CN104974249B

CN104974249B - 鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白、其抗体及制备方法和应用

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Publication number: CN104974249B
Application number: CN201510359199.1A
Authority: CN
Inventors: 汪铭书; 程安春; 李清竹; 朱德康; 刘马峰; 杨乔
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2015-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2035-06-25
Also published as: CN104974249A

Abstract

本发明公开了一种鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白、其抗体及制备方法和应用。该重组蛋白具有与天然OmpA/MotB蛋白相似的免疫反应活性，能够与RA抗体特异性结合，而与鸭沙门氏菌阳性血清、鸭大肠杆菌阳性血清、鸭肿头败血症病毒阳性血清、禽流感病毒(H5)阳性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清等不产生交叉反应，可作为检测RA全菌抗体的检测抗原应用，且由于该重组蛋白非全细菌，应用其进行检测时无散毒危险；此外，该重组蛋白的制备方法简单，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比较。

Description

鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白、其抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白、其抗体及制备方法和应用。

背景技术

鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)所致鸭疫里默氏菌病(Riemerella anatipestifer infection)是家鸭、火鸡和多种其它鸟类的一种接触传染性疾病，也称为新鸭病((New duck syndrome)、鸭败血症(Duck septicaemia)、鸭疫综合症(Anatipestfer syndrome)、鸭疫败血症(Anatipestifer septicaemia)、鸭疫巴氏杆菌病(Pasteurella anatipestifer infection)和鸭传染性浆膜炎(Infectious serositis)。它是鸭的一种常见的细菌性传染病，主要侵害2—8周龄雏鸭，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎为主要的病理特征。

引起鸭疫里默氏菌病的病原为鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)。此菌为革兰氏阴性小杆菌，无芽胞，菌体无菌毛或鞭毛，不能运动，有荚膜，瑞氏染色呈两极浓染。纯培养菌涂片，美蓝染色，可见菌体多为杆状，常单个存在，少数成双排列，偶见个别菌体呈长丝状排列。RA的血清型多而复杂，血清型超过21个，且各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，这给RA的疫苗防治带来一定困难。比较有效的方法是针对当地主要流行血清型，选取相应菌株研制疫苗，以达到更有效的预防效果。

细菌外膜蛋白(OMP)是革兰氏阴性菌特有的，是存在于外膜之中及与外膜有关的所有蛋白的总称。外膜在细菌胞浆膜(内膜)和肽聚糖层的外侧，包围整个细菌，是革兰氏阴性菌细胞壁成分中所特有的结构。外膜蛋白由6个家族组成：包括OmpA蛋白、OmpX蛋白、水解磷脂酶A、普通膜孔蛋白(OmpF，PhoE)、底物特异性膜孔蛋白(LamB，ScrY)以及金属依赖性铁运输蛋白FhuA和FepA蛋白，共有20余种，但多数功能尚不清楚。外膜蛋白A(Outer MembraneProtein A，OmpA)是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白，OmpA与细菌的生物膜形成有关，可维持外膜的完整，缺少OmpA的细菌，细胞膜不稳定。OmpA是一种跨膜蛋白，有研究表明，该蛋白除了具有维持外膜结构的作用外，其重要作用是在细菌感染早期与细胞基质相互作用，定植于宿主细胞，从而达到吸附作用。据报道，OmpA是RA的一种毒力因子，具有致病作用，因此，在鸭疫里默氏菌病的诊断和疫苗研制上可能具有重要价值。此外，OmpA基因核酸序列高度保守，有着良好的免疫原性，能够激发机体的体液免疫和细胞免疫，并可通过遗传工程技术得到大量表达。对于异种血清型，OmpA可起到免疫交叉保护的作用，是一种潜在的共同保护性抗原，它是被公认的RA高保护性抗原。再者，OmpA有助于RA逃逸机体的免疫防御。

Thrombospondin是指凝血酶敏感蛋白，又称血小板反应蛋白。其基因家族分为两个亚科，亚科A和亚科B。亚群A的蛋白质包括TSP-1和TSP-2，被组装成三聚体，包含有1、2、3型重复；亚群B的蛋白质，是指TSP-3、TSP-4与COMP(TSP-5)，它们的特征是包括独特的N端区域，缺乏原骨胶原同源区域和1型重复，含有四个版本的2型重复，被组装成五聚化物。3型重复(Thrombospondin type 3repeats)的作用在于细胞黏附(cell attachment)、传播(spreading)和抑制蛋白酶(protease inhibition)。Thrombospondin type 3repeat:OmpA/MotB可能涉及病原体同宿主细胞之间的相互作用，与病原体吸附宿主细胞有关，是OmpA家族的其他成员。MotB是细菌的一种鞭毛马达蛋白，与细菌的运动有关。但是鸭疫里默氏菌没有鞭毛，可以推测MotB与OmpA可能具有同源性，存在相似功能。有文献指出，OmpA相关蛋白与MotB蛋白C端的保守序列在革兰氏阴性菌与阳性菌中有一个共同的功能：可能与肽聚糖相互作用有关(The C-terminal sequence conservation between OmpA-relatedouter membrane proteins and MotB suggests a common function in both gram-positive and gram-negative bacteria,possibly in the interaction of thesedomains with peptidoglycan,Molecular microbiology,1994,12(2):333)。

由于国内外关于鸭疫里默氏菌凝血酶敏感III型重复蛋白(Thrombospondin type3repeats)：OmpA/MotB基因及其蛋白的研究未见报道，因此，对Thrombospondin type 3repeats：OmpA/MotB基因及其蛋白的研究有助于为RA的防控开辟新的思路。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白，其具有与天然OmpA/MotB蛋白相似的免疫反应活性，能够与RA抗体特异性结合；本发明同时还提供了上述重组蛋白的抗体及制备方法和应用。

本发明通过下述技术方案达到所述目的：

1、鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白的编码基因。

优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3、含有上述编码基因的重组表达载体。

优选的，是将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的OmpA/MotB截短重组蛋白编码基因克隆入原核表达质粒pET-32(a)+中而得到。

4、上述重组表达载体的工程菌。

优选的，是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中而得到；所述重组表达载体为将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的OmpA/MotB截短重组蛋白编码基因克隆入原核表达质粒pET-32(a)+中而得到。

5、上述工程菌制备鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白的方法，包括如下步骤：

取工程菌接种于含Amp的LB培养基中，以150-200r/min、37℃培养12h或至OD_600nm为0.6，然后按体积比为1:100的比例加入到含Amp的LB培养液中37℃继续培养至OD_600nm达0.6后，于1.2mmol/L IPTG、37℃条件下诱导12h；收集菌液，离心，菌体沉淀用1/10菌液体积的20mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl悬浮，冰水浴超声裂解菌体，而后12000r/min离心10min，沉淀用1/50原菌液体积的8mol/L尿素溶液溶解，8000r/min离心10min，取溶解液，采用Ni-NTA亲和层析进行纯化，将收集的纯化蛋白液进行梯度透析、超滤及浓缩即得。

6、鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白为抗原免疫动物得到的多克隆抗体。

7、鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白在制备鸭疫里默氏菌基因工程亚单位疫苗或抗体检测试剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明选取RA OmpA/MotB基因的主要抗原表位蛋白区域，利用原核表达系统成功制得了截短OmpA/MotB重组蛋白。该重组蛋白具有与天然OmpA/MotB蛋白相似的免疫反应活性，能够与RA抗体特异性结合，而与鸭沙门氏菌阳性血清、鸭大肠杆菌阳性血清、鸭肿头败血症病毒阳性血清、禽流感病毒(H5)阳性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清等不产生交叉反应，可作为检测RA全菌抗体的检测抗原应用，且由于该重组蛋白非全细菌，应用其进行检测时无散毒危险；此外，该重组蛋白的制备方法简单，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比较。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1 OmpA/MotB基因主要抗原表位区PCR产物电泳。M泳道：DL5000 Marker，1泳道：OmpA/MotB基因主要抗原表位区PCR扩增产物。

图2 OmpA/MotB主要抗原表位区重组质粒构建及其PCR与酶切鉴定。图中A图为pMD19-T/OmpA/MotB主要抗原表位区质粒PCR鉴定，M泳道：DL5000 Marker，1泳道：PCR产物；图中B图为pMD19-T/OmpA/MotB主要抗原表位区质粒酶切鉴定，M泳道：DL15000 Marker，1泳道：BamH I/Xho I双酶切条带；图中C图为pET-32(a)+/OmpA/MotB主要抗原表位区质粒的PCR鉴定，M泳道：DL2000 Marker，1泳道：PCR产物；图中D图为pET-32(a)+/OmpA/MotB主要抗原表位区质粒的酶切鉴定，M泳道：DL15000 Marker；1泳道：BamH I/Xho I双酶切条带。

图3 OmpA/MotB主要抗原表位区蛋白的表达分析及表达条件的优化。M泳道为低分子量蛋白质标准品。图中A图为重组蛋白表达形式的分析，泳道1为pET-32(a)+/OmpA/MotB主要抗原表位区质粒上清表达产物，第2-3泳道分别为包涵体表达产物及pET-32a+空质粒表达产物；图中B图为诱导表达时间的优化，1-4泳道依次为重组表达蛋白包涵体诱导0h、4h、8h、12h的BL21(DE3)宿主菌表达产物；图中C图为诱导表达温度的优化，1-3泳道分别为25℃、30℃、37℃的BL21(DE3)宿主菌表达产物，4泳道为pET-32a+空质粒表达产物；图中D图为IPTG浓度优化，1-4泳道分别为1.2mmol/L、0.8mmol/L、0.4mmol/L、0mmol/L的IPTG浓度诱导的表达产物。

图4表达蛋白的Western-blot鉴定结果。M泳道为预染蛋白质Marker，2泳道为OmpA/MotB截短蛋白印迹。

图5纯化的OmpA/MotB截短重组蛋白SDS-PAGE电泳结果。其中，M泳道为低分子量蛋白质标准品，1泳道为经Ni2+-NTA亲和层析得到的OmpA/MotB截短重组蛋白。

图6兔抗OmpA/MotB截短重组蛋白高免血清琼扩效价检测结果。中央孔B加入纯化的OmpA/MotB截短重组蛋白，周围孔分别加入1:2、1:4、1:8、1:16和1:32稀释的兔抗OmpA/MotB截短重组蛋白高免血清及空白对照PBS。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

主要材料：血清1型鸭疫里默氏菌菌株(RA-CH-1菌株)，Ecoli DH5α、Ecoli BL21(DE3)菌种，pET-32(a)+载体均由四川农业大学禽病防治研究中心保存提供。1日龄樱桃谷肉鸭40只购于四川农业大学家禽试验场。成年公兔4只，购于本地兔场。

TSA和TSB购自英国OXOID公司；Trypone、Yeast Extract购于Oxoid公司；DL2000Marker、DL15000 Marker、Prime STAR PCR Mix、PMD19-T cloning kit、ligationmix连接试剂盒、BamHI和XhoI限制性内切酶、大肠杆菌DH5α感受态细胞均购于宝生物工程(大连)有限公司；Agarose、DAB显色试剂盒，购于上海艾研生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒购于OMEGA公司；可溶性单组分TMB底物溶液购于天根生化科技有限公司；Tris碱、甘氨酸、SDS、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、R250、BSA、咪唑购于上海生工生物工程技术有限公司；HRP标记的羊抗鸭IgG购于美国KPL公司；低分子量蛋白质Marker、预染蛋白Marker、PVDF膜、Ni2+-NTA琼脂糖凝胶均购于Bio-rad公司；IPTG购于Promega公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购于Sigma生物科技公司；0.22μm和0.45μm滤膜、超滤管、透析袋均购于Millipore公司；ELISA酶标条购于康宁(Corning)有限公司。

实施例1 截短OmpA/MotB重组蛋白的制备

1、OmpA/MotB基因(主要抗原表位区域)引物设计

根据Gene Bank公布的RA-CH-1生物信息学分析和推测的OmpA/MotB基因序列(Genbank ID号：CP003787.1)信息，OmpA/MotB基因片段长1467bp，利用BepiPred 1.0bServer对蛋白质抗原表位解析，进一步利用DNAstar7.0中的Protean对序列进行抗原分析，选取RA-CH-1 OmpA/MotB的主要抗原表位区段：第409bp-1389bp区段(969bp)进行截短表达。以提取的RA-CH-1基因组DNA为模板，经PCR扩增，得到OmpA/MotB基因主要抗原表位区DNA片段，预期长度(引物区域加上酶切位点)981bp，OmpA/MotB主要抗原表位区域的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，氨基酸序列见SEQ ID NO.2。

PCR克隆引物：

上游引物P1：5'-ggatccggagccaactatttgagacac-3'，(SEQ ID NO.3)；

下游引物P2：5'-ctcgaggctgattgcttctacaaccactt-3'，(SEQ ID NO.4)；

其中，下划线处分别为BamH I与Xho I限制性内切酶位点，引物由上海英潍捷基有限公司合成。

2、RA全基因组提取及OmpA/MotB主要抗原表位区段PCR扩增

参照天根细菌基因组DNA试剂盒说明书步骤提取RA-CH-1菌株全基因组DNA。依据TaKaRaMax DNA Polymerase说明书进行引物及模板的处理。

扩增OmpA/MotB基因(主要抗原表位区段)PCR反应体系如下：ddH₂O 9μL，2xprimerstar max 12.5μL，P1(10pmol)1μL，P2(10pmol)1μL，模板DNA(100ng/μL)1.5μL，总体积25μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性40s、58℃退火40s、72℃延伸50s，30个循环；72℃10min。取5μL产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果，如图1所示，获得与预期981bp大小位置一致的OmpA/MotB基因主要抗原表位区段目的DNA片段。按照OMEGA胶回收试剂盒说明书进行胶回收。

3、重组表达质粒的构建

将回收纯化后目的DNA片段末端加A，便于后续的连接工作。体系为：2xPCR mix 5μL，目的DNA 5μL，总体积10μL，PCR仪72℃反应30min即可。T克隆体系为：Ligation mix 5μL，目的OmpA/MotB主要抗原表位区片段4μL，pMD19-T载体1μL，总体积10μL。16℃连接过夜，无菌下操作，以免影响转化效果。取10μL连接产物于100μL DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min；而后置于42℃水浴热击90s，然后快速转移至冰浴中，继续冰浴2min；加入LB液体培养基890μL，于37℃振荡培养1h；低速离心后弃750μ上清，取250μL沉淀培养物涂于含有氨苄青霉素(Amp+)、X-gal、IPTG的LB琼脂平板上，37℃培养16h。随机挑取单个白色菌落，接种到5mlLB液体培养基(Amp+)中，37℃振荡培养过夜。

参照OMEGA公司质粒小量提取试剂盒说明书抽提质粒，然后进行PCR与酶切鉴定，酶切鉴定体系如下：10xK buffer 1μL，质粒6μL，BamH I(15U/μL)0.5μL，Xho I(15U/μL)0.5μL，超纯水2μL，总体积10μL。反应条件为37℃，水浴4h。反应完毕后加2μL 10×LoadingBuffer以终止反应。1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，如图2所示，将OmpA/MotB基因主要抗原区片段连接至pMD19-T载体后，经PCR(图2中A图)及BamHI、XhoI双酶切(图2中B图)均得出预期条带。最后将初步鉴定正确的质粒命名为pMD19-T/OmpA/MotB抗原区，并送Invitrogen公司测序。

将测序鉴定正确的T克隆质粒pMD19-T/OmpA/MotB抗原区、pET-32(a)+载体分别BamH I/Xho I双酶切，分别回收目的基因片段及载体大片段，按照试剂盒说明书进行连接，连接体系如下：目的基因回收液4.5μL，pET-32(a)+3μL，Ligation mix 7.5μL，总体积15μL。16℃过夜连接。连接产物转化DH5α感受态细胞，以Amp抗性LB固体及液体培养基筛选阳性克隆，经PCR(图2中C图)及BamHI/XhoI双酶切(图2中D图)鉴定，分别得到预期条带。将重组质粒送Invitrogen公司测序，并将鉴定正确的质粒命名为pET-32(a)+/OmpA/MotB抗原区。将含有正确的质粒DH5α菌保种。

4、重组表达工程菌的构建及诱导表达

将测序正确的pET-32(a)+/OmpA/MotB抗原区原核表达质粒转化至Ecoli.BL21(DE3)表达菌中，挑取单菌落于含5mL Amp LB液体的试管中，150r/min，37℃培养过夜。次日将培养物1:100接种于Amp LB液体培养基，扩大培养约3h，菌液OD_600nm达0.6时以0.4mmol/LIPTG终浓度37℃诱导4h，将菌液8000r/min离心，收集菌体沉淀。菌体沉淀用1/10菌液体积的20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)悬浮，冰水浴超声裂解菌体，而后12000r/min离心10min，取上清，加入5xSDS loading buffer煮沸制样，称之为上清；沉淀用1/50原菌液体积的8M尿素溶液溶解，8000r/min离心10min，取溶解液，加5xSDS loading buffer煮沸制样，称为包涵体。同时设置含空载体质粒表达菌对照，超声后直接制样，不分上清与包涵体。将所制样品进行SDS-PAGE电泳，结果在约56kD左右处出现目的条带(图3中A图)。

挑取含pET-32(a)+/OmpA/MotB抗原区质粒的BL21(DE3)单菌落接种到LB液体培养基(Amp+)，37℃活化过夜。次日按1：100接种至新鲜的100ml LB液体培养基(Amp+)，37℃振荡培养3h,OD_600nm达0.6左右时，加IPTG诱导摇菌。做IPTG浓度、IPTG诱导时间、表达温度等条件的优化，以获得目的蛋白的最佳表达条件。

(1)诱导蛋白表达IPTG浓度优化

将含重组质粒pET-32(a)+/OmpA/MotB抗原区的表达宿主菌BL21(DE3)以1：100分别接种于含Amp的LB中，37℃剧烈振荡培养至OD_600nm＝0.6左右，加入IPTG至终浓度0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.2mmol/L诱导培养4～6h左右，离心获得菌体，超声裂解，离心，获得样品。对样品处理后，SDS-PAGE电泳，结果如图3中D图所示。

(2)诱导温度的优化

参照上述方法，待菌液培养至OD_600nm＝0.6左右后，添加IPTG至终浓度为最佳浓度，分别在25℃、30℃和37℃诱导培养4～6h，离心制样，对样品进行处理，SDS-PAGE电泳，结果如图3中C图所示。

(3)诱导时间的优化

参照上述方法，待表达菌液培养至OD_600nm＝0.6左右时，采用最佳IPTG浓度及最适温度，诱导时间设置为0h、4h、8h、12h，将表达产物制样处理后进行SDS-PAGE分析，结果如图3中B图所示。

由图3可知，OmpA/MotB截短重组蛋白的最佳表达条件为1.2mmol/L IPTG、37℃诱导12h。

5、表达蛋白的Western-blot鉴定

将筛选出的最优表达菌的表达产物按常规方法进行蛋白印迹，过程如下：将表达样品进行SDS-PAGE，随后将电泳后的凝胶转印至PVDF膜上，80V转印90min，转印完毕后将PVDF膜取出，以1％BSA于37℃孵育1h，然后以1:100稀释的兔抗RA-CH-1 IgG 37℃摇动孵育1h后取出，以PBS洗涤3次，每次2min，随后以1:3000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG于37℃摇动孵育1h，以PBS洗涤后按照DAB显色试剂盒说明书显色，待目的条带清晰可见时以蒸馏水冲洗终止显色。将PVDF膜干燥避光保存。鉴定结果见图4中2号泳道，由图4可知，重组表达的OmpA/MotB截短蛋白能与RA-CH-1多克隆抗体特异性结合。

6、重组蛋白的大量表达及纯化

挑取含pET-32a(+)/OmpA/MotB抗原区BL21(DE3)单菌落于10ml Amp LB培养基中，200r/min 37℃，5-6h，至OD_600nm为0.6；将上述10ml菌液加入含1L Amp LB培养液的锥形瓶中，37℃，200r/min继续培养2-3h。OD_600nm达0.6后，于最佳IPTG诱导浓度、最适诱导温度和最佳诱导时间条件下诱导。按照重组表达工程菌构建及诱导表达时所述方法收集菌体制样，获得包涵体溶解液，采用Ni-NTA亲和层析的方法进行纯化。按照Bio-rad Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶说明书进行纯化相关液体配制及纯化方法纯化表达的OmpA/MotB主要抗原表位区蛋白，将收集的纯化蛋白液进行梯度透析及超滤，浓缩置-20℃保存。将所得的纯化OmpA/MotB截短蛋白进行SDS-PAGE电泳以检测蛋白纯度，结果见图5。由图5可知获得了高纯度的OmpA/MotB截短蛋白。

实施例2 基于OmpA/MotB截短蛋白间接ELISA方法的建立

1、基于OmpA/MotB截短蛋白ELISA方法的反应条件优化

优化条件见表1。

表1 间接ELISA条件优化

按下列步骤以表1的各反应条件进行优化：

(1)用包被液稀释蛋白，微孔板每孔加100μL，4℃过夜；

(2)次日甩弃液体，每孔加入含1％BSA的PBST 200μL，37℃封闭1h；

(3)PBST洗4次，每次5min，拍干，加入待检血清100μL，37℃孵育1h；

(4)PBST洗涤4次，拍干，加入工作浓度HRP标记的羊抗鸭IgG 100μL，37℃孵育1h；

(5)洗板同上，拍干，每孔加入TMB 100μL，避光显色15min，加入终止液(2mol/LH₂SO₄)100μL，轻拍混匀，酶标仪下测OD_450/630nm值。

OmpA/MotB截短蛋白抗原包被浓度和血清稀释度选择见表2。

表2 OmpA/MotB截短蛋白抗原包被浓度和血清稀释度选择

由表2可知，OmpA/MotB截短蛋白的最佳包被浓度为2.9μg/mL(稀释度1:400)，血清1:160稀释。

OmpA/MotB截短蛋白酶标抗体工作浓度优化：每个浓度设置3个重复，取平均值，于37℃孵育，设置阴阳性血清，P/N值最大者为最佳二抗稀释度，则OmpA/MotB截短蛋白最佳二抗稀释度为1:1600(表3)。

表3 OmpA/MotB截短蛋白酶标抗体工作浓度优化

最佳显色时间优化：每个显色时间阳性、阴性血清均设置5个重复，读取其平均值，于37℃避光显色。选P/N值最大者所对应的分钟数为最佳显色时间，如表4所示，OmpA/MotB截短蛋白最佳显色为25min。

表4 OmpA/MotB截短蛋白最佳显色时间选择

最佳包被条件的选择：每个包被条件设5个重复。P/N值最大者为最佳包被条件，由表5可知，OmpA/MotB截短蛋白最佳包被条件为37℃3h 4℃过夜(12小时)。

表5 OmpA/MotB截短蛋白包被条件优化

最佳封闭液、封闭时间：每种封闭液设5个重复，均于37℃封闭，选择P/N值最大者作为最佳封闭液及封闭时间，详细见表6和表7，OmpA/MotB截短蛋白最佳封闭液为1％脱脂奶粉，最佳封闭时间2h。

表6 OmpA/MotB截短蛋白最佳封闭液选择

表7 OmpA/MotB截短蛋白封闭时间选择

最佳血清、酶标抗体孵育时间：每个时间点设置8个重复，均在37℃孵育，选择P/N值最大者且阴性值较低者为最佳血清、酶标抗体最佳孵育时间，详细见表8和9，由表8可知，OmpA/MotB截短蛋白最佳血清孵育时间为0.5h，由表9可知，最佳二抗孵育时间为0.5h。

表8 OmpA/MotB截短蛋白血清孵育时间优化

表9 OmpA/MotB截短蛋白二抗孵育时间优化

2、阳性阈值的确定

以OmpA/MotB截短蛋白最佳稀释度包被酶标条，以最佳反应条件进行反应，检测40份阴性血清OD_450/630nm值，计算阳性阈值＝均值+3×方差(阳性阈值＝X+3×SD)。结果见表10，取均值X+3×SD作为阳性阈值，得到OmpA/MotB截短蛋白阴阳血清临界值为0.057+3×0.022＝0.123。

表10 OmpA/MotB截短蛋白40份阴性血清OD_450/630nm值

0.079	0.068	0.056	0.065	0.070
					0.055	0.048	0.081	0.082	0.037
0.110	0.100	0.088	0.040	0.041
					0.077	0.052	0.043	0.051	0.037
0.055	0.095	0.042	0.058	0.038
					0.022	0.078	0.042	0.046	0.069
0.047	0.036	0.045	0.035	0.037
					0.038	0.038	0.038	0.035	0.100

3、ELISA方法特异性检测

(1)特异性交叉试验：以OmpA/MotB截短蛋白作为抗原，用建立的ELISA方法分别检测鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌、鸭肿头败血症病毒、禽流感病毒(H5)、鸭瘟病毒和鸭肝炎病毒的阳性血清，设置鸭疫里默氏菌阳性、阴性血清对照。实验设置3个重复取平均值，结果见表11。

表11 OmpA/MotB截短蛋白ELISA方法特异性检测

由表11可知，只有鸭疫里默氏菌阳性血清的OD值大于阳性阈值0.123且与阴性血清的OD值的比值大于2.1，其余六种待检病原的阳性血清OD值均小于阳性阈值0.123且与阴性血清的比值均小于2.1，表明建立的ELISA方法特异性良好。

(2)特异性阻断试验：用10:1的体积比(蛋白：血清)，将鸭疫里默氏菌血清1型阳性、阴性血清与1mg/mL的OmpA/MotB截短蛋白混合后置于37℃中和1h，而后稀释至最佳血清稀释度，用建立的ELISA方法检测阻断前后血清的OD_450/630nm值，计算阻断率。阳性、阴性血清阻断前与阻断后分别设置8个重复，取平均值，结果见表12。

表12 OmpA/MotB截短蛋白阻断实验

由表12可知，OmpA/MotB截短蛋白对RA-CH-1阳性血清阻断率为85.91％，阴性血清阻断率为9.52％，表明OmpA/MotB截短蛋白能与鸭疫里默氏菌血清特异性识别并进行中和。4、ELISA方法重复性检测

同一批和不同批次纯化抗原包被酶标板，用建立的ELISA方法检测6份已知阳性血清的OD_450/630nm值，每份血清设置6个重复，检测其板内、板间变异系数。计算变异系数CV＝标准差/平均值(SD/M×100％)。结果见表13和14。

表13 OmpA/MotB截短蛋白板内变异系数

表14 OmpA/MotB截短蛋白板间变异系数

结果表明OmpA/MotB截短蛋白板内变异系数在1.71％-6.96％，小于10％(表13)，板间变异系数在1.57％-7.09％，均小于10％(表14)，表明建立的重组OmpA/MotB截短蛋白检测RA抗体的ELISA检测方法重复性良好。

5、ELISA方法敏感性检测

取6份已知的血清1型鸭疫里默氏菌阳性血清，分别从1:100开始，以2倍倍比稀释，用建立的ELISA方法，以能检测出阳性的最大稀释度为其灵敏度。从表15数据得出建立的OmpA/MotB截短蛋白间接ELISA方法灵敏度为：当阳性血清稀释至1:6400时仍可检出。

表15 OmpA/MotB截短蛋白间接ELISA方法灵敏度检测

实施例3 兔抗OmpA/MotB截短重组蛋白高免血清的制备

1、免疫原的制备

用实施例1制备的OmpA/MotB截短重组蛋白和弗氏完全佐剂(FCA)或弗氏不完全佐剂(FICA)等体积混合，置于冰浴上，经超声波乳化形成油包水剂为止。检查乳化效果标准即将乳化抗原滴于冰水中出现完整且持续不扩散的圆形油珠并保持1分钟即可。

2、动物的免疫

按表16免疫程序对家兔进行免疫，首免前一天对家兔进行抽血，分离血清作为阴性血清对照。

表16 兔抗OmpA/MotB截短重组蛋白高免血清制备免疫程序

3、高免血清的制备及效价测定

四免后10天，颈动脉放血，收集血液于37℃放置lh，4℃过夜析出血清，5000r/min离心10min去除红细胞，收集血清，制得血清以琼脂糖扩散试验测定抗体效价，结果OmpA/MotB截短重组蛋白兔抗血清在1:16的稀释度下亦能观察到白色条带(图6)。

血清分装，-20℃保存或冻干保存备用。

实施例4 OmpA/MotB截短重组蛋白对雏鸭的免疫保护效果研究

1、试验分组及免疫程序

1日龄健康樱桃谷肉鸭40只分为4个小组，分别为OmpA/MotB截短蛋白免疫后攻毒组Y1；RA-CH-1灭活疫苗先免疫后攻毒组Y2；RA攻毒对照组C1，正常对照组C2。具体分组及免疫程序如表17。

表17 动物分组及免疫程序

2、雏鸭攻毒保护

首免后14d，用RA-CH-1攻毒(10⁸CFU/只)分别腿部肌肉注射Y1、Y2、和C1各组鸭子，C2正常对照组用灭菌的生理盐水处理。观察记录攻毒后一周内发病死亡情况。

发病的判定标准：符合下列条件之一，判为发病：

(1)试验鸭出现精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿色稀便；

(2)黄绿色稀薄粪便等鸭传染性浆膜炎临床症状甚至死亡；

(3)剖检时鸭可见心包膜炎或肝周膜炎或浆膜炎病变或心血、肝脏、脾脏分离细菌呈阳性。

攻毒一周后，未死鸭剖杀，记录内脏器官病变情况，只要出现纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎或其中的一种或鸭疫里默氏杆菌分离阳性，即记录为“病变鸭”。

具体分离与鉴定方法：解剖一周内发病死亡的雏鸭及未死鸭，取脑、肝脏、心脏组织进行细菌分离。用酒精灯烧红后冷却的接种环蘸取上述组织接种划线于TSA平板上，37℃培养18h后，观察菌落大小、颜色与形态。并挑取单个菌落，扩大培养，进行平板凝集试验：在干净载玻片中央滴加灭菌水1滴，用接种环蘸取离心洗涤的分离菌少许，与灭菌水混匀，滴加未稀释的阳性血清1滴。将载玻片反复振荡或用接种环涂开，观察结果。几秒钟后出现清晰的乳白色絮状凝集块者即判定为阳性反应。阳性反应者须重复3次上述操作以减少假阳性。

16日龄对四组鸭子腿部肌肉注射RA-CH-1 10⁸CFU/只，经观察发现：攻毒48小时后，攻毒对照组(C1)开始有死亡现象。攻毒对照组于攻毒后第二天，陆陆续续出现临床症状，表现为精神沉郁、伏卧、眼部周围分泌物增多，饮食量减少，部分鸭拉绿色稀便。随着时间的增长，大多数鸭步态不稳，头颈歪斜，震颤，大都于3-5天之内死亡。C1组只有极个别鸭子未见有任何症状。对C1组死亡鸭剖检，死亡早的鸭子见不到明显的剖检病变，死亡时间晚(攻毒后4-7天)的鸭子经剖检还可见到“三炎”现象。而后将死亡鸭的组织与器官(脑、心、肝)分别划线接种于TSA培养基上培养24h，都能分离到同源菌。攻毒7天后，将C1组未死亡的2只活鸭扑杀，剖检发现其中1只鸭子肝包膜及心包膜增厚，对其脑、心、肝进行RA-CH-1的分离鉴定，结果都得到RA-CH-1菌株；另外1只鸭子扑杀前，精神状况良好，未见有明显临床症状，剖检也未见任何异常，亦未从相应组织器官分离到鸭疫里默氏菌。首免后攻毒组(Y1、Y2)鸭出现死亡的时间比攻毒对照组(C1)的迟，并且死亡率明显比攻毒对照组(C1)低。攻毒1周后，将各先免疫后攻毒组活鸭全部扑杀，部分鸭子经剖检发现主要病变为心包和肝被膜增厚，有纤维素性渗出，亦能分离到同源菌。其余大部分鸭子无明显病变，也不能分离到鸭疫里默氏菌。

从攻毒保护试验结果(表18)得知，Y1、Y2组的免疫保护率分别为60％和90％。

表18 发病情况及免疫保护率

OmpA/MotB截短重组蛋白和RA-CH-商品灭活疫苗免疫雏鸭后对RA-CH-1攻击的免疫保护率分别为60％和90％，而非免疫鸭100％发病，即OmpA/MotB截短重组蛋白可作为预防鸭疫里默氏杆菌的基因工程亚单位疫苗。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白在制备鸭疫里默氏菌基因工程亚单位疫苗或抗体检测试剂中的应用，其特征在于：所述鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白按如下方法制备：取工程菌接种于含Amp的LB培养基中，以150-200r/min、37℃培养12h或至OD_600nm为0.6，然后按体积比为1:100的比例加入到含Amp的LB培养液中37℃继续培养至OD_600nm达0.6后，于1.2mmol/L IPTG、37℃条件下诱导12h；收集菌液，离心，菌体沉淀用1/10菌液体积的20 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl悬浮，冰水浴超声裂解菌体，而后12000r/min离心10min，沉淀用1/50原菌液体积的8mol/L尿素溶液溶解，8000r/min离心10min，取溶解液，采用Ni-NTA亲和层析进行纯化，将收集的纯化蛋白液进行梯度透析、超滤及浓缩即得；所述工程菌是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）中而得到；所述重组表达载体为将核苷酸序列如SEQID NO.1所示的OmpA/MotB截短重组蛋白编码基因克隆入原核表达质粒pET-32(a)+中而得到。

2.以鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白为抗原免疫动物得到的多克隆抗体，其特征在于：所述鸭疫里默氏菌OmpA/MotB截短重组蛋白按如下方法制备：取工程菌接种于含Amp的LB培养基中，以150-200r/min、37℃培养12h或至OD_600nm为0.6，然后按体积比为1:100的比例加入到含Amp的LB培养液中37℃继续培养至OD_600nm达0.6后，于1.2mmol/L IPTG、37℃条件下诱导12h；收集菌液，离心，菌体沉淀用1/10菌液体积的20 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl悬浮，冰水浴超声裂解菌体，而后12000r/min离心10min，沉淀用1/50原菌液体积的8mol/L尿素溶液溶解，8000r/min离心10min，取溶解液，采用Ni-NTA亲和层析进行纯化，将收集的纯化蛋白液进行梯度透析、超滤及浓缩即得；所述工程菌是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）中而得到；所述重组表达载体为将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的OmpA/MotB截短重组蛋白编码基因克隆入原核表达质粒pET-32(a)+中而得到。