杨赛; 鲍隆
Original assignee: Shandong Abyssopelagic Organism Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Abyssopelagic Organism Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: CN104672302B

Abstract

本发明涉及一种多肽菌素、其制备方法及其应用。本发明提供的多肽菌素，具有免疫提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促生长的作用。本发明提供的化学合成法简便易行，能够满足畜禽业和市场的需要。同时满足了大规模工业化生产的需要。

Description

一种多肽菌素、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种多肽菌素、其制备方法及其应用。具体而言，本发明提供具有免疫提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促生长的作用的多肽菌素、其制备方法及其在制备抗生素替代品或畜禽业的应用。

背景技术

自Moore等(1946)首次报道，在饲料中添加抗生素能明显提高肉鸡的日增重以来，人们对抗生素的研究和应用越来越广泛，先后有60余种抗生素应用于畜牧业，在动物疾病防治、提高饲料利用率、促进畜禽生长等方面发挥了重要作用。但随着抗生素的大量使用，特别是不科学地滥用，细菌耐药性和药物残留等问题日益突出，引起世界各国政府及业内人士的高度重视。2006年，欧盟全面禁止了抗生素饲料添加剂的应用。我国是畜禽生产大国，由于抗生素在我国养禽业的大量使用，特别是不科学地滥用，导致药物残留超标等问题，出口量仅占生产量的0.9％～1.2％。

养殖业中抗生素滥用的危害主要包括：

1.导致细菌产生抗药性

虽然耐药性因子的传递频率只有10-6，但由于细菌数量大、繁殖快，在这一频率下，仍造成抗药菌株的扩散、蔓延，而且可以使一种细胞产生多种耐药性。抗生素滥用导致耐药菌株增加，而抗生素饲料添加剂长期、大量不合理使用是其中一条主要原因。畜牧业中，大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌等过去并不严重或较少发生的细菌病，现已上升为家禽的主要传染病，这与长期滥用抗生素有直接关系。

2.造成畜禽机体免疫力下降

大量抗生素在其被摄入机体后，会随血液循环分布到淋巴结、肾、肝、脾、胸腺、肺和骨骼等各组织器官，动物机体的免疫能力就被逐渐削弱，人和动物慢性病例增多，一些可以形成终生坚强免疫的疾病频频复发。抗生素还会导致抗原质量降低，直接影响免疫过程，从而对疫苗的接种产生不良影响。

3.引起畜禽内源性感染和二重感染

抗生素虽都有自己的抗菌谱，但基本都难以避免在作用于病原菌同时会影响机体内有益菌群生长，尤其是长期、大量使用，会造成机体内菌群失调，微生态平衡破坏。潜伏在体内的有害菌趁机大量繁殖，而引起内源感染。另外一种情况，抗生素会消灭体内敏感菌，在体内一些微生物附着点上造成大量空位，为外界耐药病菌乘虚而入提供机会，从而造成外源感染。二重感染也是由于施用大量抗生素杀灭某种细菌时，破坏微生态平衡，另外一种或多种内源或外源病菌随即再次感染机体造成的。

4.在畜产品和环境中造成残留

抗生素被吸收到体内后，分布到几乎全身各器官，但大多数抗生素都难以透过机体的几个“天然屏障”，如血脑屏障、血睾屏障等。抗生素在内脏器官尤其是肝脏内分布较多，而在肌肉和脂肪中分布较少。抗生素的代谢途径多种多样，但大多数以肝脏代谢为主，经胆汁、由粪便排出体外；也会通过泌乳和产蛋过程残留在乳和蛋中。一些性质稳定的抗生素被排泄到环境中后仍能稳定存在很长一段时间，从而造成环境中的药物残留。这些残存的药物，通过畜产品和环境慢慢蓄积于人体和其它植物体中，最终以各种途径汇集于人体，导致人体产生大量耐药菌株，失去对某些疾病的抵抗力，或因大量蓄积而对机体产生毒害作用。

因此，在全球经济一体化的时代，要提高我国畜禽产品的国际竞争力，抗生素安全问题及对策研究已成为畜牧工作者的研究方向，寻找无公害的抗生素替代品已成为畜牧工作者迫在眉睫的课题。

发明内容

本发明提供了一种可作为抗生素替代品的多肽(以下称为多肽菌素)，其具有免疫提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促生长的作用。

本发明提供的多肽菌素的氨基酸序列为：Gly-Lys-Ser-Gln-Glu-Tyr-Leu-Gly。

此外，本发明还提供了上述多肽的制备方法，其包括根据Fmoc-固相多肽合成法合成粗品多肽，优选的是，所述方法还包括使用反相高效液相色谱对所述粗品多肽进行纯化。

具体而言，所述Fmoc-固相多肽合成法中，以二氯树脂(2-Chlorotrityl Chloride)为固相载体，HOBt(1-羟基-苯并-三氮唑)/TBTU(苯并三唑四甲基四氟硼酸)/DIEA (N,N'-二异丙基乙胺))为催化剂，二甲基甲酰胺DMF为溶剂和清洗剂，三氟乙酸(TFA)/1,2-乙二硫醇(EDT)/H₂O为切割剂，进行所述粗品多肽的合成。

其中在合成时，所述方法使用分别使用下述氨基酸进行合成：

Gly:Fmoc-Gly-OH；

Lys:Fmoc-Lys(Boc)-OH

Ser:Fmoc-Ser(tBu)-OH

Gln:Fmoc-Gln(Trt)-OH

Glu:Fmoc-Glu(OtBu)-OH

Tyr:Fmoc-Tyr(Tbu)-OH

Leu:Fmoc-Leu-OH

更具体而言，所述Fmoc-固相多肽合成的步骤包括：

a.用二甲基甲酰胺DMF浸泡所述二氯树脂以将其活化；

b.根据Fmoc-固相多肽合成法，以二氯树脂为固相载体，DIEA为催化剂，DMF为溶剂，连接第一个氨基酸到树脂；

c.用哌啶脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性；

d.可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除以及氨基酸的连接是否完全；

e.洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第二个氨基酸；

f.以同样方法连接其他的氨基酸；可选的是连接完每个氨基酸后都进行茚三酮显色检测，并且结果呈阴性时才可进行下步反应；

g.连接完所有氨基酸后洗涤，并用氮气将树脂吹干；

h.用切割试剂将肽从树脂上切割下来；

i.将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心；

j.冻干机中冻干获得粗品。

其中，纯化时所述反相高效液相色谱条件为：

多肽菌素纯化条件为：以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相。流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，色谱柱为C18反相色谱柱，50*250mm，紫外检测波长215nm，流速10ml/min，进样量10ml；

洗脱梯度：

本发明的制备方法获得的粗品多肽的纯度为85％以上，优选87％以上。经过所述反相高效液相色谱纯化后的产品的纯度为98％以上。

上述步骤h中切割试剂的体积比为TFA:EDT:H₂O＝95:2.5:2.5。

本发明的又一目的在于提供上述多肽菌素在制备用于免疫提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促生长的药物中的应用。

本发明的又一目的在于提供多肽菌素在制备用于畜禽养殖的抗生素替代品中的应用。

更具体而言，本发明的多肽菌素具有下述功能。

(1)多肽菌素具有调节畜禽机体免疫力的功能。

1)对T淋巴细胞具有激活作用，能够提高淋巴细胞转化率，从而激发机体的细胞免疫，增强免疫功能。

2)能够提高畜禽免疫后的NDV抗体和H9抗体水平，增强体液免疫。

3)该产品可促进免疫球蛋白的产生，能够增强机体体液免疫功能。

4)对畜禽胸腺、脾脏和法氏囊的生长发育具有促进作用。

(2)多肽菌素对禽类抗NDV病毒、抗大肠杆菌作用显著。

1)全程饲喂本品，可提高机体的抗病能力，预防新城疫病毒和大肠杆菌的感染。

2)本品可显著延缓新城疫及大肠杆菌病的发病时间，降低新城疫及大肠杆菌病的发病率、死亡率。

3)配合应用本品治疗新城疫及大肠杆菌病均疗效显著。

(3)多肽菌素可提高畜禽生产性能。

1)提高畜禽成活率、欧洲指数、单位畜禽利润。

2)降低畜禽死淘率、料重比，显著提高日增重。

3)节省畜禽用药费用，降低生产成本。

4)提高禽类孵化率，降低损失，提高效益。

(4)多肽菌素可避免抗生素残留，提高禽类的食品安全性。

本发明的多肽菌素全程添加，可替代抗生素，保证了畜禽胴体的品质，避免了抗生素的残留。

此外，本发明提供的化学合成法独具优势。该工艺简便易行，能够满足畜禽业和市场的需要。同时满足了大规模工业化生产的需要。

附图说明

图1：自制多肽合成反应器

图2：小试粗品液相图

图3：王氏树脂与Fmoc-氨基酸的连接

图4：二氯树脂与Fmoc-氨基酸的连接

图5：多肽菌素HPLC分析图谱(探索主峰出峰时间)

图6：多肽菌素HPLC分析图谱(提高分离效果)

图7：多肽菌素HPLC分析图谱(优化程序)

图8：多肽菌素HPLC分析图谱(重复程序1)

图9：多肽菌素HPLC分析图谱(重复程序2)

图10：合成工艺流程图

图11：实施例2中预试期平均产奶量统计

图12：实施例2中平均产奶量统计：

图13：实施例2的SCC统计：

图14：实施例3的T淋巴细胞百分率

图15：实施例3的总蛋白(g/L)

图16：实施例3的白蛋白(g/L)

图17：实施例3的各日龄NDV抗体

图18：实施例3的料重比

图19：多肽菌素的合成工艺思路

图20：多肽菌素小样试合成的工艺流程

具体实施方式

以下通过实施例更为详细地说明本发明，但这并不意味着本发明的保护范围受这些实施例限制。

实施例1

该实施例为说明多肽菌素的制备方法的实施例。

建立适合于大规模生产的多肽菌素的合成及纯化生产工艺，为多肽菌素产品的研究和应用提供保证。采用Fmoc-固相多肽合成原理，以2-Chlorotrityl Chloride树脂为固相载体，以HOBt/TBTU/DIEA/为催化剂，以DMF为溶剂和清洗剂，以TFA/EDT/H₂O为切割剂，以自行设计研发的合成器为设备，建立适于大规模生产的复合抗菌肽合成生产工艺及设备体系；以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相，以1％三氟乙酸为离子对，用RP-HPLC对产物进行纯化，其纯化产物经冷冻干燥后为白色粉末状，纯度大于98％；用质谱分析其相对分子量，用HPLC分析纯肽产物并与标准品对照其色谱保留值，结果一致。该工艺适用于多肽菌素的大规模生产。

多肽菌素是有八个氨基酸残基的小分子多肽，其序列为：NH₂-Gly-Lys-Ser-Gln-Glu-Tyr-Leu-Gly-OH。用以解决动物由于快速生长、环境应激以及细菌、病毒侵害造成的动物疾病或发育障碍。关于多肽菌素的来源以用合成的方法和基因工程表达多肽的方法获得，由于基因表达技术运用在小分子多肽的生产尚存在很多困难等问题，结合多肽菌素分子结构简单的特点，使其化学合成法生产独具优势。故我们选用了固相化学合成法大规模生产多肽菌素的方法，它可为我们的成品研究提供优质廉价的原料，保证该产品的研究。另外，由于该工艺简便易行，适合大规模生产，能够满足具社会需求，有重要的社会意义和良好的经济效益。

第一部分多肽菌素合成工艺的实验室研究

1.多肽菌素合成工艺整体思路和合成原理依据：

1.1多肽菌素合成工艺整体思路

结合多肽菌素的特点及一般肽合成的原则，我们形成的多肽菌素合成工艺思路如图19所示

1.2多肽菌素合成原理依据：

1963年，Merrifield创建了多肽的固相合成方法。固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性。其基本原理是按照要求序列顺序将氨基酸的C末端固定在不溶性聚合物载体上，然后依次缩合氨基酸，延长肽链的过程。在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。在完成合成后，再将肽链从固相载体上切割下来，进行纯化等后处理即可获得目标产品。今天，固相法得到了很大发展。除了Merrifield所建立的Boc法(叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc固相法(9-芴甲氧羰基)。以这两种方法为基础的各种多肽合成手段也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。

固相多肽合成的高分子载体多采用聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂，它能起到支撑和载带多肽的作用。如下：

但它并不能直接连上(第一个)氨基酸，必须要在苯环上导入反应基团(接头)。由于苯环对位上碳原子相对活跃，可进行多种反应，从而可连接上各类活性集团(Linker)，在固相多肽合成上可以与第一个氨基酸的羧基相连接使其锚定在载体上面，启动肽链在载体上面的延伸。使用不同的Linker，可以用来合成肽氨、肽酸、肽醇、肽酯等不同多肽。多肽菌素为羧酸型多肽，常采用王氏树脂(wang resin)和二氯树脂(2-chlorotrityl choloride resin)进行合成。

王氏树脂和二氯树脂Linker上的活性位点受右边相关基团的影响，和第一个氨基酸的羧基形成的结构对酸不稳定，都可以用三氟乙酸将其重新打断，所以在合成完成时用三氟乙酸将肽链从树脂上切割下来，达到肽链和树脂的分离。

在多肽合成时，首先将氨基酸的α-氨基用适当的基团进行保护，以封闭其活性，使羧基处于游离状态，第一个氨基酸的羧基与树脂的Linker连接，以锚定肽链，脱去α-氨基的保护基团，使氨基酸重新游离出来，以后形成肽键的反应只能在前一个氨基酸的氨基和后一个氨基酸的羧基之间进行。每次偶联—脱保护可使肽链延伸一个氨基酸，不断重复偶联—脱保护过程，即可完成一个多肽的合成。三功能团氨基酸的侧链也要进行保护，以免副反应的发生。

固相多肽合成中的氨基酸保护策略分Boc-和Fmoc-两种。

Boc合成法是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用HF(氢氟酸)可脱除的苄醇类。合成时将一个Boc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终采用HF或TFMSA(三氟甲磺酸)将多肽从树脂上切割下来。

Fmoc合成法采用了碱可脱除的Fmoc为α-氨基的保护基，侧链的保护采用TFA可脱除的叔丁氧基等，合成时将一个Fmoc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用哌啶脱除Fmoc，然后通过HOBt/TBTU/DIEA/催化、偶联下一个氨基酸，最终采用TFA将多肽从树脂上切割下来，避免了强酸处理所起侧链的一些副反应，故近年来各种多肽的合成大多数采用Fmoc-法。

多肽菌素的固相合成我们采用Fmoc策略，所选氨基酸的α-氨基均采用对弱酸敏感的Fmoc-基团保护，用弱碱性物质—哌啶脱保护，侧链活性基团用对弱酸敏感的(Trt、tBu、Boc、OtBu、Pbf)基团保护，其特点是再合成过程中，肽链只经受弱碱处理，而侧链保护基团一直处于稳定状态，在合成结束时用TFA一次将侧链保护基团和第一个氨基酸与树脂之间的连接键打断。

2.Fmoc-法固相多肽菌素合成工艺研究

2.1试验材料

试剂名称	生产厂家	试剂级别
			二氯树脂	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
异丙醇	天津市福晨化学试剂厂	分析纯
			二氯甲烷	天津市福晨化学试剂厂	分析纯
甲醇	西安富力化学厂	分析纯

[0107]

茚三酮	上海山浦化工有限公司	分析纯
			乙醚	西安化学试剂厂	分析纯
三氟乙酸	上海诚心化工有限公司	化学纯
			乙基二硫醇	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
哌啶	上海诚心化工有限公司	分析纯
			乙腈	Fisher	色谱纯
DMF	天津市福晨化学试剂厂	分析纯
			DIEA	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
Fmoc-AA	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
			TBTU	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
HOBT	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯

2.2试验仪器

仪器名称	型号	生产厂家
			多肽合成反应器		自制(见下图)
超纯水净水器	SA67120	美国Millipore公司
			磁力搅拌器	78HW-1	杭州仪表电机有点公司
台式低速自动平衡离心机	TDZ5-WS	湖南湘仪实验仪器开发有限公司
			液相色谱纯化系统	Delta600	美国Waters公司
电子天平	TP-220	湘仪天平仪器设备有限公司
			冻干机	CJ300B	浦东冷冻干燥设备厂
一次性使用吸管(3ml)		江苏康健医疗用品有限公司
			循环水式多用真空泵	SHB-Ⅲ	郑州长城科工贸有限公司

并且使用图1所示的自制多肽合成反应器。

2.3工艺研究：

2.3.1多肽菌素小样试合成

采用Fmoc-固相合成策略，根据以往经验，采用二氯树脂为载体合成多肽菌素。

拟合成的工艺流程如图20所示。

实验操作如下：

1.DCM浸泡树脂2h以活化树脂。

2.依据Fmoc-固相多肽合成原理，以二氯树脂为固相载体，DIEA为催化剂，DCM为溶剂，在固相多肽合成器中连接第一个氨基酸到树脂。

3.洗涤后加入20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。

4.从反应器中取少量树脂于干燥洁净的试管中，加入5％茚三酮的无水乙醇溶液(W/V)，在沸水浴中加热5分钟，颜色反应呈阳性

5.洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，在固相多肽合成器中连接第二个氨基酸。

6.同样方法连接其他的氨基酸。连接完每个氨基酸后都需用5％茚三酮的无水乙醇溶液进行检测，结果呈阴性时才可进行下步反应。

7.连接完所有氨基酸后洗涤并用氮气将树脂吹干。

8.用切割试剂将肽从树脂上切割下来，切割试剂配比如下(TFA 10ml,苯酚(phenol)0.75g,EDT 0.25ml，甲基苯基硫醚(Thioanisole)0.25ml，H₂O 0.5ml.)

9.将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心。

10.在冻干机中冻干获得粗品。

按以上的工艺流程合成步骤，小样(1克)合成，经HPLC分析，其结果见图2。

小试结果表明：粗肽主峰明显，粗品的纯度为54％，主峰保留时间与理论保留时间基本一致。故所设计的工艺流程基本可行。以下将对所选工艺进行优化组合，以提高粗品纯度。

2.3.2合成载体(树脂)的选择

采用Fmoc策略进行多肽固相合成时，载体树脂的不同决定了合成时氨基酸的选择和每一步的合成工艺、试剂的选择等等。载体树脂的选择应在满足合成策略和合成工艺要求的基础上，采用与合成体系相容性好(如对合成体系溶胀性好)，反应性好，效率高，成本低的载体树脂。

多肽菌素是一种直链羧酸型多肽，与树脂连接的第一个氨基酸为Gly(甘氨酸),因而我们可选用王氏树脂或二氯树脂进行固相合成，他们与Fmoc-氨基酸的连接分别示于图3和图4。

我们分别选用1g 1.0mmol/g的Wang Resin和1g 1.0mmol/g的2-Cl Resin采用Fmoc策略进行多肽菌素的固相合成。

表1 Wang树脂和二氯树脂的比较

结果表明，选用两种不同树脂合成所得到的多肽菌素粗品差别较小，均适用于后期纯化处理。但从表1也可看出，由于Wang树脂第一步的连接是脂化反应，为使第一步连接完全，就需要加入过量氨基酸来达到目的，加大了生产成本，不利于以后的工业化生产。因而对于多肽菌素我们在采用Fmoc策略合成的基础上选择二氯树脂作为合成载体树脂。

2.3.3氨基酸的选择

氨基酸的选择是基于合成策略、树脂载体、合成工艺的，合成工艺和氨基酸的选择对产品的纯度、质量以及合成效率都有关键性的影响。基于Fmoc策略及二氯树脂为载体的多肽菌素合成，同时出于降低成本考虑我们选用以下Fomc-氨基酸进行多肽菌素的合成。

Gly:Fmoc-Gly-OH

Lys:Fmoc-Lys(Boc)-OH

Ser:Fmoc-Ser(tBu)-OH

Gln:Fmoc-Gln(Trt)-OH

Glu:Fmoc-Glu(OtBu)-OH

Tyr:Fmoc-Tyr(Tbu)-OH

Leu:Fmoc-Leu-OH

2.3.4切割试剂的选择

根据肽序列及选用氨基酸原材料的不同，设计配制合理的切割试剂及工艺，减少切割试剂的损耗，提高收率，减小纯化负担。如传统的切割试剂中的保护基吸收剂对于有些序列无意义或效果重复，这样就可根据具体序列详加分析，选用适合切割工艺。

Fmoc-策略重传统的切割试剂多采用TFA、Thioanisole、EDT、phenol、H₂O进行配制，其中TFA为切割剂，可打断第一个氨基酸的羧基与树脂之间的连接键，以及各个氨基酸侧链保护基团与相应侧链之间的连接键。其他四种为清除剂，用于淬灭已经切割下来的各种保护集团的反应活性，以防止其重新与侧脸反应。因而设计切割液配方如下：TFA:EDT:H₂O＝95:2.5:2.5

2.3.5纯化工艺研究

采用Waters 600HPLC，以水和乙腈为二元梯度洗脱流动相，研究纯化工艺。

a.探索主峰出峰时间

色谱条件：C18反相色谱柱，4.6*250mm，紫外检测波长215nm，流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流速1ml/min，洗脱时间30min。B相5％-90％30min。其HPLC分析图谱可见图5。

b.提高分离效果

以第一次主峰出峰时间B相浓度为基点，前降20％，后加20％得程序B.相10％-50％。其HPLC分析图谱可见图6。

c.优化程序

提高A相起始浓度，可使主峰前的杂肽较易与主峰分离，降低A相终浓度可使主峰后的杂峰出峰拖后，提高分离度。B相5％-45％。其HPLC分析图谱可见图7。

d.重复程序

重复前面优化所得程序，B相5％-45％。其HPLC分析图谱可见图8和图9。

从图8和图9可知：主峰与其前后的杂峰明显分离。可初步选择此条件为纯化条件。即多肽菌素中试纯化色谱条件为：

C18反相色谱柱，20*250mm，紫外检测波长215nm，流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动B相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流速10ml/min，

第二部分多肽菌素合成中试工艺

一、技术路线及工艺流程图

1.技术路线

活化二氯树脂→连接第一个氨基酸→洗涤→→脱保护→洗涤→检测→连接第二个氨基酸→洗涤→检测→脱保护→洗涤→检测…重复连接氨基酸、脱保护…连接到第8个氨基酸→吹干树脂→切割→纯化→冻干→分析

2.合成工艺流程图，可参见图10。

3.纯化工艺如下：

冻干粗品分析→冻干粗品溶解过滤→平衡色谱柱→进样→洗脱→收集样品→分析→纯品冻干→纯品分析

二、制备工艺流程

1、连接Fmoc-Gly-OH到二氯树脂上

反应式如下：

本步反应原理：

2、脱去Fmoc-Gly-OH上的Fmoc-基团，使氨基游离出来。反应式如下：

用20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。

抽去反应混合物，并清洗树脂，为下一步反应做好准备。

从反应器中取少量树脂于干燥洁净的试管中，加入5％茚三酮的无水乙醇溶液(W/V)，在沸水浴中加热5分钟，颜色反应呈阳性。

茚三酮可与脱除Fmoc-基团氨基酸的裸露氨基发生颜色反应，用于鉴别Fmoc-基团是否脱除以及氨基酸的连接是否完全。其原理如下：

首先，氨基酸被转化成α-酮酸和氨，α-酮酸不稳定，脱羧成相应的醛和二氧化碳

然后，茚三酮水合物、还原型茚三酮和氨形成紫红色化合物：

3、连接Fmoc-Leu-OH到H₂N-Gly-OH上

在上述Fmoc--Gly-OH树脂中，加入用DMF溶解的Fmoc-Leu-OH、TBTU、HOBT、DIEA的混合物，充分反应2小时，用真空泵抽干。之后用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阴性。加入脱保护试剂哌啶、DMF溶液脱去Fmoc-基团。再次用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阳性。这样第二个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。此时获得Fmoc-Gly-Leu-树脂。

4、连接Fmoc-Tyr-OH到Fmoc-Gly-Leu上

在上述Fmoc--Gly-Leu-OH树脂中，加入用DMF溶解的Fmoc-Tyr-OH、TBTU、HOBT、DIEA的混合物，充分反应2小时，用真空泵抽干。之后用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阴性。加入脱保护试剂哌啶、DMF溶液脱去Fmoc-基团。再次用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阳性。这样第二个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。此时获得Fmoc-Gly-Leu-Tyr-树脂。

5、重复上述步骤，直至连接完最后一个氨基酸Fmoc-Gly-OH,此时获得NH₂-Gly-Lys-Ser-Gln-Glu-Tyr-Leu-Gly-OH完整序列。

6、肽链的切割及侧链脱保护

切割试剂配方：TFA:EDT:H₂O＝95:2.5:2.5。每1克树脂使用的切割试剂的量在10～15ml之间。

将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌2小时，用200目砂芯过滤器除去树脂，滤液直接抽入冷冻乙醚中，3000r/min离心使粗肽沉淀，弃去上清液，再向离心管中加入乙醚摇匀使沉淀物悬浮、离心，重复三次，洗去切割液残留物，加入蒸馏水溶解沉淀物，弃去上层乙醚层，于冻干机中冷冻干燥24小时，得生物复合抗菌粗肽粉末。

三、多肽菌素粗品的纯化

取冻干的多肽菌素粗品4.0g溶于20ml去离子水中，充分溶解后过滤，取滤液备用。

多肽菌素纯化条件为：以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相。流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，色谱柱为C18反相色谱柱，50*250mm，紫外检测波长215nm，流速10ml/min，进样量10ml。

洗脱梯度：

经研究，纯化产物经冷冻干燥后为白色粉末状，纯度大于98％。

以下实施例对多肽菌素的各种生理活性进行测试。

实施例2

该实施例测试了实施例1获得的多肽菌素对荷斯坦奶牛的作用。

一、试验方法：

于2013年9月30日——2013年11月10日，共计40天，其中前10天为预试期，后30天为正式试验期。

1.试验分组说明：

选取胎次(1-2胎)、泌乳天数(80-120天)、产奶量基本接近的健康泌乳牛40头，随机分成两组，确定出试验组和对照组。

分组	组别	数量(头)
			A组	试验组	20
B组	对照组	20

2.预试期结束后，对期间的产奶量等指标数据进行分析，若实验组和对照组无显著差以后，进入正式实验期。

3.实验组饲喂方法

(1)常规使用：多肽菌素按精饲料5‰比例(每头牛每天50克)添加，混合均匀，供试验组奶牛饲用。

(2)阶段净化：试验组在实验开始的前三天，采用多肽菌素进行净化修复，实验中期再强化一次，共计6天。具体可每天中潮在喂精料时添加50克肽。

4.数据采集

试验期间，周期性采集实验牛的产奶量和体细胞数据，其中：预试期结束后，集中采样一次，以后产奶量每五天一次，体细胞每十天一次。

二、试验记录：

1.2013年10月1日至9日为试验预试期，在此期间对试验组对照组分别进行了3次(10月1日、10月5日、10月9日)产奶量测试，测试结果表明试验组平均产奶量为29.9kg，对照组平均产奶量为29.7kg；

2.自2013年10月10日至2013年11月10日为试验期，试验组、对照组奶牛数量分别为20头；

3.在10月21日测试产奶量时发现试验组、对照组各出现1头奶牛患乳房炎，数据统计中将该数据剔除。

4.在10月31日测试产奶量时发现对照组出现1头奶牛患乳房炎，数据统计中将该数据剔除。

5.在10月11日测试产奶量时发现试验组、对照组各出现1头奶牛患乳房炎，数据统计中将该数据剔除。

6.至试验结束时，试验组奶牛数量为18头，对照组奶牛数量为17头；

三、试验结果：

1.预试期平均产奶量统计可见图11。

2.试验期平均产奶量统计看见图12。

3.SCC统计可见图13。

四、试验结果分析：

1.在产奶量方面，试验组比对照组平均每天增加2.53kg,如按每千克牛奶3元计算，则每天每头牛直接增加经济效益2.53*6＝7.6元；

2.在30天试验期内，试验组对乳房炎发病的保护力明显好于对照组，对照组出现2头乳房炎，试验组出现1头乳房炎；

3.在降低体细胞(SCC)方面，试验组比对照组降低为18.4万个/毫升，下降幅度达27％，效果明显。

五、试验小结：

通过本次试验，进一步验证了“多肽菌素”产品对奶牛健康和生产性能方面具有明显的促进改善作用，“多肽菌素”能够调节奶牛免疫系统，修复机体组织损伤，消除不良应激反应，提高奶牛生产性能。

·诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，并通过淋巴细胞再循环而活化奶牛全身免疫系统，从而增强机体的特异性免疫和非特异性免疫，提高奶牛机体对各种病原体感染的抵抗能力，减少乳房炎发生率，降低体细胞；

·能够快速修复机体受损细胞，改善细胞代谢，有效保护和修复因细菌、病毒和物理损伤等对奶牛机体造成的伤害，改善体况，呵护泌乳器官，提高产奶性能；

·具有较强的机体组组抗氧化性，能有效的清除自由基及其衍生物对机体的毒性作用，提高奶牛的抗应激能力，降低各种应激反应(如：温度、通风、噪声、疾病等)对奶牛的损伤，利于稳产高产。

实施例3

该实施例测试了实施例1获得的多肽菌素对SPF鸡免疫功能及生长性能的影响。

(一)试验材料

1试验药品及试剂

1.1产品样品：实施例1获得的多肽菌素，纯度大于98％。

1.2玫瑰花环试验用试剂

抗凝剂(3.8％的柠檬酸钠液或200U/mL的肝素生理盐水溶液)、Hank's液(无Ca2+、Mg2+，PH7.2-7.4)、淋巴细胞分离液、1％绵羊红细胞(SRBC)悬液、灭活小牛血清、固定剂(0.8％戊二醛)、瑞氏染液、吉姆萨染液，均为实验室配制。

1.3试验用试剂盒

血清总蛋白(TP)检测试剂盒，购自南京建成生物技术研究所，批号20110509，白蛋白(ALB)检测试剂盒，购自南京建成生物技术研究所，批号20110503。

1.4血凝与血凝抑制试验用试剂

1％鸡红细胞悬液，新城疫抗原(本实验室保存)，新城疫阳性血清，被检鸡血清。

2试验动物

2.1试验动物

60只SPF鸡：1日龄，购自山东省农业科学院实验动物中心。

3试验仪器设备

SPF鸡饲养隔离器及配套设施、超净工作台、显微镜、高速冷冻离心机、台式离心机、ZDX-35B1型座式自动电热压力蒸汽灭菌器、温箱、冰箱、水浴箱、微量移液器、微型振荡器、分析天平、96孔微量反应板等。

(二)试验方法

1动物分组

试验选取SPF鸡60只，随机分2组。具体分组和处理方式见下表2：

表2SPF鸡试验分组与处理

注：试验记录，每天做好耗料、用药、温度等记录，试验鸡在40日龄结束时空腹称重，计算料重比。

2肉鸡的免疫

对照组2、试验组2进行如下免疫：

14日龄：新城疫Ⅳ系弱毒苗1倍量滴口或1.5倍量饮水。

28日龄：新城疫Ⅳ系弱毒苗1倍量饮水。

3测定指标与测定方法

3.1T淋巴细胞总数及百分率检测

3.1.1绵羊红细胞悬液的制备

新鲜采集的或保存于Alsever液中的SRBC，用生理盐水洗3次，末次(1500～ 2000r/min 30min)洗涤后，用生理盐水配成1％的红细胞悬液。

3.1.2淋巴细胞悬液的制备

对照组1、试验组1在7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、34日龄、40日龄时，每组随机抽取4只鸡，静脉或心脏采血(5-10mL)，每mL加20U肝素(200U/mL肝素生理盐水溶液)抗凝，摇动混匀后静置1h。另取离心管或小试管，加淋巴细胞分离液1.5-2mL，吸取富含白细胞的血浆约1mL，沿管壁徐徐重叠于分离液上，以2000r/min离心20min，离心完毕后，吸取血浆与分离液之间乳白色细胞层，即为淋巴细胞，粒细胞及红细胞沉于管底。将淋巴细胞移入加有3-5mL Hank's液的小试管中，以1500r/min，弃去上清液，轻轻使细胞悬浮，再用Hank's液离心洗涤，重复3次，最后弃去上清液。用含10％的小牛血清的HBnk's液稀释淋巴细胞，使淋巴细胞数为5×106个/mL，即制成淋巴细胞悬液。

3.1.3染液的配制

吉姆萨染液：吉姆萨氏粉0.5g，纯甘油33mL，先将吉姆萨氏粉溶于甘油中，并置60℃温箱中，最有加甲醇即可。使用时，分别将这两种染液用PH6.4PBS稀释1倍。

3.1.4E玫瑰花环形成试验(Et试验)

将淋巴细胞悬液0.1mL和绵羊红细胞0.1mL混匀(细胞数合适比例为1:100)，37℃水浴10min，以500r/min离心5min，再置4℃2h或过夜。取出后弃去大部分上清，将沉淀轻轻摇起，加0.8％戊二醛2滴固定数分钟后，涂片。自然干燥后加1滴吉姆萨染液，覆以盖玻片，高倍镜下观察。凡淋巴细胞周围吸附3个或以上绵羊红细胞者为阳性花环。

3.1.5结果判定

凡一个淋巴细胞结合3个或3个以上的红细胞者为1个E玫瑰环。随机计数200个淋巴细胞，记录其中形成色花环和未形成花环的淋巴细胞数(ERFC)，然后根据下列公式计算

E花环形成百分率(即T淋巴细胞的百分率)：E花环形成百分率(ERFC％)＝(形成花环细胞数/计数的淋巴细胞总数)×100％

3.2血清蛋白含量检测

对照组1、试验组1在7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、34日龄、40日龄时，每组随机抽取4只鸡，每只鸡采集抗凝血1-2ml，并立即放入恒温水浴箱内 37℃水浴1-2h，然后离心10min(3000r/min)，取上清液装至处理好的离心管中，于-20℃冰柜中保存待检。血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)依据试剂盒方法测定。

3.3新城疫抗体检测

对照组1、试验组1在7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、34日龄、40日龄时，每组随机抽取4只鸡，每只鸡采集抗凝血1-2ml，注入洁净干燥试管内，在室温中静置或离心，待血清析出后，吸出血清保存于-4℃备用。吸取血清时应注意不要混杂红血球。溶血的和显著污染的血清不能使用。新城疫抗体检测依据血凝抑制实验方法测定，实验方法参见，姚火春.兽医微生物学实验指导(第二版)[M].中国农业出版社，2006，1(2)：105-108.

(三)结果与分析

试验数据采用Excel进行初步处理后，采用SPSS统计软件中t检验模块对试验数据进行显著性分析，结果以“平均值±标准差”表示，得出了T淋巴细胞百分率、免疫器官指数、血液蛋白含量、抗体水平、料重比的科学数据。各表中同一列数字右上角字母不同者表示差异显著(P＜0.05)，大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。具体结果及分析如下：

1.T淋巴细胞百分率

花环形成百分率结果见表3。

表3各日龄E花环形成百分率(ERFC％)

组别

7日龄

14日龄

21日龄

28日龄

34日龄

40日龄

试验组1

42.666±1.527

41.400±1.816

44.600±3.847^a

37.800±1.789

36.600±0.894

39.800±1.899

对照组1

36.333±2.886^a

39.000±1.581

39.800±1.304

37.200±1.304

33.000±4.899

-

T淋巴细胞百分率见图14

结果：表3可以看出，7、21日龄，试验组1与对照组1的T淋巴细胞百分率差异显著(P＜0.05)。从图14可以看出，各日龄试验组1的T淋巴细胞百分率均高于对照组1。分别是7日龄提高了17.43％，14日龄提高了6.15％，21日龄提高了12.06％，28日龄提高了1.61％，34日龄提高了10.90％。数据结果表明，多肽菌素产品有提高T淋巴细胞百分率的作用。

分析：细胞免疫是T细胞介导的机体的一种重要的免疫反应，可以抵抗细胞内微生物如病毒和宿主细胞内增生的细菌感染。因为抗体不能进入受感染的细胞，细胞内病毒的消灭主要依靠细胞免疫。T淋巴细胞是动物体内最主要的免疫活性细胞，能够敏感的反映机体细胞免疫的水平。试验结果说明了多肽菌素产品对T淋巴细胞具有激活作用，能够激发机体的细胞免疫，增强免疫功能。

3血液蛋白含量

结果见表4。

表4各日龄血清蛋白(g/L)

总蛋白和白蛋白分别示于图15、16中。

结果：表4可以看出，在28、34日龄，白蛋白差异极显著(P＜0.01)，34日龄总蛋白差异极显著(P＜0.01)；其它日龄总蛋白和白蛋白均差异不显著(P＞0.05)；图15可以看出，总体上看，试验组1的总蛋白高于对照组1，分别是：7日龄产品增加血清总蛋白含量5.48％，14日龄产品未增加血清总蛋白含量，21日龄产品增加血清总蛋白含量7.04％，28日龄产品增加血清总蛋白含量13.37％，34日龄产品增加血清总蛋白含量62.58％。图16可以看出，从总体上看，试验组1白蛋白低于对照组1，7日龄和14日龄产品未增加血清白蛋白含量；21日龄产品增加血清白蛋白含量1.56％，28日龄白蛋白显著降低了10.58％，34日龄白蛋白显著升高26.55％。

分析：血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量，作为反映肝脏合成功能检测的常规检测项目，临床应用十分普遍，是许多疾病诊断、治疗及预后的重要判断指标。血清蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成，所以先测定总蛋白和白蛋白的含量，然后用总蛋白减去白蛋白的量就是球蛋白的量。其中球蛋白占很大比重，体内的血清球蛋白是机体免疫器官制造的，球蛋白大部分在肝细胞外生成，与人体的免疫力有关系。球蛋白需要保持一定的量，当球蛋白检测值超过正常值说明体内存在免疫系统的亢进，球蛋白检测值低于正常值说明免疫力不足。试验结果表明，产品具有提高血清总蛋白和球蛋白的作用，能够增强机体体液免疫功能。

4.NDV抗体

结果见表5、6。

表5免疫鸡NDV抗体

组别	21日龄	28日龄	34日龄
				试验组2	2.000±0.000^a	2.400±0.548	1.400±0.548
对照组2	2.800±0.447	2.200±0.447	1.000±0.000

表6未免疫鸡NDV抗体

组别	21日龄	28日龄	34日龄
				试验组1	1.600±0.548	2.200±0.447	2.000±0.707
对照组1	2.000±0.000	1.600±0.548	1.000±0.000

各日龄NDV抗体的示于图17。

结果：在14、28日龄免疫新城疫疫苗，刺激机体抗体的产生。表5和6可以看出，21日龄，免疫NDV疫苗一周后，试验组2的NDV抗体水平显著低于对照组2(P＜0.05)。28、34日龄，免疫组和未免疫组均差异不显著(P＞0.05)。各组NDV抗体均不高，试验组2的NDV抗体水平略高于对照组2。21日龄，试验组2的NDV抗体未增加，28日龄，试验组2比对照组2NDV抗体增加了9.09％，试验组1比对照组1NDV抗体增加了37.5％，34日龄，试验组2比对照组2NDV抗体增加了40％，试验组1比对照组1NDV抗体增加了100％。

分析：抗体是抗病毒体液免疫的主要因素，抗体产生越多，对病毒的中和作用越强，即抗病毒的作用越强。本次试验28、34日龄抗体滴度不高，原因可能是28日龄感染了新城疫野毒，消耗掉了抗体。但试验结果可看出，总体来看试验组抗体滴度高于对照组，且试验组的抗体消耗速度明显慢于对照组，表明产品具有减缓机体NDV抗体损耗的作用，即具有维持NDV抗体滴度稳定性的作用。

5料重比

结果见表7和图18。

表7各日龄料重比

组别

1-7日龄

7-10日龄

10-14日龄

14-21日龄

21-28日龄

28-34日龄

试验组1

1.325±0.289

2.168±0.637

2.254±0.265

2.176±0.567

2.788±0.356

2.587±0.348

对照组1

2.164±0.591

1.840±0.381

2.523±0.321

2.376±0.465

2.458±0.275

2.831±0.441

[0303] 结果：表7可以看出，1-7日龄、7-10日龄、10-14日龄、14-21日龄、21-28日龄、28-34日龄两组的料重比均差异不显著(P＞0.05)。图18可以看出，1-7日龄产品降低料重比38.77％；7-10日龄产品未降低料重比；10-14日龄产品降低料重比10.66％；14-21日龄产品降低料重比8.42％。21-28日龄产品未降低料重比；28-34日龄产品降低料重比8.62％。

分析：所耗标准饲料量与增重之比，称为耗料增重比，简称料重比。反映饲料的质量与饲喂效果。料重比愈低，饲料的质量与饲喂效果愈好。试验结果表明饲喂抗生素的对照组与全程饲喂多肽菌素的试验组的料重比差异不显著，且各阶段试验组料重比低于对照组，表明产品与抗生素相比，具有相当的降低料重比的作用，甚至好于抗生素，即多肽菌素可替代抗生素对机体的增重作用。

(四)结论

1淋巴细胞百分率

T淋巴细胞是动物体内最主要的免疫活性细胞，能够敏感的反映机体细胞免疫的水平。7、21日龄，试验组1与对照组1的T淋巴细胞百分率差异显著(P＜0.05)。各日龄试验组1的T淋巴细胞百分率均高于对照组1。试验结果说明了多肽菌素产品对SPF鸡T淋巴细胞具有激活作用，能够激发机体的细胞免疫，增强免疫功能。

2血清蛋白含量

血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量，作为反映肝脏合成功能检测的常规检测项目，临床应用十分普遍，是许多疾病诊断、治疗及预后的重要判断指标。血清蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成。28、34日龄，试验组1与对照组1白蛋白差异极显著(P＜0.01)，34日龄总蛋白差异极显著(P＜0.01)；其它日龄总蛋白和白蛋白均差异不显著(P＞0.05)；从总体上看，试验组1白蛋白低于对照组1。试验结果表明，产品具有提高血清总蛋白和球蛋白的作用，能够增强SPF鸡体液免疫功能。

3NDV抗体

抗体是抗病毒体液免疫的主要因素，抗体产生越多，对病毒的中和作用越强，即抗病毒的作用越强。本次试验结果可看出，总体来看试验组抗体滴度高于对照组，且试验组的抗体消耗速度明显慢于对照组，表明产品具有减缓机体NDV抗体损耗的作用，即具有维持NDV抗体滴度稳定性的作用。

4料重比

料重比愈低，饲料的质量与饲喂效果愈好。试验结果表明饲喂抗生素的对照组与全程饲喂多肽菌素的试验组的料重比差异不显著，(P＞0.05)且各阶段试验组料重比低于对照组，表明产品与抗生素相比，具有相当的降低料重比的作用，甚至好于抗生素，即多肽菌素可替代抗生素。

5.此外，该实验还对免疫器官指数进行了测试(数据未示出)。机体免疫器官的状况直接影响机体的免疫力，它们的发育状态及机能强弱直接决定着禽类的免疫水平。胸腺、脾脏和法氏囊是禽类最重要的免疫器官，其中胸腺是细胞免疫的中枢器官，脾脏是禽类最大的外周免疫器官，参与全身的细胞免疫和体液免疫，法氏囊是禽类特有的体液免疫器官，免疫器官指数是反映机体免疫水平高低的合理指标。试验结果表明，虽然仅14和34日龄，试验组1与对照组1胸腺指数差异显著(P＜0.05)，其它各日龄以上两组的空腹活重、胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数均差异不显著(P＞0.05)。但从总体上看以上各指标试验组1高于对照组114日龄、21日龄试验组1SPF鸡的脾脏、法氏囊和胸腺指数都高于对照组1，28日龄试验组1SPF鸡的脾脏和胸腺指数都高于对照组1，表明产品具有促进SPF鸡脾脏、法氏囊和胸腺的发育的作用。

Claims

1.一种多肽菌素，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为Gly-Lys-Ser-Gln-Glu-Tyr-Leu-Gly。

2.权利要求1所述的多肽菌素的制备方法，其特征在于，所述方法包括根据Fmoc-固相多肽合成法合成粗品多肽，优选的是，所述方法还包括使用反相高效液相色谱对所述粗品多肽进行纯化。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成法中，以二氯树脂为固相载体，HOBt(1-羟基-苯并-三氮唑)/TBTU(苯并三唑四甲基四氟硼酸)/DIEA(N,N'-二异丙基乙胺))为催化剂，二甲基甲酰胺DMF为溶剂和清洗剂，三氟乙酸(TFA)/1,2-乙二硫醇(EDT)/H2O为切割剂，进行所述粗品多肽的合成。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在合成时，所述方法使用分别使用下述氨基酸进行合成：Gly:Fmoc-Gly-OH

Lys:Fmoc-Lys(Boc)-OH

Ser:Fmoc-Ser(tBu)-OH

Gln:Fmoc-Gln(Trt)-OH

Glu:Fmoc-Glu(OtBu)-OH

Tyr:Fmoc-Tyr(Tbu)-OH

Leu:Fmoc-Leu-OH。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成的步骤包括：

a.用二甲基甲酰胺(DMF)浸泡所述二氯树脂以将其活化；

g.连接完所有氨基酸后洗涤，并用氮气将树脂吹干；

h.用切割试剂将肽从树脂上切割下来；

i.将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心；

j.冻干机中冻干获得粗品。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱条件为：

洗脱梯度：

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述粗品多肽的纯度为85％以上，优选87％以上，并且所述反相高效液相色谱纯化后的产品的纯度为98％以上。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述切割试剂的体积比为TFA：EDT：H₂O＝95:2.5:2.5。

9.权利要求1所述的多肽菌素在制备用于免疫提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促生长的药物中的应用。

10.权利要求1所述的多肽菌素在制备用于畜禽养殖的抗生素替代品中的应用。