CN105198989B - 抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法，所述黄海希瓦氏菌卵黄抗体是用灭活黄海希瓦氏菌为抗原对蛋鸡进行免疫，收集该被免疫的蛋鸡的鸡蛋，从其卵黄中分离得到的水溶性组分，再进行分离纯化后得到，具有特异性好、效价高的特点，用于防治黄海希瓦氏菌引起的疾病和免疫学检测具有良好的效果。本发明的卵黄抗体在制备过程中免疫动物无需采血，不损伤免疫动物，符合现代动物权益保护规则；每个蛋大约含有100mg以上的卵黄抗体，一个月可达3g，相当于免疫兔子后从血液中提取抗体的10‑20倍，安全、绿色、高效、高产和成本低等优点，易于产业化。

Description

抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品制备技术及应用领域，尤其是涉及一种抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体的制备方法。

背景技术

黄海希瓦氏菌(Shewanella marflavi)是Jung-Hoon Yoon于2004年命名的，属于希瓦氏菌属。希瓦氏菌是主要的海洋病原菌之一。据报道黄海希瓦氏菌能感染牡蛎和仿刺参等海洋生物，是危害较高的菌种。

目前对于黄海希瓦氏菌引起的疾病的防治手段最主要的有以下几种：抗生素、中草药、单克隆抗体、灭活疫苗等。抗生素和化学药物易引起应激反应，对生物有不同程度的毒性，且反复使用容易产生耐药性，存在药物残留，在倡导绿色农业的今天必将退出历史舞台；中草药的药效持久，但却很难迅速起效，且各地区中草药药性差别较大，使用不易控制，多用于疾病预防；疫苗接种是防治细菌性疾病最直接有效的方法，国外已经有多种商品化疫苗出售，但我国水产疫苗研制起步较晚，到目前为止仅有草鱼出血病疫苗获得了商品化生产批准，疫苗的研发、生产、销售及广泛使用都需要相当长的一段时间。

卵黄抗体(IgY)是从经抗原免疫的禽类所产卵中分离的具有特异性的蛋白，它具有产率高、稳定性好、特异性强等优点，是一种易于生产、廉价的抗体，免疫1只鸡所收集到的仅1个鸡蛋中含有的IgY的量(约100mg-200mg)远远高于免疫1只兔所收集到的全部血清中的抗体量。IgY具有较强的耐酸、耐碱、耐热能力。高效卵黄抗体可以通过注射、拌饵投喂、浸浴等方式对水产动物起到保护和疾病治疗作用，还可用于免疫学检测等领域。目前，卵黄抗体在畜牧业上已经得到较广泛的关注和应用，但在水产行业的研究开发还处于基础阶段，目前在水产方面申请公开和授权的专利有抗对虾病毒、抗鳗弧菌、抗副溶血弧菌以及抗嗜水气单胞菌的卵黄抗体，但是，目前还没有关于抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法，该卵黄抗体纯度较高，且对黄海希瓦氏菌有较强的抑制作用，同时高免卵黄的获取廉价、方便，便于低成本、大批量生产，其制备方法简便易行，可用于由黄海希瓦氏菌引起的疾病的预防和治疗上及开发黄海希瓦氏菌检测试剂盒和进行免疫学上的免疫反应及诊断。

本发明的第一方面提供一种抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体，该卵黄抗体是用灭活黄海希瓦氏菌为抗原对蛋鸡进行免疫，收集该被免疫的蛋鸡的鸡蛋，对鸡蛋卵黄中分离得到的水溶性组分，再进行分离纯化后得到的。

进一步地，所述的蛋鸡为120日龄的健康产蛋母鸡。

本发明的第二方面，提供一种上述所述的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)抗原的制备：将黄海希瓦氏菌在液体培养基中扩增培养至菌液浓度10⁹CFU/mL，收集菌体，菌体用PBS稀释后用甲醛灭活，得到灭活的黄海希瓦氏菌抗原；

(2)免疫蛋鸡：将步骤(1)得到的灭活的黄海希瓦氏菌抗原与弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂按照等体积混合，乳化，制成弗式完全佐剂疫苗或弗式不完全佐剂疫苗；对蛋鸡进行免疫，共免疫三次，初免时使用完全弗式佐剂疫苗，二免和三免时使用弗式不完全佐剂疫苗；

(3)二免后每隔一周收集鸡蛋一次，将收集的鸡蛋清洗、消毒后，收集卵黄液，卵黄液中加入6倍体积的去离子水稀释，调pH至5.0-5.2，4℃静置过夜后，离心，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，滤液为水溶性组分；

(4)将步骤(3)所得水溶性组分经纯化得到抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体。

在上述技术方案中，步骤(2)所述的对蛋鸡的免疫方法为：初免时弗式完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡1mL，其中左右胸肌各注射0.2～0.4mL，颈部皮下注射0.2～0.6mL；初免2周后进行二免，弗式不完全佐剂疫苗总注射剂量为每只蛋鸡1.5mL，其中左右胸肌和颈部皮下各注射0.5mL；二免2周后进行三免，弗式不完全佐剂疫苗总注射剂量为每只蛋鸡2mL，其中左右胸肌各0.5～0.8mL，颈部皮下注射0.4～1mL。

在上述所有技术方案中，步骤(4)所述的纯化方法为：在步骤(3)得到 的水溶性组分中加入硫酸铵至饱和度为50％，混匀，待完全溶解后置4℃过夜；4℃下离心，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，混匀，置室温过夜；25℃下离心，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，得到抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体粗提液；将卵黄抗体粗提液用100KDa截留量的超滤膜包进行超滤，超滤后得到的卵黄抗体提取液在-80℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa条件下进行冷冻干燥，24h后获得卵黄抗体冻干粉，4℃保存备用。

在上述技术方案中，步骤(3)中得到的水溶性组分先进行卵黄抗体效价测定后，选取抗体效价在1:10000以上的水溶性组分，再经纯化得到抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体。所述卵黄抗体的效价测定方法采用间接酶联免疫吸附法。

在本发明中，采用上述制备方法制备得到的卵黄抗体(IgY)提取液，经BSA法测得IgY浓度达到12mg/ml，经SDS-PAGE测得IgY的纯度达85％以上。

本发明的第三方面，提供上述所述的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体在制备治疗黄海希瓦氏菌引起的疾病的制剂中的应用。所述制剂优选为药物、保健品和饲料添加剂。具体为：将上述的方法制备得到的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体的水溶性组分或经纯化得到的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体纯品按一定比例与辅料配比，制成不同的制剂，包括液态制剂、颗粒制剂、膏剂、片剂或胶囊制剂等，可用于制备预防和治疗抗黄海希瓦氏菌感染的疾病的药物、保健品，以及水产养殖中防治黄海希瓦氏菌引起的疾病的药物或饲料添加剂。所述辅料及比例不予特别限定，可以采用本领域常规添加剂或比例。

本发明的第四方面，提供上述所述的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体在制备以黄海希瓦氏菌为抗原的亲和纯化试剂或以黄海希瓦氏菌为抗原的免疫检测试剂中的应用。其中，所述以黄海希瓦氏菌为抗原的亲和纯化试剂中，抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体可以作为亲和配基，用于相应抗原的亲和纯化；所述以黄海希瓦氏菌为抗原的免疫检测试剂中的应用，具体包括酶联免疫吸附法、免疫沉淀、免疫电镜、免疫印迹、抗体芯片、时间分辨荧光免疫分析和免疫细胞学等一系列免疫诊断技术中的应用，用以检测相应的抗原。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法，该方法制备得到的卵黄抗体纯度较高，且对黄海希瓦氏菌有较强的抑制作用，同时高免卵黄的获取廉价、方便，便于低成本、大批量生产，其制备方法简便易行，最终获得的高产、高效、较高纯度的卵黄抗体 可用于由黄海希瓦氏菌引起的疾病的预防和治疗上及开发黄海希瓦氏菌检测试剂盒和进行免疫学上的免疫反应及诊断。本发明首次提出了抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体及其制备方法，填补了抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体相关研究的空白，并为以后的研究与应用奠定基础。

附图说明

图1为抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体效价随免疫时间的变化结果；

图2为检测抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体纯化效果的SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中，泳道1：蛋白Marker，泳道2：水溶性组分，泳道3：硫酸铵盐析后的IgY，泳道4：硫酸钠盐析后的IgY，泳道5：超滤后获得的IgY，泳道6：IgY冻干粉，泳道7：标准IgY；

图3为抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体体外凝集趋势图，图中显示22h内添加不同浓度特异性IgY与非特异IgY对黄海希瓦氏菌的凝集效果；

图4为透射电镜检测抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体特异性结果，图中显示黄海希瓦氏菌与特异性IgY、非特异性IgY、不添加IgY共培养后与胶体金标记兔抗鸡IgG的孵育效果；

图5为免疫荧光检测抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体特异性结果，图中显示黄海希瓦氏菌与特异性IgY、非特异性IgY、不添加IgY共培养后与FITC标记兔抗鸡IgG的孵育效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、方案、流程和优点更加清楚明晰，结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，值得注意的是，此处具体实施例仅作为解释说明本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学公司购买。

实施例1

一种抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将保藏编号为CGMCC No.7303的黄海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)接种于20ml 2216E液体培养基中，28℃培养12h，复苏菌体。菌体 复苏后，将100μL菌液接种到TSA固体琼脂培养基，28℃倒置培养24h，挑取单菌落接种于2216E液体培养基中，在28℃，140rpm的条件下，摇床震荡培养10h后，调节2216E液体培养基中的黄海希瓦氏菌菌量为3×10⁹CFU/mL。之后8000r/min，4℃条件下离心5min收集菌体。将收集的菌体用PBS重悬，8000r/min离心5min，弃上清，沉淀再用PBS重悬，这一过程重复三次。然后加入体积分数为0.5％的甲醛，37℃灭活24h，经无菌检验合格后，即得到灭活的黄海希瓦氏菌抗原，放4℃冰箱备用；

(2)将步骤(1)中的灭活黄海希瓦氏菌抗原与弗式完全佐剂(初免)或弗式不完全佐剂(二免和三免)等体积混合，并采用双推法进行乳化制备疫苗，疫苗4℃保存。并用PBS与弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂等体积混合乳化制备非特异性疫苗作为对照。

(3)免疫程序：40羽120日龄健康来杭蛋鸡随机分为两组，一组用黄海希瓦氏菌疫苗免疫，另一组用PBS疫苗免疫作为对照组生产非特异性卵黄抗体。对蛋鸡颈部皮下和左右胸肌进行3点免疫，共免疫三次，初免时使用完全弗式佐剂疫苗，剂量为1mL，颈部皮下0.4mL，左右胸肌各0.3mL。初免2周后进行二免，二免使用弗式不完全佐剂疫苗，剂量为1.5mL，颈部皮下，左右胸肌各0.5mL。二免2周后进行三免，三免也使用弗式不完全佐剂疫苗，剂量为2mL，颈部皮下0.6mL，左右胸肌各0.7mL。三免结束后两周对蛋鸡翅膀处静脉血管进行采血，4℃，3000rpm，离心10min收集血清分装-20℃保存。对照组与黄海希瓦氏菌疫苗组免疫日程及剂量相同。二免后每隔一周收集鸡蛋一次。

(4)将步骤(3)中收集的鸡蛋用清水清洗，清洗后用0.5％新洁尔灭溶液浸泡消毒。用卵黄分离器分离出卵黄，刺破卵黄膜收集卵黄液，并加入6倍卵黄体积的去离子水进行稀释，调pH至5.0，4℃静置过夜。静置后4℃，10000rpm离心10min，收集上清，上清用圆筒过滤器0.45μm滤膜过滤，过滤后的溶液即为WSF(水溶性组分，Water Soluble Fraction)，用于卵黄抗体效价测定和大规模分离纯化。

(5)将步骤(4)中得到的水溶性组分进行酶联免疫吸附试验(ELISA)测定特异性卵黄抗体效价，测得结果显示最高效价达到1:95000(图1)。

(6)根据步骤(5)实验结果，选取抗体效价在1:10000以上的鸡蛋，按照步骤(4)制得WSF。在WSF中缓慢加入硫酸铵至饱和度为50％，混匀，待完 全溶解后置4℃过夜。4℃10000r/min离心15min，弃上清，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，混匀，置室温过夜。25℃10000r/min离心15min，弃上清，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，即为抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体粗提液。将卵黄抗体粗提液用100KDa截留量的超滤膜包进行超滤，浓缩的同时进一步纯化。将超滤后得到的卵黄抗体提取液在-80℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa条件下进行冷冻干燥，24h后获得卵黄抗体冻干粉，4℃保存备用。

步骤(5)超滤后得到的卵黄抗体提取液，经BSA法测得蛋白浓度达到12mg/ml，经SDS-PAGE测得最终获得的卵黄抗体冻干粉纯度达85％以上，如图2所示。图2中泳道1：蛋白Marker，泳道2：水溶性组分，泳道3：硫酸铵盐析后的IgY，泳道4：硫酸钠盐析后的IgY，泳道5：超滤后获得的IgY，泳道6：IgY冻干粉，泳道7：标准IgY。图2的结果显示，在还原条件下，目标蛋白被分为两条带，60-70kDa为IgY重链，20-30kDa为IgY轻链，这与相关文献相符。另外，经冷冻干燥并未使IgY断裂，仍是一个完整的大分子。

实施例2

抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体的体外凝集实验

将纯培养的黄海希瓦氏菌稀释至10⁶CFU/mL，分别取20ml分装到5个50mL离心管中，再分别加入20ml 0.22μm微孔滤膜过滤除菌后的0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/mL黄海希瓦氏菌特异性卵黄抗体(溶解于PBS中)和5mg/ml非特异性卵黄抗体(溶解于PBS中)，26℃摇床培养，每隔两小时取100μL涂布TSA琼脂平板，各设1重复，26℃倒置培养24h后拍照计数。

凝集实验结果表明(图3)：加入特异性卵黄抗体的一组能有效凝集黄海希瓦氏菌，佐证了文献报道中卵黄抗体的作用机制，且凝集作用呈剂量依赖关系。

实施例3

透射电镜检测抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体特异性

将抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体冻干粉溶于无菌的PBS(pH7.2)中，浓度为1mg/mL，过0.22μm微孔滤膜除菌加入黄海希瓦氏菌，使菌浓度为10⁸cfu/ml。相同浓度非特异性IgY做对照。将上述混合物于37℃孵育2h，5000rpm离心5min，沉淀经PBS洗2次。将沉淀重悬于400μL胶体金标记兔抗鸡IgG(1:30稀释)的PBS稀释液中，37℃孵育2h，样品离心、洗涤。将获得的重悬溶液10μL 固定于透射电镜样品观察所用的铜网上，自然干燥后透射电镜下观察样本。

透射电镜结果如图4，图4A显示的是黄海希瓦氏菌的形态，图4B显示的是非特异性IgY与黄海希瓦氏菌的结合效果，图中可看出病原菌周围仅存在一颗胶体金颗粒，图4C显示的是特异性IgY与黄海希瓦氏菌的结合效果，图中可看出病原菌周围存在大量胶体金颗粒，表明抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体特异性较强。

实施例4

免疫荧光检测抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体特异性

将抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体冻干粉溶于无菌的PBS(pH7.2)中，浓度为1mg/mL，过0.22μm微孔滤膜除菌加入黄海希瓦氏菌，使菌浓度为10⁸cfu/ml。相同浓度非特异性IgY做对照。将上述混合物于37℃孵育2h，5000rpm离心5min，沉淀经PBS洗2次。将沉淀重悬于400μL FITC标记兔抗鸡IgG(1:160稀释)的PBS稀释液中，37℃孵育2h。样品离心、洗涤，于暗处制片，晾干，荧光显微镜观察并拍照(×600)。

免疫荧光结果如图3，特异性卵黄抗体与黄海希瓦氏菌结合能力强，可形成凝集物，与FITC标记兔抗鸡IgG结合后，显示绿色荧光(图5A)，当细菌与非特异IgY共培养时，凝集效果差且只显示出微弱荧光(图5B)，不与IgY共培养时，无凝集物出现且不显示荧光(图5C)，图5的A，B，C中，左侧图为在激发光照射下观察的照片，右侧图为在白光下观察的照片。

以上所述，仅是本专利的较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化和替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体，其特征在于，该卵黄抗体是用灭活黄海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi) 为抗原对蛋鸡进行免疫，收集该被免疫的蛋鸡的鸡蛋，对鸡蛋卵黄中分离得到的水溶性组分，再进行分离纯化后得到的，所述黄海希瓦氏菌保藏编号为CGMCC No.7303。

2.根据权利要求1所述的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体，其特征在于，所述的蛋鸡为120日龄的健康产蛋母鸡。

3.权利要求1或2所述的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗原的制备：将黄海希瓦氏菌CGMCC No.7303在液体培养基中扩增培养至菌液浓度10⁹CFU/mL，收集菌体，菌体用PBS稀释后用甲醛灭活，得到灭活的黄海希瓦氏菌抗原；

(2)免疫蛋鸡：将步骤(1)得到的灭活的黄海希瓦氏菌抗原与弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂按照等体积混合，乳化，制成弗式完全佐剂疫苗或弗式不完全佐剂疫苗；对蛋鸡进行免疫，共免疫三次，初免时使用完全弗式佐剂疫苗，二免和三免时使用弗式不完全佐剂疫苗；

(3)二免后每隔一周收集鸡蛋一次，将收集的鸡蛋清洗、消毒后，收集卵黄液，卵黄液中加入6倍体积的去离子水稀释，调pH至5.0-5.2，4℃静置过夜后，离心，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，滤液为水溶性组分；

(4)将步骤(3)所得水溶性组分经纯化得抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体。

4.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的对蛋鸡的免疫方法为：初免时弗式完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡1mL，其中左右胸肌各注射0.2～0.4mL，颈部皮下注射0.2～0.6mL；初免2周后进行二免，弗式不完全佐剂疫苗总注射剂量为每只蛋鸡1.5mL，其中左右胸肌和颈部皮下各注射0.5mL；二免2周后进行三免，弗式不完全佐剂疫苗总注射剂量为每只蛋鸡2mL，其中左右胸肌各0.5～0.8mL，颈部皮下注射0.4～1mL。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的水溶性组分的纯化方法为：在步骤(4)得到的水溶性组分中加入硫酸铵至饱和度为50％，混匀，待完全溶解后置4℃过夜；4℃下离心，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，再加入硫酸钠至饱和度为14％，混匀，置室温过夜；25℃下离心，用去离子水重新悬浮沉淀至原体积，得到抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体粗提液；将卵黄抗体粗提液用100KDa截留量的超滤膜包进行超滤浓缩，超滤后得到的卵黄抗体提取液在-80℃条件下预冻2h，然后在真空度20Pa条件下进行冷冻干燥，24h后获得抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体冻干粉，4℃保存备用。

6.权利要求1或2所述的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体在制备治疗黄海希瓦氏菌引起的疾病的生物制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制剂为药物、保健品和饲料添加剂。

8.权利要求1或2所述的抗黄海希瓦氏菌卵黄抗体在制备以黄海希瓦氏菌为抗原的亲和纯化试剂或以黄海希瓦氏菌为抗原的免疫检测试剂中的应用。