CN109521199B - 一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒及其应用，该胶体金检测试剂盒包括检测试纸条和微孔试剂，所述检测试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上具有检测线和质控线，所述检测线包被有抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体1A1；所述微孔试剂为含有胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体5F1的微孔；本发明胶体金检测试剂盒检测灵敏度高、耗时短，检测效率高；此外，操作简单，操作难度低，成本低，适于基层检测实验室推广应用。

Description

一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及禽白血病病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒及其应用。
背景技术
禽白血病(Avian Leukosis Disease)是由禽白血病病毒(Avian LeukosisVirus，ALV)引起的病毒性传染病，是由禽C型反录病毒群的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要是淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病。此外还可引起骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内皮肿瘤等。大多数肿瘤侵害造血系统，少数侵害其他组织。
禽白血病病毒ALV属于反转录病毒科α反转录病毒属。根据其囊膜蛋白的抗原性，迄今为止已将ALV分为A-J十个亚群。ALV主要引起鸡群感染、发病，既可引起免疫抑制、生产性能下降等亚临床致病作用，还能诱发各种急性或慢性的不同细胞类型的肿瘤。随流行毒株变异及鸡群遗传背景的不同而表现出诸如纤维肉瘤、淋巴肉瘤、成红细胞瘤、髓细胞样肿瘤、组织细胞瘤、骨硬化症等不同肿瘤。
禽白血病呈世界性分布，并且可垂直传播，严重制约着养禽业的发展。目前该病尚无切实可行的治疗方法，也无有效的疫苗，唯一有效的控制方法是净化。ALV传播方式有垂直传播和水平传播，传染源是病鸡和带毒鸡。有病毒血症的母鸡，其整个生殖系统都有病毒繁殖，以输卵管的病毒浓度最高，特别是蛋白分泌部，因此其产出的鸡蛋常带毒，孵出的雏鸡也带毒。这种先天性感染的雏鸡常有免疫耐受现象，它不产生抗肿瘤病毒抗体，长期带毒排毒，成为重要传染源。
为了从根源上控制禽白血病，中国不同的种鸡场和原种鸡场都根据自身特点制定了切实可行的净化方案。这些净化方案的核心关键就是要多次检测、剔除阳性鸡，确保种群的干净和纯粹。
目前检测禽白血病的主要方法有酶联免疫法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等，其中ELISA方法主要以ALV保守基因P27表达的P27蛋白为检测目标，通过检测P27蛋白判断鸡是否感染ALV。因使用方便，可批量检测，ALV的ELISA方法在实际检测中有大量应用，国内外也有商品化产品，如美国IDEXX、荷兰BioChek以及美国Affinitech等。
此外，中国也有一些禽白血病抗原ELISA检测相关专利，如申请号为201310161174.1的发明专利“一种用于检测禽白血病P27的酶联免疫反应载体及试剂盒”公布的禽白血病ELISA检测方法，采用多克隆抗体包板，酶标单抗检测，孵育时间为1小时45分钟，最后通过酶标仪检测；申请号为201210113675.8的发明专利“检测禽白血病群检测禽白血病特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒”公开的是间接双抗体夹心ELISA，其采用单抗包板，多抗夹心，二抗检测，整体耗时为2小时20分钟；陈晨等2005年在《禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化》(中国预防兽医学报,2005,27(6):535-539)公开的ELISA方法则与美国IDEXX公司的产品类似，整体反应时间也超过1小时。
由此可知，现有ELISA技术存在检测时间长，操作较为复杂，且需要酶标仪等缺陷，只能在化验室或者中心实验室开展检测，无法在基层养殖场大规模推广应用。
PCR方法与ELISA方法相比较，其缺陷更为明显，操作繁琐复杂，精密度要求高，而且PCR仪器昂贵，基层企业难以承担。
目前，胶体金检测技术在禽白血病检测中也有应用；例如申请号为申请号为201510573865.1的发明专利则基于单克隆抗体制备了禽白血病抗原检测试纸条，描述其检测P27蛋白的最低检出限为18.75ng/mL，试纸条的灵敏度为250TCID50/mL；该胶体金检测试纸条灵敏度较低，对目标消除净化效果较差。
发明内容
本发明实施例的第一目的在于提供一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒，用以解决现有技术中胶体金检测试剂盒灵敏度高，以及现有ELISA技术存在检测时间长，操作较为复杂，且需要酶标仪，只能在化验室或者中心实验室开展检测，无法在基层养殖场大规模推广应用的技术问题。
本发明实施例的第二目的在于提供一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒在检测禽泄殖腔拭子、胎粪、蛋清或血清样本中禽白血病病毒的应用。
为实现上述目的，本发明实施例提供一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒，所述胶体金检测试剂盒包括检测试纸条和微孔试剂，所述检测试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上具有检测线和质控线，所述检测线包被有抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体1A1；所述微孔试剂为含有胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体5F1的微孔。
本发明胶体金检测试剂盒检测灵敏度高、耗时短，检测效率高；此外，操作简单，操作难度低，成本低，适于基层检测实验室推广应用。
进一步地，本发明所述检测试纸条还包括PVC背板、吸水垫和样品垫。
进一步地，所述样品垫为聚酯纤维膜样品垫；更进一步地，所述聚酯纤维膜样品垫通过将聚酯纤维膜浸泡于3％蔗糖、1％吐温-20、0.05％叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液中1小时，随后，烘干得到；优选地，烘干温度为35-39℃，烘干时间为15-17h。
进一步地，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
进一步地，所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1由菌种保藏编号为：CGMCCNO.16202的杂交瘤细胞株(5F1)产生；更进一步地，所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1亚型为IgG2a。
进一步地，所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体1A1与所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1具有不同的结合位点；更进一步地，所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体1A1可以为本领域公知的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体；也可以通过如下方法筛选得到：
采用重组p27蛋白免疫小鼠，按照常规方法筛选制备p27蛋白特异性单克隆抗体，将其中效价较高的抗体用辣根过氧化物酶标记，与单克隆抗体5F1进行配对ELISA检测，筛选得到与5F1配对检测OD值高、效价高的单克隆抗体，即可作为所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体1A1。
进一步地，所述硝酸纤维素膜由包括如下步骤制备得到：
采用磷酸盐缓冲液分别将抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体1A1和羊抗鼠IgG抗体稀释至0.45-0.55mg/mL，再以0.08-0.12μl/mm喷量将抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体1A1和羊抗鼠IgG抗体稀释液分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置，烘干即得所述硝酸纤维素膜；优选地，所述磷酸盐缓冲液为含有3％甲醇、1％蔗糖、0.05％叠氮钠的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述微孔试剂由包括如下步骤制备得到：
(1)将胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1进行稀释，再将稀释液添加到酶标板中进行包被；优选地，稀释所采用的稀释液为0.04-0.06mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液；稀释后的胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1浓度为4-6μg/mL；包被温度为2-8℃，包被时间为14-18h；
(2)弃去酶标板孔中的包被液，并进行洗板、拍干，随后，向酶标板孔中添加0.8％-1.2％的牛血清白蛋白进行封闭；优选地，洗板采用的清洗液为浓度为0.1％pH 7.2的PBS-Tween溶液，洗板次数为3-5次，每次2-3min；封闭温度为36-38℃，封闭时间为1.5-2.5h；
(3)弃去酶标板孔中的牛血清白蛋白溶液，并进行洗板、拍干、真空干燥即得所述微孔试剂；优选地，洗板采用洗涤液为浓度为0.1％pH 7.2的PBS-Tween溶液，洗板1-2次，每次2-3min；真空干燥的真空度为5-15Kpa，时间为8-12h。
进一步地，所述胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1由包括如下步骤制备得到：
(1)在0.5-1.5ml 1.5％的胶体金溶液中添加1-10μl 0.1M的K2CO3溶液；
(2)将浓度为0.8-1.2mg/ml所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1溶液添加到胶体金溶液中，室温孵育；随后，向孵育后的溶液中添加牛血清白蛋白、混匀，离心收集沉淀物；优选地，抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1溶液的添加量为2-5μl；孵育时间为18-22min；离心转速为9000-12000r/min，离心时间为35-45min；
(3)采用磷酸盐缓冲液复溶沉淀物，即得胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1了；优选地，磷酸盐缓冲液为含有1％蔗糖、1％海藻糖、2％BSA、0.02％叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液。
上述制备方法中对胶体金的来源不做严格限制，例如，可以通过市场购买得到，也可通柠檬酸钠还原法制备得到；具体地，将0.01％氯金酸水溶液加热至沸腾，在持续搅拌的条件下加入1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热至溶液呈透亮的酒红色，室温冷却，再用去离子水恢复到原体积即得粒径为30-40nm胶体金颗粒；其中，柠檬酸钠水溶液与氯金酸水溶液的体积比为0.8％-2.5％。
本发明实施例提供一种胶体金检测试剂盒在检测禽泄殖腔拭子、胎粪、蛋清或血清样本中禽白血病病毒的应用。该应用能够实现对样本中禽白血病病毒的快速检测，检测时间不超过10min，而且检测效率、灵敏度较高，最低检测限能够达到0.5ng/ml。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明胶体金检测试剂盒无需特殊仪器设备，检测样本经裂解稀释后可直接检测，操作简单，操作难度低，成本低，适于基层检测实验室推广应用。
(2)本发明胶体金检测试剂盒整体检测时间小于10分钟，采样时间小于5分钟，耗时短，检测效率高。
(3)本发明胶体金检测试剂盒通过特定单克隆抗体的选择，提高了样本中禽白血病病毒的检测灵敏度，提高了目标消除净化效果。
附图说明
图1为本发明实施例6中胶体金检测试剂盒中检测试纸条的剖面结构示意图；
图2为本发明实施例6中胶体金检测试剂盒中微孔试剂的结构示意图；
图3为采用Western Blot方法鉴定实施例1制备的禽白血病病毒p27蛋白表达鉴定图；
图4为采用Western Blot方法鉴定实施例1制备的抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1的鉴定图。
图中：1-PVC背板样品垫；2-硝酸纤维素膜；3-检测线；4-质控线；5-样品垫；6-吸水垫；7-胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1；8-微孔；9-微孔盖帽。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例为禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
一、禽白血病病毒P27蛋白的制备：
根据GenBank序列号JF911742.1的序列设计引物，构建载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)构建重组工程菌；将表达禽白血病病毒P27蛋白的工程菌(命名为pET-28a(+)-P27-BL21(DE3))接种于含氨苄青霉素100μg/ml的LB液体培养基中，37℃下过夜活化；随后，以3％体积比将活化培养物接种于5ml的含氨苄青霉素100μg/ml的LB液体培养基中，在37℃培养至OD600nm达0.7时，加入异丙基硫代半乳糖苷，并使异丙基硫代半乳糖苷终浓度为0.2mmol/L，在37℃下以250r/min诱导4h后，收集菌液并移入离心管配平，在4℃条件下，以15000rpm离心30min，收集上清液并过0.22μm滤器，再经镍柱纯化，收集产物即得禽白血病病毒P27蛋白，并经SDS-PAGE鉴定，测定蛋白浓度后分装备用；
二、禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的制备和纯化
将50μg禽白血病病毒P27蛋白与等量弗氏佐剂混合乳化后，皮下多点注射免疫50只Balb/C小鼠；首次免疫时佐剂为弗氏完全佐剂，后续免疫佐剂为弗氏不完全佐剂；免疫间隔为2周，3次免疫后以直接ELISA测定血清效价；筛选血清效价高、交叉反应较小的小鼠按常规方法细胞融合，筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；筛选抗原为灭活的禽流感病毒、新城疫病毒、禽白血病病毒及重组P27蛋白抗原，并用阴性血清作为参考对照，通过筛选排除对所用的交叉反应物质有反应的单抗细胞株，保留只与禽白血病病毒及重组P27蛋白抗原反应的细胞株；经过筛选后获得了多株禽白血病病毒特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，选取其中效价较高的6株抗体进行扩大培养后以体内法诱生腹水，收集后经过饱和硫酸铵沉淀后，以Protein G柱纯化。
按照常规方法使用辣根过氧化物酶将所有6株抗体进行标记，并利用其两两配对，进行ELISA检测，具体操作如下：
(1)将6株单抗分别用0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至2μg/ml，分别按照50μl每孔加入酶标板中，在4℃下包被过夜、拍干液体，用0.01M PBS洗涤一遍，每孔加入150ul含1％明胶的0.01M PBS，在37℃下放置1h；
(2)将禽白血病A亚型病毒VR-335(美国ATCC产品)、禽白血病J亚型病毒CADC2010和禽流感AIV A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)均用PBS稀释200倍；将上述稀释的各病毒分别加入到ELISA板中，50μl每孔，在37℃孵育60min后，取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次后，甩干；
(3)用PBS溶液将6种辣根过氧化物酶标记的单抗作1000倍稀释后，每孔加入50μl，37℃孵育60分钟后，弃去反应液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次后，甩干；
(4)按照50μl/孔将底物溶液立即加入到ELISA反应板中，室温避光显色10分钟后，每孔加50μl终止液终止反应；
(5)反应终止后，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值；检测结果如表1所示。
表1ELISA检测结果
Figure GDA0001940514680000081
Figure GDA0001940514680000091
由表可知，单克隆抗体5F1与1A1、5F1、2A6均可配对成功，因此选取5F1于2018年7月27日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.16202。
同时，单克隆抗体5F1与1A1配对ELISA检测效价最高，并且产量较高，因此选取5F1与1A1作为配对抗体用于禽白血病病毒P27胶体金检测试剂盒。
实施例2
本实施例为胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)选取10ml质量浓度为1.5％的胶体金溶液至离心管中，并添50μl的0.1M K2CO3溶液；
(2)将20μl浓度为1mg/ml抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1溶液添加到胶体金溶液中，室温孵育20min；随后，向孵育后的溶液中添加牛血清白蛋白混匀，并使牛血清蛋白浓度为0.2％(w/v)，以10000r/min，离心40min收集沉淀物；
(3)采用含有1％蔗糖、1％海藻糖、2％BSA、0.02％叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液复溶沉淀物，即得胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1。
实施例3
本实施例为微孔试剂的制备方法，该制备方法由包括如下步骤：
(1)将胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1采用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液进行稀释至5μg/mL，再按照100μL每孔将稀释液添加到96孔酶标板中，在6℃下包被16h；
(2)弃去酶标板孔中的包被液，向酶标板每孔中添加300μL浓度为0.1％pH 7.2的PBS-Tween溶液进行洗板3次，每次3min，然后拍干，再向酶标板孔中添加200μL 1.0％的牛血清白蛋白，在37℃条件下封闭2h；
(3)弃去酶标板孔中的牛血清白蛋白溶液，向酶标板每孔中添加250μL浓度为0.1％pH 7.2的PBS-Tween溶液进行洗板3min，然后拍干，在真空度为10Kpa条件下，干燥10h即得微孔试剂。
实施例4
本实施例为一种硝酸纤维素膜的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
采用含有3％甲醇、1％蔗糖、0.05％叠氮钠的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液分别将羊抗鼠IgG抗体和实施例1制备的抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体1A1稀释至0.45-0.55mg/mL，再采用点膜仪以0.1μl/mm喷量将稀释液分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置，在37℃下烘干16h即得硝酸纤维素膜。
实施例5
本实施例为一种样品垫，该样品垫通过将聚酯纤维膜浸泡于含有3％蔗糖、1％吐温-20、0.05％叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液中1小时，随后，在37℃下烘干16h得到。
实施例6
本实施例为一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒，该胶体金检测试剂盒包括检测试纸条和实施例3制备得到的微孔试剂，其中，检测试纸条包括PVC背板1、吸水垫6、实施例5提供的样品垫5、实施例4制备得到的硝酸纤维素膜2；
如图1所示，硝酸纤维素膜2粘贴在PVC背板1上，硝酸纤维素膜2上具有有检测线3和质控线4，样品垫5粘贴在硝酸纤维素膜2上检测线3一侧的PVC背板1上，并且与硝酸纤维素膜2重合2mm；吸水垫6粘贴在硝酸纤维素膜2上质控线4一侧的PVC背板1上，并且与硝酸纤维素膜2重合2mm；
如图2所示，微孔试剂为8孔微孔试剂，包括胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1 7、微孔8和微孔盖帽9。
实验例1
本实验例为禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的鉴定，鉴定方法如下：
(1)将单抗采用PBS溶液作1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000和1:40000稀释；
(2)取p27蛋白包被板(0.1μg/ml)，以洗涤液300μl/孔洗板1次，弃去洗涤液，加入相应已稀释好的单克隆抗体，每孔50μl，每个单抗作5个重复孔，振荡混匀1分钟；在37℃孵育30分钟后，取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次后，甩干。
(3)将IgG1、IgG2b和IgG3用PBS溶液作1:1000稀释，将IgG2a和IgM用PBS溶液作1:5000稀释；每个单抗依次加入已稀释的IgG1、IgG2b、IgG3、IgG2a和IgM抗体，每孔加入100μl，4℃孵育过夜；
(4)将HRP标记的山羊抗兔IgG抗体用PBS作1:5000稀释后，每孔加入100μl，37℃孵育30分钟后，每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次，甩干；
(5)将底物溶液按照100μl/孔立即加入到反应板中，室温避光显色10分钟后，每孔加50μl终止液终止反应；
(6)反应终止后，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值，并通过比较每个单抗加入IgG1、IgG2b、IgG3、IgG2a和IgM抗体孔的OD450nm值，OD450nm最高者对应的亚类为对应单抗的亚类。
按照上述方法将实施例1制备的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1进行鉴定，鉴定结果如表2所示；
表2单克隆抗体5F1亚型鉴定结果
亚型抗体 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM
OD450 0.106 0.123 0.892 0.103 0.089
由表2可知，抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1亚型为IgG2a。
按照上述方法对实施例1制备的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体1A1进行鉴定，鉴定结果如表3所示；
表3单克隆抗体1A1亚型鉴定结果
亚型抗体 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM
OD450 0.098 0.119 0.932 0.114 0.107
由表3可知，抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体1A1亚型为IgG2b。
实验例2
采用间接ELISA鉴定禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体的特异性，具体操作如下：
(1)将单抗用PBS溶液作1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000和1:40000稀释。
(2)取P27蛋白包被板(0.1μg/ml)，以300μl/孔洗涤液洗板1次，弃去洗涤液；将禽白血病A亚型病毒VR-335(美国ATCC产品)、禽白血病B亚型病毒VR-658(美国ATCC产品)、禽白血病J亚型病毒CADC2010和禽流感AIV A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)均用PBS稀释200倍，将SPF鸡血清作为阴性对照并以PBS稀释100倍；将上述稀释的各病毒和SPF鸡血清分别加入到ELISA板中，50μl/孔，其中阳性及阴性对照血清各做2个重复；再加入已稀释好的单克隆抗体，每孔50μl，振荡混匀5分钟，在37℃孵育30分钟后，取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次后，甩干；
(3)将HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体用PBS溶液作1:100稀释后，每孔加入100μl，37℃孵育30分钟后，弃去反应液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次后，甩干；
(4)按照100μl/孔将底物溶液立即加入到ELISA反应板中，室温避光显色10分钟后，每孔加50μl终止液终止反应；
(5)反应终止后，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。
按照上述方法将实施例1制备的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1进行鉴定，鉴定结果如表4所示；
表4单克隆抗体5F1特异性鉴定结果
检测物 阴性对照 VR-335 VR-658 CADC2010 AIV
OD450 0.114 1.206 1.136 1.403 0.104
由表4可知：单克隆抗体5F1对禽白血病A亚群、B亚群和J亚群病毒均可检出，与AIV无交叉反应，可用于禽白血病检测。
按照上述方法将实施例1制备的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体1A1进行鉴定，鉴定结果如表5所示；
表5单克隆抗体1A1特异性鉴定结果
检测物 阴性对照 VR-335 VR-658 CADC2010 AIV
OD450 0.108 1.019 1.345 1.230 0.107
由表5可知：单克隆抗体1A1对禽白血病A亚群、B亚群和J亚群病毒均可检出，与AIV无交叉反应，可用于禽白血病检测。
实验例3
采用Western Blot方法鉴定实施例1制备的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1，检测结果如图3、图4所示；
由图3、图4可知，抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1在大约27kDa处形成了明显条带，即抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1与p27蛋白成功结合。
实验例4
本实验例为实施例6中用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒的检测稳定性试验:
将上述胶体金试纸条和微孔试剂分3个批次(NB20160812，NB20160826，NB20160905)，每个批次检测5份胎粪样本，每个样本重复检测2次，根据检测结果判定胶体金试纸条的检测稳定性，检测结果如表6所示。
表6胶体金试纸条的检测稳定性试验结果
Figure GDA0001940514680000141
由表6可知，在相同试验条件下用3个批次试纸条和微孔试剂，对同样的胎粪样品进行平行检验，样本1～4号检测结果均为阴性；样本5号检测均为阳性，检测结果一致，本发明制备的胶体金试纸条和微孔试剂的检测稳定性较高。
实验例5
本实验例为实施例6中用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒的特异性试验：
选取禽流感病毒(AIV，A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)，来自(Li,C.,etal.Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in MainlandChina.Virology 340(1),)；禽网状内皮组织增生症病毒(REV，CVCC AV107)，来自中国兽医药品监察所产品；马立克氏病病毒(MDV，VR-987)，来自美国ATCC产品；产蛋下降综合征病毒(EDS，CVCC AV71)，来自中国兽医药品监察所产品；传染性法氏囊病毒(IBDV，VR-478)，来自美国ATCC产品；采用实施例6用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒分别检测上述AIV、REV、MDV、EDS和IBDV，结果AIV、REV、MDV、EDS和IBDV均呈阴性；由此可知，本发明胶体金检测试剂盒特异性好。
采用实施例6用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒检测P27重组蛋白：
将纯化的P27蛋白用PBS梯度稀释至100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1和0ng/mL，用移液器吸取100ul稀释好的P27蛋白至微孔试剂中，将P27蛋白与金标抗体混匀后，插入试纸条；室温静置9分钟；
根据试纸条的显色情况判定结果：当试纸条的C线显色，T线颜色浅于C线时，检测结果为阴性；当试纸条的C线显色，T线颜色等于或深于C线时，检测结果为阳性，T线颜色越深，阳性越强；当试纸条的C线不显色，检测无效；每个浓度重复检测5次，具体检测结果如表7所示：
表7
Figure GDA0001940514680000151
Figure GDA0001940514680000161
由表7可知，P27稀释浓度为0.25ng/mL时，本发明的检测试剂盒检测结果为1个阳性，4个阴性；稀释浓度大于0.5ng/mL时，本发明的检测试剂盒检测结果全部为阳性，即本发明胶体金检测试剂盒灵敏度高，最低检测限为0.5ng/mL。
实验例6
本实验例为实施例6中用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒检测纯化的禽白血病病毒试验：
病毒样品为：纯化的禽白血病病毒禽白血病A亚型病毒VR-335(ATCC产品)、禽白血病B亚型病毒VR-658(ATCC产品)、禽白血病J亚型病毒CADC2010(由中国动物疾病预防控制中心提供)；
试验方法：
(1)将禽白血病A亚型病毒、禽白血病B亚型病毒和禽白血病J亚型病毒的细胞培养液(病毒效价为106.0TCID50/mL)，用50％灭菌甘油PBS稀释成1:100、1:1000、1:10000共计3个稀释度。
(2)取胶体金检测试剂盒分别检测A亚型病毒、B亚型病毒和J亚型病毒不同稀释度的细胞培养液，结果均呈阳性。
通过上述试验可知，本发明的胶体金试纸条可以识别常见A、B、J亚型禽白血病病毒，并且数据分析可知本发明胶体金试纸条对禽白血病病毒的检测极限至少可以达到100TCID50/mL。
实验例7
本实验例为实施例6中用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒检测临床禽泄殖腔拭子、胎粪和蛋清样品中禽白血病病毒的实验：
样品准备：临床采集禽白血病病毒阳性临床样品158份，其中阳性蛋清100份，阳性拭子50份，人工培养的禽白血病病毒8份；其中100份蛋清样品和50份拭子样品均采集自没有免疫的阳性鸡场，所有蛋清样品和拭子样品经IDEXX公司的禽白血病抗原ELISA检测试剂盒检测均为阳性。
实验方法：用不同批次的实验室制备的实施例6中的用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒(NB20160812，NB20160826，NB20160905)检测所有样品，计算阳性检出率；另将人工培养的8份禽白血病病毒样品进行1:16～1:1024连续倍比稀释后，再用3批禽白血病抗原检测试剂盒进行检测。
实验结果：采用不同批次的胶体金检测试剂盒，检测临床采集的100份阳性蛋清样品、50份阳性拭子和8份病毒样品，其阳性率分别为150/158，151/158，151/158，敏感性为94.9％，95.6％，95.6％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金检测试剂盒包括检测试纸条和微孔试剂，所述检测试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上具有检测线和质控线，所述检测线包被有抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体1A1；所述微孔试剂为含有胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体5F1的微孔；
所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1由菌种保藏编号为：CGMCC NO.16202的杂交瘤细胞株产生。
2.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
3.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1亚型为IgG2a。
4.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述检测试纸条还包括PVC背板、吸水垫和样品垫。
5.根据权利要求4所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫为聚酯纤维膜样品垫；所述聚酯纤维膜样品垫通过将聚酯纤维膜浸泡于磷酸盐缓冲液，烘干得到。
6.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜由包括如下步骤制备得到：
采用磷酸盐缓冲液分别将抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体1A1和羊抗鼠IgG抗体稀释至0.45-0.55mg/mL，再以0.08-0.12μl/mm喷量将抗禽白血病病毒p27蛋白的单克隆抗体1A1和羊抗鼠IgG抗体稀释液分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测线和质控线位置，烘干即得所述硝酸纤维素膜。
7.根据权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述微孔试剂由包括如下步骤制备得到：
(1)将胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1进行稀释，再将稀释液添加到酶标板中进行包被；
(2)弃去酶标板孔中的包被液，并进行洗板、拍干，随后，向酶标板孔中添加牛血清白蛋白溶液进行封闭；
(3)弃去酶标板孔中的牛血清白蛋白溶液，并进行洗板、拍干、真空干燥即得所述微孔试剂。
8.根据权利要求7所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1由包括如下步骤制备得到：
(1)在0.5-1.5ml 1.5％的胶体金溶液中添加1-10μl 0.1M的K2CO3溶液；
(2)将浓度为0.8-1.2mg/ml所述抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体5F1溶液添加到胶体金溶液中，室温孵育；随后，向孵育后的溶液中添加牛血清白蛋白、混匀，离心收集沉淀物；
(3)采用磷酸盐缓冲液复溶沉淀物，即得胶体金标记的抗禽白血病病毒p27蛋白的特异性单克隆抗体5F1。
9.权利要求1-8任一所述的胶体金检测试剂盒在检测禽泄殖腔拭子、胎粪、蛋清或血清样本中禽白血病病毒的应用。
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