CN110036976B - 一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用 - Google Patents
一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110036976B CN110036976B CN201910391512.8A CN201910391512A CN110036976B CN 110036976 B CN110036976 B CN 110036976B CN 201910391512 A CN201910391512 A CN 201910391512A CN 110036976 B CN110036976 B CN 110036976B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alv
- virus
- exosome
- exosomes
- positive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 title claims abstract description 26
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 28
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 118
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 21
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims abstract description 16
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 claims abstract description 16
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 241000323253 Avian leukosis virus ev/J Species 0.000 claims description 47
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 claims description 11
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 claims description 11
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 claims description 9
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 claims description 9
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 8
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 8
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 241001428887 Avian leukosis virus - RSA Species 0.000 claims description 2
- 101000839464 Leishmania braziliensis Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 208000004668 avian leukosis Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 10
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 10
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 10
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 9
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 6
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101000603407 Homo sapiens Neuropeptides B/W receptor type 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100038847 Neuropeptides B/W receptor type 1 Human genes 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001664176 Alpharetrovirus Species 0.000 description 1
- 101100449539 Arabidopsis thaliana GRP17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100411820 Arabidopsis thaliana RBG7 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100191768 Caenorhabditis elegans pbs-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000003566 sealing material Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/02—Breeding vertebrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用，发明人首次发现禽白血病病毒的垂直传递是由禽白血病阳性鸡的生殖系统来源的外泌体携带、介导并且感染受体鸡和后代小鸡的，提供了一种通过干预禽白血病阳性公鸡的精液外泌体从而阻断ALV垂直传播的方法和阻断剂。其有益效果在于，本发明所公开的与禽白血病病毒垂直传播相关的外泌体为治疗或预防禽白血病提供了新靶点，并且提供的阻断方法不受毒株亚群、变异的影响，从传播途径进行统一切断，针对范围广，方法简单快速，效果好。
Description
技术领域
本发明属于动物医学技术领域，更具体地，涉及一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用。
背景技术
禽白血病是由反转录病毒科、α反转录病毒属的禽白血病病毒(Avian LeukosisVirus，ALV)及肉瘤病毒群引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，ALV引起的禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的肿瘤性疾病，包括髓细胞性白血病、成髓细胞白血病、成红细胞性白血病和淋巴细胞性白血病，是威胁世界养禽业的主要疾病之一，给世界养禽业带来巨大损失。将禽白血病/肉瘤病毒群病毒划分为A-K 11个亚群，感染鸡的禽白血病病毒包括ALVA-E、J和K共7个亚群。
J亚群具有感染率高、传播速度快、宿主范围广、致死率高等特点，给养禽业造成了严重的危害和巨大的经济损失，引起了国内外兽医界的高度重视。ALV-J水平传播感染情况与鸡的年龄水平传播感染情况与鸡的年龄相关，较小年龄的禽类接触病毒后倾向于产生耐受的病毒血症，并大几率发生肿瘤；而在较老年龄的禽类接触病毒导致其产生免疫，可能会或不释放病毒。
垂直传播垂是ALV-J发生的主要途径。垂直传播主要是指亲本鸡的体内病毒通过种蛋传给下一代。垂直传播的的存在，使得淋巴白血病在鸡群中世代存在提供了途径。而母鸡较公鸡更容易发生淋巴白血病，因此，切断垂直传播途径尤为重要。
目前国内外尚无可有效防治J亚群禽白血病的药物和商品化疫苗，仅能通过淘汰阳性鸡、加强生物安全措施以达到控制的目的。减少种鸡群的感染率和建立无白血病的种鸡群是控制本病的最有效措施。种鸡在育成期和产蛋期各进行2次检测，淘汰阳性鸡。从蛋清和阴道拭子试验阴性的母鸡选择受精蛋进行孵化，在隔离条件下出雏、饲养，连续进行4代，建立无病鸡群。但由于费时长、成本高、技术复杂，一般种鸡场还难以实行。
发明内容
本发明针对于以上问题，提供一种简单、快速阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，所述方法为干预禽白血病阳性亲本生殖系统来源的外泌体。
本发明在研究感染禽白血病鸡的过程中，发现了禽白血病病毒的垂直传播依赖于亲本生殖系统来源的外泌体的参与，禽白血病病毒通过被此类外泌体包裹，运输，进而进入到子代胚体中，又在外泌体的帮助下不断增殖，感染细胞。
禽白血病阳性亲本生殖系统来源的外泌体，例如，阳性父本中运输禽白血病病毒的是精液外泌体，精液外泌体主要来源于其生殖细胞，阳性母本运输亲白血病病毒传播的外泌体的主要来源于其生殖道上皮细胞。
进一步，所述外泌体为禽白血病阳性父本的精液外泌体。
实际生产过程中，垂直传播是ALV发生的主要途径，且发明人发现阳性父本即阳性公鸡中精液外泌体中含有禽白血病病毒，且精液外泌体还是介导该类病毒从亲代传递到子代的重要载体。
进一步，所述干预为人工受精时，封闭或阻断禽白血病阳性父本的精液外泌体。
本发明所提供的方法是干预参与运输所述禽白血病病毒的外泌体的功能，而阻断该传播途径，特别是，当亲本中父本为感染者或携带者时，只需在人工授精时，将其精液外泌体封闭或阻断，即可达到干预目的。
进一步，所述禽白血病病毒为ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-D、ALV-E、ALV-J或ALV-K的一种或多种。
进一步，所述禽白血病病毒为ALV-J时，是本发明一个较优的实施方式，但并不局限于该亚群的病毒。
本发明同时保护所述阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法在鸡抗病育种中的应用。
本发明所提供的阻断鸡的禽白血病病毒垂直传播的方法，能够提高种公鸡利用率，ALV目前没有疫苗，生产上，很多具有优越生产性能的种公鸡一旦感染ALV，只能淘汰，人工受精的过程中阻断精液外泌体，可以阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，对高生产性能种公鸡和濒危品种尤为重要；此外，能够减少生产环节，提高生产效率，生产过程中，个体感染情况具有一定的不确定性，常出现假阳性或假阴性，造成潜在ALV传播，增加生产工作量和感染风险，需要不断净化和淘汰，本发明所述阻断方法，可以阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，更方便快速的杜绝这种潜在威胁。
本发明公开一种鸡的禽白血病病毒垂直传播的阻断剂，所述阻断剂为外泌体的封闭物。
利用外泌体封闭物将外泌体及其包裹在内的物质封存，阻止外泌体被目的细胞所吸收，进而阻止包裹于内的病毒遗传信息的释放。
进一步，所述封闭物包括外泌体抗体。
进一步，所述外泌体抗体为外泌体的跨膜蛋白抗体或热休克蛋白抗体中的一种或多种。
外泌体有由磷脂双分子层组成的胞外膜泡状结构，研究表明，外泌体跨膜蛋白与病毒入侵、肿瘤进展相关同时也与病毒介导的细胞融合相关，封闭这些蛋白，能够干预外泌体功能，从而抑制病毒的入侵、融合或增殖，起到阻断病毒的作用。
进一步，所述跨膜蛋白为CD9、CD63或CD81的一种或多种，所述热休克蛋白为HSP70。
本发明的研究过程中发现，在精液中添加CD9、CD63、CD81和/或HSP70能有效抑制禽白血病病毒的复制和表达，从而阻断该病毒在子代细胞中增殖和传播。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
发明人通过外泌体RNA的高通量测序和RT-PCR与Western Blot的检测，发现阳性精液外泌体可以携带病毒的遗传物质，并且可以体外感染DF-1细胞，在实际生产中，发明人用人工授精的方法模拟外泌体在垂直传播中的作用，验证了阳性公鸡的精液外泌体能够携带病毒成分感染母鸡，并且通过鸡蛋感染后代小鸡，并且通过封闭外泌体的跨膜蛋白，限制了ALV在细胞内的增殖，从而阻断了外泌体介导的ALV对母鸡和小鸡的感染。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次发现外泌体抗体可以结合到精液外泌体细胞膜上，抑制外泌体中ALV病毒的传播，从而抑制精液中ALV的感染能力，进而阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，为治疗或预防禽白血病提供了新靶点；
(2)提高种公鸡利用率，ALV目前没有疫苗，生产上，很多具有优越生产性能的种公鸡一旦感染ALV，只能淘汰，本发明所使用的方法可以阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，对高生产性能种公鸡和濒危品种尤为重要；
(3)减少生产环节，提高生产效率，生产过程中，个体感染情况具有一定的不确定性，常出现假阳性或假阴性，造成潜在ALV传播，增加生产工作量和感染风险，需要不断净化和淘汰，本发明的阻断方法可以阻断禽白血病病毒经公鸡精液垂直传播，因此能很好的杜绝这种潜在威胁；
(4)ALV易发生变异，很难针对各种亚群或变异型研发有统一功效的疫苗，而本发明所提供的方法不受毒株亚群、变异的影响，从传播途径进行统一切断，针对范围广，方法简单快速，效果好。
附图说明
图1为精液外泌体电镜下形态，其中A：8600×的视野观察；B：14000×的视野观察；C：18000×的视野观察。
图2为外泌体的标记蛋白western blot结果图。
图3为外泌体的病毒全基因组分段扩增。
图4为western检测外泌体的病毒蛋白表达情况图。
图5为用10nm胶体金颗粒标记gp85蛋白的免疫电镜照片。
图6为ALV-J特异性扩增图，其中M：DL2000marker，1：阴性对照，2：control，3：PBS4：50μg外泌体5：100μg外泌体。
图7为阳性外泌体感染细胞后病毒蛋白表达。
图8为不同封闭物对病毒增殖的抑制作用。
图9为不同封闭物对病毒蛋白表达的抑制作用。
图10为D组后代小鸡血浆感染细胞的间接免疫荧光，其中，荧光标记gp85，
A：D组后代小鸡血浆感染细胞 B：空白对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所使用的DF-1细胞为商品化细胞；SPF母鸡购自广东大华农有限公司SPF实验动物中心。
以下实施例以ALV-J病毒感染的情况为例。
实施例1
精液外泌体中内含物(ALV-J病毒成分)的确认
1)精液样品中外泌体的提取与纯化：用ALV-J感染公鸡，并采血检测病毒血症和p27抗体以确认公鸡持续带毒。分别采集感染了3只ALV-J公鸡和3只健康公鸡的精液，-80℃保存备用。以下实施例中，SEP为健康外泌体，SEN为阳性外泌体。
将精液样品进行4℃梯度离心，分别为1000g，10min；2400g，10min；10000g，30min以去除细胞和细胞碎片，用0.22μm滤膜过滤大分子杂质，用Exo-quick试剂盒(外泌体提取试剂盒)以4∶1的比例混合精液样品上清，过夜(＞12h)孵育，收集1500g，30min，4℃离心后的沉淀，用1/10原液体积的PBS重悬。
用Exosome-CD63 immunomagnetic bead试剂盒对初步提取的外泌体进行纯化。
2)精液外泌体的鉴定：
透射电镜观察外泌体形态，方法如下：
(1)取20μL外泌体悬浮液滴加到铜网上，室温静置5min使之吸附，滤纸吸去多余的液体；
(2)滴加2％的醋酸双氧铀于铜网上，室温染色不超过3min，滤纸吸干负染液后，自然晾干；
(3)将载有样品的铜网置于透射电镜中观察exosome的形态和大小。
电镜结果见图1，从精液中分离纯化的外泌体是有双层膜的囊泡，具有典型的cup-shaped结构，大小比较均一，证明提取纯化的为外泌体。
3)检测外泌体标志蛋白CD81、CD63、Hsp70，以及内质网蛋白GRP7和病毒蛋白gp37分别在健康外泌体(1～3)，阳性公鸡精液外泌体(4～6)，ALV-J病毒，阳性DF-1细胞和阳性精液中的分布情况(结果见图2)。注阳性DF-1为实施例2中用阳性精液外泌体感染的阳性细胞。
外泌体里含有许多生物活性的蛋白，有些是与外泌体的形成和分泌相关的；本实施例选取了几个重要的外泌体蛋白进行western blot检测；分别是外泌体的跨膜蛋白：CD9、CD63和分子伴侣HSP70蛋白，其中，GPR7为内质网标记蛋白，gp37为ALV-J病毒标记蛋白。
结果如图2所示，感染了ALV-J的阳性精液外泌体提取物和健康的精液外泌体提取物都能检测到外泌体的相关蛋白CD9、CD63和HSP70，且都没有GPR7，表明所提取的产物是外泌体；阳性精液外泌体，阳性公鸡细胞和阳性精浆中都含有外泌体和ALV-J病毒蛋白gp37，表明ALV-J病毒的阳性感染跟含有病毒成分的外泌体有关。
4)阳性感染细胞和阳性公鸡精液外泌体RNA的RT-PCR
(1)TRIZOL Reagent分别提取阳性感染细胞和阳性公鸡精液外泌体的RNA；
(2)分别反转录exo-RNA合成cDNA。
表1：反转录体系1
表2：反转录体系2
42℃ 2min后将混合溶液加入反转录体系2，反应条件37℃ 15min，85℃5s，4℃保存。
(3)全基因组分片段(片段A、B和C)PCR扩增
表3：ALV-J扩增片段引物序列和参数
表4：PCR反应体系3
94℃ 7min；94℃30s；56℃，30s；72℃2min；30个循环；72℃10min；4℃终止反应。
从图3结果可以看出，阳性感染细胞和阳性公鸡精液外泌体RNA能够扩增出ALV-J病毒蛋白的RNA序列，表明感染了ALV-J病毒的阳性细胞和公鸡精液外泌体中都含有ALV-J病毒的全基因组序列。
5)Western Blot检测外泌体里的病毒蛋白gp85和p27，检验阳性外泌体的病毒蛋白表达情况。
图4结果表明，以ALV-J病毒颗粒为阳性对照，在阳性精液外泌体中均有ALV-J病毒蛋白gp85和p27表达，而在健康公鸡精液外泌体中则没有对应ALV-J病毒蛋白的表达，表明阳性公鸡精液外泌体中含有ALV-J病毒的蛋白，为反转录病毒出芽提供了条件。
6)免疫电镜观察阳性精液外泌体中的病毒蛋白
(1)取20μL外泌体悬浮液滴加到铜网上，室温静置5min使之吸附，滤纸吸去多余的液体
(2)在铜网上滴加4％多聚甲醛静置10min，将外泌体固定；
(3)将铜网置于BSA封闭液中室温1h；
(4)将铜网置于一滴gp85抗体液中室温1h；
(5)铜网用PBS洗涤5次后，用10nm胶体金颗粒标记gp85抗体；
(6)最后再用醋酸双氧铀进行负染，透射电镜观察。
gp85抗体能够与外泌体中的标记蛋白gp85特异性结合，再用胶体金颗粒标记gp85抗体进行观察，结果见图5，电镜中观察到胶体金颗粒的位置即为外泌体中的gp85蛋白的位置，证明阳性外泌体中存在ALV-J病毒蛋白。
以上结果表明，禽白血病阳性公鸡的精液外泌体中含有ALV-J病毒的遗传和感染成分。
实施例2
ALV-J阳性鸡精液外泌体的感染性
1)阳性外泌体体外感染DF-1细胞：
(1)按照1×106/孔的比例接种DF-1细胞到六孔板，细胞密度到60-70％左右，加入50μg和100μg实施例1中得到的纯化了的阳性精液外泌体，孵育2h；
(2)换2％维持液，维持5天；
(3)用TRIZOL Reagent提取细胞RNA进行PCR检测。
表5：ALV-J特异性检测引物序列和参数
表6：扩增反应体系
反应条件：50℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s，34个循环；72℃，5min；4℃终止反应；用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果显示，见图6，DF-1细胞经阳性外泌体共同孵育后，细胞中有检测到ALV-J病毒RNA，证明ALV-J病毒能够通过外泌体进入细胞内，并且增殖。
(4)用RIPABuffer提取细胞蛋白进行Western Blot检测。
结果表明，见图7，DF-1细胞经阳性外泌体共同孵育后，细胞中有检测到ALV-J病毒的标记蛋白(本实施例中标记蛋白为gp85)，证明ALV-J病毒能够通过外泌体进入细胞内，并且利用细胞内物质进行病毒蛋白的翻译复制。
实施例3
一种ALV-J病毒垂直传播的阻断剂
(1)按照1×106/孔的比例接种DF-1细胞到六孔板，细胞密度到60-70％左右，分成9组，分别为加入50μg纯化了的阳性精液外泌体和5μg标记蛋白封闭物的实验组(4组)和只添加阳性精液外泌体，不添加对应标记蛋白封闭物的对照组(4组)，孵育细胞，收取12h，24h，36h和72h的细胞中ALV-J病毒RNA和蛋白进行检测。其中，本实施例选取外泌体常见的标记蛋白CD9、CD63、CD81和HSP70进行封闭。空白组为既不添加阳性外泌体也不添加封闭物的纯DF-1细胞培养。
封闭效果见图8，相比对照组，实验组中CD9、CD63、CD81和HSP70四种蛋白的封闭物的添加都能有效减少了ALV-J病毒在细胞内的增殖数量，降低了阳性外泌体对于细胞的感染，图9的结果表明，以ALV-J病毒蛋白gp37为指示蛋白，除了空白对照，添加有标记蛋白封闭物的实验组中，ALV-J病毒蛋白几乎没有表达，图8和图9共同说明，蛋白CD9、CD63、CD81和HSP70的封闭物都能有效抑制阳性外泌体对细胞的感染。
实施例4
一种阻断ALV-J垂直传播的方法
将15只26-27周龄SPF母鸡分为5组(如表7)，进行人工授精。其中SEP为健康外泌体，SEN为阳性外泌体，选用的阻断方法为E组：在SEP中添加阻断剂CD81，添加量为终浓度50μg/mL，其他为对照组。
表7：动物实验分组
1)母鸡病毒血症检测
授精后两周开始对各组母鸡进行每周采血检测：采集血液(不加抗凝剂)，放置37℃恒温箱2h，待析出血清后收集，用AXYGEN病毒核酸提取试剂盒提取病毒RNA(具体方法参考说明书)进行RT-PCR。
ALV-J特异性检测引物序列如下：
5’GGATGAGGTGACTAAGA；3’CGAACCAAAGGTAACACACG。
表8：扩增反应体系
反应条件：50℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s，34个循环；72℃，5min；4℃终止反应；用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2)母鸡p27抗体检测(一种试剂盒检测，检测外泌体攻毒后母鸡的感染情况)：采集血液(不加抗凝剂)，放置37℃恒温箱2h，待析出血清后收集；用Avian Leukosis VirusSubgroup J Antibody Test Kit进行抗体检测，具体方法参考试剂盒使用说明书。
3)母鸡病毒分离
(1)采母鸡抗凝血，用0.22μm滤膜过滤后与DMEM培养基1∶1稀释，用2mL接种长成单层的DF-1细胞，设置空白对照，2h后换含2％胎牛血清的DMEM维持液，培养至5天；
(2)用细胞DNA提取试剂盒提取细胞DNA；
(3)PCR。
表9：病毒基因扩增引物
表10：病毒基因扩增反应体系
反应条件：98℃，5min；98℃，10s；57℃，5s；72℃，2min，30个循环；72℃，10min；4℃终止反应。
(4)胶回收并进行测序鉴定。
结果如表11：
表11：各实验组母鸡ALV病毒感染情况
如表11结果所示，经过连续8周的检测，A组母鸡(健康精液+ALV-J病毒液)并没有检测到病毒血症，这表明单独的ALV-J病毒并不能直接通过生殖道感染母鸡；D组母鸡(健康精液+SEP)却能检测到病毒血症，表明母鸡能被阳性精液外泌体通过人工授精感染上ALV-J；但是E组母鸡(健康精液+SEP+CD81)也没有检测到病毒血症，这表明CD81抗体可以抑制阳性外泌体的感染。
4)小鸡病毒血症检测(方法同母鸡病毒检测)，结果如表12：
表12：A、B、C、D、E组母鸡和公鸡产下的小鸡感染情况
表12结果显示，A组小鸡(健康精液+ALV-J病毒液的后代)并没有检测到病毒血症，这表明单独的ALV-J病毒并不能直接通过胎盘传染小鸡；而D组的后代小鸡能检测到病毒血症，ALV-J病毒的垂直传播依赖于外泌体的辅助作用，并将D组小鸡血浆与DF-1细胞孵育，通过荧光抗体标记gp85蛋白进行间接免疫荧光(IFA)的观察(如图10)；E组的后代小鸡并没有检测到病毒血症；以上结果这表明阳性外泌体可以通过垂直传播感染后代小鸡，并且能被CD81抗体阻断其传播。
5)D组小鸡(设空白对照)间接免疫荧光检测
(1)将采集的D组小鸡的抗凝血与60％DF-1细胞孵育2小时；
(2)换2％维持液，维持2天；
(3)细胞固定：500μL PBS洗涤细胞两次，加入250μL 4％多聚甲醛室温孵育15min
(4)穿透：500μL PBS洗涤三次后加入0.2％Triton X-100孵育5min
(5)封闭：加入500μL BSA封闭液于室温静置1h；
(6)抗体孵育：室温孵育gp85抗体室温1h，洗涤三次后，孵育对应的荧光二抗于室温30min；用荧光显微镜观察。
结果如图10显示，D组小鸡的细胞中有检测到荧光标记的gp85，表明D组小鸡的体内感染有ALV-J病毒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种鸡的禽白血病病毒垂直传播的阻断剂，其特征在于，所述阻断剂为外泌体的封闭物；所述封闭物包括外泌体抗体；所述外泌体抗体为外泌体的跨膜蛋白抗体或热休克蛋白抗体中的一种或多种；所述阻断剂通过干预禽白血病阳性亲本生殖系统来源的外泌体发挥其阻断作用；所述外泌体为禽白血病阳性父本的精液外泌体。
2.根据权利要求1所述的阻断剂，其特征在于，所述禽白血病病毒为ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-D、ALV-E、ALV-J或ALV-K中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的阻断剂，其特征在于，所述禽白血病病毒为ALV-J。
4.根据权利要求1所述鸡的禽白血病病毒垂直传播的阻断剂，其特征在于，所述跨膜蛋白为CD9、CD63或CD81的一种或多种，所述热休克蛋白为HSP70。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910391512.8A CN110036976B (zh) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | 一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910391512.8A CN110036976B (zh) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | 一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110036976A CN110036976A (zh) | 2019-07-23 |
| CN110036976B true CN110036976B (zh) | 2021-12-07 |
Family
ID=67281599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910391512.8A Active CN110036976B (zh) | 2019-05-08 | 2019-05-08 | 一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110036976B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111939249B (zh) * | 2020-08-11 | 2023-05-23 | 贵州省畜牧兽医研究所 | 一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用 |
| CN114487386A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-05-13 | 吉林大学 | 一种禽源外泌体的elisa检测方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102905534A (zh) * | 2010-04-06 | 2013-01-30 | 约翰·W·霍拉迪 | 治疗癌症的方法 |
| CN107987136A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-05-04 | 清华大学 | Zikv-ns1蛋白及其在制备寨卡病毒传播阻断疫苗中的应用 |
| CN109069634A (zh) * | 2016-02-18 | 2018-12-21 | 国立大学法人京都大学 | 能够抑制外泌体中的遗传功能的复合物以及癌症增殖和/或转移抑制剂 |
| CN109423517A (zh) * | 2017-08-28 | 2019-03-05 | 中国医学科学院肿瘤医院 | 外泌体在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的用途 |
| WO2019050998A1 (en) * | 2017-09-05 | 2019-03-14 | GLAdiator Biosciences, Inc. | METHOD FOR TARGETING EXOSOMES |
| CN109521199A (zh) * | 2018-11-29 | 2019-03-26 | 中国动物疫病预防控制中心(农业农村部屠宰技术中心) | 一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006230400A (ja) * | 2005-01-26 | 2006-09-07 | Osaka Univ | 白血病浸潤精巣に由来する細胞集団から白血病細胞を除去する方法、及びそれに用いられる試薬キット |
| US20160287622A1 (en) * | 2013-11-18 | 2016-10-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for treating immune and viral disorders and modulating protein-rna interaction |
| CN105918311A (zh) * | 2016-07-01 | 2016-09-07 | 江苏省家禽科学研究所 | 一种畜禽精液消毒剂及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-05-08 CN CN201910391512.8A patent/CN110036976B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102905534A (zh) * | 2010-04-06 | 2013-01-30 | 约翰·W·霍拉迪 | 治疗癌症的方法 |
| CN109069634A (zh) * | 2016-02-18 | 2018-12-21 | 国立大学法人京都大学 | 能够抑制外泌体中的遗传功能的复合物以及癌症增殖和/或转移抑制剂 |
| CN109423517A (zh) * | 2017-08-28 | 2019-03-05 | 中国医学科学院肿瘤医院 | 外泌体在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的用途 |
| WO2019050998A1 (en) * | 2017-09-05 | 2019-03-14 | GLAdiator Biosciences, Inc. | METHOD FOR TARGETING EXOSOMES |
| CN107987136A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-05-04 | 清华大学 | Zikv-ns1蛋白及其在制备寨卡病毒传播阻断疫苗中的应用 |
| CN109521199A (zh) * | 2018-11-29 | 2019-03-26 | 中国动物疫病预防控制中心(农业农村部屠宰技术中心) | 一种用于检测禽白血病病毒的胶体金检测试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 外泌体在免疫学和病毒感染中的研究及应用;张玉嫱;《外泌体在免疫学和病毒感染中的研究及应用》;中国家禽;20151130;第37卷(第20期);第1页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110036976A (zh) | 2019-07-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jensen et al. | Isolation and propagation of a virus from a spontaneous mammary carcinoma of a rhesus monkey | |
| Vogt et al. | An avian leukosis virus related to RSV (O): properties and evidence for helper activity | |
| Malmquist et al. | Isolation, immunodiffusion, immunofluorescence, and electron microscopy of a syncytial virus of lymphosarcomatous and apparently normal cattle | |
| Eddy | Polyomavirus | |
| CN103667176A (zh) | 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用 | |
| CN110036976B (zh) | 一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用 | |
| CN113198011B (zh) | 一种鸭腺病毒3型菌株灭活疫苗及其应用 | |
| CN109837250B (zh) | 羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用 | |
| Takemoto et al. | Recovery of SV40 virus with genetic markers of original inducing virus from SV40-transformed mouse cells | |
| CN111474357A (zh) | 非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用 | |
| AU2020102162A4 (en) | Pig tonsil cell line susceptible to jev and construction method thereof | |
| Barth et al. | A nonimmunosuppressive helper virus allows high efficiency induction of B cell lymphomas by reticuloendotheliosis virus strain T. | |
| Svoboda et al. | Comparative study of RSV rescue from RSV‐transformed mammalian cells | |
| Cunningham | Studies on the cellular basis of IgM immunological memory: The induction of antibody formation in bone marrow cells by primed spleen cells | |
| Ihle et al. | Serological and virological analysis of NIH (NIH× AKR) mice: evidence for three AKR murine leukemia virus loci | |
| MXPA02010744A (es) | Eliminacion de reovirus de celulas neoplasticas mediadas por ras de composiciones celulares mezcladas. | |
| CN105121634A (zh) | 具有提高的病毒生产能力的细胞系及其生产方法 | |
| CN106754753B (zh) | 病毒培养方法 | |
| Ishimoto et al. | Presence of antibody against mouse fetal antigen in the sera from C57BL/6 mice immunized with Rauscher leukemia | |
| JP2003510067A (ja) | 鳥類胚盤葉細胞系 | |
| CN110079509B (zh) | 一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法 | |
| Busch et al. | Isolation, Ex Vivo Expansion, and Lentiviral Transduction of Alveolar Macrophages | |
| Ayalew et al. | Virulence of emerging arthrotropic avian reoviruses correlates with their ability to activate and traffic interferon-γ producing cytotoxic CD8+ T cells into gastrocnemius tendon | |
| Monti‐Bragadin et al. | Rescue of the genome of the defective murine sarcoma virus from a non‐producer hamster tumor cell line, pm‐1, with murine and feline leukemia viruses as helpers | |
| RU2702707C2 (ru) | Штамм бактериофага Bacillus anthracis Ф112PRE, используемый для специфической индикации возбудителя сибирской язвы |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |