CN102360013A - 用于检测鸭瘟病毒抗体的elisa试剂盒及抗体检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物医学领域，特别涉及用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒由固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液组成，所述抗体捕获剂为重组鸭瘟病毒UL16蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法具体步骤为：固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色及检测和判定；本试剂盒特异性和敏感性高，该方法对批内或批间重复试验显示变异系数均小于10%，能检出经1:5120倍稀释的DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清。

Description

用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒及抗体检测方法

技术领域

本发明涉及动物医学领域，特别涉及用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒及抗体检测方法。

背景技术

鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的鸭瘟病毒（duck plague virus，DPV）引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病，在世界各养鸭地区都有分布，其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂,而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法主要有中和试验(neutralization test，NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、Dot-ELISA测定法和被动血凝试验等。其中经典的方法是血清中和试验，但其敏感性不够理想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点，是DPV感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段；但是，由于DPV全病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想，阻碍了包被全病毒的ELISA方法（DPV-ELISA）的大规模应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种ELISA试剂盒，该试剂盒可用于鸭瘟病毒抗体的检测，其成本低，适用于大规模运用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液，所述抗体捕获剂为重组鸭瘟病毒UL16蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步，所述重组鸭瘟病毒UL16蛋白的浓度为大于或等于1.25μg/ml；

进一步，所述酶标二抗作10000倍体积稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG；

进一步，所述抗体捕获剂与所述酶标二抗的加入量为等体积。

本发明的目的之二在于提供一种鸭瘟病毒抗体的检测方法，该方法操作简单，特异性和敏感性高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

运用ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体步骤为：

用所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体步骤为：

a 固相抗原的制备：将抗体捕获剂与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

b 一抗结合：将待检标本通过保温反应使与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

c 二抗结合：将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

d 显色：在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

e 检测并判定：将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD_450nm值, 判断结果。

     进一步，步骤B中所述待测标本为作160倍体积稀释的血清；

     进一步，步骤e中,将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD_450nm值, 所述OD_450nm值＞0.598为阳性，所述OD_450nm≤0.598则为阴性；

进一步，所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验；

进一步，步骤a中所述重抗体捕获剂、步骤b中所述待检标本及步骤c中所述酶标二抗的加入量为等体积；

进一步，步骤a中所述重组鸭瘟病毒UL16蛋白液、步骤b中所述待测标本及步骤c中所述酶标二抗加入量为100μL。

本发明的有益效果在于：本发明基于纯化的重组UL16蛋白建立的间接ELISA法，其特异性好，对鸭乙肝病毒（DHBV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、鸭疫里默氏菌（RA）、鸭大肠杆菌（E.coli）、鸭沙门氏菌（Salmonella）、鸭肿头出血症病毒（DSHDV）、流感病毒（H5N1）的阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法对批内或批间重复试验显示变异系数均小于10%，能检出经1:5120倍稀释的DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清。

 

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为DPV UL16基因的PCR扩增：M指DNA相对分子质量标准D2000；1指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(分子量大小，约为1098 bp)；

图2 为重组质粒pMD18-UL16的双酶切及PCR鉴定：M1指DNA相对分子质量标准D15000，M2为DNA相对分子质量标准D2000；1指重组质粒pMD18-UL16用HindIII和 XhoI双酶切得到的两个片段；2指重组质粒pMD18-UL16 的PCR扩增产物(分子量大小约为1098 bp)；

图3为重组表达载体pET32b-UL16的双酶切及PCR鉴定：M1为DNA相对分子质量标准D2000；M2指DNA相对分子质量标准D15000；1是重组表达载体pET32b-UL16的PCR产物；2指重组表达载体pET32b-UL16用HindIII和 XhoI双酶切得到的两个片段(UL16分子量大小约为1098bp)。

图4为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定：M为蛋白质相对分子质量标准；1为以Rossetta（DE3）为表达宿主的pET32b-UL16加IPTG诱导的包涵体；2为以Rossetta（DE3）为表达宿主的pET32b-UL16未加IPTG诱导；3为以Rossetta（DE3）为表达宿主的pET32b空载加IPTG诱导，4为Rossetta（DE3）为表达宿主的pET32b-UL16加IPTG诱导的上清 (表达蛋白质分子量大小约为60 KD)。

图5为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果：1-6的IPTG浓度分别为1.0、0.8、、0.6、0.4、0.2、和0.0 mmol/L；M为蛋白质相对分子质量标准；7为以Rossetta（DE3）为表达宿主的pET32b空载加IPTG诱导(IPTG浓度对表达量的影响较小)。

图6为不同温度诱导pET32b-UL16表达结果：1-3的温度分别为25、30和37℃;

图7为不同时间诱导pET32b-UL16表达结果：1-5的诱导时间分别为2、4、0、8和6h；6为以Rossetta（DE3）为表达宿主的pET32b空载加IPTG诱导（诱导6h时表到量最大）。

图8为重组UL16蛋白纯化效果检测（SDS-PAGE分析）: M为蛋白质相对分子质量标准；1为包涵体洗涤法过柱纯化后透析复性的重组UL16蛋白；2为6次洗涤后的重组UL16包涵体蛋白；

图9为重组UL16蛋白的反应原性检测（Western blotting 分析）：M为预染蛋白质相对分子质量标准；1指是以兔抗DPV 抗体为一抗检测复性的重组UL16蛋白 (约为60 KD)。

具体实施方式

实施例1 抗体捕获剂的制备

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一 材料方法

菌株、质粒和毒株

质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET32b(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5a、表达宿主菌E.coli Rossetta(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。

    2 试验鸭胚和血清

10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性；兔抗DPV 抗体，由四川农业大学禽病研究中心提供。

主要试剂

琼脂糖、2×Taq PCR MasterMix、DNA 连接酶Mix、限制性内切酶HindIII和XhoI、UltraPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒和UltraPure^TM DNA回收试剂盒等分子生物学试剂及试剂盒购自大连宝生物公司、北京赛百盛基因技术有限公司、华美生物工程公司和Bio-Rad公司；其它试剂均为分析纯，购自上海生工生物技术有限公司。

二 实验方法

    1  鸭瘟病毒 UL16基因的克隆

    1.1引物设计

利用Primer Premier5.0 软件，参考UL16基因序列（GenBank登录号：EU195095），由宝生物生物技术有限公司合成。引物DPV-UL16  P1:5’-AAGCTTATGGCTCGCAGTACTATTA-3’(划线部分为HindIII 位点)，如SEQ ID NO:1所示；引物DPV-UL16 P2: 5’-CTCGAGGACAGTATATTATGTTTTGG-3’(划线部分为XhoI 位点)，如SEQ ID NO:2所示。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为10 μmol/L，-20℃保存备用。

鸭瘟病毒基因组DNA的提取

鸭胚成纤维细胞的制作方法：取10d日龄健康鸭胚，分别用5％碘酒和75％酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成1mm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂（体积分数为2.5%的胰蛋白酶）150μl/胚，于37℃水浴中消化2min。立即将细胞悬液以5000r/min 4℃离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布过滤，向滤液中加入10％小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于100mL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。

鸭瘟病毒增殖：取刚刚长成致密单层的鸭胚成纤维细胞（DEF），弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入鸭瘟病毒液0.5～1mL覆盖细胞表面进行吸附，37℃吸附120 min 后弃鸭瘟病毒液，然后加含体积分数为3％小牛血清和100IU/mL 双抗的MEM 维持营养液，之后37℃培养。同时做未接毒的DEF对照。

DNA提取方法：直接从感染细胞中提取鸭瘟病毒基因组DNA的具体步骤如下：(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变（CPE）达60％～70％的DEF（100mL细胞瓶）；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500μL的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10min；(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚：氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30～60min；(6)13 000r/min离心20min，沉淀用预冷的70%乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μL RNA酶，37℃作用30min，-20℃保存备用。

 

1.3  PCR 扩增鸭瘟病毒 UL16基因

PCR反应体系为：

轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用。取5μL PCR 产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，设DL2000和空白对照，观察扩增片段的长度。

1.4  UL16基因的pMD18-T 克隆、鉴定与测序

在优化好的PCR条件下用保真PCR Mixture 扩增UL16基因，产物按大连宝生物公司的T克隆试剂盒说明书进行T克隆并送大连宝生物公司测序确认。

将T克隆菌种接种于5ml的LB液体培养基(含Amp 50μg/ml)中，37℃水浴振摇培养过夜，次日提取重组质粒，提取方法按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，抽提的重组质粒命名为pMD18-UL16。然后分别以HindIII／Xho I双酶切消化，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。

酶切体系如下：

2原核表达质粒pET32b-UL16的构建与鉴定

2.1 目的片段的酶切与连接：限制性内切酶HindIII和XhoⅠ分别双酶切pMD18-UL16质粒和原核表达载体pET32b(+).

酶切体系均为：

37℃水浴4 h，按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照下列连接体系16℃连接过夜。

连接体系：

2.2 重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5a感受态细胞。之后取连接液15μL加到含200μL感受态DH5a的离心管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90sec，然后迅速冰浴2min；加入不含Amp的LB液体培养基800μL，37℃振摇（150r/min）培养1～1.5 h；取200μL培养物涂布于含100μg/mLAmp的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃培养 12～16h，同时设立空载体转化组（空载体 10μL +感受态DH5a 200μL）、无载体对照组（灭菌超纯水10μL +感受态DH5a 200μL）。

 2.3 重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL的LB液体培养基(含Amp 100μg/mL)中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用HindIII和XhoⅠ双酶切鉴定该重组质粒，1.0％凝胶电泳观察结果；同时利用方法中的引物进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET32b-UL16。

酶切体系如下： 

2.4重组表达质粒pET32b-UL16的诱导表达

重组质粒pET32b-UL16的提取：挑取已鉴定含阳性重组质粒pET32b-UL16的DH5a菌种划线接种于含Amp 100μg/mL的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于5mL LB液体培养基上，剧烈振荡培养10～16h，离心收集菌液，按U1traPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

重组质粒pET32b-UL16转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coli Rossetta(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET32b-UL16转化到表达宿主菌E.coli Rossetta (DE3)中。

重组质粒pET32b-UL16的诱导表达：从上述LB固体培养基（含Amp 1000μg/mL）上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1:50的比例接入5mL LB液体培养基（含Amp 1000μg/mL）中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀=0.6时，分别加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，诱导4h后，收集1mL培养菌液，4℃ 13000r/min 离心2 min，弃上清，沉淀中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

重组质粒pET32b-UL16表达产物的可溶性分析：将诱导表达的100mL菌液和未诱导表达的100mL菌液，分别按以下步骤处理：4℃ 10000r/min 离心5min，菌体沉淀用20mL 20mmol Tris-HCl（pH8.0）悬浮；加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，置-20℃过夜后， 4℃搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（200w，30sec/次，10次），4℃ 10000r/min 离心10min，取上清备用①；沉淀用10mL洗液（10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2% Triton X-100）悬浮，4℃，10000r/min 离心10min后，沉淀再次用10mL 洗液悬浮，重复洗6次后，用适量尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。并将染好色的凝胶经全自动凝胶成像分析系统扫描和Quantity One软件分析诱导菌液中重组蛋白在胞浆（上清①，可溶性）和沉淀中(沉淀②，包涵体形式)的相对百分含量。

2.5重组质粒pET32b-UL16诱导条件的优化

诱导剂IPTG的浓度优化：取含重组质粒pET32b-UL16的表达宿主菌Rossetta(DE3)，接种5mL LB液体培养基（含Amp 1000μg/mL）中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于5mL LB液体培养基（含Amp 1000μg/mL）中，37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.6时，取其中6只试管，分别加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L 37℃诱导培养4h后，按2.4方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

温度条件优化：取含重组质粒pET32b-UL16的表达宿主菌Rossetta (DE3)，接种5mL LB液体培养基（含Amp 1000μg/mL）中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于5mL LB液体培养基（含Amp 1000μg/mL）中，37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.6时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，分别置于25℃、30℃、37℃诱导培养4h，按2.4方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

诱导时间优化：取含重组质粒pET32b-UL16的表达宿主菌Rossetta (DE3)，接种5mL LB液体培养基（含Amp 1000μg/mL）上，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于5mL LB液体培养基（含Amp 1000μg/mL）上，继续培养至OD₆₀₀值约0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L ,37℃诱导培养，分别于诱导后0、2、4、6、8h，吸取1mL培养液，按2.4方法对样品进行处理，12%SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.6重组UL16蛋白的大量制备、复性与纯化

重组UL16蛋白的大量制备：

（1）将含pET32b-UL16 质粒的表达菌E.coli Rossetta (DE3)接种于200mL LB液体培养基（含Amp 1000μg/mL）中，37℃培养16h，作为种子菌；（2）向大三角瓶中注入1L的LB液体培养基，密封后121℃灭菌30min，之后待液体冷却至37℃；（3）向培养基中加入终浓度为1000μg/mL Amp和50mL种子菌（5% v/v）；（4）在200r/min, 37℃, pH 7.0, 和 50%溶氧量的条件下培养, 待培养至菌液OD₆₀₀=0.6 左右时，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，37℃诱导培养6h；（5）收集菌液8000 r/min离心10 min 后收集菌体沉淀，用适量Tris–HCl（20mmol/L，pH 8.0)重悬后，按1mg/mL加溶菌酶，-20℃保存备用。

重组ULL16蛋白的纯化与复性：

取出-20℃保存的菌体沉淀，室温下融化后，4℃搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（200w，30sec/次，5～10次），4℃ 10000r/min 离心10min。将沉淀用20mL洗液（10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2% Triton X-100）悬浮，4℃ 10000r/min 离心10min后，沉淀再次用20mL 洗液悬浮，重复洗涤6次后，用适量尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉淀，4℃保存备用。

UL16基因表达蛋白亲和层析：

用平衡缓冲液Ⅰ约5个床体积平衡层析柱，流速为1mL/min；将0.45μm滤膜过滤的可溶性包涵体样品约5mL，加入层析柱中，流速为0.5mL/min；用平衡缓冲液Ⅱ再洗2-5个床体积，流速为1mL/min；分别用含50、300、500mmol咪唑的洗脱缓冲液Ⅲ进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各梯度的洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；用超纯水洗5个柱床体积，再用25%的乙醇洗3个柱床体积，流速为1mL/min，回收镍琼脂糖凝胶柱，于4℃中保存。

UL16基因表达蛋白纯化后的复性：

将纯化得到的重组UL16蛋白分多次加入到复性缓冲液（50mM Tris-HCl pH 8.0+0.15M NaCl+1mM EDTA+1mM GSSG+10mM GSSH）中,使尿素浓度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0.1~1mg/ml的范围内。4℃复性24~48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋4℃透析（透析缓冲液：50mM Tris-HCl pH 8.0+50mM NaCl+0.5mM EDTA+10%甘油+1%甘氨酸）24~48h。透析后样品经8000g离心15min后收集上清，取其中20μl进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩保存于－20℃备用。

重组ULL16蛋白的反应原性检测：

取复性纯化好的重组UL16蛋白20μL进行SDS-PAGE分析，并以纯化的兔抗DPV IgG为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Western blotting检测。再重复大量表达两次并分别纯化UL16重组蛋白，共得到2批不同表达和纯化的UL16重组蛋白。

 

三 实验结果

1 鸭瘟病毒 UL16基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

1.1鸭瘟病毒UL16基因的PCR扩增结果

以鸭瘟病毒CHv毒株基因组DNA为模板对UL16基因进行PCR扩增，其产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约1098 bp的特异性DNA条带，与预期结果一致（图1）。

1.2鸭瘟病毒UL16基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD18-UL16。对pMD18-UL16进行PCR、酶切（图2）和测序鉴定，结果表明，T克隆获得的UL16基因序列同已知的DPV UL16基因序列完全一致。

2 原核表达质粒pET32b-UL16的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

2.1重组表达质粒pET32b-UL16的构建与鉴定

以HindIII和XhoI双酶切T克隆质粒后回收目的片断，与经相同酶切的pET-32b（+）表达载体连接，转化DH5α，得到重组表达质粒pET32b-UL16（理论大小约为6169bp），用1.1的引物按1.3方法PCR检测为阳性，经HindIII和XhoI双酶切后得到的两条片断的大小分别约为5370 bp和1098 bp，与理论值相符，表明原核表达载体被成功构建（见图3）。

2.2重组质粒pET32b-UL16的诱导表达

重组质粒pET32b-UL16的诱导表达：

将重组质粒pET32b-UL16转化表达菌株Rossetta (DE3)在含Amp的LB琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒pET32b-UL16的表达宿主菌Rossetta（DE3）用IPTG进行诱导表达、未用IPTG诱导、空载体pET-32a（+）转化菌株诱导表达，结果表明：空载体pET-32a（+）转化菌株诱导和未诱导菌株都未出现特异性蛋白条带；而含重组表达质粒pET32b-UL16的菌株出现特异性蛋白条带，表达的重组UL16蛋白在60KD处（图4）。

重组质粒pET32b-UL16表达产物的可溶性分析:

诱导表达的100mL菌液经可溶性分析处理后，电泳结果显示：表达蛋白主要存在于沉淀中，说明重组表达蛋白在菌体中大量以不溶的包涵体形式存在（图4）。

2.3重组质粒pET32b-UL16诱导表达条件的优化

IPTG浓度的优化：在37℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L诱导培养4h，结果显示：未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量没有明显差别（图5）。但是比较而言，IPTG浓度为0.2 mmol/L时，蛋白表达量略高。因此，可选择0.2 mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

诱导温度条件的优化：37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.6时，取3只灭菌试管，分装5mL/管，分别加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，分别置于25℃、30℃、37℃诱导培养4h，结果：温度在25℃时，诱导蛋白量较少，37℃时最高（图6），说明随着温度升高，蛋白诱导量逐渐增加。因此，选择温度37℃为最佳诱导温度。

诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.2 mmol/L，37℃条件下，采用0～8 h不同诱导时间进行诱导表达，结果随着时间的增加诱导产生的重组蛋白表量先升高再降低。其诱导6 h的重组蛋白表达量最大（图7）。因此，选择6 h作为最佳诱导时间。

2.4重组UL16蛋白的纯化结果

通过大量扩大培养，收集到了大量含有重组UL16蛋白的菌体沉淀，经溶菌酶裂解、超声破碎、洗涤和溶解包涵体、变性蛋白透析复性等过程获得了大量纯化的重组UL16蛋白，通过SDS-PAGE 分析显示纯化的重组UL16蛋白具有较高的纯度（图8），Western blotting 分析显示该重组UL16蛋白能与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应（图9），表明该重组UL16蛋白与DPV血清具有较高的反应原性，可作为临床上检测鸭瘟抗体的检测抗原，即抗体捕获剂，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

实施例2 用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒

固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中固相载体的材料很多，如聚苯乙烯，其必须满足具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，可制成各种形式。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。

抗体捕获剂：由于鸭瘟病毒的全病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想，阻碍了鸭瘟病毒的全病毒作为抗体捕获剂作为包被全病毒的ELISA方法（DPV-ELISA）的大规模应用。本发明中采用的抗体捕获剂为实施例1制备的重组UL16蛋白。

酶标二抗：本发明中采用的酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)，也可采用其他非鸭动物的抗鸭IgG-HRP，除了以辣根过氧化酶标记，也可以采用其他酶标记，如磷酸酯酶。

底物：底物可选用四甲基联苯胺（TMB），邻苯二胺，2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS）及其他HRP有色结合物作为底物。当采用其他酶标记是，可采用与其有色结合物作为底物。

封闭液：封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是体积分数为0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂。

 

实施例3 运用ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法

一  材料

上述实施例获得的纯化后的重组UL16蛋白，抗DPV（鸭瘟病毒）、DHBV（鸭乙肝病毒）、DHV（鸭肝炎病毒）、RA（鸭里默氏杆菌）、Salmonella（鸭沙门氏菌）、DSHDV（鸭肿头出血症病毒）、H5N1（流感病毒）和E.coli（鸭大肠杆菌）阳性鸭血清及抗DPV鸭阴性血清，由四川农业大学禽病研究中心提供；羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)和四甲基联苯胺（TMB）均购自美国KPL公司，羊抗鸭IgG-HRP的为冻干剂，分装为0.1mg/瓶，使用时按说明书溶解为1ml；牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma公司产品。

二 实验方法

1  鸭瘟病毒UL16-ELISA法检测DPV抗体方法的建立

1.1重组鸭瘟病毒UL16蛋白最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定

采用方阵方法确定最佳抗原包被浓度和血清稀释浓度，用包被液对浓度为0.1mg/mL的复性后的重组鸭瘟病毒UL16蛋白进行系列体积稀释（1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1：640、1：1280），包被酶标反应板，每孔包被100μl，将鸭血清（抗DPV阳性血清或阴性血清）按1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320的稀释度进行系列稀释，羊抗鸭IgG-HRP作1：5000稀释，用间接ELISA方法测定，选择阳性血清的OD_450nm值接近1.0，阴性血清的OD_450nm值较小，P/N值最大的UL16蛋白和鸭血清的稀释度为此ELISA的抗原抗体反应的最适工作浓度，同时做BSA/PBS空白对照。

重组鸭瘟病毒UL16白抗原用包被液作系列稀释后，再加1:10-1:320稀释的阳性血清或阴性血清；另加1:5000稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，加四甲基联苯胺（TMB），用全自动酶标仪测定OD_450nm值。纯化抗原包被浓度在10μg /ml~0.078μg /ml之间时，阳性血清的稀释度为1:10-1:320时，不同稀释度的抗体的OD_450nm值见表1。当P/N值最大为12.368的时候，由方阵滴定所得的最佳抗原包被浓度为1.25μg/ml时，阳性血清的稀释度为1:160。各抗原抗体浓度对应的P/N值见表2。

2.1.2酶标二抗最佳稀释度的确定

把纯化的重组鸭瘟病毒UL16蛋白抗原按1.25μg /ml的浓度包被于ELISA反应板，每孔100μl，再加1:160稀释的阳性血清或阴性血清。之后将羊抗鸭IgG-HRP作1:2500、1:5000、1:10000、1:20000 系列体积稀释后进行捕获 ELISA 测定，同时空白对照，选择 P/N值最大时羊抗鸭IgG-HRP浓度作为最适工作浓度。本实施例中的稀释均按照体积比进行稀释。

固相载体酶标板用包被浓度为1.25μg /ml的重组鸭瘟病毒UL16蛋白抗原包被，血清做1:160稀释，酶标抗体做系列稀释，进行间接ELISA检测。当酶标二抗羊抗鸭IgG-HRP的稀释度在1:10000，检测血清浓度1:160时，P/N值最大；因此选择的最佳二抗稀释度为1:10000，见表3。

2  UL16-ELISA阴阳性临界值的确定及重组鸭瘟病毒UL16-ELISA方法的检测程序

取非免疫鸭阴性血清24份，每个样本平行包被1次。对重组鸭瘟病毒UL16蛋白包被浓度、待检血清和羊抗鸭IgG-HRP最佳稀释度进行间接ELISA测定,以确定鸭血清在无DPV感染时其吸收值范围。同时以BSA/PBS溶液作空白对照。将24份血清样品的OD_450nm值的平均值（X）和3倍标准方差(SD)之和作为阴性血清的上限，即待检血清样品的OD_450nm值＞X+3SD时，判断为阳性；否则为阴性。通过对24份DPV阴性血清进行检测(表4)，结果表明，X值为0.442，SD值为0.052，临界值（X+3SD）为0.598。即待测样品的OD值大于0.598为阳性，小于或等于0.598则为阴性。

3  重组鸭瘟病毒UL16-ELISA方法的检测程序

根据上述优化结果，间接ELISA方法的检测程序如下：（1）固相抗原的制备：将重组UL16蛋白以1.25μg /ml浓度包被于酶标板中，l00μl/孔，置4℃湿盒孵育过夜，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；加入100μl/孔封闭液，37℃湿盒封闭1h，洗板机洗涤1次，5min/次，拍干；（2）一抗结合：将待检血清按1:160的体积稀释度稀释后加入酶标板，100μl/，37℃湿盒孵育1h，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；（3）二抗结合：以酶标二抗稀释液将酶标二抗（羊抗鸭IgG-HRP）以1:10000的体积稀释度稀释后加入，l00μl/孔，37℃反应1h，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；（4）显色：加入TMB底物（色原底物四甲基联苯胺）100μl/孔，25℃避光显色30min后，加入50μl/孔2mol/L硫酸终止反应；（5）检测并判断：用酶标仪测OD_450nm值，当酶标仪测OD_450nm值, OD_450nm值大于0.598为阳性，小于或等于0.598则为阴性。同时以BSA/PBS溶液作平行空白对照。

三 结果

1 敏感性实验

将重组鸭瘟病毒UL16蛋白按最佳包被浓度进行包被,将抗DPV鸭阳性血清做1:320、1:640、1:1280、1:2560、1:5120、1:10240、1:20480，1:40960 共8个稀释梯度，其余条件按本实施例条件进行UL16-ELISA试验，结果如表5所示。当阳性血清稀释到1:250时，通过肉眼观察颜色变化难以判断阴性、阳性结果，但通过酶标仪仍然可以检出，按1:5120稀释的阳性血清检测结果高于临界值0.598，表明此方法能够检出1:5120倍稀释的抗DPV阳性血清，具有较强的敏感性。

2重复性实验

将重组鸭瘟病毒UL16蛋白按最佳包被浓度进行包被,取3份已知阳性血清，按最佳稀释度稀释，加到抗原包被孔中，每份8孔，作ELISA测定，由每份血清的OD值计算出平均OD 值与标准差（SD），进而计算出每份血清的批内变异系数，结果如表6所示。收获的另一批重组UL16蛋白按最佳包被浓度进行包被,取3份已知阳性血清，按最佳稀释度稀释，加到抗原包被孔中，每份8孔，作ELISA测定，由每份血清的OD值计算出平均OD 值与标准差（SD），进而计算出每份血清的批间变异系数，结果如表7所示。

变异系数都小于10％，同一样品在同一批试验中变异程度很小，同一样品在不同批次抗原试验中变异程度也小，建立的UL16-ELISA方法检测DRV抗体具有很好的重复性。

3 特异性实验

采用确立的ELISA条件，以纯化的UL16蛋白包被ELISA酶标板，分别用DPV、DHBV、DHV、RA、E.coli、Salmonella、DSHDV、H5N1阳性血清各两份进行UL16-ELISA特异性试验，结果如表8所示。根据临界值判定标准，2份DPV阳性血清OD_450nm为0.993、0.93，均远大于0.598，判为阳性，其余各病毒病或细菌病，鸭血清OD_450nm值均小于临界值，则均为阴性，表明建立的检测DPV抗体的UL16-ELISA法具有很好的特异性。

2.4.4阻断性试验

将DPV阳性血清按最佳稀释度稀释，加入等量最佳稀释度的表达蛋白UL16，37℃作用1h后，作为一抗血清按确立的ELISA条件进行间接ELISA，用DPV阳性血清同时设对照组，比较结果。计算（N-P）/N=（阻断前OD_450nm值-阻断后OD_450nm值）/阻断前OD_450nm值，若此值大于0.5，则判为阻断阳性，否则为阴性。结果表明，鸭瘟病毒UL16蛋白抗原阻断的阳性血清OD_450nm值比未被阻断的对照阳性血清明显低，阻断后三份阳性OD450nm值平均分别为0.613、0.532、0.385，对照未阻断阳性血清的OD_450nm值平均分别为1.815、1.375、1.700。此时表达蛋白的（N-P）/N值也分别为0.662、0.613、0.774，均大于0.5，判为阻断阳性，说明表达蛋白UL16抗原可以阻断阳性血清，结果见表9。

在ELISA方法检测过程中，抗原包被浓度对试验结果影响较大，若抗原包被浓度高，由于抗原蛋白分子之间作用力较大而造成蛋白分子的多层化（stacking efect），容易被洗涤，非特异性增加，若浓度太低，酶标板表面可能留下未吸附抗原但完全封闭的活性表面，非特异性也会增加，因此必须对包被蛋白抗原浓度的进行筛选。此外，抗体的纯度直接关系到ELISA试验的特异性和敏感性，纯度不高的抗体常常会有超量的与特异性抗原结合的宿主细胞高分子化合物，可与抗原竞争有限的载体表面位置而减少有效的吸附率，因此高纯度的抗体蛋白可以提高反应特异性，但间接ELISA方法通常检测血清中的抗体，血清成分复杂，生产中通常不逐一对被检血清进行纯化，只有通过摸索适当的血清稀释倍数，才能减少非特异结合。本实验方阵法确定血清（一抗）的最佳稀释倍数，从结果来看，虽血清稀释倍数从1:10至1:320，但血清浓度降低，OD_450nm值变小，根据OD_450nm值接近1.0，P/N最大来判定抗原抗体的最佳稀释度。因此确定的最佳抗原包被浓度为1.25μg/ml,血清的稀释倍数为1:160。

酶标二抗浓度的高低对试验结果也有较大的影响，浓度太高，非特异性结合的机会增多，可能出现假阳性，浓度太低，没有有效结合，则可能出现假阴性等现象。本实验在优化好的ELISA条件下进行间接ELISA来确定酶标二抗的最佳稀释倍数。根据OD_450nm值接近1.0，P/N最大来判定最佳稀释度，确定出酶标二抗的最佳稀释倍数为1:10000。封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，抗原包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。最常用的封闭剂是1%牛血清白蛋白，也有用5%脱脂奶粉明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。本实施例中选用BSA作封闭液，其成分单一，封闭效果较好。

在ELISA判定标准中，常用两种方法，一种是用测定样本的原始OD_450nm值和标准方差来确定临界值。另一种是计算待测样品相对于阴性对照的比值，通过测定大量样本效价的频次分布来确定临界值和可疑区间。本研究在确定阴阳性判定标准时，采用了第一种判定标准。根据大量的阴性样品的OD_450nm值，采用统计学方法确定阴阳临界值。依据的原理是样本的OD_450nm值>阴性样本OD_450nm值的平均值(X)+3SD时，可以在99.9％ 的水平上判为阳性，根据统计学原则，大量实验证实了该判断标准是可靠的。此外，Alonso 等报道利用大肠杆菌表达的蛋白作为包被抗原检测田间猪血清时，可能存在宿主蛋白干扰的问题，即猪血清中存在的大肠杆菌抗体有可能与表达蛋白中残存的宿主蛋白发生非特异性反应。因此，在建立UL16-ELISA方法的过程中，选择了鸭源的E.coli阳性血清做特异性实验，结果表明该UL16-ELISA方法与E.coli血清无交叉反应性，特异性好。同时又分别用DPV、DHBV、DHV、RA、E.coli、Salmonella、DSHDV、H5N1阳性血清做特异性试验，结果都证实了建立的UL16-ELISA具有良好的特异性和敏感性，显示了良好的应用前景，也为进一步组装成试剂盒奠定了基础。

本发明提供的UL16基因原核表达抗原，是利用基因过程技术对鸭瘟病毒UL16基因进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET32b(+)（一种带有6个组氨酸标签的融合表达载体）连接，转化至大肠杆菌Rossetta表达系统进行诱导表达和表达条件的优化。该蛋白的表达形式是His-UL16融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量大约为60kDa，将产品设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。原核表达系统表达的产品经Western blot鉴定后表明具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。原核表达系统表达的产品为包被抗原建立的UL16－ELISA法检测DPV抗体方法具有很强的特异性强、很好的重复性和很高的敏感性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

<110>  四川农业大学

<120>  用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒及抗体检测方法

<160>  3

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物UL16 F

<400>  1

aagcttatgg ctcgcagtac tatta             25      

 

<210>  2

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  引物UL16 R

<400>  2

ctcgaggaca gtatattatg ttttgg           26

<210>  3

<211>  1089

<212>  DNA

<213>  鸭

<220> 

<223>  鸭瘟病毒UL16

<400>  3

atggctcgca gtactattac acgtcgatta tcatcatgta cggaactcga cgatggagaa      60

ctgaattcgc caatattatt tttaaatgac ccgtctctcg gtagtgttca cctagctcgg     120

gcattgaaca cacaagtgtg ttcatggcgc cttattagat ctgattctcg tatcaagatc     180

atgatcgcaa ttacagcact cggggaccgt ctttgtgctt tcgcgcctcc actagaagat     240

cgagaaaggg cggcaatggt ggaaataata ttgtacttaa cgcgtcctaa agcgttagct     300

ctcccatctg gaactttcca tgccgtgttt attgtcaacc gttcatcaat gtatgctgca     360

atagcagcta tacatatcga agcactaaac caatctggaa ccctgttctc attattgttt     420

tcctcagtag aaacgacccc gccgcctccg gaagttcctg acccgtcgac agaaattatg     480

ccgcaggccc ctgcttcaat cctaaatcta gaagaccata cggaaaatat aacgccgcca     540

agggatcctc ataactgtag aatggtatct gttggggcgt ggtggtcttt tcccaaacga     600

aggctctact atttacgaat ggatacacca cttttagcta tatgcccggc gggatggaaa     660

gcaagaacgc ttggagacgt tctagcgaga ctcgtagacc atacaccagg ttgcgagacc     720

tgcattagcg gccacgatca cgtggattcg tataatgcca tatggaagcc tggcgaagtc     780

gcagaggcat gtttatgtaa aggaccatgc ctgtggctca aatcaaaaca gcgggatatg     840

atagtagaag gggatgtgag tatgtgtcgc gttttgttca tggacgctgt agatactata     900

cgacttgtat ctaaccgtaa tccacgtatt tctgcaaatt tggccgaagt aatttccgcc     960

tttggttcag ccagacaagt acctgtcaat gcggccggat ggcacttggt ggcgttatcg    1020

gaaattgcta gttcgatcat gatatctggt tgcgcgcgtc ttagacgtct atgttatccc    1080

aaaacataa                                                                       1089

   

 

Claims (10)

1.用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述ELISA试剂盒包括固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液，所述抗体捕获剂为重组鸭瘟病毒UL16蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述重组鸭瘟病毒UL16蛋白的浓度为大于或等于1.25μg/ml。

3.根据权利要求1所述的用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗作10000倍体积稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG。

4.根据权利要求1所述的用于检测鸭瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述抗体捕获剂与所述酶标二抗的加入量为等体积。

5.用权利要求1-4任一项所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于，具体步骤为：

a 固相抗原的制备：将抗体捕获剂与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

b 一抗结合：将待检标本通过保温反应使与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

c 二抗结合：将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原—抗体—二抗复合物；

d 显色：在步骤c所得抗原—抗体—二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

e 检测并判定：将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD_450nm值, 判断结果。

6.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于，步骤B中所述待测标本为作160倍体积稀释的血清。

7.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于，步骤e中,将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD_450nm值, 所述OD_450nm值＞0.598为阳性，所述OD_450nm≤0.598则为阴性。

8.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于：所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。

9.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于：步骤a中所述重抗体捕获剂、步骤b中所述待检标本及步骤c中所述酶标二抗的加入量为等体积。

10.根据权利要求5所述的ELISA试剂盒检测鸭瘟病毒抗体的方法，其特征在于：步骤a中所述重组鸭瘟病毒UL16蛋白液、步骤b中所述待测标本及步骤c中所述酶标二抗加入量为100μL。

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