KR20170043783A - 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 시스템 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (enhanced split-GFP complementation assay) 개발에 관한 것이다. 또한 본 발명은 녹색형광 단백질 두 절편에 각각 스트렙타비딘 (streptavidin)과 스트렙타비딘 결합 펩타이드 (streptavidin binding peptide, SBP)을 융합하여, 두 녹색형광 단백질 절편이 낮은 농도에서도 두 절편의 상보에 의한 녹색형광 신호를 탐지하도록 민감도를 개선시킨 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편 (split-GFP fragment)을 융합한, 세포질 침투능을 가진 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편 및 이를 융합한 세포질 침투능을 가지는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (enhanced split-GFP complementation assay)을 이용하여 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 항체가 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 것을 직접적으로 증명할 수 있는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)을 이용하여 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 항체가 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 양을 정량하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)을 이용하여 기존 세포 침투 물질이 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 것을 직접적으로 증명할 수 있는 방법과 세포질에 위치하는 양을 정량하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합하여 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체가 가지는 구조 및 수용성에 영향주지 않으면서 살아있는 세포내부로 침투 및 세포질에 잔류하는 성질을 확인할 수 있다. 또한, 복잡하고 비용이 많이 드는 화학적 표지 없이 유전공학적인 펩타이드 융합만으로 상기 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법이 가능하다. 또한, 세포질에 위치하는 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체의 양, 전체 처리한 양에 대비하여 세포질 내부에 위치하게 되는 비율 및 세포 내부 농도 역시 계산할 수 있다. 또한 항체뿐만 아니라 기존 세포 침투 물질에 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합함으로써 세포질 내부에 위치함을 직접적으로 증명할 수 있으며, 세포질 내부에 위치하는 항체의 절대적인 양을 정량할 수 있다.
또한 상기 시스템은 세포질 내부에 침투한 살아있는 세포 내부의 녹색 형광 단백질에 의한 녹색 형광을 측정함으로써 대량고속선별 (high throughput screening)에 적용이 가능하며, 세포질에 높은 효율로 도달하는 후보 항체 선별 및 도출에 활용할 수 있다.

Description

개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 시스템 및 이의 용도 {Enhanced split-GFP complementation system, and use thereof}
본 발명은 민감도(sensitivity)가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (enhanced split-GFP complementation assay)을 이용한 검출물질의 세포질 침투능 판단 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 녹색형광 단백질 두 절편에 각각 스트렙타비딘 (streptavidin)과 스트렙타비딘 결합 펩타이드 (streptavidin binding peptide, SBP)을 융합하여, 두 녹색형광 단백질 절편이 낮은 농도에서도 두 절편의 상보에 의한 녹색형광 신호를 탐지하도록 민감도를 개선시킨 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (enhanced split-GFP complementation assay)에 이용되는 녹색형광 단백질 절편에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 녹색형광 단백질 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (enhanced split-GFP complementation assay)를 이용한 세포질 침투능 검출 시스템에 관한 것이다.
암을 포함한 여러 질환들에서 세포내 단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction, PPI)에 중요한 역할을 하는 효소 또는 전사, 신호전달 관련 여러 단백질의 돌연변이 및 비정상적 과발현되는 현상이 발생한다. 한 예로, 현재 효과적인 치료물질이 없는 세포질 중요 종양 관련 인자 중 하나인 RAS는 세포막 수용체를 통해 세포 외부의 신호를 세포 내 신호전달 체계로 전달하는 분자적 스위치(molecular switch)역할을 하며, 인간 암의 약 30 %, 주로 대장암과 췌장암에서 세포내에 발암관련 돌연변이체로 인한 상시 활성화되어 있으며, 이러한 발암관련 돌연변이는 기존의 항암치료에 대한 강한 내성을 부여하여 주요한 종양관련인자로 알려져 있다 (Scheffzek K et al., 1997).
이러한 세포 내부의 병원성 단백질을 특이적으로 표적하기 위한 펩타이드, 항체 단편 등 세포 침투 물질들의 다양한 연구가 이루어졌다 (Leena N et al., 2007; Michael P et al., 1996; Manikandan J et al., 2007). 세포 침투 물질은 주로 능동적 세포내부 수송기작인 세포내제화(Endocytosis) 에 의해 세포 내로 침투하게 된다. 일반적으로 세포내제화를 통해 세포 내로 침투할 경우, 엔도좀(endosome) 을 거쳐 라이소좀까지 가게 되어 라이소좀에서 분해된다. 하지만 세포 침투 물질이 활성을 나타내기 위하여 엔도좀에서 세포질로 탈출하는 기작을 가지고 있다. 엔도좀 내부에 위치하는 물질은 활성을 나타내지 못하기 때문에, 엔도좀에서 세포질로 탈출하는 양이 많을수록 물질의 활성을 잘 나타낼 수 있다. 따라서, 엔도좀 내부에 위치하는 물질과 세포질에 위치하는 물질을 구별하여 물질이 세포질에 위치하는 성질을 가지는 것을 선별하는 것과 그 양을 정량하는 것이 중요하다.
엔도좀 내부에 위치하는 물질과 세포질에 위치하는 물질을 구별하기 위한 다양한 연구가 이루어졌는데, 주로, 세포질에 위치하는 베타-갈락토시다아제 (β-galactosidase)에 의해 가수분해되어 형광을 띠는 형광 물질을 세포 침투 물질에 접합하여 처리한 후에 형광을 측정하여 세포질 내부에 위치함을 확인하였다 (Chao et al., 2013). 또한 산도-민감성 (pH-sensitive) 형광 표지물질을 펩타이드에 접합하여 처리한 후에 형광을 측정하여 세포질 내부에 위치함을 확인하였다 (Qian et al., 2015). 하지만 화학적 물질을 단백질에 접합하는 과정은 단백질의 구조, 수용성 및 세포 침투능에 영향을 미칠 수 있다는 한계를 지니고 있다.
화학적 물질이 아닌 크리 재조합효소 (Cre recombinase)를 완전 이뮤노글로빈에 융합하여 세포에 처리한 후, 세포질로 크리 재조합효소가 방출되었을 때 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 발현할 수 있다 (Marschall et al., 2014) 하지만, 크리 재조합효소가 계속적으로 녹색 형광 단백질의 발현에 영향을 미치기 때문에 세포질 내부에 위치하는 양을 정량하기에는 부적합하다는 한계를 지니고 있다.
반면, 세포 내부에 바이오틴화 효소인 BirA를 발현시킨 후, 세포침투 물질에 BirA 특이적으로 인지하여 바이오틴을 결합시키는 아비-텍(Avi-tag)을 융합시킨다 (Verdurmen et al., 2015). 세포에 침투한 물질의 경우, BirA에 의해 바이오틴화 되어 웨스턴 블롯을 수행하였을 때, 물질의 크기가 크게 검출된다. BirA 역시 효소이지만, 세포질 내부로 침투한 물질 당 하나의 반응만 일어나므로 크리 재조합효소의 한계를 극복할 수 있다. 하지만, 이 방법은 시간이 걸리는 기법이며, 추후에 이 실험 방법을 통하여 고처리율 선별을 진행할 수 없다는 한계를 지니고 있다.
BiFC (이분자 형광 상보성; bimolecular fluorescence complementation)는 관심 대상이 되는 단백질에 부착된 비형광성 구성요소로부터 형광 단백질 복합체를 형성하는 기술에 기반을 둔 단백질-단백질 상호작용을 가시화하기 위한 방법이다 (Kerppola et al., 2008). 그 중 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)을 이용하여 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 시도가 많이 진행되었다(Fortunato et al., 2011; Kaddoum et al., 2010; Waldo et al, 2011; Chun et al., 2007). 주로, 녹색 형광 단백질을 1-10, 11 번 단편으로 나눠 각각의 단편을 상호작용할 두 단백질에 각각 융합시킨 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 측정하였다. 또한, 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)을 이용하여 단백질의 발현 정도를 상대적으로 비교하는 시도도 진행되었다 (Stephanie et al., 2006). 크기가 작은 녹색 형광 단백질 11번 단편을 발현하고자 하는 단백질에 융합시킨 후, 정제한 녹색 형광 단백질 1-10번 단편과 반응시켜 형광 정도를 분석하였다. 그러나, 기존 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법은 각 녹색 형광 단백질간의 친화도가 아직 밝혀지지 않아 낮은 농도에서도 상보적인 결합이 가능한지 여부를 확신할 수 없다. 또한, 현재까지 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법을 이용하여 세포 침투 물질이 살아있는 세포 내부로 침투하여 세포질에 위치함을 증명하고, 그 양을 정량하는 연구가 진행된 바 없다.
따라서 본 발명자는 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay) 개발하였다. 더욱이, 본 발명자는 상기 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)을 이용하여 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 항체가 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 것을 직접적으로 증명할 수 있음을 확인하였으며, 상기 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)을 이용하여 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 항체가 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 양을 정량할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 양상은 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (enhanced split-GFP complementation assay)을 이용한 검출물질의 세포질 침투능 판단 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 녹색형광 단백질 두 절편에 각각 스트렙타비딘 (streptavidin)과 스트렙타비딘 결합 펩타이드 (streptavidin binding peptide, SBP)을 융합하여, 두 녹색형광 단백질 절편이 낮은 농도에서도 두 절편의 상보에 의한 녹색형광 신호를 탐지하도록 민감도를 개선시킨 방법에 관한 것이다.또한, 본 발명의 일 양상은 상기 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (enhanced split-GFP complementation assay)에 이용되는 녹색형광 단백질 절편에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 녹색형광 단백질 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (enhanced split-GFP complementation assay)를 이용한 세포질 침투능 검출 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 일 양상은 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay) 을 이용함으로써, 검출물질의 세포질 침투능을 판단하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 상기 방법은
(1) 세포질 내 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 녹색형광단백질 제1절편을 발현시키는 단계;
(2) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 녹색형광단백질 제2절편이 융합된 검출 물질을 상기 제 (1) 단계의 세포에 처리하는 단계; 및
(3) 형광신호를 확인하는 단계;를 포함하는, 검출물질의 세포질 침투능 판단 방법이다.
상기 녹색형광단백질 제1절편은 세포의 세포질에 발현되어 세포질에 위치하고 있으며, 제1절편만으로는 형광 신호를 발생시키지 않는다.
상기 녹색형광단백질은 세포질에 침투하거나, 침투할 것으로 예상되는 검출물질과 융합한 형태로 세포질로 침투하게 되며, 이러한 검출물질이 세포질 침투능을 발휘하는 경우, 세포질에 도달하여 녹색 형광 신호를 발생시키게 된다.
도 6은 검출물질의 일 예로서 항체 또는 항체 절편인 단쇄가변영역이 세포질에 위치함을 직접적으로 증명하기 위한 본 발명의 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법을 도식화한 것이다.
상기 제1 녹색형광단백질 절편 및 제2 녹색형광단백질의 서열은 하기와 같으며, 이는 하기의 서열 또는 이와 상동성이 90% 이상인 서열을 포함하는 개념이다.
상기 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 서열정보는 하기와 같다.
Figure pat00001

또한, 상기 녹색형광단백질 제1절편은 스트렙타비딘 (streptavidin) 과 융합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 스트렙타비딘과 융합된 녹색형광단백질 제1절편은 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “융합”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질에 상기 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편이 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 개선된 불할 녹색 형광 단백질 단편과 상기 단백질과의 융합을 중계할 수 있다. 상기 링커펩타이드의 서열은 그 제한이 없으나, 일 예로서 (G3S)3 서열로 이루어진 링커가 이용될 수 있다. 또한 상기 융합의 위치는 그 제한이 없다. 즉, 아미노산의 말단인 N-말단, 또는 C-말단, 또는 N 및 C 말단일 수 있으며, 아미노산의 비-말단 부분에도 융합될 수 있다.
또한, 상기 스트렙타비딘과 융합된 녹색형광단백질 제1절편은 사량체의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 상기 녹색형광단백질 제2절편은 스트렙타비딘 결합 펩타이드 (streptavidin binding peptide, SBP)와 융합된 형태일 수 있다.
상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 야생형 SBP 또는 이와 유사한 생물확적 활성을 나타내는 이의 절편, 이의 변이체일 수 있다. 바람직하게는 상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 하기 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 스트렙타비딘 결합 펩타이드 2일 수 있다. 또한, 상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드가 융합된 녹색형광단백질 제2절편은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
Figure pat00002
상기 검출물질은 녹색형광단백질 제2절편과 융합된 형태이다. 상기 융합은 그 형태의 제한이 없으며, 본 발명의 일 구체예에서는 링커펩타이드에 의하여 결합된 형태를 개시한다.
상기와 같이 녹색형광 단백질 두 절편에 각각 스트렙타비딘 (streptavidin)과 스트렙타비딘 결합 펩타이드 (streptavidin binding peptide, SBP)을 융합하여, 두 녹색형광 단백질 절편이 낮은 농도에서도 두 절편의 상보에 의한 녹색형광 신호를 탐지할 수 있도록 하여, 기존의 녹색형광 단백질 상보 신호의 민감도를 개선할 수 있다.
상기 검출물질은 그 종류에 제한이 없으나, 생물학적 활성물질, 예를 들어, 항체, 항체의 절편, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 나노입자, 소분자약물 또는 리포좀 등 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 항체 또는 단쇄가변영역의 세포질 침투능을 확인하기 위하여, 녹색형광단백질 제2절편을 항체 단쇄 가변영역에 융합하여, 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 항체 또는 항체의 단편이 세포질에 위치하는 것을 직접적으로 증명할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 상기 세포질 침투능 판단 방법은 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)을 이용하여 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 항체가 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 것을 직접적으로 증명할 수 있으며 세포질에 위치하는 양을 정량할 수 있다.
또한, 본 발명은 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)을 이용하여 기존 세포 침투 물질이 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 것을 직접적으로 증명할 수 있는 방법과 세포질에 위치하는 양을 정량하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 민감도가 개선된 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)에 있어서의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스트렙타비딘과 융합된 형태의 녹색형광단백질 제1절편을 제공한다.
상기 녹색형광단백질 제1절편은 세포질에 존재할 수 있다.
상기 세포의 종류는 제한이 없으며, 미생물, 식물 또는 동물 세포일 수 있으나, 바람직하게는 동물세포일 수 있다.
상기 제1절편의 세포질 내의 발현은 그 방법에는 제한이 없다. 발명의 일 구체예에 있어서 동물세포의 세포질에 안정적으로 개선된 분할 녹색 형광 단백질을 발현하기 위하여 렌티 바이러스(Lenti virus)를 이용하였다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 개선된 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법 (split-GFP complementation assay)에 있어서의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 녹색형광단백질 제2절편을 제공한다.
상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 야생형 SBP 또는 이와 유사한 생물확적 활성을 나타내는 이의 절편, 이의 변이체일 수 있다. 바람직하게는 상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 하기 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 스트렙타비딘 결합 펩타이드 2일 수 있다. 또한, 상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드가 융합된 녹색형광단백질 제2절편은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 녹색형광단백질 제2절편은 세포질내로 침투하거나 침투할 것으로 예상되는 검출물질과 융합된 것일 수 있다.
융합의 정의는 상기한 바와 같으며, 그 종류 및 형태에 제한은 없다.
또한, 상기 검출물질은 항체, 항체의 절편, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 나노입자, 소분자약물 또는 리포좀 등 생체 또는 살아있는 세포에서 생물학적 활성을 나타낼 수 있거나, 나타낼 것으로 예상되는 물질은 모두 포함한다.
상기 항체는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체 및 이의 절편일 수 있다.
상기 항체는 키메릭, 인간, 또는 인간화된 항체일 수 있다.
또한, 상기 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있으며, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있으며, 가장 바람직하게는 IgG 타입의 단일클론항체일 수 있다.
완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합(disulfide bond, SS-bond) 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
"중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
특히, 상기 생체물질이 항체 또는 항체의 단편인 경우, 상기 녹색형광단백질 제2절편은 중쇄가변영역 C-말단에 융합될 수 있으며, 상기 융합은 링커단백질에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서 중쇄가변영역 C-말단과 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편은 (G3S)3 연결자(linker)로 융합된 형태로 개시되나, 이에 제한 되지 않는다.
또한 본 발명은 상기 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법에서의 제1 및 제2의 녹색형광단백질 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은
세포질 내에 발현하는 상기 녹색형광단백질 제1절편; 및
검출물질과 융합한 상기 녹색형광단백질 제2절편을 포함하는, 세포질 침투능 검출 시스템을 제공한다.
상기 검출물질의 세포질 침투능 검출 시스템은 완전한 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 형태의 항체 또는 이의 절편이 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 것을 직접적으로 증명하거나, 그 효율 및 침투량을 정량하는 것에 이용할 수 있다.
또한, 상기 시스템은
기존 세포 침투 물질이 세포막을 침투하여 세포질에 위치하는 것을 직접적으로 증명할 수 있는 방법과 세포질에 위치하는 양을 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 항체의 중쇄의 C-말단에 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합하는 단계를 포함하는,
개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편이 융합된 살아있는 세포내부로 침투하여 세포질에 위치하는 항체의 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예는 기존의 항체의 중쇄의 C-말단에 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합하여, 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편이 융합된 완전한 이뮤노글로불린 형태의 단일클론항체가 상기 세포질 침투능을 가지는 완전 이뮤노글로불린 형태의 단일클론항체의 세포질 침투와 같은 특성을 갖게 하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 항체의 중쇄의 C-말단에 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합하여 세포질 침투 경쇄가변영역(VL)을 이용한 세포내부로 침투하여 세포질에 분포하는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체 제조방법의 예는 아래와 같다.
(1) 상기 인간 경쇄가변영역(VL) 및 인간 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 경쇄에서 경쇄가변영역(VL)을 세포질에 침투하는 인간화 경쇄가변영역(VL)으로 치환된 핵산(nucleic acids)을 클로닝한 세포질 침투 경쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 제조된 경쇄와 상호작용하여 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체 발현을 위한 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)이 포함된 중쇄의 C-말단에 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합시킨 단백질을 코딩하는 핵산(nucleic acides)를 클로닝한 중쇄 발현 벡터를 제조하는 단계;
(3) 상기 제조된 경쇄, 중쇄 발현벡터를 단백질 발현용 동물세포에 동시 형질전환하여 세포내부 침투 및 세포질 잔류 인간화 경쇄가변영역(VL)와 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 포함하는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 발현하는 단계; 및
(4) 상기 발현된 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편이 융합된 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 정제 및 회수하는 단계.
상기 방법은 경쇄를 발현하는 벡터와 중쇄를 발현하는 벡터를 발현하여 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 제조할 수 있다. 또한, 세포내부의 특정 단백질을 인지할 수 있는 중쇄가변영역을 포함하는 중쇄를 발현하는 벡터와 함께 형질전환을 통하여, 세포내부로 침투하고 세포질에 분포하여 특정 단백질과 결합할 수 있는 항체를 발현할 수 있다. 벡터는 경쇄와 중쇄를 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 본 발명에서 제공하는 경쇄가변영역, 및 경쇄불변영역(CL), 중쇄가변영역(VH) 및 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)은 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공할 수 있다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포내부로 침투하여 세포질에 위치하는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화(glycosylation) 문제로 인해 인택트(intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법에 의하는 경우, 살아있는 세포 내부로 침투한 세포질 침투능을 가지는 항체가 세포질에 위치한다는 것을 직접적으로 증명할 수 있다.
본 발명에 따른 민감도가 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법에 의하는 경우, 항체가 세포외부에서 세포질 내로 침투하지만 엔도좀 탈출 효율이 매우 낮아, 항체가 세포질에 매우 낮은 농도가 존재하더라도, 이를 탐지할 수 있게하여, 항체가 살아있는 세포에 침투하여 세포질에 위치한다는 것을 직접적으로 증명할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합하여 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체가 가지는 항원 구조 및 수용성에 영향을 주지 않으면서 살아있는 세포내부로 침투 및 세포질에 잔류하는 성질을 확인할 수 있다. 또한, 복잡하고 비용이 많이 드는 화학적 표지 없이 유전공학적인 펩타이드 융합만으로 상기 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 기법이 가능하다. 또한 항체뿐만 아니라 기존 세포 침투 물질에 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합함으로써 세포질 내부에 위치함을 직접적으로 증명할 수 있다.
본 발명에 따른 세포질 침투능을 가지는 항체에 융합된 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편의 상보적 결합에 의해 생성된 형광을 통하여 세포질 내부에 위치하는 항체의 절대적인 양을 정량할 수 있다. 또한 항체뿐만 기존 세포 침투 물질에 개선된 분할 녹색 형광 단백질 단편을 융합함으로써 세포질 내부의 양을 정량할 수 있다. 전체 처리한 양에 대비하여 세포질 내부에 위치하게 되는 비율 및 세포 내부 농도 역시 계산할 수 있다.
또한 상기 시스템은 세포질 내부에 침투한 살아있는 세포 내부의 녹색 형광 단백질에 의한 녹색 형광을 측정함으로써 대량고속선별 (high throughput screening)에 적용할 수가 있어, 세포질에 높은 효율로 도달하는 후보 항체 선별 및 도출에 활용할 수 있다.
도 1a는 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab이 세포질에 위치하는 경우 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
도 1b는 녹색 형광 단백질 1-10 단편을 코딩하는 유전자와 TMab4 scFv-GFP11를 코딩하는 유전자를 함께 트랜스팩션하여, 세포질 내부에서 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 공초점 현미경 (confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
도 2a는 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합이 향상될 수 있도록 디자인된 개선된 분할 녹색 형광 단백질을 나타낸 모식도이다.
도 2b는 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab이 세포질에 위치하는 경우 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
도 3a는 구축한 안정적으로 streptavidin-GFP1-10을 발현하는 형질전환 세포주의 streptavidin-GFP1-10의 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 3b는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 TMab4 scFv-GFP11-SBP2를 코딩하는 유전자를 트랜스팩션하여, 세포질 내부에서 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 공초점 현미경 (confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
도 4는 GFP11-SBP2 융합된 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab 정제 후, 환원성 또는 비환원성 SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 5a는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 0.5, 1, 2, 4 μM 의 GFP11-SBP2 융합된 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab를 처리한 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 플레이트 리더기(plate reader)를 통해 측정한 결과이다.
도 5b는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 1, 2, 4 μM 의 GFP11-SBP2 융합된 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab를 처리한 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 6은 완전 IgG 형태의 cytotransmab이 세포질에 위치하는 경우 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
도 7는 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab 정제 후, 환원성 또는 비환원성 SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 8a는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 0.1, 0.5, 1 μM 의 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab를 처리한 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 플레이트 리더기를 통해 측정한 결과이다.
도 8b는 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 통한 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab의 양을 정량을 위해, 녹색 형광 단백질의 형광 표준 곡선(standard curve)이다.
도 8c는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 0.4, 0.8, 1, 2, 4 μM 의 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab를 처리한 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합을 통한 cytotransmab 의 세포질 잔류능 확인 논리
도 1a는 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab이 세포질에 위치하는 경우 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
구체적으로는, cytotransmab이 세포질에 위치한다는 것을 직접적으로 확인하기 위해 분할 녹색 형광 단백질의 상보 결합 기법을 사용하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)을 1-10번, 11번 단편으로 나누게 되면 형광을 띠는 특성이 제거되고, 만약 두 조각의 거리가 가까워져 결합한다면, 형광을 띠는 특성을 회복할 수 있다(Cabantous et al., 2005). 이러한 특성을 이용하여 녹색 형광 단백질 1-10번 단편은 세포질에 발현시키고, 녹색 형광 단백질 11번 단편은 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab의 C-말단에 융합시킨다. 따라서, 녹색 형광이 관찰된다는 것은 cytotransmab이 세포질에 위치한다는 것을 반증한다.
상기 디자인된 시스템이 구현 가능한지 확인하기 위해 각각 GFP1-10과 TMab4 scFv-GFP11을 코딩하는 DNA를 도입하여 세포질 내부에서 발현되도록 유도하여 세포질에서 분할 녹색 형광 단백질의 상보적 결합에 의한 녹색 형광을 확인하였다.
구체적으로는, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적 결합에 의한 녹색 형광을 확인하기 위한 세포질 발현벡터를 구축하기 위해 녹색 형광 단백질 1-10번 단편을 코딩하는 DNA, TMab4 scFv의 C-말단에 GGGGS 의 링커를 사용하여 녹색 형광 단백질 11번 단편을 유전공학적으로 융합시킨 유전자를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.1 (Invitrogen) 벡터에 NheI/XhoI로 클로닝하였다.
도 1b는 녹색 형광 단백질 1-10 단편을 코딩하는 유전자와 TMab4 scFv-GFP11를 코딩하는 유전자를 함께 트랜스팩션하여, 세포질 내부에서 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 공초점 현미경 (confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 커버슬립을 넣고 각 웰 당 1x104 개의 HeLa 세포주를 10 % FBS (Fetal bovine Serum)가 포함된 배지 0.5 ml로 넣어 12 시간 동안 5 % CO2, 37 도 조건에서 배양했다. 세포가 안정화 되면, 배지를 제거하고 각 웰을 인산완충용액(PBS)을 이용하여 세척하였다. Opti-MEM media (Gibco) 50 μl에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) 2 μl을 넣고, 형질전환 할 500 ng의 pcDNA3.1-GFP1-10 단독; pcDNA3.1-GFP1-10와 pcDNA3.1-TMab4 scFv-GFP11를 조심스럽게 첨가하여 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 각 웰에 첨가하였다. 추가적으로 항생제가 없는 DMEM media 0.5 ml을 넣고 6시간 동안 37 도, 5% CO2에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 0.5 ml 교환한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 약산성용액(200 mM glycine, 150 mM NaCl pH 2.5)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거하고, PBS 세척 후, 4 % 파라포름알데히드 첨가 후 25 도 조건으로 10 분간 세포를 고정했다. PBS로 세척하고, Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰했다. 상기 실험을 진행하였을 때, 세포 내부 및 세포질에서 녹색 형광이 관찰되지 않았다.
실시예 2. 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합을 통한 cytotransmab의 세포질 잔류능 확인 논리
도 2a는 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합이 향상될 수 있도록 디자인된 개선된 분할 녹색 형광 단백질을 나타낸 모식도이다.
구체적으로는, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합을 보조하기 위해 더 높은 친화도를 가진 Streptavidin(SA)-SBP2(streptavidin binding peptide 2)를 이용하였다 (Barrette-Ng et al., 2013). SBP2는 SA가 이량체 형태를 이룰 때 결합하는 특징을 갖고 있으며, SA는 사량체를 이루고 있기 때문에 결론적으로 SA와 SBP2의 결합 비율은 4:2이다. SA와 SBP2의 결합으로 인하여 녹색 형광 단백질의 1-10 번 단편과 11번 단편의 거리가 가까워지게 되고 상보적인 결합이 용이해진다는 장점이 있다.
도 2b는 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab이 세포질에 위치하는 경우 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
구체적으로는, 크기가 큰 SA는 녹색 형광 단백질 1-10번 단편의 N-말단에 GGGGS 3개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하여 세포질에 발현시킨다. 또, 크기가 작은 SBP2를 GFP 11번 단편 C-말단에 GGGGS 3개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합시킨다. 상기 실시예 1과 동일하게, 녹색 형광이 관찰된다는 것은 cytotransmab이 세포질에 위치한다는 것을 반증한다.
실시예 3. 안정적으로 SA- GFP1 -10 발현하는 형질전환 세포주 구축 및 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합을 통한 cytotransmab 의 세포질 잔류능 확인
상기 시스템을 구현하기 위해 안정적으로 streptavidin-GFP1-10을 발현하는 형질전환 세포주를 개발하였다.
구체적으로는, Streptavidin-GFP1-10을 코딩하는 DNA를 렌티 바이러스(Lenti virus) 벡터인 pLJM1(Addgene) 벡터에 SalI/EcoRI으로 클로닝하였다. 세포 배양 플레이트에 3 x 106개의 HEK293T 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 10 ml로 넣어 12시간 동안 5 % CO2, 37 도 조건에서 배양했다. 세포가 안정화되면, 배지를 제거하고 플레이트를 인산완충용액(PBS)을 이용하여 세척하였다. Opti-MEM media(Gibco) 600 μl에 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA) 40 μl을 넣고, 구축한 렌티 바이러스 벡터와 바이러스 패키징 벡터인 pMDL, pRSV, pVSV-G(Addgene)을 조심스럽게 첨가하여 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 접시에 첨가하였다. 추가적으로 항생제가 없는 DMEM media 9 ml을 넣고 6시간 동안 37 도, 5% CO2에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 10 ml 교환한 후, 72시간 동안 배양하였다. 60시간 후 1 x 105개의 HeLa 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 1 ml로 넣어 12시간 동안 37 도, 5 % CO2 조건에서 배양했다. 렌티 바이러스 벡터를 일시적 트랜스펙션시킨 배지를 전부 필터하여 배지 속의 바이러스 입자들을 미리 준비해 둔 HeLa 세포가 있는 세포배양 접시에 첨가한다. 항생제 저항성은 퓨로마이신(puromycin) 저항성 유전자를 선택마커로 사용하였다.
도 3a는 구축한 안정적으로 streptavidin-GFP1-10을 발현하는 형질전환 세포주의 streptavidin-GFP1-10의 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
구체적으로는, 6 웰 플레이트에 플레이트에 각 웰 당 1 x 105개의 HeLa 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 1 ml로 넣어 12시간 동안 37 도, 5 % CO2 조건에서 배양했다. 배양 후 세포 용해물을 얻기 위해 용해 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl, 1% SDS, 1mM EDTA, Inhibitor cocktail(sigma))를 넣어준다. 세포 용해물은 BCA protein assay kit (Pierce) 를 이용하여 정량하였다. SDS-PAGE를 수행한 겔을 PVDF 막(membrane)에 옮기고 각각 streptavidin와 β-actin을 인지하는 항체(SantaCruz)와 25 도 2시간 반응시키고, HRP가 결합된 이차 항체(SantaCruz)을 25 도 1시간 반응시킨 후 검출하였다. 분석은 ImageQuant LAS4000 mini(GE Healthcare)를 이용하였다.
상기 디자인된 시스템이 구현 가능한지 확인하기 위해, 구축한 안정적으로 streptavidin-GFP1-10을 발현하는 형질전환 세포주에 TMab4 scFv-GFP11-SBP2를 코딩하는 DNA를 도입하여 세포질 내부에서 발현되도록 유도하여 세포질에서 분할 녹색 형광 단백질의 상보적 결합에 의한 녹색 형광을 확인하였다.
구체적으로는, 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적 결합에 의한 녹색 형광을 확인하기 위한 세포질 발현벡터를 구축하기 위해 TMab4 scFv-GFP11-SBP2를 pcDNA3.1 (Invitrogen) 벡터에 NheI/XhoI로 클로닝하였다.
도 3b는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 TMab4 scFv-GFP11-SBP2를 코딩하는 유전자를 트랜스팩션하여, 세포질 내부에서 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 공초점 현미경 (confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 상기 실시예 1와 동일하게 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화 되면, 배지를 제거하고 각 웰을 인산완충용액(PBS)을 이용하여 세척하였다. Opti-MEM media (Gibco) 50 μl에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) 2 μl을 넣고, 형질전환 할 500 ng의 pcDNA3.1-TMab4 scFv-GFP11-SB2를 조심스럽게 첨가하여 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 웰에 첨가하였다. 추가적으로 항생제가 없는 DMEM media 0.5 ml을 넣고 6시간 동안 37 도, 5% CO2에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 0.5 ml 교환한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 상기 상기 실시예 1과 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. 그리고 Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰했다. 상기 실험을 통하여 세포질에서 녹색 형광이 관찰되었다.
실시예 4. GFP11 - SBP2 융합된 단쇄가변영역 ( scFv ) 형태의 cytotransmab 의 구축 및 발현 정제
상기 디자인된 GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab 의 단쇄가변영역 (scFv) 형태를 대장균에서 발현하기 위해 GFP11-SBP2를 중쇄 C-말단에 GGGGS 3개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하고 정제하였다.
구체적으로는, Tmab4 scFv-GFP11-SBP2 유전자를 N-말단에 Pho A 시그널 펩타이드와 6x his 태그가 포함된 pIg20 벡터로 NheI/BamHI 제한효소를 이용하여 클로닝하였고, 단백질 발현용 대장균인 BL21(DE3)plysE에 전기천공법을 이용하여 형질전환하였다. 100 ug/ml 암피실린이 포함된 2xTYA 배지에서 180 rpm, 37 도 조건에서 흡광도 600 nm에서 0.6~0.8까지 배양한 이후 최종 농도 0.2 mM IPTG (Isoprophy β-D-1-thiogalactopyronoside) 처리 후 20 도에서 20시간 발현하였다. 발현 후 고속원심분리기를 이용하여 8,000 rpm에서 40 분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 Ni-NTA 수지(Clontech)와 반응시켰다. 50 mM phosphate 300 mM NaCl, pH 8.0 버퍼 50 ml을 이용하여 수지 세척을 한 이후 50 mM phosphate 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 8.0 버퍼 10ml로 추가적 세척하였다. 이후 50 mM phosphate, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazole pH 8.0 버퍼로 수지에서 단백질을 용출하였고, 투석방법을 이용하여 12mM PBS, 137 mM NaCl, 10% glycerol pH 6.5 버퍼로 교체하였고, BCA(bicinchoninic acid(Pierce))분석 방법을 통해 단백질 농도 측정 및 SDS-PAGE를 통해 단백질의 순도를 확인하였다.
도 4는 GFP11-SBP2 융합된 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab 정제 후, 환원성 또는 비환원성 SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
구체적으로는, 비환원성 및 환원성 조건에서 약 34 kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 GFP11-SBP2 융합된 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab이 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
실시예 5. GFP11 - SBP2 융합된 단쇄가변영역 ( scFv ) 형태의 cytotransmab 의 세포질 잔류능 확인
도 5a는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 0.5, 1, 2, 4 μM 의 GFP11-SBP2 융합된 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab를 처리한 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 플레이트 리더기(plate reader)를 통해 측정한 결과이다.
구체적으로는, 96 웰 블랙 플레이트에 각 웰 당 1.5x104 개의 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 10 % FBS (Fetal bovine Serum)가 포함된 배지 0.2 ml로 넣어 12 시간 동안 5 % CO2, 37 도 조건에서 배양했다. 세포가 안정화되면, PBS, TMab4 scFv-GFP11-SBP2 0.5, 1, 2, 4 μM을 37 도에서 12시간 동안 배양했다. 양성 대조군으로는 자발광 시약인 Calcein 30 nM과 PEI 2 μM을 이용하였다. 각 웰을 PBS pH 7.4 buffer로 세척한 후 PBS pH 7.4 buffer 50 μl 를 넣고 Biotek의 Synergy HTX Multi-mode reader (excitation 485, emission 528)을 통해서 각각 웰의 형광 세기를 측정하였다.
TMab4 scFv-GFP11-SBP2 0.5, 1 μM 처리한 세포에서는 거의 백그라운드와 유사한 수준의 형광이 측정되었다. 반면 TMab4 scFv-GFP11-SBP2 2, 4 μM 처리한 세포에서 양성 대조군과 비교하였을 때 유의미한 수준의 형광이 측정되었다.
도 5b는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 1, 2, 4 μM 의 GFP11-SBP2 융합된 단쇄가변영역 (scFv) 형태의 cytotransmab를 처리한 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 커버슬립을 넣고 각 웰 당 4x104 개의 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 10 % FBS (Fetal bovine Serum)가 포함된 배지 0.5 ml로 넣어 12 시간 동안 5 % CO2, 37 도 조건에서 배양했다. 세포가 안정화되면, PBS, TMab4 scFv-GFP11-SBP2 1, 2, 4 μM을 37 도에서 12시간 동안 배양했다. 상기 실시예 1와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. 그리고 Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰했다. TMab4 scFv-GFP11-SBP2 4 μM 을 처리한 세포에서만 형광이 관찰된다.
실시예 6. GFP11 - SB2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab 세포질 잔류능 확인 논리
도 6은 완전 IgG 형태의 cytotransmab이 세포질에 위치하는 경우 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
상기 디자인된 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab 동물세포 발현을 위해 GFP11-SBP2를 cytotransmab의 중쇄 C-말단에 GGGS 3개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하고 정제하였다.
구체적으로는, 완전 IgG 형태의 단일클론항체 형태로 생산하기 위한 중쇄 발현벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 항체의 중쇄가변영역(인간화 hT0 VH), 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3), GFP11-SBP2를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다. 또한 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 세포질 침투 경쇄가변영역(hT4 VL)과 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
상기 경쇄, 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하여 수율을 비교하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2.0 × 106 세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 파종하여, 150 rpm, 8 % CO2에서 배양하였다. 각각의 단일클론항체 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 중쇄 125μg, 경쇄 125μg 총 250μg (2.5μg/ml)으로 희석하여, PEI 750 μg (7.5 μg/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150 rpm, 8% CO2에서 배양 후, 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일동안 배양했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행했다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량했다.
도 7는 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab 정제 후, 환원성 또는 비환원성 SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
구체적으로는, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 GFP11-SBP2 융합된 cytotransmab이 용액상태에서 단일체 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
실시예 7. GFP11 - SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab 의 세포질 잔류능 확인
도 8a는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 0.1, 0.5, 1 μM 의 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab를 처리한 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 플레이트 리더기를 통해 측정한 결과이다.
구체적으로는, 96 웰 블랙 플레이트에 상기 실시예 5와 동일하게 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, TMab4-GFP11-SBP2 0.1, 0.5, 1 μM을 37 도에서 6시간 동안 배양했다. 양성 대조군으로는 자발광 시약인 calcein 50 nM과 PEI 2 μM을 이용하였다. 각 웰을 PBS pH 7.4 buffer로 세척한 후 PBS pH 7.4 buffer 50 μl 를 넣고 Biotek의 Synergy HTX Multi-mode reader (excitation 485, emission 528)을 통해서 각각 웰의 형광 세기를 측정하였다. TMab4-GFP11-SBP2 0.1, 0.5, 1 μM 처리한 세포 모두에서 백그라운드 형광에 비하여 유의미한 형광이 측정되었다.
도 8b는 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 통한 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab의 양을 정량을 위해, 녹색 형광 단백질의 형광 표준 곡선(standard curve)이다.
구체적으로는, 상기 도 8a 실험과 동일한 96 웰 블랙 플레이트에 녹색 형광 단백질 변형체인 GFP-11.3.3-L 를 정제하여, 0-10 μg/ml 의 단백질을 PBS pH 7.4 buffer 50 μl에 희석하여 넣어주었다 (Yoo et al., 2007). Biotek의 Synergy HTX Multi-mode reader (excitation 485, emission 528)을 통해서 각각 웰의 형광 세기를 측정하였다.
측정한 형광 세기를 표준 곡선에 대입하여 녹색 형광 단백질의 양을 계산하고, 녹색 형광 단백질 변형체인 GFP-11.3.3-L의 녹색 형광에 대한 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광의 상대적인 밝기인 1.66 배를 곱하여 (Yoo et al., 2007, Pedelacq et al., 2006), 세포질 내부의 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab의 몰 수를 계산하였다. 또한, 세포질 부피인 940 μm3 와, 세포 수 2 x 104 cells 로 나누어 세포 내 농도를 계산하였다.
하기 표 1은 세포질 내부에 위치하는 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab의 몰 수와 세포 내 농도를 나타낸 표이다.
Figure pat00003
세포질 내부에 위치하는 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab의 몰 수와 세포 내 농도.
도 8c는 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주에 0.4, 0.8, 1, 2, 4 μM 의 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 cytotransmab를 처리한 후, 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 녹색 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 상기 실시예 5와 동일하게 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, TMab4-GFP11-SBP2 0.4, 0.8, 1, 2, 4 μM을 37 도에서 6시간 동안 배양했다. 상기 실시예 1와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. 그리고 Hoechst33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰했다. TMab4-GFP11-SBP2 0.4 μM 처리한 세포에서 미약한 형광이 관찰되며, 0.8, 1, 2, 4 μM 처리한 세포에서도 역시 GFP 형광이 관찰됨을 확인하였다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Enhanced split-GFP complementation system, and use thereof <130> 1-71p <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP1-10 <400> 1 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 50 55 60 Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Thr Val Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Gly Thr 210 215 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP11 <400> 2 Arg Asp His Met Val Leu His Glu Tyr Val Asn Ala Ala Gly Ile Thr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SA-GFP1-10 <400> 3 Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30 Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60 Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu 130 135 140 Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 145 150 155 160 Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Ile 165 170 175 Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 180 185 190 Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe 195 200 205 Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 210 215 220 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp 225 230 235 240 Gly Lys Tyr Lys Thr Arg Ala Val Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 245 250 255 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Thr Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 260 265 270 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr 275 280 285 Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Thr Val 290 295 300 Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 305 310 315 320 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 325 330 335 Tyr Leu Ser Thr Gln Thr Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Gly 340 345 350 Thr <210> 4 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP11-SBP2 <400> 4 Arg Asp His Met Val Leu His Glu Tyr Val Asn Ala Ala Gly Ile Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 His Val Val Glu Gly Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg 35 40 45 Leu Glu His His Pro Gln Gly 50 55 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SBP2 <400> 5 Gly His Val Val Glu Gly Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala 1 5 10 15 Arg Leu Glu His His Pro Gln Gly 20

Claims (22)

  1. (1) 세포질 내 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 녹색형광단백질 제1절편을 발현시키는 단계;
    (2) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 녹색형광단백질 제2절편이 융합된 검출 물질을 상기 제 (1) 단계의 세포에 처리하는 단계; 및
    (3) 녹색형광신호를 확인하는 단계;를 포함하는, 검출물질의 세포질 침투능 판단 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 녹색형광신호는 세포 외부에 처리된 검출 물질이 세포질 내로 침투하여 녹색형광 단백질 상보로 생성되는 것인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 녹색형광단백질 제1절편은 스트렙타비딘과 융합된 것인, 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 융합은 링커펩타이드에 의한 것인, 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 스트렙타비딘과 융합된 녹색형광단백질 제1절편은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 녹생형광단백질 제2절편은 스트렙타비딘 결합 펩타이드와 융합된 것인, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 스트렙타비딘 결합 단백질은 야생형 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 이의 절편, 또는 이의 변이체인 것인, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 검출물질은 항체, 항체의 절편, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 나노입자, 소분자약물 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 방법.
  10. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 녹색형광단백질 제1절편.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 녹색형광단백질 제1절편은 스트렙타비딘과 융합된 것인, 녹색형광단백질 제1절편.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 녹색형광단백질 제1절편은 세포질에 존재하는 것인, 녹색형광단백질 제1절편.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 스트렙타비딘과 녹색형광단백질 제1절편은 링커펩타이드에 의하여 융합된 것인, 녹색형광단백질 제1절편.
  14. 청구항 11에 있어서, 스트렙타비딘과 융합된 녹색형광단백질 제1절편은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 녹색형광단백질 제1절편.
  15. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 녹색형광단백질 제2절편.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 녹색형광단백질 제2절편은 스트렙타비딘 결합 펩타이드와 융합된 것인, 녹색형광단백질 제2절편.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 야생형 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 이의 절편, 또는 이의 변이체인 것인, 녹색형광단백질 제2절편.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 녹색형광단백질 제2절편.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 녹색형광단백질 제2절편은 세포질내로 침투하거나 침투할 것으로 예상되는 검출물질과 융합된 것인, 녹색형광단백질 제2절편.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 검출물질은 항체, 항체의 절편, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 나노입자, 소분자약물 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 녹색형광단백질 제2절편.
  21. 청구항 10 내지 14 중 어느 한 항의 녹색형광단백질 제1절편 또는 청구항 15 내지 20 중 어느 한 항의 녹색형광단백질 제2절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  22. 세포질 내에 발현하는 청구항 10 내지 14 중 어느 한 항의 녹색형광단백질 제1절편; 및
    검출물질과 융합한 청구항 15 내지 20 중 어느 한 항의 녹색형광단백질 제2절편을 포함하는, 세포질 침투능 검출 시스템.
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