CN105181963B - 一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法 - Google Patents

一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105181963B
CN105181963B CN201510458766.9A CN201510458766A CN105181963B CN 105181963 B CN105181963 B CN 105181963B CN 201510458766 A CN201510458766 A CN 201510458766A CN 105181963 B CN105181963 B CN 105181963B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pseudo
goat
preparation
envelope antigen
thalline
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510458766.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105181963A (zh
Inventor
陈德坤
霍宁宁
刘鹤媛
周铭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN201510458766.9A priority Critical patent/CN105181963B/zh
Publication of CN105181963A publication Critical patent/CN105181963A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105181963B publication Critical patent/CN105181963B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/34—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Corynebacterium (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法。本发明以完整的伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，检测血清中是否含有抗伪结核棒状杆菌抗体，判断山羊是否感染伪结核。本发明确定了阴阳性临界值，具有很高的特异性和重复性，能够快速有效的检测出山羊血清中的伪结核抗体，可用于山羊伪结核诊断、流行病学调查。

Description

一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法
一、技术领域：
本发明涉及伪结核棒状杆菌的检测技术领域，具体涉及一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法。
二、背景技术：
山羊干酪性淋巴结炎（Caseous Lymphadenitis，CLA）（又称山羊伪结核）是由伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis，C.p)引起的以淋巴结肿大为主要特征的一种慢性人兽共患病，主要感染山羊和绵羊，分为体表型和内脏型两种。患病畜及隐性感染动物可通过鼻分泌物、排泄物以及破溃的脓肿流出的浓汁向外界排放大量的病原体，病原体通过直接或间接接触感染健康羊只并造成土壤、水、食物、牧草地的污染。患病羊产奶量下降、产毛量减少、繁殖能力减弱，在食欲不明显减退的情况下逐渐消瘦，生产力下降的同时能源消耗不减，不仅增加了养殖成本，还引发羊肉、羊奶鲜乳等动物性食品病原微生物及兽药残留严重超标，带来食品安全隐患。临床上对体表型脓包病羊通常可以采取治疗或淘汰措施，但内脏型患病羊只无明显临床症状，较难及时发现采取相应措施。因此，内脏型患病羊只的有效诊断对于该病的防控十分重要。
目前，对于该病的病原学诊断方法有病原菌的分离培养与生化鉴定、协同溶血试验、PCR，但这些方法基本不适用于内脏型患羊的活体诊断。鉴于国内目前尚无伪结核疫苗，而患病羊血清中必然存在抗伪结核棒状杆菌抗体，因此，ELISA检测方法检测其抗体水平可有效反映羊只的感染情况。
目前，间接ELISA方法检测山羊伪结核抗体所用的包被抗原包括原核表达PLD蛋白、超声裂解的菌体蛋白。以原核表达的PLD蛋白做包被抗原时，特尔异性较差，会与其他疫病阳性血清发生交叉反应。以超声裂解的菌体作为包被抗原时，不同批次裂解菌体所得结果差异较大，不能保证批次间的稳定性；且菌体裂解，释放内部蛋白，易出现假阳性检测结果。本发明以完整山羊伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，检测结果特异性强，且重复性好，避免了上述两种包被抗原造成的缺陷。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，该方法操作简单，检测结果灵敏稳定，适用于大批量样本检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：用伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，确定抗原包被浓度，待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装间接ELISA检测试剂盒。
包被抗原的制备：将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mL LB培养液中，在200～220rpm，37℃的条件下扩大培养48h后，10000～12000rpm离心3～5min，收集菌体，用PBS洗涤菌体三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液，此即为包被抗原。
配制不同浓度的包被抗原，确定包被抗原浓度对应的OD600值在0.060～0.090之间。
界定了待检血清的临界值。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明以完整的伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，检测病羊血清中是否含有抗伪结核棒状杆菌的抗体，依此判断病羊是否感染伪结核，该诊断方法能够针对性的检测抗羊伪结核抗体，为伪结核防控提供有力监测手段。
四、具体实施方式：
本发明涉及的羊伪结核抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1．间接ELISA检测方法的建立
步骤一、包被抗原的制备
将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mL LB培养液中，在200～220rpm，37℃的条件下扩大培养48h后，10000～12000rpm离心3～5min，收集菌体。用PBS洗涤菌体三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液。此即为包被抗原。
步骤二、酶标板的包被
在分光光度计上调整伪结核棒状杆菌菌悬液的浓度使其OD600在0.060～0.090范围，取菌悬液100μL/孔加至酶标板，置于4℃过夜。包被结束后，将PBST添加至酶标板，200μL/孔，轻微震荡10s后，弃掉酶标板中的PBST，重复洗涤3次，最后一次洗涤结束后于干净纱布拍干孔中残留PBST。
步骤三、封闭
取5%（百分比）脱脂奶粉，100μL/孔添加至酶标板，37℃封闭1～3h。封闭结束后洗涤，洗涤操作同步骤二。
步骤四、一抗血清的孵育
将待检血清做1:400（体积比）稀释后，100μL/孔添加至酶标板中，37℃孵育1h。孵育结束后，洗涤操作同步骤二。
步骤五、酶标二抗的孵育
用PBST对酶标二抗做1∶5000稀释，100μL/孔添加至酶标板中，37℃孵育1h。孵育结束后，洗涤操作同步骤二。
步骤六、显色
取4℃避光保存的TMB显色液，100μL/孔添加至酶标板，37℃孵育20min。
步骤七、反应终止及结果测定
取室温保存的2M稀H2SO4，100μL/孔添加至酶标板，于酶标仪450nm读取结果。
2．包被抗原浓度的确定
将纯化培养的伪结核棒状杆菌的菌体作为包被抗原，CLA的阳性血清为阳性对照，在酶标板上进行方阵滴定试验。用碳酸盐缓冲液将伪结核棒状杆菌菌体重悬，在酶标仪上调整其浓度，使其OD600分别为0.1、0.08、0.05、0.03、0.01，100μL/孔纵向包被酶标板，各浓度分别包被一列，置于4℃，包被过夜。按照上述间接ELISA检测方法操作，以P/N值最大确定抗原的最佳包被浓度，根据试验结果得，当OD600为0.08时所对应的菌液浓度为抗原的最佳包被浓度。具体检测结果如表1：
表1·抗原包被浓度检测结果
3．临界值的确定
按照1中ELISA操作步骤，将20份标准阴性血清做1∶400稀释后作为一抗血清，测定其OD450，计算器平均值（）和标准差（SD），临界值即为OD450和3SD之和，本研究所确定的临界值为0.329。具体测定结果如表2：
4．特异性试验
按照1中ELISA操作步骤，分别将羊口疮阳性血清、羊痘阳性血清、乳房炎阳性血清做1:400稀释，测定其OD450，同时设置伪结核标准阳性血清、阴性血清做阳性、阴性对照，检测结果显示羊口疮阳性血清、羊痘阳性血清、乳房炎阳性血清的测定结果均小于阳性临界值0.329，说明本研究所确定的试验方法特异性良好。具体试验结果如表3：
5．重复性试验
（1） 批内重复性试验：在同一块酶标板上，取伪结核标准阳性血清、阴性血清各5份，按照1中ELISA操作步骤，测定OD450，每份血清做三个重复，计算批内变异系数（CV），批内CV=（SD/OD450平均值）×100%。结果显示，批内变异系数均小于5%。具体试验结果如表4：
（2） 批间重复性试验：在不同批次包被的酶标板上，取伪结核标准阳性血清、阴性血清各5份，按照1中ELISA操作步骤，测定OD450，每份血清做三个重复，计算批间变异系数（CV），批间CV=（SD/OD450）×100%。结果显示，批间变异系数均小于10%。具体试验结果如表5：
6．ELISA试剂盒的组装
伪结核间接ELISA检测试剂盒具体组成如下：
（1）空白96孔酶标板一块；
（2）伪结核棒状杆菌纯品一支，置于-20℃保存，使用前，用包被稀释液调整OD600值至0.08；
（3）CLA阳性血清，CLA阴性血清各一支；
（4）辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体，使用前，用样品稀释液1:5000稀释；
（5）TMB显色液，终止液，封闭液，样品稀释液，洗涤液各一支。
具体实施例
从羊场采集临床症状的山羊血12份，其中4份具有典型的山羊脓胞症状，4份为表观正常内脏型的患病羊只，4份为健康羊只。分离血清，测定其OD450。检测结果显示体表型、内脏型患病羊只的OD450均大于阳性临界值，健康羊只的OD450均小于阳性临界值，与实际患病状况一致，说明本研究建立检测方法可靠。具体检测结果如表6：

Claims (1)

1.一种山羊伪结核杆菌抗体的ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为：用伪结核棒状杆菌菌体作为包被抗原，确定抗原包被浓度，待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装间接ELISA检测试剂盒；
包被抗原的制备：将伪结核棒状杆菌单菌落接种于5mL LB培养液中，在200～220rpm，37℃的条件下扩大培养48h后，10000～12000rpm离心3～5min，收集菌体，用PBS洗涤菌体三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成菌悬液，此即为包被抗原；
配制不同浓度的包被抗原，确定包被抗原浓度对应的OD600值在0.060～0.090之间。
CN201510458766.9A 2015-07-30 2015-07-30 一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法 Active CN105181963B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510458766.9A CN105181963B (zh) 2015-07-30 2015-07-30 一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510458766.9A CN105181963B (zh) 2015-07-30 2015-07-30 一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105181963A CN105181963A (zh) 2015-12-23
CN105181963B true CN105181963B (zh) 2017-08-01

Family

ID=54904185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510458766.9A Active CN105181963B (zh) 2015-07-30 2015-07-30 一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105181963B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861357B (zh) * 2016-04-06 2019-05-28 山西瑞亚力科技有限公司 一种用于伪结核杆菌的无血清培养基制备方法
CN107746837A (zh) * 2017-11-02 2018-03-02 云南省畜牧兽医科学院 山羊伪结核棒状杆菌pld重组蛋白及其制备方法与应用
CN110244042B (zh) * 2019-07-24 2020-08-14 山东农业大学 羊腐败梭菌的间接elisa检测试剂盒
CN110244043A (zh) * 2019-07-24 2019-09-17 山东农业大学 B型诺维氏梭菌的间接elisa检测试剂盒
CN112986560A (zh) * 2021-04-13 2021-06-18 内蒙古民族大学 一种牛源致病性蜡样芽孢杆菌间接elisa检测试剂盒
CN115154489B (zh) * 2022-06-06 2023-07-21 西北农林科技大学 一种治疗羊干酪性淋巴结炎的多菌群复合制剂及培养物
CN115902217B (zh) * 2023-03-08 2023-06-16 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种牛副结核病间接elisa检测试剂盒及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5239290A (en) * 1989-03-29 1990-10-04 Csl Limited Purification of c.pseudotuberculosis toxin, and cloning and expression of toxin gene
CN1810838A (zh) * 2005-01-28 2006-08-02 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白及其制备方法
CN101498724A (zh) * 2009-01-24 2009-08-05 中国检验检疫科学研究院 玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法
CN102004150A (zh) * 2010-09-30 2011-04-06 四川农业大学实验动物工程技术中心 基于重组ul51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法
CN102323428A (zh) * 2011-08-17 2012-01-18 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 鸭疫里默氏杆菌抗体间接elisa方法检测试剂盒及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5239290A (en) * 1989-03-29 1990-10-04 Csl Limited Purification of c.pseudotuberculosis toxin, and cloning and expression of toxin gene
CN1810838A (zh) * 2005-01-28 2006-08-02 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种诊断牛结核病的重组抗原蛋白及其制备方法
CN101498724A (zh) * 2009-01-24 2009-08-05 中国检验检疫科学研究院 玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法
CN102004150A (zh) * 2010-09-30 2011-04-06 四川农业大学实验动物工程技术中心 基于重组ul51蛋白的鸭瘟病毒抗体的检测方法
CN102323428A (zh) * 2011-08-17 2012-01-18 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 鸭疫里默氏杆菌抗体间接elisa方法检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
山羊伪结核棒状杆菌病的ELISA 诊断;王旋 等;《上海畜牧兽医通讯》;20091231(第2期);29 *
羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定及 ELISA检测方法的建立;张彦明 等;《中国兽医学报》;20050131;第25卷(第1期);34-36 *
羊伪结核病研究进展;赵宏坤 等;《中国预防兽医学报》;20000531;第22卷(第3期);236-237 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105181963A (zh) 2015-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105181963B (zh) 一种山羊伪结核杆菌抗体的elisa检测试剂盒的制备方法
Luengo et al. Influence of intramammary infection and non-infection factors on somatic cell counts in dairy goats
Bachofen et al. Clinical appearance and pathology of cattle persistently infected with bovine viral diarrhoea virus of different genetic subgroups
Caicedo et al. Virology, immunology and pathology of human rabies during treatment
Pomorska-Mól et al. Kinetics of single and dual infection of pigs with swine influenza virus and Actinobacillus pleuropneumoniae
Schulz et al. Experimental infection of South American camelids with bluetongue virus serotype 8
Simsek et al. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and enzyme-linked immunoelectrotransfer blot (EITB) for immunodiagnosis of hydatid diseases in sheep
CN104020297B (zh) 用于结核分枝杆菌感染检测及临床治疗效果监测的试剂盒及其用途
Larios Mora et al. Kinetics of respiratory syncytial virus (RSV) Memphis strain 37 (M37) infection in the respiratory tract of newborn lambs as an RSV infection model for human infants
CN103698514B (zh) 检测猪胞内劳森氏菌抗体的elisa试剂盒
Pomorska‐Mól et al. Analysis of the acute‐phase protein response in pigs to clinical and subclinical infection with H 3 N 2 swine influenza virus
Ellis et al. Relationship of the extent of pulmonary lesions to the partial pressure of oxygen and the lactate concentration in arterial blood in calves experimentally infected with bovine respiratory syncytial virus
CN110244043A (zh) B型诺维氏梭菌的间接elisa检测试剂盒
CN107656057A (zh) 一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用
Yang et al. Seroprevalence and associated risk factors of Toxocara infection in Korean, Manchu, Mongol, and Han ethnic groups in northern China
CN106990253A (zh) 一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法
Bogere et al. Optimization of fecal calprotectin assay for pig Samples
CN102809653A (zh) 一种检测新布尼亚病毒抗原的elisa试剂盒的制备和应用
CN104165998B (zh) Prrsv基因标记疫苗株elisa鉴别诊断试剂盒及方法和应用
Ashitani et al. Elevated levels of β-D-glucan in bronchoalveolar lavage fluid in patients with farmer’s lung in Miyazaki, Japan
Khan et al. Cultural and immunological methods for the detection of Campylobacter jejuni: A review
CN111707822A (zh) 一种鸡毒支原体抗体检测试剂及制备方法和应用
CN103995123B (zh) 检测布氏杆菌抗体的一种elisa试剂盒的制备方法与应用
Hilbe et al. New world camelids and bovine virus diarrhea virus (BVDV) infection in Switzerland
Fetherston et al. Recurrent blocked duct (s) in a mother with immunoglobulin A deficiency

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant