CN114487386A - 一种禽源外泌体的elisa检测方法 - Google Patents

一种禽源外泌体的elisa检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114487386A
CN114487386A CN202210072178.1A CN202210072178A CN114487386A CN 114487386 A CN114487386 A CN 114487386A CN 202210072178 A CN202210072178 A CN 202210072178A CN 114487386 A CN114487386 A CN 114487386A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exosome
poultry
protein
antibody
elisa detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210072178.1A
Other languages
English (en)
Inventor
徐小洪
丁壮
丁伟
邹映雪
黄天鸿
曲书靚
苏佳鑫
刘婷婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN202210072178.1A priority Critical patent/CN114487386A/zh
Publication of CN114487386A publication Critical patent/CN114487386A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Abstract

本发明属于禽类疾病检测技术领域，具体涉及一种禽源外泌体的ELISA检测方法专利申请。所述禽源外泌体的ELISA检测方法，包括样本制备、包被、封闭、加样、检测、结果判定等步骤。现有技术中，基于外泌体的ELISA检测方法均以人源外泌体表面标志蛋白CD9、CD81为靶标，但由于这些标志蛋白并不适用于禽用，也即，无法适用于检测禽源外泌体检测。为此，本申请以禽源外泌体表面标志蛋白CD63为标志物，通过制备禽源CD63蛋白、并制备其对应多抗血清，进一步以此为基础，设计开发了禽源外泌体的ELISA检测方法，进而可为禽类相关生理工作研究奠定一定技术基础。

Description

一种禽源外泌体的ELISA检测方法
技术领域
本发明属于禽类疾病检测技术领域，具体涉及一种禽源外泌体的ELISA检测方法专利申请。
背景技术
外泌体是一种包含RNA、蛋白质等物质的粒径在40~100nm左右的囊泡状结构生物器，目前已知的大多数生物细胞均可以合成并向外释放外泌体。研究表明，外泌体膜富含脂筏，通过与细胞膜相融合的方式完成从细胞内到细胞外的释放过程。早期研究中，人们一直以为外泌体只具参与细胞间运输物质的功能，直到外泌体在细胞之间起到的信息传递功能被发现，才让科研人员对外泌体的产生方式、具体功能以及其发挥作用机制得以重新重视。一般认为，外泌体被细胞释放至细胞外后，可以被周围的受体细胞识别并进入受体细胞，在此过程中，其携带的各种分子被释放从而进入受体细胞，进而参与调控受体细胞的生物学活性。
研究表明，外泌体中可以包含不同的分子，除了会包含各种蛋白质外，还会包含mRNA、微小RNA等各种核酸。其中，微小RNA是一类可以对mRNA起到各种调节作用的非编码RNA，大小一般为17-23nt，并且部分研究报道认为许多微小RNA是潜在的预测性生物标志物。形态观察研究中，外泌体可经磷钨酸负染后使用透射显微镜进行观察，正常情况下具有杯状结构。另一方面，也可以借助大部分外泌体普遍具有的标志蛋白进行鉴定，如TSG101、CD9和CD81等。
病毒学研究表明，当病毒侵入宿主细胞后，可以借助宿主细胞内的细胞器编码病毒蛋白、上调或下调宿主细胞内致病基因的表达量、破坏宿主免疫系统等，最终导致宿主细胞的正常生理功能被破坏。在此过程中，病毒对于宿主细胞的侵袭以及大量复制传播，外泌体起到了非常重要的作用。病毒借助细胞释放的外泌体，将病毒的致病性蛋白甚至是基因组运输至机体各处，促进病毒在机体内大量扩散，导致机体免疫功能失调并产生免疫耐受。
目前针对外泌体的研究难点主要在于分离技术和检测技术。分离技术一般有：超速离心法、过滤离心法、密度梯度超速离心法、免疫磁珠结合超速离心法和色谱法等。检测技术主要包括：扫描电子显微镜观察形态(但SEM对样品的预处理和制备要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量，而且由于外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确的进行外泌体浓度的测量)、动态光散射技术(但由于动态光散射技术当前是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度)、纳米微粒追踪分析技术(是一种比较新颖的研究纳米颗粒的方法，可以直接和实时的观测纳米颗粒。由于外泌体表面有标志物CD9等跨膜分子的存在，在复杂的背景环境下(如血清中)，可以用荧光抗体标记外泌体， 再用NTA的荧光测量功能实现在复杂背景下对外泌体的测量， 但需要精密的仪器) 、流式细胞仪检测技术(流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量，而且通过荧光标记可以检测囊泡的来源，将囊泡进行分类，因此，流式细胞仪是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。但传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是300-500nm，而大多数细胞外囊泡的直径都在300nm以下，因此很难进行精确地定量和定性分析；另外，流式细胞分析一次一般只能针对一个标志物进行检测，而外泌体太小，现有流式细胞仪设备检测时，需要先绑定外来抗体包被的磁珠，操作需要精密的仪器设备，且操作繁琐、敏感度各异) 、免疫印迹检测技术(操作过程复杂) 和荧光定量PCR检测分析microRNA(提取核酸步骤复杂，需要昂贵的实验仪器)。
与其他物种中外泌体类似，禽源外泌体对于研究相关病毒的传播机制、病毒防控具有重要的技术意义，因此，基于上述各方法的优缺点，开发、设计一种适于禽用的较为快速、可靠、便捷、经济的检测外泌体的方法，对于禽类相关疾病的研究和防控具有十分重要的技术意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种禽源外泌体的ELISA检测方法，以便有效检测和定量禽源细胞上清和血清中外泌体的量，从而为相关病毒的发病机理、传播机制研究和相关疾病的防控奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种禽源外泌体的ELISA检测方法，该方法具体包括如下操作步骤：
（一）样本制备
收集禽类来源（禽源）的细胞无血清上清液100ml或血清2ml，室温（18~28℃）、2000g离心15分钟，以去除细胞及其残片，留上清；
将上述离心后上清液4℃、100000g离心60分钟，留沉淀（所保留沉淀即为禽源外泌体）；
将沉淀（外泌体）用PBS(pH 7.0) 重悬， 所制备重悬液即为待检外泌体重悬液，待检备用；
所述禽类，具体例如为鸡；
（二）包被、封闭
采用96孔酶标板，按每孔100μL量，将步骤（一）中所制备外泌体重悬液包被到96孔酶标板的板孔上，37℃孵育2小时后，移除上清液；
包被时，包被液为0.1M的NaHCO3， 使用时，优选在使用前事先置于4℃条件下放置2小时；
随后，按每孔100μL量，加入1%的BSA封闭液，轻轻摇匀，4℃过夜（或者37℃孵育1小时）以进行封闭；
封闭结束后，小心移除孔内液体， 再按每孔200μL量，用排枪对每孔添加PBS洗涤缓冲液(pH7.4)，静置3分钟后小心后移除孔内液体以进行洗涤；重复洗涤4次后拍干；
（三）加样、检测
对步骤（二）中封闭后的待检样本依次添加抗体和酶标反应物，之后加底物显色；具体而言：
按每孔100μL量，每孔加入1：200-1：500的anti-CD63抗体， 轻轻摇匀， 37℃孵育1小时；随后小心移除孔内液体， 再按每孔200μL量，加入PBS洗涤缓冲液(pH 7.4) ， 静置3分钟后 小心移除孔内液体以进行洗涤；重复洗涤4次后拍干；
在上述加入抗体孔板上，按每孔100μL量，每孔加入1：2000-1：5000的HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶），轻轻摇匀，37℃孵育1小时；随后小心移除孔内液体， 再按每孔200μL量，每孔PBS洗涤缓冲液(pH 7.4) ， 静置3分钟后 小心移除孔内液体以进行洗涤；重复洗涤4次后拍干；
加底物显色时，按每孔100μL量，每孔加入TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）显色液（参考采用天根生化科技（北京）有限公司的可溶型单组分TMB底物溶液 (PA107)产品），37℃避光显色15分钟，再观察结果；
反应结束后，按每孔50μL量，每孔加入2mol/L的H2SO4 终止反应；
随后，在酶标仪内测OD450值，并记录结果；
每次检测时，同时设定空白对照、阴性对照和阳性对照，每个样本重复3次；
所述空白对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为CD63蛋白，正常加入二抗HRP，但不加入一抗（一抗为抗CD63抗体anti-CD63）；
所述阳性对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为CD63蛋白，正常加入一抗和二抗；
所述阴性对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为BSA，正常加入一抗和二抗；
（四）结果判断
依据酶标结果，当试验组OD450/阴性对照组OD450值大于或等于2.1时，判定为阳性，即判定待检外泌体重悬液含有外泌体；
进一步地，依据事先制作标准曲线，再将具体酶标检测定结果和标准曲线的对比，可对待检样品中禽源外泌体的相关浓度或含量进行进一步定量分析。
所述标准曲线构建时，具体可参考如下：
在上述步骤（一）中，选择健康禽源样本作为标准品，然后将所获得的外泌体悬液，按照10倍系列稀释法，稀释成不同浓度标准品（以6个梯度为例，具体为：原液、1：10、1：100、1：1000、1：10000和1：100000），相同操作条件下，对每个梯度的稀释液分别进行ELISA检测，并据此检测结果的吸光度值建立对应的曲线， 即为ELISA检测标准曲线。
机体被病毒侵入感染后，会第一时间激活体内细胞的一系列信号通路并最终激活机体的非特异性免疫应答，紧接着被激活的细胞就开始合成并释放干扰素及一系列抗病毒因子。机体内发生的一系列上述反应可以有效抑制侵入机体的病毒在机体内持续感染，同时可以促进产生一系列非特异性免疫应答。在此过程中，不同病毒感染会对不同细胞的外泌体组分产生影响，一方面病毒可以通过外泌体促进自身的复制与传播，另一方面机体可以通过外泌体发挥抗病毒免疫功能。因此，借助于外泌体中特定组分检测，可为病毒感染及与宿主细胞互作机制研究奠定一定基础。
现有技术中，基于外泌体的ELISA检测方法均以人源外泌体表面标志蛋白CD9、CD81为靶标，但由于这些标志蛋白并不适用于禽用，也即，无法适用于检测禽源外泌体检测。为此，本申请以禽源外泌体表面标志蛋白CD63为标志物，通过制备禽源CD63蛋白、并制备其对应多抗血清，进一步以此为基础，设计开发了禽源外泌体的ELISA检测方法，进而可为禽类相关生理工作研究奠定一定技术基础。
总体上，与现有技术相比，本发明的主要创新点体现在如下几个方面：
1) 本发明利用外泌体跨膜蛋白CD 63这一特有的标志物， 建立了一种ELISA反应体系和快速检测方法，该反应体系与检测方法，可用于检测禽源外泌体的含量，具有高度特异性的特点；
2) 本发明的检测对象是禽源外泌体，适用范围广，本发明的检测方法也不需要昂贵且精密的实验仪器，具有很大的应用前景。
附图说明
图1为CD63特异性引物PCR鉴定电泳图；其中M：5000bp DNA Marker；1：重组质粒pET28a-CD63采用CD63特异性引物的PCR结果，片段大小约为2141bp；
图2为原核表达质粒的酶切鉴定电泳图；其中M：5000bp DNA Marker；1：重组质粒pET28a-CD63酶切结果，结果可见5300bp的载体片段及2141bp的CD63基因片段；
图3为CD63蛋白Western Blot鉴定图；其中M：蛋白分子量标准；
图4为外泌体的透射电镜图；
图5为所制备标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请技术方案做进一步解释说明。在介绍具体实施例前，为便于本领域技术人员详细了解本申请的相关研发情况，就下述实施例中所涉及的部分实验材料、检测方法等背景性实验情况简介如下。
生物材料：
相关引物合成及测序工作，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成提供；
鸡，取11日龄SPF鸡胚（Merial，China），分离CEF（鸡胚成纤维细胞），加入含有10%胎牛血清（FBS）（BI，USA）、100U /ml青霉素和100 µg/ ml链霉素的DMEM（Hyclone，USA），于37℃、5%CO2条件下培养CEF；
待密度达95%时将培养基替换为不含FBS的DMEM，并加入PBS或新城疫病毒 NA-1毒株（MOI=0.5）（以避免血清中外泌体残留）；
静置48h后收集细胞上清液，经0.22μm滤器过滤后，再100000g（Beckman Coulter480 Instruments）4℃离心60min；将超离产物用PBS洗涤1次后重悬于PBS中，通过BCA蛋白质测定试剂盒检测其浓度后储存于-80℃备用。
主要试剂：
青霉素-链霉素溶液（双抗）和PEG 6000粉末购自于北京索莱宝公司；
DMEM高糖培养基及DMEM/F12（1：1）培养基购自于Hyclone公司；
胎牛血清（FBS）购自于BI公司；
pEasy-T Simple、HiFi DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和感受态E.coli DH5α购自于北京全式金生物技术有限公司；
限制性内切酶XhoⅠ和限制性内切酶NheⅠ购自TaKaRa公司；
鼠抗His单克隆抗体购自于Earthox公司；
HRP标记兔抗鸡IgY二抗购自Bioworld公司；
protein A/G磁珠购自MCE公司；
实验过程中所用转膜液、PBS、PBST、封闭液、PEG 6000缓冲液、洗脱液、分离液等，参考现有技术常规配制即可，不再赘述；
主要仪器：
PCR仪PTC-100，美国BIO-RAD公司产品；
倒置生物显微镜CKX31，日本OLYMPUS公司产品；
酶标仪ELX800，美国BioTek公司产品。
实施例1
本申请所提供禽源外泌体的ELISA检测方法，以禽源CD63作为靶标，因此首先需要制备相关获得相关重组蛋白，以便后续检测应用。因此，本实施例首先就相关重组蛋白的制备过程简介如下。
（一）设计引物并进行PCR扩增
根据现有禽CD63序列，通过对密码子进行优化、切除信号肽，同时引入XhoⅠ和NheⅠ酶切位点及His标签，重新设计编码序列（2142bp，如SEQ ID No.1所示）如下：
GCTAGCATGGAGGAACTCCGCGTTGCGTTTTCTATTCTGGTACTGTGTGCCGCAGGTTCTTGGGGTTCCAACATTTGTGCAACTCGTGGCGTGACCTCTTGTAAACAGTGCCTGGCTGTTTCTCCGCTGTGTGCATGGTGCTCCGCCGAAGTTGTTGCCCAGTCTACCCCACGTTGCGATCTGTTCGCAAACCTGCTGCAGAACGGTTGCGGTCGTGATTTTATTGAATTCCCGCGTTCTTCCATCACGGTTCTGGAAGAACGTCCACTGTCCGATAAAGGTTCCGGCGGTAGCACTACCACGCAGATGAGCCCGCAGCGTATTCAACTGAACCTGCGTCCAGACGATAGCCAGATGTTCCGTGTTCACGTCCGTCAGGTTGAAGACTACCCGGTCGATATTTACTACCTGATGGATCTGAGCAACTCCATGAAAGACGACCTGAAAAACATCCAGAACCTGGGCACCAAACTGGCTTCCGAAATGCGTAAACTGACCAGCAACCTGCGTATTGGCTTCGGTGCGTTCGTGGATAAACCGATCAGCCCGTACATGTACATCAGCCCGCCGGAGGCGATTAAAAACCCGTGTTATGAAATCGGTGAAAAATGCCTGCCGATGTTCGGTTATAAACACGTACTGACGCTGACCGACGAAGTTATGCGTTTTAATGAAGAAGTTAAAAAACAGTCTGTCTCTCGTAACCGCGATGCGCCGGAAGGTGGTTTCGACGCTATCATCCAGGCTACCGTCTGCGACGAAAAAATCGGTTGGCGTAACGACGCCTCCCACCTGCTGGTGTTCACCACGGATGCCAAGACTCACATCGCGCTGGATGGTCGTCTGGCTGGTATTGTTCAGCCGAACGACGCTCAGTGTCACATCGACAAAGACAACTTCTACTCTGCGAGCACTACCCTGGACTACCCGAGCCTGGGCCTGATGACTGAAAAGCTGTCTCAAAAGAATATCAACCTGATCTTTGCTGTTACGGATACTGTCGTAGGCCTGTACCAAAACTACTCTGAACTGATCCCGGGCACGACTGTTGGTACTCTGTCTCGCGACTCCTCCAACGTACTGCAGCTGATCGTGGACGCGTACGGCAAAATCCGTAGCAAAGTTGAACTGGAAGTGCGTGACCTGCCGGAAGAACTGTCTCTGTCTTTCAACGCTACCTGTCTGAACGATGAAGTGATCACCGGTCTGAAATCTTGTATGGGTCTGAAAATTGGCGATACTGTTTCCTTCTCCATTGAAGCAAAAGTTCGCGGCTGCCCGCAGGAACGTCAGAAGTCTTTTACGATTAAACCAGTGGGTTTCAAAGACAGCCTGACCGTTGTCGTAAACTTTGACTGTAACTGCTCCTGCGAAAGCCAGGCCGAAGCAAACAGCAGCTTCTGTAGCAAAGGTAATGGTTCCCTGGAGTGTGGTGTATGCCGCTGTAATCCAGGTCGTCTGGGCAGCCACTGTGAATGCAGCGAAGAAGAATATAATCCGAGCGAACAGGATAACTGTAGCCCGCAACCAGGTCAGCCGCTGTGTTCTCAGCGTGGTGAGTGTATCTGCGGTCAGTGCGTTTGTCATGGCTCCGATTTCGGTAAAGTTACCGGCAAATACTGTGAATGTGATGATTTCTCTTGCGTTCGCTTCAAAGGTCAAATGTGCAGCGGCCACGGTCAGTGCTCCTGTGGTGACTGCCTGTGTGATAGCGACTGGACCGGCGACTACTGCAACTGCACCACCCGTACCGACACCTGTATGTCTTCTAACGGTCTGGTTTGCAGCGGCCACGGTATCTGCGTTTGCGGTAAATGCGACTGTATCCAGCCGGGCTCTTACGGCAACACCTGCGAAAAATGCCCGACCTGCTCTGACGCTTGCACTATTAAAAAAGAATGCGTCGAATGTAAAAAGTACGAGCGCGGTACCCTGGTCGAACAACAGTCTTGCGGCCGCGTCTGCCGCGATGAAATCGAAACTGTCCAGGAACTGGGTGACCGTGGCAAGGACGCAGTCAACTGTACTTACAAAGATGAGAATGATTGCGTAGTTCGTTTCCAGTATTACGAAGACAGCTCCGGTAAAAGCATTCTGTACGTGATCGAAGAACCGGAGTGCCCGCTCGAGGTCTGGCCCCTT。
随后，设计PCR扩增用引物序列如下：
CD63-NheⅠ-F：5’- GCTAGCATGGAGGAACTCCG-3’；（其中“GCTAGC”分序列为NheⅠ酶切位点）
CD63-XhoⅠ-R：5’- CTCGAGGTCTGGCCCCTT-3’；（其中“CTCGAG”分序列为XhoⅠ酶切位点）
最后，以前述合成序列为模板，利用上述引物进行PCR扩增获得CD63序列，并对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定（结果如图1所示），确保扩增正确后，回收扩增产物。
（二）质粒连接
将步骤（一）中所获得的CD63与T载体（pEasy-T Simple）连接，并进行测序鉴定，确保连接正确；
将连接正确的T载体质粒与及原核表达载体pET-28a分别用限制性内切酶XhoⅠ及NheⅠ双酶切后，回收酶切产物，并酶切产物用T4 DNA连接酶连接（室温连接30min），以将目的基因（CD63）重组到pET-28a质粒中；
随后，再将连接产物转化至感受态E.coli DH5α中，37℃培养后，挑取阳性单菌落，提取质粒后进行XhoⅠ及NheⅠ双酶切鉴定（鉴定结果如图2所示），并将鉴定正确的质粒进一步送至生工生物公司测序鉴定，最终获得构建正确的重组质粒：pET-28a-CD63。
（三）转化、筛选和诱导表达
将步骤（二）中的重组质粒pET-28a-CD63转化至感受态E.coli BL21中，37°C培养过夜，挑取阳性单菌落转接到5mL液体LB培养基（100μg/mL卡那霉素）中， 37°C、175rpm/min的摇床中振摇过夜培养；
次日，将菌液按1：1000的比例接种于500mL含50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，继续培养至菌液OD值为0.6时加入IPTG，进一步培养以诱导表达（30°C诱导表达8h）。
培养结束后，超声处理以破碎细胞，并进行蛋白提取，具体操作参考如下：
取500mL诱导表达后菌液，离心后弃去上清，用30mL超声缓冲液（5mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，20mmol/L PBS，pH7.5）将菌液沉淀重悬，冰浴条件下超声破碎30min（功率38%，工作5s，间歇5s），直至离心管内液体澄清透明；
再次离心后收取上清，0.22μm过滤除去杂质；
利用目的蛋白与杂蛋白间镍离子结合率不同，将上述过滤液过镍柱以将表达产物进行纯化，最后再通过咪唑洗脱液将目的蛋白洗脱。
对洗脱后纯化产物进行Western Blot检测（结果如图3所示），并将鉴定正确蛋白于-80°C保存待用。
（四）制备一抗
参考现有常规操作，以步骤（三）所制备蛋白免疫家兔，制备获得获得兔抗鸡CD63抗体（anti-CD63抗体），即ELISA检测中所使用一抗。
实施例2
利用实施例1所制备的CD63蛋白及其相应抗体，发明人进一步绘制了标准曲线。
（一）样本制备
收集健康鸡的细胞无血清上清液，室温（25°C）、2000g离心15分钟，以去除细胞及其残片，留上清；
将上述离心后上清液4℃、100000g离心60分钟，留沉淀（所保留沉淀即为禽源外泌体）；
将沉淀（外泌体）用PBS(pH 7.0) 重悬， 所制备重悬液即为外泌体重悬液；
将所获得的外泌体悬液，按照10倍系列稀释法，稀释成不同浓度标准品；
对所制备外泌体进行电镜检测，结果如图4所示。可以看出，所得产物呈现典型的双层膜的碟状结构，直径在50-150nm之间，说明所制备样品中含有具有完整结构的外泌体，可用于进一步检测。
（二）包被、封闭
采用96孔酶标板，按每孔100μL量，将步骤（一）中所制备外泌体重悬液包被到96孔酶标板的板孔上，37℃孵育2小时后，移除上清液；
包被时，包被液为0.1M的NaHCO3， 使用时，优选在使用前事先置于4℃条件下放置2小时；
随后，按每孔100μL量，加入1%的BSA封闭液，轻轻摇匀，37℃孵育1小时以进行封闭；
封闭结束后，小心移除孔内液体， 再按每孔200μL量，用排枪对每孔添加PBS洗涤缓冲液(pH7.4)，静置3分钟后小心后移除孔内液体以进行洗涤；重复洗涤4次后拍干；
（三）加样、检测
对步骤（二）中封闭后的待检样本依次添加抗体和酶标反应物，之后加底物显色；具体而言：
按每孔100μL量，每孔加入1：200-1：500的anti-CD63抗体， 轻轻摇匀， 37℃孵育1小时；随后小心移除孔内液体， 再按每孔200μL量，每孔PBS洗涤缓冲液(pH 7.4) ， 静置3分钟后 小心移除孔内液体以进行洗涤；重复洗涤4次后拍干；
在上述加入抗体孔板上，按每孔100μL量，每孔加入1：2000-1：5000的HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶），轻轻摇匀，37℃孵育1小时；随后小心移除孔内液体， 再按每孔200μL量，每孔PBS洗涤缓冲液(pH 7.4) ， 静置3分钟后 小心移除孔内液体以进行洗涤；重复洗涤4次后拍干；
加底物显色时，按每孔100μL量，每孔加入TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）显色液（参考其说明书即可），37℃避光显色10~30分钟（具体例如为15分钟），再观察结果；
反应结束后，按每孔50μL量，每孔加入2mol/L的H2SO4 终止反应；
随后，在酶标仪内测OD450值，并记录结果；
每次检测时，同时设定空白对照、阴性对照和阳性对照，每个样本重复3次；
空白对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为CD63蛋白，正常加入二抗HRP，但不加入一抗（一抗为抗CD63抗体anti-CD63）；
阳性对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为CD63蛋白，正常加入一抗和二抗；
阴性对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为BSA，正常加入一抗和二抗；
据此检测结果的吸光度值建立对应的曲线， 即为ELISA检测标准曲线（结果如图5所示）。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 一种禽源外泌体的ELISA检测方法
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
gctagcatgg aggaactccg cgttgcgttt tctattctgg tactgtgtgc cgcaggttct 60
tggggttcca acatttgtgc aactcgtggc gtgacctctt gtaaacagtg cctggctgtt 120
tctccgctgt gtgcatggtg ctccgccgaa gttgttgccc agtctacccc acgttgcgat 180
ctgttcgcaa acctgctgca gaacggttgc ggtcgtgatt ttattgaatt cccgcgttct 240
tccatcacgg ttctggaaga acgtccactg tccgataaag gttccggcgg tagcactacc 300
acgcagatga gcccgcagcg tattcaactg aacctgcgtc cagacgatag ccagatgttc 360
cgtgttcacg tccgtcaggt tgaagactac ccggtcgata tttactacct gatggatctg 420
agcaactcca tgaaagacga cctgaaaaac atccagaacc tgggcaccaa actggcttcc 480
gaaatgcgta aactgaccag caacctgcgt attggcttcg gtgcgttcgt ggataaaccg 540
atcagcccgt acatgtacat cagcccgccg gaggcgatta aaaacccgtg ttatgaaatc 600
ggtgaaaaat gcctgccgat gttcggttat aaacacgtac tgacgctgac cgacgaagtt 660
atgcgtttta atgaagaagt taaaaaacag tctgtctctc gtaaccgcga tgcgccggaa 720
ggtggtttcg acgctatcat ccaggctacc gtctgcgacg aaaaaatcgg ttggcgtaac 780
gacgcctccc acctgctggt gttcaccacg gatgccaaga ctcacatcgc gctggatggt 840
cgtctggctg gtattgttca gccgaacgac gctcagtgtc acatcgacaa agacaacttc 900
tactctgcga gcactaccct ggactacccg agcctgggcc tgatgactga aaagctgtct 960
caaaagaata tcaacctgat ctttgctgtt acggatactg tcgtaggcct gtaccaaaac 1020
tactctgaac tgatcccggg cacgactgtt ggtactctgt ctcgcgactc ctccaacgta 1080
ctgcagctga tcgtggacgc gtacggcaaa atccgtagca aagttgaact ggaagtgcgt 1140
gacctgccgg aagaactgtc tctgtctttc aacgctacct gtctgaacga tgaagtgatc 1200
accggtctga aatcttgtat gggtctgaaa attggcgata ctgtttcctt ctccattgaa 1260
gcaaaagttc gcggctgccc gcaggaacgt cagaagtctt ttacgattaa accagtgggt 1320
ttcaaagaca gcctgaccgt tgtcgtaaac tttgactgta actgctcctg cgaaagccag 1380
gccgaagcaa acagcagctt ctgtagcaaa ggtaatggtt ccctggagtg tggtgtatgc 1440
cgctgtaatc caggtcgtct gggcagccac tgtgaatgca gcgaagaaga atataatccg 1500
agcgaacagg ataactgtag cccgcaacca ggtcagccgc tgtgttctca gcgtggtgag 1560
tgtatctgcg gtcagtgcgt ttgtcatggc tccgatttcg gtaaagttac cggcaaatac 1620
tgtgaatgtg atgatttctc ttgcgttcgc ttcaaaggtc aaatgtgcag cggccacggt 1680
cagtgctcct gtggtgactg cctgtgtgat agcgactgga ccggcgacta ctgcaactgc 1740
accacccgta ccgacacctg tatgtcttct aacggtctgg tttgcagcgg ccacggtatc 1800
tgcgtttgcg gtaaatgcga ctgtatccag ccgggctctt acggcaacac ctgcgaaaaa 1860
tgcccgacct gctctgacgc ttgcactatt aaaaaagaat gcgtcgaatg taaaaagtac 1920
gagcgcggta ccctggtcga acaacagtct tgcggccgcg tctgccgcga tgaaatcgaa 1980
actgtccagg aactgggtga ccgtggcaag gacgcagtca actgtactta caaagatgag 2040
aatgattgcg tagttcgttt ccagtattac gaagacagct ccggtaaaag cattctgtac 2100
gtgatcgaag aaccggagtg cccgctcgag gtctggcccc tt 2142

Claims (5)

1.一种禽源外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，该方法具体包括如下操作步骤：
（一）样本制备
收集禽类来源细胞无血清上清液或血清，室温、2000g离心处理，留上清；
将上述离心后上清液4℃、100000g离心60分钟，留沉淀；
再将沉淀用PBS 重悬， 所制备重悬液即为待检外泌体重悬液，待检备用；
（二）包被、封闭
将步骤（一）中所制备待检外泌体重悬液包被到酶标板的板孔上，孵育、包被；
随后，加入1%的BSA封闭液进行处理，以进行封闭；
封闭结束后，添加PBS洗涤缓冲液以进行洗涤；
（三）加样、检测
对步骤（二）中封闭后的待检样本依次添加抗体和酶标反应物，之后加底物显色；具体而言：
按每孔100μL量，每孔加入1：200-1：500的anti-CD63抗体， 孵育，并用PBS洗涤缓冲液洗涤；
在上述加入抗体孔板上，按每孔100μL量，每孔加入1：2000-1：5000的HRP，孵育，并用PBS洗涤缓冲液洗涤；
加底物显色时，按每孔100μL量，每孔加入TMB显色液，37℃避光显色15分钟，再观察结果；
反应结束后，加入2mol/L的H2SO4 终止反应；
随后，在酶标仪内测OD450值，并记录结果；
每次检测时，同时设定空白对照、阴性对照和阳性对照；
所述空白对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为CD63蛋白，正常加入二抗HRP，但不加入一抗anti-CD63；
所述阳性对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为CD63蛋白，正常加入一抗和二抗；
所述阴性对照，为将步骤（一）中待检外泌体重悬液替换为BSA，正常加入一抗和二抗；
（四）结果判断
依据酶标结果，当试验组OD450/阴性对照组OD450值大于或等于2.1时，判定为阳性，即判定待检外泌体重悬液含有外泌体。
2.如权利要求1所述禽源外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述CD63蛋白，采用如下步骤制备获得：
（一）设计引物并进行P CR扩增
首先，合成如SEQ ID No.1所示CD63蛋白的基因编码序列；
其次，设计对应的PCR扩增用引物序列如下：
CD63-NheⅠ-F：5’- GCTAGCATGGAGGAACTCCGC-3’；
CD63-XhoⅠ-R：5’- CTCGAGGTCTGGCCCCTT-3’；
最后，以前述合成序列为模板，利用上述引物进行PCR扩增获得CD63序列，并回收扩增产物；
（二）质粒连接
将步骤（一）中所获得的CD63与T载体连接，确保连接正确；
将连接正确的T载体质粒与及原核表达载体pET-28a分别用限制性内切酶XhoⅠ及NheⅠ双酶切后，回收酶切产物，并酶切产物用T4 DNA连接酶连接，以将目的基因CD63序列重组到pET-28a质粒中；
随后，再将连接产物转化至感受态E.coli DH5α中，筛选、鉴定获得构建正确的重组质粒：pET-28a-CD63；
（三）转化、筛选和诱导表达
将步骤（二）中的重组质粒pET-28a-CD63转化至感受态E.coli BL21中，筛选正确的转化菌株，并利用IPTG诱导表达；
诱导表达培养结束后，超声处理以破碎细胞，并进行蛋白提取获得CD63蛋白。
3.如权利要求2所述禽源外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述一抗anti-CD63，为利用CD63蛋白免疫家兔制备所得兔抗鸡CD63抗体。
4.如权利要求1所述禽源外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述禽类为鸡。
5.如权利要求1所述禽源外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，步骤（4）中，定量分析待检外泌体重悬液中外泌体含量时，事先制作标准曲线，所述标准曲线构建时，具体如下：
在上述步骤（一）中，选择健康禽源样本作为标准品，然后将所获得的外泌体悬液，按照10倍系列稀释法，稀释成不同浓度标准品，相同操作条件下，对每个梯度的稀释液分别进行ELISA检测， 并据此检测结果的吸光度值建立对应的曲线， 即为ELISA检测标准曲线。
CN202210072178.1A 2022-01-21 2022-01-21 一种禽源外泌体的elisa检测方法 Pending CN114487386A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210072178.1A CN114487386A (zh) 2022-01-21 2022-01-21 一种禽源外泌体的elisa检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210072178.1A CN114487386A (zh) 2022-01-21 2022-01-21 一种禽源外泌体的elisa检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114487386A true CN114487386A (zh) 2022-05-13

Family

ID=81472551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210072178.1A Pending CN114487386A (zh) 2022-01-21 2022-01-21 一种禽源外泌体的elisa检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114487386A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115047186A (zh) * 2022-06-15 2022-09-13 暨南大学 一种新型的外泌体检测方法
CN115902204A (zh) * 2022-09-23 2023-04-04 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种外泌体形式半乳糖凝集素9的检测方法与试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160041153A1 (en) * 2008-11-12 2016-02-11 Kirk Brown Biomarker compositions and markers
CN106053811A (zh) * 2016-06-05 2016-10-26 浙江大学 一种尿液外泌体elisa的检测方法及其应用
CN110036976A (zh) * 2019-05-08 2019-07-23 华南农业大学 一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160041153A1 (en) * 2008-11-12 2016-02-11 Kirk Brown Biomarker compositions and markers
CN106053811A (zh) * 2016-06-05 2016-10-26 浙江大学 一种尿液外泌体elisa的检测方法及其应用
CN110036976A (zh) * 2019-05-08 2019-07-23 华南农业大学 一种阻断鸡禽白血病病毒垂直传播的方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李莹等: "鸡胚来源的外泌体不同提取方法比较", 《广东农业科学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115047186A (zh) * 2022-06-15 2022-09-13 暨南大学 一种新型的外泌体检测方法
CN115047186B (zh) * 2022-06-15 2023-02-14 暨南大学 一种外泌体检测方法
CN115902204A (zh) * 2022-09-23 2023-04-04 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种外泌体形式半乳糖凝集素9的检测方法与试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schütze et al. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells
CN114487386A (zh) 一种禽源外泌体的elisa检测方法
CN113087779B (zh) 一种马尔尼菲篮状菌甘露糖蛋白、抗体、检测试剂及试剂盒
AU2021207690A1 (en) Activity-specific cell enrichment
JP5222813B2 (ja) 生体高分子物質の相互作用検出方法
WO2020048340A1 (zh) 一种基于全自动化学发光分析仪的血清tk1检测试剂盒
CN114594262A (zh) 基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用
Chen et al. Affinity maturation of anti-TNF-alpha scFv with somatic hypermutation in non-B cells
CN112433055A (zh) 一种基于报告基因方法检测pvrig抗体的生物学活性的方法
CN109837281B (zh) 特异性结合s100p蛋白的核酸适配体及其筛选、鉴定和应用
CN109554433B (zh) 一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法
CN114414808A (zh) 一种检测tigit抗体和pvrig抗体的协同生物学活性的方法
CN110006866B (zh) 一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒
CN114369154A (zh) 一种n-甲基-d-天冬氨酸受体重组抗原、其制备方法及含有该重组抗原的试剂盒
US20140335545A1 (en) Method for detecting compound-binding protein
CN117347621B (zh) 一种用蛋白模拟抗原-纳米抗体检测黄曲霉毒素b1的方法
CN114487448B (zh) 用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及应用
Schubert et al. Reproducible and easy production of mammalian proteins by transient gene expression in high five insect cells
CN116068198B (zh) Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用
CN109946450B (zh) 一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒
CN115819595B (zh) 一种抗lag3纳米抗体及其制备方法与应用
CN110004179B (zh) 一种大麻素类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒
NL2027065B1 (en) Hybridoma cell strain secreting monoclonal antibody against tobacco ringspot virus, antibody therefrom and antibody preparation method thereof
Schofield et al. Sequencing and affinity determination of antigen-specific B lymphocytes from peripheral blood
CN116804196A (zh) 一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220513