CN111323582A - 一种金黄色葡萄球菌seo的elisa检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种检测试剂盒及其检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素O的方法。所述检测试剂盒包含以下试剂：兔抗SEO血清、包被抗体稀释液、洗涤液、封闭液、标准品、样本稀释液、抗SEO卵黄抗体、HRP标记的兔抗鸡IgY酶标二抗、TMB、终止液。使用所述试剂盒不仅能有效对新型肠毒素O进行定性、定量检测还具有较好的特异性、准确性、重复性等优点。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种检测试剂盒及其检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素O(SEO)的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素超家族(Staphylococcal enterotoxin superfamily)是一类由金黄色葡萄球菌分泌的一组分子量在26～30kDa的具有超抗原活性可溶性单链蛋白质，具耐热、耐酸、耐酶消化等活性。
目前已发现超过20种金黄色葡萄球菌肠毒素，包括5种经典肠毒素(SEA～SEE)和新型肠毒素，如SEG、SHE、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER和SEU等。编码肠毒素的基因位于染色体、质粒、噬菌体或毒力岛中，新型肠毒素基因seg、sei、sem、sen和seo存在于染色体操纵子中一个称为肠毒素基因簇(enterotoxin gene cluster，egc)内，有研究表明，egc基因簇与食物中毒和其他危及生命的感染性疾病有关。
一般来说，每克食品中含5x 105个产毒素的金黄色葡萄球菌可导致中毒。金黄色葡萄球菌肠毒素常存于意大利面、肉制成品、奶、奶产品、冰淇淋、蛋类产品、沙拉、面包、蛋糕、馅饼及由这些产品制备而成的其他食品中。近年来，越多的由金黄色葡萄球菌导致的食物中毒事件被发现与新型肠毒素有关。有研究表明，产新型肠毒素SEK、SEL，SEM、SEN、SEO和SEP在食物中毒中扮演重要角色。含有编码肠毒素蛋白的seo基因的金黄色葡萄球菌常常在食物中毒病例中被检出。新型肠毒素O(Staphylococcus enterotoxin O,SEO)作为一种新型肠毒素，具有呕吐活性，并且有与经典肠毒素SEC相当的超抗原活性。由于seo基因的广泛流行，以及SEO存在于食品中的潜在危害，因此，研制出一种高灵敏度，高特异性和高准确性的SEO检测方法对于控制新型肠毒素对公共卫生的威胁具有重要作用。
目前检测肠毒素的方法主要有生物学检测、分子生物学方法、生物传感器方法和免疫学方法。
生物检测是通过提取受污染的食品中的金黄色葡萄球菌感染细胞，取细胞培养上清进行动物实验，验证是否能诱导其产生典型症状，如呕吐、胃肠道症状和超抗原活性等。通常研究者们通过给猴子饲喂或小动物腹腔注射超抗原毒素验证其呕吐活性。随着研究的发展以及实验动物饲养的便利性等方面的考虑，麝香鼠(house musk shrew)被更多地用于验证肠毒素呕吐活性。有研究利用SEA的超抗原活性，将其与Raji细胞进行反应，考虑到成本及操作的便利性，这种方法的使用受到了一定的限制。
分子生物学检测方法主要是聚合酶链式反应(PCR)，这种方法主要用于检测食物中是否含有超抗原毒素基因。这种方法虽然具有高特异性、高灵敏性、快速等优点，但只检测是否含有超抗原毒素基因不能说明是否有毒素蛋白的表达，具有一定的局限性。近年来，有研究者设计引物进行逆转录PCR(RT-PCR)，从mRNA水平说明毒素基因是否发生转录，从侧面反映毒素蛋白是否表达，但对于毒素最终是否表达以及表达毒素蛋白量的多少尚不清楚。
生物传感器利用抗体与抗原之间的特异性的免疫化学反应为原理制成。该方法将抗体固定在固相载体上，可以从复杂的基质中富集抗原物质，达到检测特定化学物质和其浓度的目的。最新研发的免疫传感器对肠毒素的最低检出限可达0.017ng/ml。具有操作简单、响应时间短、高灵敏度等优点。但由于该方法检测成本高，检测稳定性较差，使得其在实际应用上受到很大的限制。
目前最常用于检测食物中肠毒素的方法是基于单克隆抗体和多克隆抗体的免疫学方法。由于其原理是基于抗原抗体之间的特异性反应，因此具有高度的特异性。市面上销售的商业化试剂盒主要分为两类：一类是基于酶联免疫分析法的酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联荧光分析法(ELFA)；另一类是反向乳胶凝集实验(RPLA)。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有成本低、操作简便、敏感性高、特异性强等优点，被广泛地应用于临床检测中。
现市面销售的商品化金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法主要是经典肠毒素(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)的ELISA检测试剂盒和胶体金检测试纸条。虽然它们都具有灵敏度高、耗时短、操作简单等优点，但是对于新型肠毒素检测方法的研究还十分有限。在未来，由新型肠毒素引发的为公共卫生问题将成为新的隐患。与SEM和SEI同属一个基因簇的SEO，同样也被证实具有呕吐活性和与经典肠毒素SEC类似的超抗原活性，但目前尚未有研究报道SEO的检测方法。因此研制出一种精准、高效的SEO的检测方法十分有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测试剂盒，所述试剂盒特异性强、敏感性高、检测准确、耗时短、能有效检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素O。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述检测试剂盒用于金黄色葡萄球菌新型肠毒素O的检测，所述检测试剂盒包含以下试剂：兔抗SEO血清、包被抗体稀释液、洗涤液、封闭液、标准品、样本稀释液、抗SEO卵黄抗体、HRP标记的兔抗鸡IgY酶标二抗、TMB、终止液。
进一步，所述兔抗SEO血清的浓度为2.056μg/ml。
进一步，所述洗涤液为0.05％Tween20的PBS溶液。
进一步，所述封闭液为10％的脱脂奶粉。
进一步，所述抗SEO卵黄抗体的用封闭液进行稀释，稀释比例为1：1000。
进一步，所述终止液为1M的硫酸溶液。
本发明的目的之二在于提供一种检测SEO的方法，所述方法不仅能有效对新型肠毒素O进行定性分析，还能有效对新型肠毒素O进行定量检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述方法包括以下步骤：
1)包被抗体包被酶标板，洗去未结合的抗体，该包被抗体为兔抗SEO血清；
2)加入封闭液，洗去多余封闭液；
3)加入样品和标准品，孵育后洗板；
4)加入抗SEO卵黄抗体为检测抗体，反应后洗板；
5)加入以辣根过氧化氢酶标记的兔抗鸡IgY为酶标二抗，反应后洗板；
6)加入显色液TMB后加入终止液终止反应，酶标仪检测OD450吸光度；
7)根据标准品OD450值得标准曲线，将样品的OD450值带入标准曲线即可求得样品中SEO的含量。
当样品中SEO浓度≥8μg/ml时，样品中SEO与包被抗体及检测抗体-酶标二抗结合，催化底物在450nm处产生吸光值时被判为阳性。
当样品中SEO浓度＜8μg/ml时，样品中SEO与不能与包被抗体及检测抗体-酶标二抗结合或引起的信号过低时被判为阴性。
本发明记载的方法对不同浓度的标准SEO进行OD450值检测后，得到的线性范围良好，可以直接做成标准曲线，通过对样品的OD450值检测后，用该值在标准曲线上找出对应的浓度，即可实现对样品的定量检测。
所述方法采用黄卵黄抗体作为检测抗体，由于卵黄抗体与金黄色葡萄球菌的SPA无交叉反应，同时由于与哺乳动物的种属差异较大，故很大程度上减少了假阳性的产生，提高了所述方法的准确性。
本发明进一步优化了包被抗体、检测抗体和酶标抗体的工作浓度及包被、封闭、检测抗体及酶标抗体的工作时间，通过该条件的设置可使检测灵敏度达0.107μg/ml，标准曲线的R2值达0.9947，最低检测下线达8μg/ml。
本发明中各步骤的具体工作条件和过程如下：
所述步骤1)中具体步骤如下：用包被液将兔抗SEO血清稀释到浓度为2.056μg/ml，每孔100μl，4℃过夜。
所述步骤2)中具体步骤如下：封闭液为10％的脱脂奶粉，每孔200μl，37℃封闭2h。
所述步骤3)中具体步骤如下：加入样品和标准品，标准品共有6个，浓度分别为100、50、25、15、10、0μg/ml，每孔100μl，37℃反应90min。
所述步骤4)中具体步骤如下：用封闭液对抗SEO卵黄抗体用封闭液进行稀释，稀释比例为1：1000，每孔100μl，37℃反应1h。
所述步骤5)中具体步骤如下：用封闭液对HRP标记的兔抗鸡IgY用封闭液进行稀释，稀释比例为1：500，每孔100μl，37℃反应1h。
所述步骤6)中具体步骤如下：加入每孔100μl，TMB反应条件为室温避光反应5min左右，待一半标准品变蓝后立即每孔加入100μl 1M硫酸溶液。
所述步骤1)～5)中洗涤液为0.05％Tween20的PBS溶液，洗涤次数为3～5次，洗涤完成后拍干。
本发明的有益效果在于：
1.本发明所述试剂盒和方法不仅能有效对新型肠毒素O进行定性分析，还能有效对新型肠毒素O进行定量检测；
2.所述检测方法特异性强、敏感性高、操作简便、性能稳定。可应用于临床上大批量样本的检验，在食品卫生学检验和流行病学调查中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒得到的标准曲线。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1试剂的配制以及样品的准备
试剂盒用到的酶标板为96孔聚苯乙烯酶标板；包被抗体为兔抗SEO多克隆抗体浓度为2.056μg/ml；封闭液浓度为10％的脱脂奶粉，检测抗体为卵黄抗SEO多克隆抗体；酶标二抗为市售辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡IgY，购自北京博奥森生物技术有限公司；显色液为市售TMB显色液，购自北京索莱宝科技有限公司；终止液为1M H2SO4；样品包括待检样品和标准品。以上溶液中包被液由pH＝9.6的碳酸盐缓冲液制成；样品稀释液由pH＝7.4的1×PBS制成；检测抗体及酶标抗体由包被液制成；洗涤液由含0.05％Tween20的PBS溶液制成。
用到的兔抗SEO多克隆抗体的制备方法为：将重组表达的SEO与氢氧化铝佐剂等量混合作为免疫原，免疫健康新西兰白兔，进行以下免疫程序：注射方式为皮下多点免疫，每隔两周免疫一次，免疫三次后心脏采血，收集血清，将其作为本试剂盒的检测抗体。
卵黄抗SEO抗体由重组表达的SEO与等量氢氧化铝佐剂混合后免疫成年雌性白洛克鸡，进行以下免疫程序：注射方式为肌肉注射，每隔两周免疫一次，免疫三次后收集卵黄，纯化后作为卵黄抗体。
实施例2样品检测
使用实施例1的试剂盒，通过检测样品的OD450与标准曲线进行换算，可以得到样品中SEO的浓度，具体操作步骤如下：
1)加入包被抗体：将制备好的兔抗SEO用包被液进行稀释，以每孔100液进包被至酶标板中，4℃过夜。
2)封闭：洗板后加入200μl封闭液，37℃封闭2h。
3)加入抗原：本实施例一共采用了3种待检样品，分别为6个标准品、1个阳性对照及1个阴性对照。标准品为用PBS稀释到浓度为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、15μg/ml、10μg/ml、0μg/ml；阳性对照为浓度为50μg/ml的SEO；阴性对照为PBS。洗板后将上述样品依次加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育1h。
4)加入检测抗体：洗板后将稀释好的卵黄抗体加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育1h。
5)加入酶标二抗：洗板后将稀释好的HRP标记的兔抗鸡IgY酶标二抗加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育45min左右。
6)显色：洗板后每孔加入100μl显色液，避光显色5min左右，加入100μl终止液，用酶标仪检测OD450的吸光度。
上述步骤中的洗板的具体实施方式为：倒掉酶标板中的液体后，每孔加入200μlTween20浓度为0.05％PBS溶液，轻拍几下酶标板，再倒掉板中液体，重复以上步骤3～5次后在干净的纸上将酶标板拍干。
根据标准品的OD450及其对应的浓度，在Excel中绘制散点图，求得标准曲线对应的方程和R2值，如图1所示。同时，上述步骤中也可加入未知浓度的待检样品，根据标准曲线的方程求得样品中所含SEO的浓度。
实施例3试剂盒性能检测
(1)标准曲线
由图1可知，本发明检测试剂盒在线性良好，y＝0.0072x+0.1063，R2＝0.9947，最低检测下线为8μg/ml。即当样本中所含SEO浓度超过8μg/ml时可判断其为阳性样本，当样本中所含SEO低于8μg/ml时，由于其不被包被抗体或检测抗体所识别，不足以引起足够的信号，被判定为阴性。
(2)灵敏度
将空白对照重复测量20次，计算平均吸光度(x)及标准差(s)，根据标准曲线求得
对应的灵敏度为0.107μg/ml。
(3)重复性
①批内重复
取同一批组装试剂盒，对4份不同样品(浓度分别为100、50、15、0μg/ml)进行检测，每个样本重复5次，分析结果。
②批间重复
取3个不同批次组装的试剂盒的ELISA板，对上述样品进行检测，分析结果。重复性结果如表1所示。
表1 检测样品的变异系数
通过重复性实验可以看出本方法批内变异系数<10％，批间变异系数<15％,说明本方法有良好的重复性。
(4)特异性
对SEO，TSST-1，SEA，SEG，SEM及SEI同时进行检测，结果如表2所示：
表2 特异性实验结果
由表2可知，除SEO外其他待检样品在100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml时P/N值均小于2.0，说明本试剂盒具有良好的特异性。
(5)检测seo阳性菌株产SEO情况
将山羊奶、牛奶、饲料、地面、养殖场水样、肛拭子、空气中分离到的金黄色葡萄球菌进行PCR检测seo基因，将阳性菌株用脑心浸出液培养24h后取上清进行ELISA检测，当待检样品OD450/阴性对照OD450>2.0时该样品判定为阳性，带入标准区县后求得具体SEO产量，检测结果如表3所示：
表3 seo阳性菌株产SEO情况
| 样本类型 | seo阳性样本数量 | ELISA阳性数量 | SEO检出量(μg/ml) |
| 山羊奶 | 6 | 6 | 23.401-156.250 |
| 牛奶 | 7 | 7 | 124.278-159.643 |
| 饲料 | 5 | - | - |
| 地面 | 6 | - | - |
| 养殖场水样 | 1 | 1 | 15.441 |
| 肛拭子 | 23 | 5 | 15.571-55.635 |
| 空气 | 2 | - | - |
注：“-”表示未检出
由表3可以看出，山羊奶、牛奶、养殖场水样中所有seo阳性菌株均产SEO蛋白，肛拭子中部分seo阳性菌株产SEO蛋白，饲料、地面及空气中seo阳性菌株不产SEO蛋白。以上结果说明本方法能够很好地与PCR结合判断seo阳性菌株是否产SEO蛋白。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于金黄色葡萄球菌新型肠毒素O的检测，所述检测试剂盒包含以下试剂：兔抗SEO血清、包被抗体稀释液、洗涤液、封闭液、标准品、样本稀释液、抗SEO卵黄抗体、HRP标记的兔抗鸡IgY酶标二抗、TMB、终止液。
2.一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素O的双抗夹心法，其特征在于，使用权利要求1所述的试剂盒，具体包括以下步骤：
1)包被抗体包被酶标板，洗去未结合的抗体，该包被抗体为兔抗SEO血清；
2)加入封闭液，洗去多余封闭液；
3)加入样品和标准品，孵育后洗板；
4)加入抗SEO卵黄抗体，反应后洗板；
5)加入以HRP标记的兔抗鸡IgY为酶标二抗，反应后洗板；
6)加入显色液后加入终止液终止反应，酶标仪检测OD450吸光度；
7)根据标准品OD450值得标准曲线，将样品的OD450值带入标准曲线即可求得样品中SEO的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中兔抗SEO血清用包被液稀释至的浓度为2.056μg/ml，4℃过夜。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述封闭液为10％的脱脂奶粉，37℃封闭2h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中样品和标准品的反应时间为90min，标准品共有6个，浓度分别为100、50、25、15、10、0μg/ml。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述抗SEO卵黄抗体用封闭液进行稀释，稀释比例为1：1000，反应时间为1h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5)所述HRP标记的兔抗鸡IgY用封闭液进行稀释，稀释比例为1：500，反应时间为45min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6)所述显色液为TMB，反应条件为室温避光反应5min左右；所述终止液为硫酸溶液，浓度为1M。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)～5)中洗涤液为含0.05％Tween20的PBS溶液，洗涤次数为3～5次，洗涤完成后拍干。
10.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒检测的吸光度与样品中SEO浓度的函数关系为y＝0.0072x+0.1063，R2＝0.9947。
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