CN109554433B

CN109554433B - 一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

Info

Publication number: CN109554433B
Application number: CN201811653505.2A
Authority: CN
Inventors: 范春雷; 吴王亲; 武虎; 匡红; 刘美星; 莫一平
Original assignee: Hangzhou Kexing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Kexing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109554433A

Abstract

本发明建立了一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白RFP偶联于CD47蛋白羧基未端(C端)；青色荧光蛋白基因CyPet构建在SIRPα蛋白的下游，以及黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)3构建在PTPN11基因的下游，分别构建真核表达载体，并获得新型的稳转细胞系SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP‑1，以CD47‑RFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗SIRPα和抗CD47药的效应，可同时获得阻断功能与CD47/SIRPα信号通路的生物学效应数据，构建快速筛选抗CD47/SIRPα药物和评估其生物学效应的实验模型。

Description

一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

技术领域

本发明涉及一种基于CD47/SIRPα靶点的药物快速筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

CD47(Cluster of Differentiαtion 47，分化簇47)也被称为整合蛋白相关蛋白(IΑP)，是一种跨膜蛋白。CD47属于免疫球蛋白超家族，可结合配体血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα，Signal Regulatory Proteinα，信号调节蛋白α)。SIRPα是一个调节性膜糖蛋白，主要表达于髓细胞、干细胞或神经元。SIRPα的胞内域包含4个ITIMs(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，免疫受体基于酪氨酸的抑制域)，在SIRPα的胞外域结合CD47后传导信号至细胞内使ITIMs磷酸化，随即SHP磷酸酶，如PTPN11(PTPN11，SHP2：Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type11，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11型)被招募到细胞膜上并磷酸化激活酪氨酸激酶SHP2；同时SHP磷酸酶会抑制细胞表面肌凝蛋白的积累，并导致吞噬作用的抑制。肿瘤细胞表面高表达CD47。CD47作为一种不吃我信号通过CD47/SIRPα信号系统使肿瘤细胞避免被免疫系统的巨噬细胞吞噬，因而CD47/SIRPα是某些癌症的潜在治疗靶点。

基于CD47/SIRPα阻断功能的抗癌新药，包括抗CD47、抗SIRPα单抗药、小分子阻断剂、多肽阻断剂等的研发是目前医药领域热点之一。但目前为止尚未见有关基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的新药快速、高效而精准的筛选系统。

发明内容

本发明的目的是建立了一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物学效应的药物快速筛选方法。

本发明构思如下：

采用红色荧光蛋白tagRFP偶联于CD47蛋白羧基末端；青色荧光蛋白基因CyPet构建在SIRPα蛋白的下游，黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)₃构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游，将两个带有荧光蛋白标记基因的片段构建载体并在细胞内表达，建立稳转细胞系。将稳转细胞系诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂共同孵育，清洗非特异性结合后与加入CD47-tagRFP融合蛋白共孵育。通过检测红色荧光蛋白tagRFP荧光值判断该抗SIRPα或抗CD47药具有CD47/SIRPα阻断功能；通过检测CyPet/Ypet荧光值并与对照组比较，判断抗SIRPα或抗CD47药具有CD47/SIRPα阻断功能。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将第一荧光蛋白与CD47蛋白羧基末端连接构建重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白；

2)将第二荧光蛋白与构建在SIRPα蛋白的下游；将第三荧光蛋白基因构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游；在CMV启动子下分别连接SIRPα-第二荧光蛋白和SH2_PTPN11-第三荧光蛋白基因片段，构建表达质粒；

3)将CMV-SIRPα-第二荧光蛋白和CMV-SH2_PTPN11-第三荧光蛋白基因共转染到单核细胞系中，建立稳转细胞系；

4)稳转细胞系诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药孵育，清洗非特异性结合后与重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育；

5)分别检测第一、第二、第三荧光蛋白荧光值，并判断新药对CD47/SIRPα信号通路的阻断功能。

进一步地，第一荧光蛋白是tagRFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是青色荧光蛋白CyPet；第三荧光蛋白是黄色荧光蛋白Ypet。

进一步地，步骤1)中，将tagRFP基因与人全长CD47基因构建在同一个读码框使tagRFP接于CD47蛋白C端形成所述CD47-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。

进一步地，步骤1)中，将CD47-tagRFP基因通过EcoR I/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-CD47tagRFP；；将pCMV-CD47tagRFP与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-CD47tagRFP慢病毒，转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达CD47-tagRFP融合蛋白的CD47tagRFP/293细胞系；扩增该CD47tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化含重组CD47-RFP融合蛋白的膜碎片。

进一步地，步骤2)中，将CyPet偶联于SIRPα的C端，YPet偶联于PTPN11(SHP2)的C端。

进一步地，步骤2)中，将青色荧光蛋白CyPet基因构建在SIRPα蛋白基因的下游，通过EcoR I/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SIRPαCyPet；将黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)₃构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游，即SH2_PTPN11[MCLVKGDRRFSDEFTLHEMESGREAGMMEKARGEVLKKKLWKGKFQRGGF]-(G4S)₃-Ypet，并通过EcoR I/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SH2_PTPN11Ypet；将pCMV-SIRPαCyPet和pCMV-SH2_PTPN11Ypet分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-SIRPαCyPet和CMV-SH2_PTPN11Ypet慢病毒，共转染到人外周血的单核细胞THP-1中，建立SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1稳转细胞系。

进一步地，步骤4)中，使用佛波酯诱导稳转细胞系成巨噬细胞。

进一步地，步骤4)中，诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药，并加入CD47-tagRFP融合蛋白共同孵育；同时设立SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1细胞与CD47-tagRFP融合蛋白直接共孵育的对照组。

进一步地，步骤5)中，经缓冲液清洗去除非特异性结合后用流式细胞仪、或荧光酶标仪分析细胞表面的红色荧光蛋白RFP荧光值；按CyPet/Ypet荧光蛋白FRET法分析SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1细胞内的Ypet荧光值。通过药物组荧光值与对照组比较，判断抗SIRPα或抗CD47药对CD47/SIRPα阻断功能。

另一方面，本发明提供一种稳转细胞系，其能够筛选对CD47/SIRPα信号通路具有阻断功能的药物。

进一步地，该稳转细胞系中包含不同种类的荧光蛋白，分别与PTPN11基因和SIRPα基因连接，当CD47/SIRPα信号通路被阻断或正常连接时，能够激发不同的荧光信号。

进一步地，该稳转细胞系中的荧光蛋白分别是光谱吸收峰/发射峰为Ex/Em＝435/477nm的青色荧光蛋白CyPet；光谱吸收峰/发射峰为Ex/Em＝517/530nm的黄色荧光蛋白YPet。

另一方面，本发明提供一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将红色荧光蛋白tagRFP偶联于CD47蛋白羧基末端(C端)，制备CD47-tagRFP融合蛋白。

2)将青色荧光蛋白基因CyPet构建在SIRPα蛋白的下游，通过EcoR I/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SIRPαCyPet；将黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)₃构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游，通过EcoR I/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SH2_PTPN11Ypet；将pCMV-SIRPαCyPet和pCMV-SH2_PTPN11Ypet分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-SIRPαCyPet和CMV-SH2_PTPN11Ypet慢病毒，共转染到人外周血的单核细胞THP-1中，建立稳转细胞系SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1。

3)将SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1细胞诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药共孵育，同时加入CD47-tagRFP融合蛋白孵育；同时设立SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1细胞与CD47-tagRFP融合蛋白直接共孵育的对照组；

4)清洗去除非特异性结合后，检测细胞表面的红色荧光蛋白tagRFP荧光值；或按CyPet/Ypet荧光蛋白FRET法分析细胞内的Ypet荧光值，并与对照组比较。

5)依据荧光值判断抗SIRPα或抗CD47的新药对CD47/SIRPα信号通路的阻断作用。

进一步地，编码CD47-tagRFP融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；CD47-tagRFP融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

编码SIRPαCyPet融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO:3所示，表达后SIRPαCyPet融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

编码SH2_PTPN11Ypet融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO:5所示，表达后SH2_PTPN11Ypet融合蛋白的序列如SEQ ID NO:6所示。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)快速简便、低成本，系统除了必要的阻断效应实验步骤外无需另外处理，如用荧光素酶的话需裂解细胞并要用昂贵的荧光素酶试剂盒。本发明的方法可直接用活细胞，即测即得，并可进行动态监测。

(2)可用通用的流式细胞仪、荧光酶标仪等方法测定，适用绝大多数普通实验室。

(3)系统可精确反映抗SIRPα和抗CD47药的效应。

(4)使用活细胞检测，一个样本可同时获得CD47/SIRPα的阻断功能与CD47/SIRPα信号通路的生物学效应数据，为快速筛选抗CD47/SIRPα药物和评估其生物学效应提供了一个新型强有力的系统和实验模型。

附图说明

图1 pCMV-CD47tagRFP质粒图谱

图2 pCMV-SIRPαCyPet质粒图谱

图3 pCMV-SH2_PTPN11Ypet质粒图谱

图4A正常情况下，没有CD47与SIRPα结合，ITIMs无磷酸化，SH2_PTPN11Ypet则游离于细胞质内。

图4B当CD47与SIRPα结合时，ITIMs磷酸化，SH2_PTPN11Ypet则被招募到细胞膜下与磷酸化ITIMs结构域结合；414nm激发光被CyPet吸收产生475nm发射波，被Ypet吸收产生530nm发射波，故可检测530nm荧光判断SH2_PTPN11CyPet是否与ITIMs结构域结合。

图4C当有阻断功能的anti-CD47单抗与CD47结合时，阻断了CD47与SIRPα结合时，ITIMs去磷酸化，SH2_PTPN11Ypet又游离于细胞质内；414nm激发光被CyPet吸收产生475nm发射波，但Ypet的530nm荧光会很弱或无。

图5使用快速筛选系统筛选抗SIRPα单抗药。检测数据如图所示，空白组的平均荧光强度MFI(PE Texas Red)＝7.3；对照组的MFI(PE Texas Red)＝7928.6，是空白组的1086.1倍；实验组的MFI(PE Texas Red)各不相等，其中筛选出5个阻断性能优良(MFI(PETexas Red)≤500)的抗SIRPα单抗药，即anti-SIRPα-3_{MFI(PE Texas Red)}＝406.7；anti-SIRPα-10_{MFI(PE Texas Red)}＝106.7；anti-SIRPα-26_{MFI(PE Texas Red)}＝7.6；anti-SIRPα-33_{MFI(PE Texas Red)}＝120.3；anti-SIRPα-43_{MFI(PE Texas Red)}＝46.7。

图6使用快速筛选系统检测抗SIRPα单抗药的生物学效应。检测数据如图所示，空白组的平均荧光强度MFI(FITC)＝29.2；对照组的MFI(FITC)＝3839.2，为空白组的131.5倍；实验组的MFI(FITC)各不相等，其中可筛选出5个生物学效应优良(MFI(FITC)≤200)的抗SIRPα单抗药，即anti-SIRPα-3_MFI(FITC)＝226.3；anti-SIRPα-10_MFI(FITC)＝80.9；anti-SIRPα-26_MFI(FITC)＝32.9；anti-SIRPα-33_MFI(FITC)＝87.5；anti-SIRPα-43_MFI(FITC)＝51.8。

图7基于快筛系统筛选抗CD47单抗药。检测数据如图所示，空白组的平均荧光强度MFI(PE Texas Red)＝7.3；对照组的MFI(PE Texas Red)＝7929.1，是空白组的1086.2倍；实验组的MFI(PE Texas Red)各不相等，其中筛选出7个阻断性能优良(MFI(PE Texas Red)≤500)的抗CD47单抗药，即anti-CD47-5_{MFI(PE Texas Red)}＝462.9；anti-CD47-12_{MFI(PE Texas Red)}＝36.9；anti-CD47-19_{MFI(PE Texas Red)}＝293.5；anti-CD47-29_{MFI(PE Texas Red)}＝82.6；anti-CD47-33_{MFI(PE Texas Red)}＝7.9；anti-CD47-48_{MFI(PE Texas Red)}＝342.8；anti-CD47-54_{MFI(PE Texas Red)}＝73.9。

图8基于快筛系统检测抗CD47单抗药的生物学效应。检测数据如图所示，空白组的平均荧光强度MFI(FITC)＝29.3；对照组的MFI(FITC)＝3843.6，为空白组的131.2倍；实验组的MFI(FITC)各不相等，其中可筛选出7个生物学效应优良(MFI(FITC)≤255)的抗SIRPα单抗药，即anti-SIRPα-5_MFI(FITC)＝253.6；anti-SIRPα-12_MFI(FITC)＝47.2；anti-SIRPα-19_MFI(FITC)＝171.5；anti-SIRPα-29_MFI(FITC)＝69.3；anti-SIRPα-33_MFI(FITC)＝33.1；anti-SIRPα-48_MFI(FITC)＝195.4；anti-SIRPα-54_MFI(FITC)＝65.1。

图9 Elisa法筛选抗SIRPα单抗药。检测数据如图所示，空白组的OD(450nm，下同)＝0.2；对照组的OD＝1.8，是空白组的9倍；实验组的OD值各不相等，其中筛选出15个阻断性能较好(OD≤0.5)的抗SIRPα单抗药，即anti-SIRPα-1OD＝0.5；anti-SIRPα-3OD＝0.3；anti-SIRPα-5OD＝0.5；anti-SIRPα-10OD＝0.2；anti-SIRPα-12OD＝0.3；anti-SIRPα-15OD＝0.4；anti-SIRPα-16OD＝0.5；anti-SIRPα-19OD＝0.4；anti-SIRPα-26OD＝0.2；anti-SIRPα-31OD＝0.4；anti-SIRPα-33OD＝0.2；anti-SIRPα-41OD＝0.3；anti-SIRPα-43OD＝0.2；anti-SIRPα-44OD＝0.5；anti-SIRPα-45OD＝0.4。

图10 Elisa法筛选抗CD47单抗药。检测数据如图所示，空白组的OD＝0.2；对照组的OD＝1.8，是空白组的9倍；实验组的OD值各不相等，其中筛选出17个阻断性能较好(OD≤0.5)的抗CD47单抗药，即anti-CD47-3OD＝0.4；anti-CD47-5OD＝0.3；anti-CD47-18OD＝0.3；anti-CD47-19OD＝0.3；anti-CD47-21OD＝0.3；anti-CD47-22OD＝0.3；anti-CD47-23OD＝0.3；anti-CD47-29OD＝0.2；anti-CD47-33OD＝0.2；anti-CD47-35OD＝0.3；anti-CD47-36OD＝0.3；anti-CD47-39OD＝0.5；anti-CD47-42OD＝0.4；anti-CD47-47OD＝0.4；anti-CD47-45OD＝0.3；anti-CD47-49OD＝0.4；anti-CD47-54OD＝0.2。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1重组CD47-tagRFP融合蛋白的制备

将红色荧光蛋白tagRFP基因与人全长CD47基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白tagRFP接于CD47蛋白C端形成CD47-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。由于CD47与SIRPα的结合位点在胞外域的N端，故tagRFP接于CD47胞内域的C端，不影响CD47与SIRPα的结合。前后两端的限制性内切酶EcoRI(GAATTC)和SexAI(ACCTGGT)用于基因合成后连接于慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，获得质粒pCMV-CD47tagRFP(图1)，去掉了原质粒中的PGK启动子和Puro抗性基因，有利于提高慢病毒的转染效率，而阳性克隆的筛选可利用目标蛋白中tagRFP荧光蛋白直接用分选型流式细胞仪筛选或荧光显微镜下挑取。末端的6个His标签用于蛋白His亲和柱纯化以及用His₆抗体鉴定目标蛋白。Flag标签(DYKDDDDK)前面为CD47蛋白，后面为tagRFP蛋白；可用Flag抗体鉴定目标蛋白，蛋白纯化后还可以用肠激酶(特异性识别序列DDDDK)将CD47蛋白与tagRFP蛋白切开。CD47tagRFP融合蛋白的DNA基因序列(7-1662bp)如SEQ ID NO:1所示，表达后CD47tagRFP融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

将pCMV-CD47tagRFP与质粒pH1、pH2共转染至慢病毒包装系细胞293V，经5代或20天以上培养获得稳定表达目的蛋白细胞后，荧光显微镜下，用50μl的移液枪挑取高表达CD47-tagRFP融合蛋白的CD47-tagRFP/293细胞克隆。扩增收集该CD47-tagRFP/293细胞，可用匀浆、超声、或冷冻高压细胞破碎仪裂解细胞，1500g高速离心后取沉淀加His结合缓冲液，上Ni²⁺或Co²⁺His亲和法柱制备纯化重组CD47-tagRFP融合蛋白。

CD47-RFP融合蛋白的制备纯化和鉴定的具体过程包括：

(1)将扩增的CD47-RFP/293细胞离心收集，800g、4℃、20min；并用结合缓冲液(20mM Tris-HCl(PH8.0)、150mM NaCl、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupeptin、1mM的PMSF、0.1％DNA酶和0.05％RNA酶)、10％(V/V)Glycerol清洗三遍。

(2)沉淀细胞加入裂解结合缓冲液(按1g细胞湿重/mL缓冲液)，裂解结合缓冲液即为结合缓冲液中加有0.5％NP-40；冰浴研磨50次，并超声裂解10min(300w、工作3s、间隔10s)。

(3)高速(8,000g、4℃)离心20min，取上清过0.22μm滤膜，加入Ni²⁺-NTA-Sepharose亲和柱材料，混匀后，摇床4℃、140rpm/min震荡1-2小时。

(4)放入重力柱，先用结合缓冲液洗3遍，弃洗脱液；用清洗缓冲液(含60mM咪唑的结合缓冲液)清洗三遍。

(5)用洗脱液(含200mM咪唑的结合缓冲液)洗脱，收集洗脱液。

(6)用10KD蛋白分子量截留的超滤管离心(6000g、、4℃、30min)，浓缩蛋白；用PBSpH7.4置换3遍，收集蛋白液，因为CD47-tagRFP融合蛋白有红色荧光蛋白标签，纯化后的蛋白液显红色，红色越深目标蛋白浓度越高；蛋白液加15％甘油，分装于4℃保存。

(7)取2.5μL用BCA法测蛋白质浓度。

(8)取4μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后观察蛋白质纯度。

(9)Western-blot验证目标蛋白质特异性，包括用His₆抗体、Flag抗体、及CD47抗体验证。

如上述步骤中，获得的CD47-tagRFP融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，表达后CD47-tagRFP融合蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2质粒pCMV-SIRPαCyPet的构建

将青色荧光蛋白CyPet基因构建在SIRPα蛋白的下游，基因合成后用EcoRI(GAATTC)和SexAI(ACCTGGT)连接于慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，获得质粒pCMV-SIRPαCyPet(如图2所示)。SIRPαCyPet融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO:3所示，表达后SIRPαCyPet融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例3 pCMV-SH2_PTPN11Ypet质粒的构建

将黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G₄S)₃构建在PTPN11蛋白N端2个SH2结构域基因的下游，并克隆(EcoR I/SexA I)到慢病毒表达载体pLV-Puro的CMV启动子下游，获得质粒pCMV-SH2_PTPN11Ypet(如图3所示)。融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO:5所示，表达后SH2_PTPN11Ypet融合蛋白的序列如SEQ ID NO:6所示。

实施例4建立SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1稳转细胞系

将pCMV-SIRPαCyPet和pCMV-SH2_PTPN11Ypet分别与病毒蛋白pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备SIRPαCyPet和SH2_PTPN11Ypet慢病毒，并共转染人外周血的单核细胞THP-1，筛选克隆建立新型的SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1稳转细胞系。

青色荧光蛋白CyPet的光谱吸收峰/发射峰为Ex/Em＝435/477nm；黄色荧光蛋白Ypet的光谱吸收峰/发射峰为Ex/Em＝517/530nm。CyPet/Ypet是目前研究获得的动态范围最大的青/黄色FRET对[NguyenΑW,Dαugherty PS.Evolutionαryoptimizαtion offluorescent proteins for intrαcellulαr FRET.NαtBiotechnol,2005,23:355～360]。

将Ypet偶联于PTPN11蛋白N端1-244肽段(含2个SH2结构域)的C端；CyPet偶联于SIRPα的C端。当SIRPα-CyPet的胞外域与CD47结合时SIRPα-CyPet胞内域的ITIMs磷酸化，随即SH2_PTPN11Ypet被招募到细胞膜上与SIRPα-CyPet胞内域靠近；如果药物能阻断CD47与SIRPα的结合，则SH2_PTPN11Ypet不会被招募到细胞膜上去靠近SIRPα-CyPet胞内域磷酸化的ITIMs，故可利用预先设计好的CyPet/Ypet，青/黄色FRET对，分析判断药物有没有CD47/SIRPα阻断功能及其生物学效能(图4A、4B、4C)。

实施例5使用快速筛选系统筛选抗SIRPα单抗药

实验前，先用10-30ng/ml的佛波酯将SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1细胞诱导成巨噬细胞(Macrophages，

)。将SIRPαCyPet.SH2_PTPN11

细胞与各1μg/mL的49种待筛选抗SIRPα单抗药(αnti-SIRPα-1～αnti-SIRPα-49)分别孵育20分钟。洗去非特异性结合后，再与2μg/mL的CD47-tagRFP融合蛋白共孵育为实验组。同时设立不做任何处理的SIRPαCyPet.SH2_PTPN11

细胞为空白组；设立SIRPαCyPet.SH2_PTPN11

细胞与2μg/mL的CD47-tagRFP融合蛋白直接共孵育为对照组。共孵育至20分钟时，从上述组别中取部分细胞，洗去非特异性结合，用流式细胞仪分析细胞表面tagRFP(555/584nm)荧光值(如以BDFACSVerse^TM流式细胞仪PE Texas Red通道进行数据收集，下同)。

共孵育至2小时，取上述组别的剩余细胞，洗去非特异性结合后，按CyPet/Ypet荧光蛋白对(414/530nm)FRET法用流式细胞仪分析细胞表面Ypet荧光值(如以BD FACSVerse^TM流式细胞仪FITC通道进行数据收集，下同)。

检测数据如图5所示，空白组的平均荧光强度MFI(PE Texas Red)＝7.3；对照组的MFI(PE Texas Red)＝7928.6，是空白组的1086.1倍；实验组的MFI(PE Texas Red)各不相等，其中筛选出5个阻断性能优良(MFI(PE Texas Red)≤500)的抗SIRPα单抗药，从优到次顺序为：anti-SIRPα-26MFI(PE Texas Red)＝7.6；anti-SIRPα-43MFI(PE Texas Red)＝46.7；anti-SIRPα-10MFI(PE Texas Red)＝106.7；anti-SIRPα-33MFI(PE Texas Red)＝120.3；anti-SIRPα-3MFI(PE Texas Red)＝406.7。

检测数据又如图6所示，本实施例中空白组的平均荧光强度MFI(FITC)＝29.2；对照组的MFI(FITC)＝3839.2，为空白组的131.5倍；实验组的MFI(FITC)各不相等，其中可筛选出5个具有影响CD47/SIRPα信号通路生物学效应的优良(MFI(FITC)≤200)抗SIRPα单抗药，从优到次顺序为：anti-SIRPα-26MFI(FITC)＝32.9；anti-SIRPα-43MFI(FITC)＝51.8；anti-SIRPα-10MFI(FITC)＝80.9；anti-SIRPα-33MFI(FITC)＝87.5；anti-SIRPα-3MFI(FITC)＝226.3。

如图5、6所示，抗SIRPα单抗阻断SIRPα-CD47结合的能力和阻断CD47/SIRPα信号通路的生物学效应在本发明所述之体系中表现出很好的一致性。

如上所述，使用本发明所述之系统从49种待筛选抗SIRPα单抗药中筛选到5种具有较好阻断能力和生物学效应的抗SIRPα单抗药。进一步结合对比例1(具体实施见下文)的数据，证明本系统在反映抗SIRPα单抗药阻断SIRPα和CD47的结合上，其特异性、精确性和识别度是高度优于其他系统的。且同时还能体现其具有阻断CD47/SIRPα信号通路的生物学效应，即SIRPα-CD47的结合抑制了巨噬细胞对肿瘤细胞的的吞噬杀伤作用，而抗SIRPα单抗药对于SIRPα-CD47的阻断恢复了巨噬细胞对肿瘤细胞的的吞噬杀伤作用。

实施例6基于快筛系统筛选抗CD47单抗药

实验前，先用10-30ng/ml的佛波酯将SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1细胞诱导成巨噬细胞

实验组先将2μg/mL的CD47-tagRFP融合蛋白分别与各1μg/mL的54种待筛选的抗CD47单抗药(αnti-CD47-1～αnti-CD47-54)分别孵育20分钟。洗去非特异性结合后，再同SIRPαCyPet.SH2_PTPN11

细胞共孵育为实验组。同时设立不做任何处理的SIRPαCyPet.SH2_PTPN11

细胞为空白组；设立SIRPαCyPet.SH2_PTPN11

细胞与各2μg/mL的CD47-tagRFP融合蛋白直接共孵育为对照组。共孵育至20分钟时，从上述组别中取部分细胞，洗去非特异性结合，用流式细胞仪分析细胞表面tagRFP荧光值；

共孵育至2小时时，取上述组别的剩余细胞。洗去非特异性结合后，按CyPet/Ypet荧光蛋白FRET法用流式细胞仪分析细胞Ypet荧光值。

检测数据如图7所示，本实施例中空白组的平均荧光强度MFI(PE Texas Red)＝7.3；对照组的MFI(PE Texas Red)＝7929.1，是空白组的1086.2倍；实验组的MFI(PE TexasRed)各不相等，其中筛选出7个阻断性能优良(MFI(PE Texas Red)≤500)的抗CD47单抗药，从优到次顺序为：αnti-CD47-33MFI(PE Texas Red)＝7.9；αnti-CD47-54MFI(PE TexasRed)＝73.9；αnti-CD47-12MFI(PE Texas Red)＝36.9；αnti-CD47-29MFI(PE Texas Red)＝82.6；αnti-CD47-19MFI(PE Texas Red)＝293.5；αnti-CD47-48MFI(PE Texas Red)＝342.8；αnti-CD47-5MFI(PE Texas Red)＝462.9。

检测数据又如图8所示，本实施例中空白组的平均荧光强度MFI(FITC)＝29.3；对照组的MFI(FITC)＝3843.6，为空白组的131.2倍；实验组的MFI(FITC)各不相等，其中可筛选出7个阻断生物学效应优良(MFI(FITC)≤255)的抗SIRPα单抗药，从优到次顺序为：anti-SIRPα-5MFI(FITC)＝253.6；anti-SIRPα-33MFI(FITC)＝33.1；anti-SIRPα-12MFI(FITC)＝47.2；anti-SIRPα-54MFI(FITC)＝65.1；anti-SIRPα-29MFI(FITC)＝69.3；anti-SIRPα-19MFI(FITC)＝171.5；anti-SIRPα-48MFI(FITC)＝195.4。

如图7、8所示，抗CD47单抗阻断SIRPα-CD47结合的能力和阻断CD47/SIRPα信号通路的生物学效应在本发明所述之体系中表现出很好的一致性。

如上所述，使用本发明所述之系统从54种待筛选抗CD47单抗药中筛选到7种具有较好阻断能力和生物学效应的抗CD47单抗药。进一步结合对比例2(具体实施见下文)的数据，证明本系统在反映抗CD47单抗药阻断SIRPα和CD47的结合上，其特异性、精确性和识别度是高度优于其他系统的。且同时还能体现其具有阻断CD47/SIRPα信号通路的生物学效应，即SIRPα-CD47的结合抑制了巨噬细胞对肿瘤细胞的的吞噬杀伤作用，而抗CD47单抗药对于SIRPα-CD47的阻断恢复了巨噬细胞对肿瘤细胞的的吞噬杀伤作用。

对比例1：Elisa法筛选抗SIRPα单抗药。

先以250ng/mL浓度SIRPα蛋白过夜包被96孔板。洗板5次尽去非特异性结合后，实验组加入各1μg/mL的49种待筛选抗SIRPα单抗药(αnti-SIRPα-1～αnti-SIRPα-49)分别孵育30分钟。洗板5次尽去非特异性结合后，加入生物素标记的CD47蛋白，孵育30分钟；洗板5次尽去非特异性结合。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲合素，孵育30分钟。洗板5次尽去非特异性结合后，加底物TMB显色10分钟，随后加酸终止。同时设立不加任何单抗药和生物素标记的CD47蛋白，仅显色终止的为空白组；设立仅加辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲合素，随后显色、终止为对照组。最后以上各组用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D)值。

检测数据如图9所示，本对比例1中空白组的OD＝0.2；对照组的OD＝1.8，是空白组的9倍；实验组的OD值各不相等，其中筛选出15个阻断性能较好(OD≤0.5)的抗SIRPα单抗药，从优到次顺序为：αnti-SIRPα-10OD＝0.2；αnti-SIRPα-26OD＝0.2；αnti-SIRPα-33OD＝0.2；αnti-SIRPα-43OD＝0.2；αnti-SIRPα-3OD＝0.3；αnti-SIRPα-12OD＝0.3；αnti-SIRPα-41OD＝0.3；αnti-SIRPα-19OD＝0.4；αnti-SIRPα-31OD＝0.4；αnti-SIRPα-15OD＝0.4；αnti-SIRPα-45OD＝0.4；anti-SIRPα-1OD＝0.5；αnti-SIRPα-5OD＝0.5；αnti-SIRPα-16OD＝0.5；αnti-SIRPα-44OD＝0.5。

对比实施例5，以Elisa法筛选抗SIRPα单抗药，其特异性、精确性和识别度不如本文所述之系统，且仅能反映抗SIRPα单抗药对于SIRPα-CD47结合的阻断作用，不能获得是否具有阻断CD47/SIRPα信号通路生物学效应的数据。另外，以Elisa法进行筛选还有操作繁琐、特异性低、误差较大、试剂盒成本较高等缺点。

对比例2：Elisa法筛选抗CD47单抗药。

先以250ng/mL浓度CD47蛋白过夜包被96孔板。洗板5次尽去非特异性结合后，实验组加入各1μg/mL的54种待筛选抗CD47单抗药(anti-CD47-1～anti-CD47-54)分别孵育30分钟。洗板5次尽去非特异性结合后，加入生物素标记的SIRPα蛋白，孵育30分钟；洗板5次尽去非特异性结合。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲合素，孵育30分钟。洗板5次尽去非特异性结合后，加底物TMB显色10分钟，随后加酸终止。同时设立不加任何单抗药和生物素标记的SIRPα蛋白，仅显色终止的为空白组；设立仅加辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲合素，随后显色、终止为对照组。最后以上各组用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D)值。

检测数据如图10所示，本对比例中空白组的OD＝0.2；对照组的OD＝1.8，是空白组的9倍；实验组的OD值各不相等，其中筛选出17个阻断性能较好(OD≤0.5)的抗SIRPα单抗药，从优到次顺序为：αnti-CD47-29OD＝0.2；αnti-CD47-33OD＝0.2；αnti-CD47-54OD＝0.2；αnti-CD47-5OD＝0.3；αnti-CD47-18OD＝0.3；αnti-CD47-19OD＝0.3；αnti-CD47-21OD＝0.3；αnti-CD47-22OD＝0.3；αnti-CD47-23OD＝0.3；αnti-CD47-35OD＝0.3；αnti-CD47-36OD＝0.3；αnti-CD47-45OD＝0.3；αnti-CD47-3OD＝0.4；αnti-CD47-42OD＝0.4；αnti-CD47-47OD＝0.4；αnti-CD47-49OD＝0.4；αnti-CD47-39OD＝0.5。

对比实施例6，以Elisa法筛选抗CD47单抗药，其特异性、精确性和识别度不如本文所述之系统，且仅能反映抗CD47单抗药对于SIRPα-CD47结合的阻断作用，不能获得细胞信号通路应答的生物学效应数据。而且，以Elisa法进行筛选还有操作繁琐、非特异性干扰大、误差较大、试剂盒成本较高等缺点。

综上所述，本发明的筛选方法具有：1)快速简便、低成本，系统除了必要的阻断效应实验步骤外无需另外处理，即测即得，并可进行动态监测。2)可用通用的流式细胞仪、荧光酶标仪等多种方法测定，普适性好。3)系统可精确反映抗SIRPα和抗CD47药的效应，稳定性好，精确度高，特异性极高。4)一个系统可同时进行抗SIRPα药物和抗CD47药物的筛选，简便多用。5)一个样本可同时获得SIRPα/CD47的阻断功能与PTPN11信号通路的生物学效应数据。为快速筛选抗SIRPα/CD47药和评估其生物学效应提供了一个新型强有力的系统和实验模型。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特点的前体下，还可以做出变化和改进。这些变化和改进均属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州科兴生物科技有限公司

<120> 一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1689

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gaattcatgt ggccactggt ggccgccctg ctgctgggct ctgcctgctg tggcagcgcc 60

cagctgctgt tcaacaagac caagagcgtg gagttcacct tttgcaatga cacagtggtc 120

atcccttgtt ttgtgacaaa catggaggcc cagaatacca cagaggtgta cgtgaagtgg 180

aagttcaagg gcagggacat ctataccttt gatggcgccc tgaacaagtc caccgtgcca 240

acagacttca gctccgccaa gatcgaggtg agccagctgc tgaagggcga tgcctccctg 300

aagatggaca agagcgatgc cgtgtcccac accggcaatt acacatgcga ggtgaccgag 360

ctgacacggg agggagagac catcatcgag ctgaagtata gagtggtgtc ttggtttagc 420

cctaacgaga atatcctgat cgtgatcttc ccaatctttg ccatcctgct gttctggggc 480

cagtttggca tcaagacact gaagtaccgg agcggcggca tggacgagaa gaccatcgcc 540

ctgctggtgg caggactggt catcacagtg atcgtgatcg tgggagcaat cctgttcgtg 600

ccaggagagt attctctgaa gaacgcaacc ggactgggac tgatcgtgac cagcacaggc 660

atcctgatcc tgctgcacta ctacgtgttc agcaccgcca tcggcctgac atcttttgtg 720

atcgccatcc tggtcatcca ggtcatcgcc tacatcctgg cagtggtggg actgtccctg 780

tgcatcgcag catgtatccc aatgcacgga ccactgctga tctccggact gtctatcctg 840

gccctggcac agctgctggg actggtgtac atgaagtttg tggcctctaa tcagaagacc 900

atccagcccc ctggcatcac agattataag gacgatgacg ataagctcga gagcgagctg 960

attaaggaga acatgcacat gaagctgtac atggagggca ccgtgaacaa ccaccacttc 1020

aagtgcacat ccgagggcga aggcaagccc tacgagggca cccagaccat gagaatcaag 1080

gtggtcgagg gcggccctct ccccttcgcc ttcgacatcc tggctaccag cttcatgtac 1140

ggcagcagaa ccttcatcaa ccacacccag ggcatccccg acttctttaa gcagtccttc 1200

cctgagggct tcacatggga gagagtcacc acatacgaag acgggggcgt gctgaccgct 1260

acccaggaca ccagcctcca ggacggctgc ctcatctaca acgtcaagat cagaggggtg 1320

aacttcccat ccaacggccc tgtgatgcag aagaaaacac tcggctggga ggccaacacc 1380

gagatgctgt accccgctga cggcggcctg gaaggcagaa gcgacatggc cctgaagctc 1440

gtgggcgggg gccacctgat ctgcaacttc aagaccacat acagatccaa gaaacccgct 1500

aagaacctca agatgcccgg cgtctactat gtggaccaca gactggaaag aatcaaggag 1560

gccgacaaag agacctacgt cgagcagcac gaggtggctg tggccagata ctgcgacctc 1620

cctagcaaac tggggcacaa gcatcaccat caccatcact agcggccgca tctagaagat 1680

ctacctggt 1689

<210> 2

<211> 551

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Gly Ile

290 295 300

Thr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu Ser Glu Leu Ile Lys

305 310 315 320

Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu Gly Thr Val Asn Asn His

325 330 335

His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr

340 345 350

Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala

355 360 365

Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Ile

370 375 380

Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu

385 390 395 400

Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Leu

405 410 415

Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp Gly Cys Leu Ile Tyr Asn

420 425 430

Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser Asn Gly Pro Val Met Gln

435 440 445

Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Asn Thr Glu Met Leu Tyr Pro Ala

450 455 460

Asp Gly Gly Leu Glu Gly Arg Ser Asp Met Ala Leu Lys Leu Val Gly

465 470 475 480

Gly Gly His Leu Ile Cys Asn Phe Lys Thr Thr Tyr Arg Ser Lys Lys

485 490 495

Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val Tyr Tyr Val Asp His Arg

500 505 510

Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu Thr Tyr Val Glu Gln His

515 520 525

Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys Leu Gly His

530 535 540

Lys His His His His His His

545 550

<210> 3

<211> 2328

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

gaattcatgg agccagcagg accagcacca ggcaggctgg gacctctgct gtgcctgctg 60

ctggcagcat cctgtgcatg gagcggagtg gccggcgagg aggagctgca ggtcatccag 120

ccagacaagt ccgtgctggt ggcagcagga gagaccgcca ccctgagatg caccgccacc 180

agcctgatcc cagtgggacc tatccagtgg ttcagaggag caggacctgg aagggagctg 240

atctacaacc agaaggaggg ccacttccca cgcgtgacca ccgtgtccga cctgaccaag 300

agaaacaaca tggacttcag catccgcatc ggaaacatca ccccagcaga cgcaggaacc 360

tactactgcg tgaagttccg gaagggctcc cccgacgacg tggagttcaa gtccggagca 420

ggaaccgagc tgagcgtgag ggcaaagcca tccgccccag tggtgagcgg acctgcagcc 480

agggccaccc cacagcacac cgtgtccttc acctgtgagt cccacggctt cagcccaagg 540

gacatcaccc tgaagtggtt caagaacggc aacgagctca gcgacttcca gaccaacgtg 600

gaccccgtgg gcgagagcgt gtcctacagc atccactcca ccgcaaaggt ggtgctgacc 660

cgggaggacg tgcacagcca ggtcatctgc gaggtggcac acgtgaccct gcagggcgac 720

cctctgagag gaaccgccaa cctgagcgag accatcaggg tgccacctac cctggaggtg 780

acccagcagc ctgtgagagc cgagaaccag gtgaacgtga cctgtcaggt gaggaagttc 840

tacccacagc ggctgcagct gacctggctg gagaacggca acgtgtccag gaccgagacc 900

gcaagcaccg tgaccgagaa caaggacggc acctacaact ggatgtcctg gctgctggtg 960

aacgtgagcg cccacaggga cgacgtgaag ctgacctgcc aggtggagca cgacggacag 1020

ccagccgtgt ccaagagcca cgacctgaag gtgtccgccc accctaagga gcagggcagc 1080

aacaccgcag cagagaacac cggctccaac gagcgcaaca tctacatcgt ggtgggagtg 1140

gtgtgcaccc tgctggtggc cctgctgatg gccgccctgt acctggtgag gatcaggcag 1200

aagaaggcac agggcagcac cagctccacc aggctgcacg agccagagaa gaacgcccgg 1260

gagatcaccc aggacaccaa cgacatcacc tacgccgacc tgaacctgcc aaagggcaag 1320

aagcctgcac cacaggcagc agagccaaac aaccacaccg agtacgcatc catccagacc 1380

agcccacagc ctgcatccga ggacaccctg acctacgccg acctggacat ggtgcacctg 1440

aacagaaccc caaagcagcc agcaccaaag cctgagccat ccttcagcga gtacgccagc 1500

gtgcaggtgc ctcgcaagga ttataaggac gatgacgata agctcgaggg cgccgtgagc 1560

aagggagagg aactgttcgg cggcatcgtg cccatcctgg tggagctgga gggcgacgtg 1620

aacggccaca agttcagcgt gagcggcgag ggcgagggcg acgccaccta cggcaagctg 1680

accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctggtgacc 1740

accctgacct ggggcgtgca gtgcttcagc cggtaccccg accacatgaa gcagcacgac 1800

ttcttcaaga gcgtgatgcc cgagggctac gtgcaggagc ggaccatctt cttcaaggac 1860

gacggcaact acaagacccg ggccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgg 1920

atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctgggcca caagctggag 1980

tacaactaca tcagccacaa cgtgtacatc accgccgaca agcagaagaa cggcatcaag 2040

gccaacttca aggcccggca caacatcacc gacggcagcg tgcagctggc cgaccactac 2100

cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgatcctgc ccgacaacca ctacctgagc 2160

acccagagcg ccctgagcaa ggaccccaac gagaagcggg accacatggt gctgctggag 2220

ttcgtgaccg ccgccggcat cacccacggc atggacgaac tgtacaaaca tgatgagctt 2280

catcaccatc accatcacta gcggccgcat ctagaagatc tacctggt 2328

<210> 4

<211> 764

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn

355 360 365

Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val

370 375 380

Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys

385 390 395 400

Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn

405 410 415

Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu

420 425 430

Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn

435 440 445

Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser

450 455 460

Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg

465 470 475 480

Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr

485 490 495

Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

500 505 510

Leu Glu Gly Ala Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Gly Gly Ile Val

515 520 525

Pro Ile Leu Val Glu Leu Glu Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser

530 535 540

Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu

545 550 555 560

Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu

565 570 575

Val Thr Thr Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp

580 585 590

His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Val Met Pro Glu Gly Tyr

595 600 605

Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr

610 615 620

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu

625 630 635 640

Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys

645 650 655

Leu Glu Tyr Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys

660 665 670

Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ala Arg His Asn Ile Thr

675 680 685

Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile

690 695 700

Gly Asp Gly Pro Val Ile Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln

705 710 715 720

Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu

725 730 735

Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu

740 745 750

Tyr Lys His Asp Glu Leu His His His His His His

755 760

<210> 5

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

gaattcatga catcgcggag atggtttcac ccaaatatca ctggtgtgga ggcagaaaac 60

ctactgttga caagaggagt tgatggcagt tttttggcaa ggcctagtaa aagtaaccct 120

ggagacttca cactttccgt tagaagaaat ggagctgtca cccacatcaa gattcagaac 180

actggtgatt actatgacct gtatggaggg gagaaatttg ccactttggc tgagttggtc 240

cagtattaca tggaacatca cgggcaatta aaagagaaga atggagatgt cattgagctt 300

aaatatcctc tgaactgtgc agatcctacc tctgaaaggt ggtttcatgg acatctctct 360

gggaaagaag cagagaaatt attaactgaa aaaggaaaac atggtagttt tcttgtacga 420

gagagccaga gccaccctgg agattttgtt ctttctgtgc gcactggtga tgacaaaggg 480

gagagcaatg acggcaagtc taaagtgacc catgttatga ttcgctgtca ggaactgaaa 540

tacgacgttg gtggaggaga acggtttgat tctttgacag atcttgtgga acattataag 600

aagaatccta tggtcgacta caaggacgac gacgacaagg gaggaggagg cagcggcgga 660

ggaggctccg gcggcggcgg cagcaaaggt gaagaattat tcactggtgt tgtcccaatt 720

ttggttgaat tagatggtga tgttaatggt cacaaatttt ctgtctccgg tgaaggtgaa 780

ggtgatgcta cgtacggtaa attgacctta aaattactct gtactactgg taaattgcca 840

gttccatggc caaccttagt cactacttta ggttatggtg ttcaatgttt tgctagatac 900

ccagatcata tgaaacaaca tgactttttc aagtctgcca tgccagaagg ttatgttcaa 960

gaaagaacta tttttttcaa agatgacggt aactacaaga ccagagctga agtcaagttt 1020

gaaggtgata ccttagttaa tagaatcgaa ttaaaaggta ttgattttaa agaagatggt 1080

aacattttag gtcacaaatt ggaatacaac tataactctc acaatgttta catcactgct 1140

gacaaacaaa agaatggtat caaagctaac ttcaaaatta gacacaacat tgaagatggt 1200

ggtgttcaat tagctgacca ttatcaacaa aatactccaa ttggtgatgg tccagtcttg 1260

ttaccagaca accattactt atcctatcaa tctgccttat tcaaagatcc aaacgaaaag 1320

agagaccaca tggtcttgtt agaatttttg actgctgctg gtattaccga gggtatgaat 1380

gaattgtaca aacatcacca tcaccatcac tagcggccgc atctagaaga tctacctggt 1440

<210> 6

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

Met Thr Ser Arg Arg Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala

1 5 10 15

Glu Asn Leu Leu Leu Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Ser Lys Ser Asn Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn

35 40 45

Gly Ala Val Thr His Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp

50 55 60

Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr

65 70 75 80

Tyr Met Glu His His Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile

85 90 95

Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ala Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp

100 105 110

Phe His Gly His Leu Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr Glu

115 120 125

Lys Gly Lys His Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His Pro

130 135 140

Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu Ser

145 150 155 160

Asn Asp Gly Lys Ser Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln Glu

165 170 175

Leu Lys Tyr Asp Val Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr Asp

180 185 190

Leu Val Glu His Tyr Lys Lys Asn Pro Met Val Asp Tyr Lys Asp Asp

195 200 205

Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

225 230 235 240

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

245 250 255

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Leu Cys

260 265 270

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

275 280 285

Gly Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

290 295 300

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

305 310 315 320

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

325 330 335

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

340 345 350

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

355 360 365

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

370 375 380

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val

385 390 395 400

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

405 410 415

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Phe

420 425 430

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Leu

435 440 445

Thr Ala Ala Gly Ile Thr Glu Gly Met Asn Glu Leu Tyr Lys His His

450 455 460

His His His His

465

Claims

1.一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

2)将第二荧光蛋白构建在SIRPα蛋白的下游；将第三荧光蛋白基因构建在PTPN11基因SH2结构域的下游；在CMV启动子下分别连接SIRPα-第二荧光蛋白和SH2_PTPN11-第三荧光蛋白基因片段，构建两个表达质粒；

3)将CMV-SIRPα-第二荧光蛋白和CMV-SH2_PTPN11-第三荧光蛋白的基因共转染到单核细胞系中，建立稳转细胞系；

4)稳转细胞系诱导成巨噬细胞，将巨噬细胞与抗SIRPα的单抗药、小分子、或多肽阻断剂孵育，清洗非特异性结合后与重组CD47-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育；

或，将CD47-第一荧光蛋白与抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂孵育，清洗非特异性结合后与巨噬细胞共孵育；

5)分别检测第一、第二、第三荧光蛋白荧光值，并判断单抗药、小分子、或多肽阻断剂对CD47/SIRPα信号通路的阻断功能；

其中第一荧光蛋白是RFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是青色荧光蛋白CyPet；第三荧光蛋白是黄色荧光蛋白Ypet。

2.根据权利要求1的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与人全长CD47基因构建在同一个读码框使tagRFP接于CD47蛋白C端形成CD47-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。

3.根据权利要求2的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将CD47-tagRFP基因通过EcoRI/SeXA I克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-CD47tagRFP，去掉了原质粒中的PGK启动子和Puro抗性基因，有利于提高慢病毒的转染效率，而阳性克隆的筛选利用目标蛋白中tagRFP荧光蛋白直接用分选型流式细胞仪筛选或荧光显微镜下挑取；将pCMV-CD47tagRFP与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-CD47tagRFP慢病毒，转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达CD47-tagRFP融合蛋白的CD47-tagRFP/293细胞系；扩增该CD47-tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化含重组CD47-tagRFP融合蛋白的膜碎片。

4.根据权利要求3的药物快速筛选方法，其中步骤2)中，将YPet偶联于PTPN11基因SH2结构域的C端，CyPet偶联于SIRPα的C端；将青色荧光蛋白CyPet基因构建在SIRPα蛋白的下游，构建SIRPα-CyPet融合蛋白基因，并通过EcoR I/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SIRPαCyPet；同样，将黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽构建在PTPN11基因SH2结构域的下游，即SH2_PTPN11-连接肽-Ypet，构建SH2_PTPN11-Ypet融合蛋白基因，并通过EcoRI和SexAI亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SH2_PTPN11Ypet；将pCMV-SIRPαCyPet和pCMV-SH2_PTPN11Ypet分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-SIRPαCyPet和CMV-SH2_PTPN11Ypet慢病毒，并共转染到人外周血的单核细胞THP-1中，建立SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1稳转细胞系；

其中编码CD47-tagRFP融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；CD47-tagRFP融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

编码SIRPαCyPet融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO：3所示，表达后SIRPαCyPet融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

编码SH2_PTPN11Ypet融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO：5所示，表达后SH2_PTPN11Ypet融合蛋白的序列如SEQ ID NO：6所示；

连接肽氨基酸序列为(G4S)3，即：

GGGGSGGGGSGGGGS。

5.根据权利要求4的药物快速筛选方法，其中步骤4)中，使用佛波酯诱导稳转细胞系成巨噬细胞；

将巨噬细胞与抗SIRPα的单抗药、小分子、或多肽阻断剂孵育，清洗非特异性结合后与重组CD47-tagRFP融合蛋白共孵育；

或，将CD47-tagRFP与抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂孵育，清洗非特异性结合后与巨噬细胞共孵育；

同时设立巨噬细胞与CD47-tagRFP融合蛋白直接共孵育的对照组。

6.根据权利要求5的药物快速筛选方法，其中步骤5)中，经缓冲液清洗去除非特异性结合后用流式细胞仪、或荧光酶标仪分析细胞表面的tagRFP荧光值；按CyPet/Ypet荧光蛋白FRET法分析巨噬细胞内的Ypet荧光值；通过药物组荧光值与对照组比较，判断抗SIRPα或抗CD47药对CD47/SIRPα阻断功能。

7.一种基于CD47/SIRPα阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：

1)将红色荧光蛋白tagRFP偶联于CD47蛋白羧基末端，制备CD47-tagRFP融合蛋白；

2)将青色荧光蛋白基因CyPet构建在SIRPα蛋白基因的下游，通过EcoR I/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SIRPαCyPet；同样，将黄色荧光蛋白基因Ypet通过一个连接肽(G4S)3构建在PTPN11基因SH2结构域的下游，并通过EcoRI/SeXA I亚克隆到慢病毒表达载体pLV-puro的CMV启动子下，获得质粒pCMV-SH2_PTPN11Ypet；将pCMV-SIRPαCyPet和pCMV-SH2_PTPN11Ypet分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制各CMV-SIRPαCyPet和CMV-SH2_PTPN11Ypet慢病毒，并共转染到人外周血的单核细胞THP-1中，建立稳转细胞系SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1；

3)将SIRPαCyPet.SH2_PTPN11Ypet/THP-1细胞诱导成巨噬细胞后与抗SIRPα的单抗药、小分子、或多肽阻断剂共孵育，清洗非特异性结合后与重组CD47-tagRFP融合蛋白共孵育；

同时设立巨噬细胞与CD47-tagRFP融合蛋白直接共孵育的对照组；

4)清洗去除非特异性结合后，检测细胞表面的红色荧光蛋白tagRFP荧光值；以及按CyPet/Ypet荧光蛋白FRET法分析细胞内的Ypet荧光值，并与对照组比较；

5)依据荧光值判断抗SIRPα或抗CD47的单抗药、小分子、或多肽阻断剂对CD47/SIRPα信号通路的阻断作用；

编码SIRPαCyPet融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO：3所示，表达后SIRPαCyPet融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；编码SH2_PTPN11Ypet融合蛋白的DNA基因序列如SEQID NO：5所示，表达后SH2_PTPN11Ypet融合蛋白的序列如SEQ ID NO：6所示。