CN102004150B - 基于重组ul51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物医学领域，特别涉及用于检测鸭瘟病毒抗体的方法，具体包括固相抗原的制备、一抗结合、二抗结合、显色及检测并判定等步骤，本方法是基于纯化的重组UL51蛋白建立的间接ELISA法，其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭大肠杆菌(E.coli)的阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法的批内或批间重复试验显示变异系数均小于10％，能检出经1∶3200倍稀释的DPV疫苗免疫鸭阳性血清。

Description

基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法

技术领域

本发明涉及动物医学领域，特别涉及基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法。

背景技术

鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病，在世界各养鸭地区都有分布，其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂，而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法主要有中和试验(neutralization test，NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、Dot-ELISA测定法和被动血凝试验。其中经典的方法是血清中和试验，但其敏感性不够理想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点，是DPV感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段；但是，由于DPV全病毒纯化方法的复杂性以及纯度不够理想，阻碍了包被全病毒的ELISA方法(DPV-ELISA)的大规模应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的鸭瘟病毒抗体检测方法，该方法避免了繁琐的病毒纯化步骤，且操作简单，特异性、灵敏性较高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，具体步骤为：

a固相抗原的制备：将包被浓度大于或等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

b一抗结合：将待检血清作体积小于或等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与步骤a所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

c二抗结合：将酶标二抗作体积小于或等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与步骤b所得固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；

d显色：在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物中加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

e检测及结果判定：将步骤d所得显色样品液用酶标仪测定OD_450nm值，当OD_450nm值＞0.216时判为阳性，当OD_450nm≤0.216时判为阴性。

进一步，所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法，其特征在于，具体步骤为：

a固相抗原的制备：将包被浓度等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

b一抗结合：将待检血清作等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

c二抗结合：将酶标二抗作等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；

d显色：在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物加入色原底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

e检测并判定：将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD_450nm值，所述OD_450nm值＞0.216为阳性，所述OD_450nm≤0.216则为阴性；

进一步，步骤a中所述重组UL51蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100μL；

进一步，步骤c中所述酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP；

进一步，步骤a中所述的封闭液为体积百分浓度为1％的牛血清白蛋白溶液；

进一步，步骤d中所述色原底物为四甲基联苯胺；

进一步，步骤d中避光显色的时间为20分钟；

进一步，所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。

本发明的有益效果在于：本发明基于纯化的重组UL51蛋白建立的间接ELISA法，其特异性好，对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)和鸭大肠杆菌(E.coli)的阳性血清进行检测，结果均为阴性；该方法对批内或批间重复试验显示变异系数均小于10％，能检出经1∶3200倍稀释的DPV阳性血清。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1-A为DPV UL51基因的PCR扩增：M指DL2000相对分子质量标准；1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp)；图1-B为重组质粒pMD18-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图1-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III；1指重组表达载体pET28a-UL51，2指重组表达载体pET28a-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。

图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定：M为蛋白质相对分子质量标准；1为阴性对照(未加IPTG诱导)；2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为34KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果：1-7的IPTG浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L；图2-C为不同温度诱导pET28a-UL51表达结果：1-3的温度分别为20、30和37℃；图2-D为不同时间诱导pET28a-UL51表达结果：1-8的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、7和8h。

图3为重组UL51蛋白的检测：(a)SDS-PAGE分析：M为蛋白标准(KD)；1为发酵培养的全菌液；2为包涵体洗涤法纯化的重组UL51蛋白；3为透析复性后的重组UL51蛋白；(b)Western blotting分析：1是以兔抗DPV抗体为一抗检测重组UL51蛋白(约为34KD)。

图4为敏感性试验检测结果。

图5为特异性试验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。本实施例首先对所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET28a-UL51、转化表达菌并发酵培养，收集到大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀，再通过超声波破碎菌体、重组UL51蛋白包涵体冼涤、纯化及梯度透析而获得的；同时，用Westernblotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应；进一步确定了重组UL51蛋白的包被浓度及一抗、二抗的稀释度，从而制备了鸭瘟病毒抗体检测方法。

实施例基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法

一鸭瘟病毒UL51基因的克隆、原核表达及UL51蛋白的纯化

1、材料方法

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.1菌株、质粒和毒株

质粒pMD18-T，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET28a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5a、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和DPV CHv强毒株，由四川农业大学禽病研究中心提供。

1.2试验鸭胚和血清

10日龄鸭胚，其种鸭DPV和抗体均为阴性；兔抗DPV抗体，由四川农业大学禽病研究中心提供。

1.3主要试剂

琼脂糖、2×傻瓜PCRMix、DNA连接酶Mix、限制性内切酶EcoRI和XhoI、UltraPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒和UltraPure^TMDNA回收试剂盒等分子生物学试剂及试剂盒购自大连宝生物公司、北京赛百盛基因技术有限公司、华美生物工程公司和Bio-Rad公司；其它试剂均为分析纯，购自上海生工生物技术有限公司。

2实验方法

2.1DPV UL51基因的克隆

2.1.1引物设计

利用Primer Premier5.0软件，参考UL51基因序列(GenBank登录号：DQ072725)，由宝生物生物技术有限公司合成。引物DPV-UL51F：5’-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3’(划线部分为EcoRI位点)；引物DPV-UL51R：5’-TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3’(划线部分为XhoI位点)。合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。

2.1.2DPV基因组DNA的提取

2.1.2.1DEF的制作方法：取10d日龄健康鸭胚，分别用5％碘酒和75％酒精消毒蛋壳表面。无菌操作条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗净，剪去头、翅、腿和内脏，PBS冲洗后将胚体剪成1mm大小的小块，加PBS适量，之后置于三角瓶内，加细胞分散剂(体积分数为2.5％的胰蛋白酶)150μl/胚，于37℃水浴中消化3min。立即将细胞悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用5层纱布过滤，向滤液中加入10％小牛血清和100IU/mL双抗后，分装于100mL细胞培养瓶中，7mL/瓶，水平静置于37℃细胞培养箱中进行培养。

2.1.2.2DPV增殖：取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细胞表面2次后，加入DPV病毒液2～3mL覆盖细胞表面进行吸附，37℃吸附120min后弃病毒液，然后加含3％小牛血清和100IU/mL双抗的MEM维持营养液，之后37℃培养。同时做未接毒的DEF对照。

2.1.2.3DNA提取方法：直接从感染细胞中提取DPV基因组DNA的具体步骤如下：(1)选取用DPV种毒感染后细胞病变(CPE)达60％～70％的DEF(100mL细胞瓶)；同时选取细胞形态正常的DEF作对照；(2)倾去细胞培养液，加入500μL的细胞裂解液，同时加蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为200μg/mL，轻轻混匀后，37℃孵育10min；(3)将细胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500μL的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心管中；(4)用饱和酚：氯仿及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；(5)加1/10倍体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20℃放置30～60min；(6)13000r/min离心20min，沉淀用预冷的70％乙醇洗涤两次；(7)真空抽干后，溶于适量TE缓冲液中，加入1μL RNA酶，37℃作用30min，-20℃保存备用。

2.1.3PCR扩增DPV UL51基因

PCR反应体系为：

轻轻混匀，2000r/min瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用。取4μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，设DL2000和空白对照，观察扩增片段的长度。

2.1.4UL51基因PCR产物的回收

按北京赛百盛基因技术有限公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA贮存于-20℃保存备用。

2.1.5纯化的UL51基因与pMD18-T的连接

连接反应体系如下：

将上述试剂加入0.2mL的EP管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接过夜。

2.1.6DH5a感受态细胞的制备

采用氯化钙法制备新鲜的DH5a株大肠杆菌感受态细胞，简述如下：(1)无菌挑取平板上新鲜培养的DH5a单克隆菌落接种于5mL LB培养液中，于37℃振荡培养过夜；(2)取1mL上述培养液接种于100mL LB培养液中，37℃200r/min振荡培养2.5～3h，使OD₆₀₀＝0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴10min；(4)于4℃4000r/min离心8min，弃上清；(5)加10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂，温和悬起细菌沉淀，冰浴30min；(6)于4℃4000r/min离心8min，弃上清，加4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为200μL/管，直接用于转化或置于-70℃冰箱中保存备用。

2.1.7转化感受态细胞

将10μL连接体系全部取出加到200μL DH5a感受态细胞中，冰浴30min；再置于42℃温浴90s，之后再冰浴2min；然后立即加入0.8mL LB培养基，37℃水浴振荡培养45min，取200μL涂于含(X-gal/IPTG/Kan)的培养基上，置37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌落接种于5mL LB(含50μg/mL Kan)中，37℃水浴振荡培养18h后进行质粒抽提。

2.1.8质粒的抽提

按北京赛百盛基因技术有限公司质粒抽提试剂盒说明书进行，回收产物贮存于-20℃保存备用。

2.1.9重组质粒的PCR和酶切鉴定

将上一步抽提的重组质粒命名为pMD18-UL51，分别以EcoR I/XhoI双酶切消化与XhoI单酶切消化，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因。

2.1.10UL51基因序列测定

将鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。

2.2原核表达质粒pET28a-UL51的构建、诱导表达与表达条件优化

2.2.1原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定

2.2.1.1目的片段的酶切与连接：限制性内切酶EcoR I和Xho I分别双酶切pMD18-UL51质粒和原核表达载体pET28a(+)，酶切体系均为：

37℃水浴4h，按DNA回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照下列连接体系16℃连接过夜。

2.2.1.2重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5a感受态细胞。之后，取连接液15μL加到含200μL感受态DH5a的离心管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90sec，然后迅速冰浴2min；加入不含Kan的LB液体培养基800μL，37℃振摇(150r/min)培养1～1.5h；取200μL培养物涂布于含100μg/mL Kan的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃培养12～16h，同时设立空载体转化组(空载体10μL+感受态DH5a 200μL)、无载体对照组(灭菌超纯水10μL+感受态DH5a 200μL)。

2.2.1.3重组质粒的酶切和PCR鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL的LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用Xho I单酶切、EcoR I和Xho I双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如下：

然后，以上述重组质粒为模板，利用方法2.1.1中的引物进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测。经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET28a-UL51。

2.2.2重组表达质粒pET28a-UL51的诱导表达

2.2.2.1重组质粒pET28a-UL51的提取：挑取2.2.1.3已鉴定含阳性重组质粒pET28a-UL51的DH5a菌种划线接种于含Kan 50g/mL的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于5mL LB液体培养基上，剧烈振荡培养10～16h，离心收集菌液，按UltraPure^TM质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

2.2.2.2重组质粒pET28a-UL51转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coli BL(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET28a-UL51转化到表达宿主菌E.coli BL(DE3)中，方法同2.2.1.2。

2.2.2.3重组质粒pET28a-UL51的诱导表达：从上述LB固体培养基(含Kan 50μg/mL)上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1∶50的比例接入5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀＝0.4时，分别加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，诱导3h后，收集1mL培养菌液，4℃13000r/min离心2min，弃上清，沉淀中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

2.2.2.4重组质粒pET28a-UL51表达产物的可溶性分析：将诱导表达的100mL菌液和未诱导表达的100mL菌液，分别按下步骤处理：4℃，10000r/min离心5min，菌体沉淀用20mL20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮；置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w，30sec/次，10次)，4℃，10000r/min离心10min，取上清备用①；沉淀用10mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)悬浮，4℃，10000r/min离心10min后，沉淀再次用10mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入80μL超纯水和20μL 5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性5～10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。并将染好色的凝胶经全自动凝胶成像分析系统扫描和Quantity One软件分析诱导菌液中重组蛋白在胞浆(上清①，可溶性)和沉淀中(沉淀②，包涵体形式)的相对百分含量。

2.2.3重组质粒pET28a-UL51诱导条件的优化

2.2.3.1诱导剂IPTG的浓度优化：按2.2.2.3方法，取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取其中7只试管，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L 37℃诱导培养4h后，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.2.3.2温度条件优化：按上述方法，取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)中，37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，分别置于20℃、30℃、37℃诱导培养4h，按2.2.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.2.3.3诱导时间优化：取含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)，接种5mLLB液体培养基(含Kan 50μg/mL)上，37℃振摇培养过夜。次日按1∶50转接种于5mL LB液体培养基(含Kan 50μg/mL)上，继续培养至OD₆₀₀值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导培养，分别于诱导后0、1、2、3、4、5、6、7、8h，吸取1mL培养液，按2.2.2.3方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.3重组UL51蛋白的大量制备、纯化与复性

2.3.1菌体的发酵培养

发酵的具体步骤为：(1)将含pET28a-UL51质粒的表达菌E.coli BL21(DE3)接种于200mLLB液体培养基(含50μg/mL Kan)中，37℃培养16h，作为种子菌；(2)向发酵罐中注入10L的LB液体培养基，密封后115℃灭菌30min，之后待液体冷却至37℃；(3)从加样孔处向发酵罐中加入终浓度为50μg/mL Kan、1mL消泡剂和200mL种子菌(2％v/v)；(4)在640r/min，37℃，pH 7.0，和50％溶氧量的条件下培养，待培养至菌液OD₆₀₀＝0.6左右时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导培养3h；(5)收集培养好的菌液(约10L)，取其中1mL进行SDS-PAGE分析，其余的菌液8,000r/min离心10min后收集菌体沉淀，用适量TrisHCl(20mmol/L，pH 8.0)重悬后，-20℃保存备用。

2.3.2重组ULL51蛋白的包涵体洗涤法大量纯化

取出-20℃保存的菌体沉淀，室温下融化后，按1mg/mL加溶菌酶，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃，10000r/min离心10min。将沉淀用20mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)悬浮，4℃，10000r/min离心10min后，沉淀再次用20mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液(10mmol/LPBS+8mol/L尿素)溶解沉淀，4℃保存备用。

2.3.3重组UL51蛋白的复性和检测

将包涵体洗涤纯化得到的重组UL51蛋白，于4℃在不同浓度的尿素溶液(6、4、3、2、1、0mol/L)中梯度透析，使变性蛋白逐渐复性，收集透析好的蛋白液，取其中20μL进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Westernblotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，稀释成2mg/mL，分装后备用。

再重复发酵两次并分别纯化UL51重组蛋白，共得到3批不同发酵和纯化的UL51重组蛋白。

3实验结果

3.1DPV UL51基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

3.1.1UL51基因的PCR扩增结果

以DPV CHv毒株基因组DNA为模板对UL51基因进行PCR扩增，其产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约760bp的特异性DNA条带，而以正常DEF基因组DNA为模板进行PCR扩增，无特异性条带，这与预期结果一致(图1-A)。

3.1.2UL51基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD18-T载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD18-UL51。对pMD18-UL51进行PCR、酶切(图1-B)和测序鉴定，结果表明，T克隆获得的UL51基因序列同已知的DPV UL51基因序列完全一致。

3.2原核表达质粒pET28a-UL51的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

3.2.1重组表达质粒pET28a-UL51的构建与酶切鉴定

以EcoR I和Xho I双酶切T克隆质粒后回收目的片断，与经相同酶切的pET-28a(+)表达载体连接，转化DH5α，得到重组表达质粒pET28a-UL51(理论大小约为6130bp)，经EcoRI和Xho I双酶切后得到的两条片断的大小分别约为5370bp和760bp(见图1-C)，与理论值相符，表明原核表达载体被成功构建。

3.2.2重组质粒pET28a-UL51的诱导表达

3.2.2.1重组质粒pET28a-UL51的诱导表达：将重组质粒pET28a-UL51转化表达菌株BL21(DE 3)，在含Kan的LB琼脂平板上筛选到了白色菌落。将含重组质粒pET28a-UL51的表达宿主菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达、未用IPTG诱导、空载体pET-28a(+)转化菌株诱导表达，结果表明：空载体pET-28a(+)转化菌株诱导和未诱导菌株都未出现特异性蛋白条带；重组表达质粒pET28a-UL51表达的重组UL51蛋白在34KD处(图2-A)。

3.2.2.2重组质粒pET28a-UL51表达产物的可溶性分析：诱导表达的100mL菌液经可溶性分析处理后，电泳结果显示：表达蛋白主要存在于沉淀中，说明重组表达蛋白在菌体中大量以不溶的包涵体形式存在。同时Quantity One软件分析显示：诱导菌液中重组蛋白在胞浆上清(可溶性)和沉淀中(包涵体形式)的相对百分含量分别为6.72％和93.28％。

3.2.3重组质粒pET28a-UL51诱导表达条件的优化

3.2.3.1 IPTG浓度的优化：在37℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L诱导培养4h，结果显示：未加诱导剂的对照管无特异性蛋白条带；随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量逐渐增加，当增加到0.8mmol/L蛋白表达量达到最大；其后再增大IPTG浓度到1.0mmol/和1.2mmol/L时，其蛋白表达量与0.8mmol/L时没有明显差别(图2-B)。因此，可选择0.8mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

3.2.3.2诱导温度条件的优化：37℃培养培养至OD₆₀₀值约0.4时，取3只灭菌试管，分装5mL/管，分别加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，分别置于20℃、30℃、37℃诱导培养4h，结果：温度在20℃时，诱导蛋白量较少，37℃时最高(图2-C)，说明随着温度升高，蛋白诱导量逐渐增加。因此，选择温度37℃为最佳诱导温度。

3.2.3.3诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.8mmol/L，37℃条件下，采用1～8h不同诱导时间进行诱导表达，结果1h时几乎无特异的蛋白条带产生；诱导1～3h的重组蛋白表达量均低于4h诱导组；诱导5～8h，其重组蛋白表达量同4h相比无明显变化(图2-D)。因此，选择4h作为最佳诱导时间。

3.3重组UL51蛋白的纯化结果

通过发酵培养，收集到了大量含有重组UL51蛋白的菌体沉淀，经溶菌酶裂解、超声破碎、洗涤和溶解包涵体、变性蛋白透析复性等过程获得了大量纯化的重组UL51蛋白，通过SDS-PAGE分析显示纯化的重组UL51蛋白具有较高的纯度(图3-a)，Western blotting分析显示该重组UL51蛋白能与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应(图3-b)，表明该重组蛋白可作为U151-ELISA法检测DPV抗体的包被原。

二、UL51-ELISA法检测DPV抗体方法的建立和应用

1UL51-ELISA法检测DPV抗体方法的建立

上述实施例获得的重组UL51蛋白，抗DPV鸭血清(为弱毒疫苗免疫后14d的免疫鸭血清，中和效价为1∶8)，抗DHV、RA和E.coli鸭血清及非免疫鸭阴性血清，由四川农业大学禽病研究中心提供；羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG)和四甲基联苯胺(TMB)均购自美国KPL公司；牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司产品。

1.1重组UL51蛋白包被浓度的确定

用包被液对浓度为2mg/mL的复性后的重组UL51蛋白进行系列稀释(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320)，包被酶标反应板，每孔包被100μL，每个滴度平行包被两列，将鸭血清(抗DPV阳性血清或非免疫鸭阴性血清)分别做1∶100稀释，羊抗鸭IgG-HRP作1∶2000稀释，用间接ELISA方法测定，以能产生OD_450nm(P或N)值为1.0左右，且P/N值也较大的抗原稀释度为最佳稀释度。

重组UL51蛋白抗原用包被液作系列稀释后，再加1∶100稀释的阳性血清或阴性血清；另加1∶2000稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，加底物显色液，用全自动酶标仪测定OD_450nm值。纯化抗原包被浓度在20.0μg/100μL～0.625μg/100μL之间时，阳性血清的平均OD_450nm值为1.2，相应的阴性血清的平均OD_450nm值为0.152；抗原包被浓度为2.5μg/100μL时，阳性血清的OD₄₅₀值为1.197，阴性血清的OD_450nm值为0.145；P/N值为8.26。各包被浓度的P/N值均大大地大于2.1，为尽可能减少非特异性、节约抗原，选择P/N值最大的1∶80倍稀释(2.5μg/100μL)作为包被酶标板的工作浓度(见表1)。

表1抗原最佳浓度的确定

1.2待检血清和酶标二抗最佳稀释度的确定

把纯化的重组UL51蛋白抗原按2.5μg/100μL浓度包被于ELISA反应板，每孔100μL，之后采用方阵方法确定待检血清和酶标二抗的最佳稀释度。把鸭血清(抗DPV阳性血清或非免疫鸭阴性血清)按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400的稀释度进行系列稀释，作酶标二抗的羊抗鸭IgG-HRP按1∶1000、1∶2000、1∶4000的稀释度进行系列稀释后，依次加入反应孔中，用间接ELISA方法测定，选择阳性血清的OD_450nm值接近1.0，阴性血清的OD_450nm值较小，P/N值最大的鸭血清和酶标二抗的稀释度为最适工作浓度。本实施例中的稀释均按照体积比进行稀释。

酶标板用包被浓度为2.5μg/100μL的重组UL51蛋白抗原包被，血清和酶标抗体做系列稀释，进行间接ELISA检测，结果如表2所示：各待检血清和酶标二抗浓度下的P/N值均大大地大于2.1。当酶标抗体的稀释度为1∶1000，检测血清的稀释度为1∶200时，阳性血清OD_450nm值为1.578，相应的阴性血清的OD_450nm值为0.096，P/N值最大，达16.4375；当酶标二抗的稀释度在1∶2000，检测血清浓度1∶200时，阳性血清的OD_450nm值为1.132，相应的阴性血清的的OD_450nm值为0.086，P/N值为13.1628；酶标二抗的稀释度为1∶4000，检测血清的稀释度为1∶200时，阳性血清的OD_450nm值为0.847，相应的阴性血清的的OD_450nm值为0.073，P/N值为11.6027。因此选择OD_450nm值接近1.0，阴性血清的OD_450nm值较小，P/N值最高的稀释度则为：待检血清稀释度为1∶200，二抗稀释度为1∶2000。

表2间接ELISA检测酶标抗体和待检血清的最适稀释度P/N值

1.3UL51-ELISA阴阳性临界值的确定及UL51-ELISA方法的检测程序

取非免疫鸭阴性血清20份，对重组UL51蛋白包被浓度、待检血清和酶标二抗最佳稀释度进行间接ELISA测定，以确定鸭血清在无DPV感染时其吸收值范围。同时以1％BSA/MPBS溶液作空白对照。将20份血清样品的OD_450nm值的平均值(X)和3倍标准方差(SD)之和作为阴性血清的上限，即待检血清样品的OD_450nm值＞X+3SD时，判断为阳性；否则为阴性。

通过对20份DPV阴性血清进行检测(表3)，结果表明，健康鸭血清OD值最高为0.193，X值为0.103，SD值为0.038，临界值(X+3SD)为0.216。即待测样品的OD值大于0.216为阳性，小于或等于0.216则为阴性。

表320份DPV阴性血清检测结果

1.4UL51-ELISA方法的检测程序

根据上述优化结果，间接ELISA方法的检测程序如下：(1)固相抗原的制备：将重组UL51蛋白以2.5μg/100μL浓度包被于酶标板中，100μL/孔，置4℃湿盒孵育过夜，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；加入100μL/孔封闭液，37℃湿盒封闭1h，洗板机洗涤1次，5min/次，拍干；(2)一抗结合：将待检血清按1∶200的体积稀释度稀释后加入酶标板，100μL/L，37℃湿盒孵育1h，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(3)二抗结合：以酶标二抗稀释液将酶标二抗(羊抗鸭IgG-HRP)以1∶2000的体积稀释度稀释后加入，100μL/孔，37℃反应45min，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(4)显色：加入TMB底物(色原底物四甲基联苯胺)100μL/孔，25℃避光显色20min后，加入50μL/孔2mol/L硫酸终止反应；(5)检测并判断：用酶标仪测OD_450nm值，当酶标仪测OD_450nm值，OD_450nm值大于0.216为阳性，小于或等于0.216则为阴性。同时以1％的BSA/PBS溶液作平行空白对照。

2有益效果评价

2.1敏感性实验

将重组UL51蛋白按最佳包被浓度进行包被，将DPV弱毒疫苗免疫后14d、中和效价为1∶8的阳性血清做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800，8个体积稀释度，其余条件按本实施例条件进行UL51-ELISA试验，结果如表4和图4所示。当阳性血清稀释到1∶3200时，通过肉眼观察颜色变化难以判断阴性、阳性结果，但通过酶标仪仍然可以检出，按1∶6400稀释的阳性血清检测结果低于临界值0.216，表明此方法能够检出1∶3200倍稀释的弱毒疫苗免疫后14d的阳性血清，具有较强的敏感性。

表4敏感性试验检测结果

P为阳性，N为阴性；

2.2特异性试验结果

采用确立的ELISA条件，以纯化的UL51蛋白包被ELISA酶标板，用DPV阳性血清、DHV阳性血清、RA阳性血清、E.coli阳性血清各两份进行UL51-ELISA特异性试验，结果如表5和图5所示。根据临界值判定标准，2份DPV阳性血清OD_450nm为0.927、0.876，均远大于0.216，判为阳性，其余各病毒病或细菌病，鸭血清OD_450nm值均小于临界值，则均为阴性，表明建立的检测DPV抗体的UL51-ELISA法具有很好的特异性。

表5特异性试验结果

P为阳性，N为阴性；

3、讨论

在ELISA方法检测过程中，若浓度太低，酶标板表面可能留下未吸附抗原且未完全封闭的活性表面，非特异性会增加，因此必须对包被蛋白抗原浓度的进行筛选。另外，封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，抗原包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。最常用的封闭剂是0.5％-1％的BSA，也有用脱脂奶粉或1％明胶作为封闭剂的。本实施例中选用1％的BSA作封闭液，其成分单一，封闭效果较好。

此外，抗体的纯度直接关系到ELISA试验的特异性和敏感性，纯度不高的抗体常常会有超量的与特异性抗原结合的宿主细胞高分子化合物，可与抗原竞争有限的载体表面位置而减少有效的吸附率，因此高纯度的抗体蛋白可以提高反应特异性，但间接ELISA方法通常检测血清中的抗体，血清成分复杂，生产中通常不逐一对被检血清进行纯化，只有通过摸索适当的血清稀释倍数，才能减少非特异结合。并且，若果二抗浓度太低，没有有效结合，会出现假阴性等现象。本实验采用方阵法确定血清(一抗)和酶标二抗的最佳稀释倍数，从结果来看，血清稀释倍数从1∶50至1∶6400，血清浓度降低，OD_450nm值变小，根据OD_450nm值接近1.0，P/N最大来判定最佳稀释度，确定出血清的最佳稀释倍数为1∶200，酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶2000。

在ELISA判定标准中，常用两种方法，一种是用测定样本的原始OD_450nm值和标准方差来确定临界值。另一种是计算待测样品相对于阴性对照的比值，通过测定大量样本效价的频次分布来确定临界值和可疑区间。本研究在确定阴阳性判定标准时，采用了第一种判定标准。根据大量的阴性样品的OD_450nm值，采用统计学方法确定阴阳临界值。依据的原理是样本的OD_450nm值＞阴性样本OD_450nm值的平均值(X)+3SD时，可以在99.9％的水平上判为阳性，根据统计学原则，大量实验证实了该判断标准是可靠的。此外，Alonso等报道利用大肠杆菌表达的蛋白作为包被抗原检测田间猪血清时，可能存在宿主蛋白干扰的问题，即猪血清中存在的大肠杆菌抗体有可能与表达蛋白中残存的宿主蛋白发生非特异性反应。因此，在建立UL51-ELISA方法的过程中，选择了鸭源的E.coli阳性血清做特异性实验，结果表明该UL51-ELISA方法与E.coli血清无交叉反应性，特异性好。同时又用DPV阳性血清、DHV阳性血清、RA阳性血清做特异性试验，结果都证实了建立的UL51-ELISA具有良好的特异性和敏感性，显示了良好的应用前景，也为进一步组装成试剂盒奠定了基础。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (3)

1.基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征在于，具体步骤为：

a固相抗原的制备：将包被浓度等于2.5μg/100μL的重组UL51蛋白液与固相载体连接，用体积百分浓度为1％的牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；

b一抗结合：将待检血清作等于200倍的稀释，得稀释血清，即一抗，通过保温反应使所述稀释血清与所述固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；

c二抗结合：将羊抗鸭IgG-HRP作等于2000倍的稀释，得酶标二抗稀释液，将所述酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原-抗体-二抗复合物；

d显色：在步骤c所得抗原-抗体-二抗复合物加入色原底物四甲基联苯胺避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液；

e检测并判定：将步骤d所述显色样品液用酶标仪测OD_450nm值，所述OD_450nm值＞0.216为阳性，所述OD_450nm≤0.216则为阴性；

步骤a中所述重组UL51蛋白液、步骤b中所述稀释血清及步骤c中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积且大于或等于100μL；

所述重组UL51蛋白采用以下方法制得：将含pET28a-UL51质粒的表达菌E.coli BL21(DE3)接种于200mL LB液体培养基中，所述LB液体培养基中含50μg/mL Kan，37℃培养16h，作为种子菌；向发酵罐中注入10L的LB液体培养基，密封后115℃灭菌30min，之后待液体冷却至37℃，从加样孔处向发酵罐中加入终浓度为50μg/mL Kan、1mL消泡剂和200mL种子菌，在640r/min，37℃，pH7.0和50％溶氧量的条件下培养，待培养至菌液OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导培养3h，收集培养好的菌液，8,000r/min离心10min后收集菌体沉淀，用20mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl重悬，按1mg/mL加溶菌酶，4℃搅拌30min，超声波冰浴间歇破碎菌体，200w，30sec/次，5～10次，然后4℃、10000r/min离心10min，将沉淀用20mL洗液悬浮，所述洗液由10mmol/L PBS、2mol/L尿素和0.2％Triton X-100组成，4℃、10000r/min离心10min后，沉淀再次用20mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用尿素溶液溶解沉淀，所述尿素溶液由10mmol/L PBS和8mol/L尿素组成，于4℃在不同浓度的尿素溶液即6、4、3、2、1、0mol/L的尿素溶液中梯度透析，使变性蛋白逐渐复性，即得重组UL51蛋白。

2.根据权利要求1所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征在于：步骤d中避光显色的时间为20分钟。

3.根据权利要求1所述的基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法，其特征在于：所述方法还包括空白对照实验和阴性对照实验。

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