CN110244042B

CN110244042B - 羊腐败梭菌的间接elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN110244042B
Application number: CN201910670069.8A
Authority: CN
Inventors: 柴同杰; 林静; 韦良孟
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2039-07-24
Also published as: CN110244042A

Abstract

本发明公开了一种羊腐败梭菌的间接ELISA检测试剂盒，所述间接ELISA检测试剂盒以腐败梭菌菌悬液为包被抗原。所述腐败梭菌菌悬液由如下方法制备而成：将腐败梭菌菌落接种于培养基中，在37℃厌氧环境中静置培养12‑24h；将培养得到的腐败梭菌培养物离心，收集菌体，洗涤，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成腐败梭菌菌悬液。本发明的试剂盒能够高敏感及高特异性的检测羊血清中是否含有腐败梭菌的抗体，并依此判断羊是否感染腐败梭菌，能够实现在羊发病后快速做出诊断并采取紧急治疗措施。

Description

羊腐败梭菌的间接ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及腐败梭菌检测的技术领域，具体涉及一种羊腐败梭菌的间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

腐败梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，是造成人类非创伤性或自发性气性坏疽疾病的主要病原体，是造成农场动物恶性水肿病的主要病因。腐败梭菌极易引发羊快疫，此类疾病发病急、死亡率高，给畜牧业带来巨大的经济损失。有报道指出，自2002年至2009年，在我国西北部地区羊群持续发病，致死率高达60％。自2010年以来，全国各地，例如：青海省、新疆、广西省、贵州省、河北省、河南省、甘肃省等接连出现羊快疫病例，致死率均高于50％，每年死于羊快疫的羊只达到万头以上。为了对腐败梭菌病进行快速、有效检测，必须建立准确、高效、特异的腐败梭菌血清学检测技术。

现有的腐败梭菌的方法主要包括PCR检测、细菌生化鉴定和溶血试验等，但是这些方法操作繁琐、敏感性较低并且难以定量。近年来，由腐败梭菌引起的羊快疫在全国各地时有爆发，但国内外针对腐败梭菌检测方法却研究甚少。目前，国内对羊快疫的爆发仅能做到初步防控，却不能在发病后快速做出诊断并采取紧急治疗措施；而在国外，腐败梭菌引起的疫病报道主要是由人感染而引发的结肠癌等，在动物发病方面并没有引起相当的重视。

因此，为了弥补腐败梭菌检测方法上的空白，迫切需要建立特异性强、灵敏度高并且能在生产中便于应用的ELISA检测方法，以便为羊快疫等腐败梭菌病的快速诊断和该类疾病的防控提供技术支撑。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种羊腐败梭菌的间接ELISA检测试剂盒。本发明的试剂盒能够高敏感及高特异性的检测羊血清中是否含有腐败梭菌的抗体，并依此判断羊是否感染腐败梭菌，能够实现在羊发病后快速做出诊断并采取紧急治疗措施。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种羊腐败梭菌的间接ELISA检测试剂盒，所述间接ELISA检测试剂盒以腐败梭菌菌悬液为包被抗原。

优选的，所述腐败梭菌菌悬液由如下方法制备而成：

将腐败梭菌菌落接种于培养基中，在37℃厌氧环境中静置培养12-24h；将培养得到的腐败梭菌培养物离心，收集菌体，洗涤，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成腐败梭菌菌悬液。

更优选的，所述培养基由以下重量份的原料制成：

厌气肉干汤35-36份、葡萄糖2-4份、L-半胱氨酸盐酸盐0.2-0.4份、胰蛋白胨6-8份、水1000份。

优选的，厌氧环境气体组成体积比为：氮气78％、氢气8％、二氧化碳和惰性气体组成的混合气体14％。

进一步的，所述间接ELISA检测试剂盒还包括：酶标板、封闭液、腐败梭菌阳性血清、腐败梭菌阴性血清、酶标二抗、底物显色液和终止液。

优选的，所述封闭液为5％脱脂奶粉。

优选的，所述酶标二抗为HRP标记的兔抗绵羊IgG酶标二抗。

本发明的第二方面，提供利用上述间接ELISA检测试剂盒检测腐败梭菌抗体的方法，包括以下步骤：

(1)用抗原包被液将腐败梭菌稀释至OD_600nm为0.06，包被酶标板，4℃包被过夜；

(2)取出酶标板，用PBST溶液洗涤，加入封闭液，37℃封闭2h；

(3)分别加入稀释后的腐败梭菌阳性血清、腐败梭菌阴性血清和待检血清；37℃孵育1h；

(4)加入按1:8000稀释的酶标二抗，37℃孵育1h；

(5)加入底物显色液，37℃避光反应15min；

(6)加入终止液终止反应，在450nm处读取吸光值，对检测结果进行判定。

优选的，步骤(3)中，腐败梭菌阳性血清、腐败梭菌阴性血清和待检血清均按1:1000进行稀释。

优选的，步骤(6)中，检测结果的判定标准为：计算阴性样品平均值

与标准差(SD)，求得

为阳性临界值，

为阴性临界值；若待测血清的

则结果判定为阳性；若待测血清的

则结果判定为阴性；若待测血清的OD_450nm值介于

和

之间，则判定为可疑样品。

需要说明的是，上述方法除了用于腐败梭菌病的快速诊断外，还可以用于腐败梭菌病治疗药物和疫苗的开发。

本发明的有益效果：

本发明的羊腐败梭菌的间接ELISA检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简单等优点，能够用于腐败梭菌病抗体的定性和定量检测，可以对腐败梭菌病(例如羊快疫)进行快速、有效的检测。

附图说明

图1：以腐败梭菌阳性血清浓度的自然对数LN(x)为横坐标，OD_450nm值为纵坐标绘制标准曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，目前国内外对于腐败梭菌的研究较少，现有的腐败梭菌检测方法普遍存在操作繁琐、敏感性低、难以定量等问题。

基于此，本发明的目的是提供一种羊腐败梭菌的间接ELISA检测试剂盒，并建立了特异性强、灵敏度高、可重复性好、经济、简便、快速的检测腐败梭菌ELISA检测方法，为羊快疫等腐败梭菌病的快速诊断和这类疾病的防控提供了技术支持。

由于腐败梭菌増菌培养困难，通过原核表达的方式获取腐败梭菌重组蛋白，可以打破现在对腐败梭菌増菌培养困难的瓶颈。但是，以原核表达的蛋白做包被抗原时，特异性较差，会与其他疫病阳性血清发生交叉反应；以超声裂解的菌体作为包被抗原时，不同批次裂解菌体所得结果差异较大，不能保证批次间的稳定性；且菌体裂解，释放内部蛋白，易出现假阳性检测结果。因此，本发明仍选择对腐败梭菌进行増菌培养，并直接使用増菌培养后的腐败梭菌菌体作为包被抗原以消除这些因素，而且重组蛋白只针对一种菌体蛋白，或外毒素蛋白或菌体结构蛋白，不能保证检测结果的可靠性。羊只发病时往往是菌体先被检测到，而后大量增殖产生外毒素，因此以菌体作为包被抗原构建ELISA检测方法准确性更高。

但以直接菌体作为包被抗原的难度在于菌体的增殖培养、菌悬液浓度的确定，本发明的间接ELISA检测试剂盒是以腐败梭菌菌体作为包被抗原，确定包被抗原浓度、待检血清稀释度，并界定阴阳血清的临界值，建立并组装腐败梭菌ELISA检测试剂盒，实现了对羊快疫病的快速检测。

腐败梭菌培养条件苛刻，培养条件困难，本发明运用改良的腐败梭菌增菌培养基成功培养出密度较大的腐败梭菌培养物，以制备菌悬液作为包被抗原构建ELISA检测方法，弥补了我国腐败梭菌病血清学诊断检测方面的技术空缺，该方法省去了很多繁琐的检测步骤，相较PCR检测、生化鉴定、毒素中和试验、豚鼠攻毒试验等方法更省时省力，检测结果也更加准确可靠。

本发明的间接ELISA检测试剂盒的构建过程包括：

1.腐败梭菌的培养及鉴定；

2.腐败梭菌间接ELISA检测方法的建立。

在本发明的一种实施方案中，给出了腐败梭菌培养物的制备及鉴定过程，具体如下：

将腐败梭菌参考株(ATCC 12464)冻干粉无菌操作接种于培养基中，所述培养基由以下重量份的原料制成：

在37℃厌氧环境中静置增菌培养12～24h，设置对照组为未接种细菌的增菌液，紫外分光光度计检测细菌培养物OD_600nm数值，当达到增菌产毒高峰时停止培养。

将细菌培养物进行革兰氏染色镜检，镜检可见典型的腐败梭菌培养形态。通过细菌DNA抽提试剂盒提取厌氧培养24h后的细菌培养液，运用腐败梭菌α毒素csa基因鉴定引物鉴定增殖后的细菌培养物是否为腐败梭菌，成功扩增出腐败梭菌α毒素csa基因全长(1333bp)，且测序结果正确，可用于腐败梭菌ELISA检测试剂盒的开发。

在本发明的另一种实施方案中，给出了腐败梭菌间接ELISA检测方法的建立，具体过程如下：

(1)包被抗原的制备：将鉴定成功的腐败梭菌菌落接种于培养基(所述培养基由厌气肉干汤36份、葡萄糖3份、L-半胱氨酸盐酸盐0.3份、胰蛋白胨7份、水1000份组成)，在37℃厌氧条件(厌氧环境气体组成体积比为：氮气78％、氢气8％、二氧化碳和氦气按体积比1:1组成的混合气体14％)下静置培养12～24h，将腐败梭菌培养物12000rpm离心5min，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成细菌悬液，此即为包被抗原。

(2)包被抗原：用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)将腐败梭菌悬液稀释至OD_600nm数值为0.06，包被酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜包被；

(3)封闭：取出酶标板，弃液拍干，用PBST溶液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)洗涤3次后，加入5％脱脂奶粉作为封闭液，200μL/孔，37℃封闭2h；

(4)加入阴阳性血清：用PBST溶液洗涤3次后，加入1:1000稀释的腐败梭菌阴、阳性血清，100μL/孔，37℃孵育1h；

对血清样本进行检测时，待检血清样本也是在此步骤加入，稀释度与阴、阳血清的稀释度相同。

(5)加入酶标二抗：用PBST溶液洗涤3次，分别加入1:8000稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；

(6)显色：用PBST溶液洗涤3次，加入TMB底物显色液100μL/孔,37℃避光反应15min；

(7)终止显色和计数：用2M的H₂SO₄溶液100μL/孔来终止反应，在450nm处读取吸光值。

检测结果判定标准：计算阴性样品平均值

与标准差(SD)，求得

为阳性临界值，

为阴性临界值。运用建立的腐败梭菌间接ELISA方法测定OD_450nm，

为阳性，

为阴性，

为可疑样品。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：

腐败梭菌参考株(ATCC12464)购自美国菌种保藏中心；腐败梭菌阳性血清及其他阴性血清为山东农业大学环境微生物实验室提供；Tween-20均购自美国Sigma公司；兔抗绵羊IgG-HRP购自北京聚合美生物技术有限公司；96孔酶标板购自Solarbio公司；可溶性TMB底物显色液购自天根生化科技有限公司；其他所用化学试剂均为分析纯

实施例1：间接ELISA检测方法的建立

分别确定该方法抗原的最佳包被浓度、抗原最佳包被条件、最佳封闭条件、待检血清最佳稀释倍数、待检血清孵育时间、酶标二抗最佳稀释浓度、酶标二抗的作用时间、底物最佳的显色时间等条件，确定最佳优化方案如下：

(1)抗原最佳包被稀释度的确定

用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)将腐败梭菌悬液分别稀释至OD_600nm数值为0.02、0.04、0.06、0.08和0.1，对腐败梭菌阳性血清进行检测，测定其在450nm处吸光值，根据P/N值确定抗原最佳包被浓度。最终确定抗原最佳包被浓度为OD_600nm＝0.06。

(2)最佳包被条件的确定

用抗原包被液包被抗原后，分别于4℃包被12h，37℃包被1h，37℃包被2h，根据P/N值确定最佳包被条件。最终确定最佳包被条件：4℃包被12h效果最佳。

(3)最佳封闭条件的确定

抗原包被结束后，分别用5％脱脂奶粉、5％胎牛血清、1％BSA作为封闭液，分别于4℃封闭12h、37℃封闭1h、37℃封闭2h，取5份阳性血清和阴性血清进行检测，测定其在450nm处的OD值，根据P/N值确定合适的封闭条件。最终确定最佳封闭条件：用5％脱脂奶粉作为封闭液，37℃封闭2h。

(4)待检血清最佳稀释倍数及作用时间的确定

取阳性血清和阴性血清各10份，分别按1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000的比例稀释待检血清，并置于37℃分别反应1h、1.5h和2h，进行ELISA试验，根据P/N值确定待检血清的最佳作用时间。最终确定待检血清的最佳稀释倍数为1:1000，最佳作用时间为1h。

(5)酶标二抗最佳稀释倍数及作用时间的确定

血清孵育结束后，分别按1:2000、1:4000、1:6000、1:8000和1:10000的比例稀释酶标二抗，并置于37℃分别反应1h、1.5h和2h，进行ELISA试验，根据P/N值确定酶标二抗最佳稀释倍数和作用时间。最终确定酶标二抗最佳稀释倍数为1:8000，最佳作用时间为1h。

(6)底物显色液最佳显色时间的确定

二抗孵育结束后，加入TMB底物显色液100μL/孔,37℃分别避光反应5min、10min、15min和20min，根据P/N值确定底物显色液最佳显色时间。最终确定最佳显色时间为15min。

最终确定的腐败梭菌间接ELISA检测方法步骤如下：

(1)包被抗原的制备：将鉴定成功的腐败梭菌菌落接种于改良型脑心浸液肉汤中，在37℃厌氧条件下静置培养12～24h，将腐败梭菌培养物12000rpm离心5min，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀三次，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成细菌悬液，即为包被抗原。

(2)包被抗原：用抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH＝9.6)将腐败梭菌悬液稀释至OD_600nm为0.06，包被酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜包被；

实施例2：间接ELISA方法标准曲线的建立

根据已建立好的腐败梭菌间接ELISA检测方法操作程序，对腐败梭菌阳性血清从7500ng/mL起二倍比稀释至7.32ng/mL、阴性样品和空白孔分别进行检测，反应完毕后测定OD_450nm值。以腐败梭菌阳性血清浓度为横坐标，OD_450nm值为纵坐标绘制曲线图；根据曲线图，选择最佳线性范围，以浓度的自然对数LN(x)为横坐标，OD_450nm值为纵坐标绘制标准曲线。标准血清浓度的自然对数LN(x)与可检测到吸光度呈显著的线性关系，其相关系数R²＝0.9974，线性方程为y＝0.3622x-0.7971，线性范围14.65～1875ng/mL(图1)，此方法最低检测线为12.34ng/mL。该标准曲线线性范围理想，可根据标准曲线计算待测血清浓度。

实施例3：间接ELISA方法性能评价

(1)特异性试验：运用建立好的间接ELISA方法，检测腐败梭菌阳性血清样品20份，阴性样本如：产气荚膜梭菌阳性血清、诺魏氏梭菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、里默氏杆菌阳性血清及葡萄球菌阳性血清各20份，并设置空白对照。结果显示，除与腐败梭菌阳性血清反应呈阳性外，其他均为阴性，表明无交叉反应。

(2)敏感性分析：根据上述试验中得到的

的值，从标准曲线中找出对应浓度，即为此方法的检测限。根据标准曲线的线性范围确定有效检测范围。通过试验和标准曲线得知，线性范围在14.65～1875ng/mL即为该方法的有效检测范围；

(OD_450nm)在标准曲线中对应的浓度为12.34ng/mL，即为此方法最低检测线。

(3)可重复性分析：在线性范围内选择937.5、117.2、29.3ng/mL 3个浓度点，在一次试验中每个浓度测10孔，计算批内变异次数；连续测10个批次，计算批间变异系数。该方法批内变异系数为2.98％～6.75％，批间变异系数为2.43％～6.02％，两者均小于10％，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度较小，变异结果可忽略不计，表明该方法具有较好的重复性。

(4)回收率分析：按标准检测程序测定不同浓度(937.5、117.2、29.3ng/mL)阳性血清，根据(实测值/理论值)*100％求得平均回收率。在10次试验中，对3个浓度点的血清样品测量得到的回收率在98.61％～103.74％范围内，证明该方法准确性较高。

实施例4：腐败梭菌ELISA试剂盒的组装

腐败梭菌间接ELISA检测试剂盒具体组成如下：

(1)空白96孔酶标板一块；

(2)腐败梭菌纯品一支，置于-20℃保存，使用前，用包被稀释液调整OD_600nm为0.06；

(3)腐败梭菌标准阳性血清及阴性血清各一支；

(4)辣根过氧化物酶标记的兔抗绵羊抗体，使用前，用二抗稀释液按1:8000比例稀释；

(5)抗原包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、TMB底物显色液以及终止液各一支。

实施例5：临床样本的检测

从羊场采集有临床发病症状的山羊血液样本15份，采集健康羊只血液样本5份。分离血清，采用建立的腐败梭菌间接ELISA检测方法测定以上20份血清样本，记录其OD_450nm数值。具体检测结果如表1所示。

表1临床样品检测结果

检测结果显示表现出临床发病症状的羊只血清样本OD_450nm数值均大于阳性临界值，健康羊只的OD_450nm数值均小于阴性临界值，与实际患病情况一致(检测准确率为100％)，说明本研究建立检测方法可靠。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。