KR102091195B1 - 세포질 침투 항체 및 이의 용도 - Google Patents

세포질 침투 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포질 침투 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 살아있는 세포의 세포막 막단백질을 통해 내재화(cellular internalization) 후 엔도좀(endosome)에서 세포질(cytosol)로 탈출하는 엔도좀 탈출을 일으키는 구조적인 기작을 규명하여, 엔도좀 탈출 효율성이 현저히 향상된 세포질에 위치하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역, 이를 포함하는 세포질 침투 항체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

세포질 침투 항체 및 이의 용도 {Cytosol-Penetrating Antibodies and Uses Thereof}
본 발명은 세포질 침투 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 살아있는 세포의 세포막 막단백질을 내재화(cellular internalization)하여 형성되는 엔도좀(endosome)으로부터 세포질(cytosol)로 탈출하는 엔도좀 탈출 효율성이 현저히 향상된 세포질에 분포하는 세포질 침투 항체 (Cytotransmab)의 엔도좀 탈출 효능을 높일 수 있는 엔도좀 탈출 유도 모티프, 이를 포함하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역, 이를 포함하는 세포질 침투 항체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
일반적 항체와 고분자 바이오 의약품은 소수성인 세포막 통과가 불가능하여 세포질 내부의 다양한 질병 관련 물질과 결합하여, 이를 저해하지 못하는 한계가 있다. 또한, 기존 항체는 큰 사이즈와 친수성에 의해 살아있는 세포 내부로 직접 침투하지 못한다.
따라서, 기존의 항체 대부분은 세포외로 분비된 단백질 또는 세포막 단백질을 특이적으로 표적하고 있다.
또한, 일반적으로 세포의 생장, 특이적 억제 등과 같은 기작 연구를 위한 실험에서 사용되는 세포내부 물질과 특이적 결합하는 상업적 항체들은 살아있는 세포에 대해서 직접 처리하지 못하고, 세포 내부 물질과 결합하기 위해서는 양친매성 글리코사이드인 사포닌(saponin)을 이용한 세포막 투과화 (permeabilization) 과정을 통해 세포막에 천공을 형성하기 위한 전처리 과정이 요구된다.
타겟 단백질에 고특이성, 고친화도로 결합하는 특징에 의해 세포막 또는 세포 외로 분비된 단백질을 표적으로 하는 다수의 치료용 항체가 개발되어 왔다. 세포막 단백질을 표적하는 항체는 세포막 단백질에 결합한 후, 막수용체 단백질 의 내재화 (receptor-mediated endocytosis) 과정을 통해 엔도좀 경로 (endosomal pathway)로 세포 내부로 들어갈 수 있다.
이와 같은 과정은 처음에 초기 엔도좀 (early endosome) 과정이후 여러 경로를 거친다. 즉, 1) 대부분의 항체는 초기 엔도좀에서 말기 엔도좀 (late endosome)을 거쳐, 라이소좀 (lysosome)으로 가서, 산성 분위기 조건과 단백질 가수분해 효소에 의해 완전 파괴되는 경로로 가고, 2) 일부 항체는 초기 엔도좀 산성 조건에서 FcRn (neonatal Fc receptor) 수용체와 결합하여 재순환 엔도좀 (recycling endosome) 경로를 거쳐 다시 세포 밖으로 나가는 경로를 거칠 수 있다.
따라서, 대부분의 항체는 타겟 막 단백질과 강한 결합으로 라이소좀 경로를 거쳐서 대부분 파괴된다. 상기 엔도좀 경로에서 엔도좀이 성숙화 되면서 내부가 수소펌프 (proton pump)에 의해 점차 산성화가 일어나는데, 초기 엔도좀의 pH는 5.5-6.5, 말기 엔도좀 pH는 4.5-5.5, 라이소좀의 pH는 pH 3.5-4.5 정도로 알려져 있으며 (Quadir MA et al., 2014; Li S et al., 2014), 엔도좀 내부에서 많은 단백질 가수분해 효소가 활성화 되어, 외부에서 내재화된 단백질들이 엔도좀 내부에서 파괴된다.
결국, 항체가 수용체에 의한 세포 내 내재화 후에 엔도좀 경로를 따라 이동할 때, 라이소좀으로 가기 전 초기 또는 말기 엔도좀에서 탈출해서 세포질로 위치하기 위해서는 타겟 막단백질과 분리되고 엔도좀에 천공을 만들어 탈출해야 한다.
세포 내부에 있는 자연계에 존재하는 물질 중 바이러스 및 독소 등은 세포 내재화 (Endocytosis)를 통하여 능동적으로 살아있는 세포 내부로 침투한다고 알려져 있다. 세포 내재화에 의해 세포 내부로 침투한 물질이 세포질에서 활성을 나타내기 위해서는 엔도좀에서 세포질로 탈출하는 과정, "엔도좀 탈출 (endosomal escape)"이 필수적이다. 아직까지 엔도좀 탈출 기작(endosomal escape mechanism)에 대하여 명확히 밝혀져 있지 않지만, 현재까지 엔도좀 탈출 기작에 대한 가설로는 크게 3가지가 있다.
첫 번째 가설은 엔도좀 막에 천공을 형성하는 기작으로서 엔도좀막에 양이온 양친매성 펩타이드 (Cationic amphiphilic peptides)와 같은 물질이 음전하의 세포 이중 지질막에 결합하여 내부 응력(internal stress) 또는 내막 수축을 일으켜 결과적으로 원통형의 구멍(barrel-stave pore) 또는 도넛형의 통로(toroidal channel)를 형성한다는 것이며 (Jenssen et al., 2006), 천공 형성 기작 (pore formation mechanism) 이라고 불린다.
두 번째 가설은 양성자 스펀지 효과 (proton sponge effect) 에 의하여 엔도좀이 터지는 기작으로 양성자화 아민기(protonated amine group)에 의해 아민기를 가진 물질이 높은 완충 효과를 통해 엔도좀의 삼투압 증가로 엔도좀막이 붕괴될 수 있다는 것이다 (Lin and Engbersen, 2008).
세 번째 가설은 중성에서 친수성 코일 모양 유지하지만 엔도좀과 같은 산성에서는 소수성 나선형 구조로 변형되는 특정 모티프가 엔도좀막과의 융합을 통해, 모티프가 포함된 바이러스 및 톡신이 엔도좀을 탈출한다는 가설이 있으며, 지질막 융합 기작 (Membrane fusion mechanism)이라고 명명된다 (Karen J. Cross et al., 2001). 이러한 3 가지 가설이 바이러스 단백질 및 식물/박테리아 유래 독소 단백질의 세포 내재화 후, 엔도좀 탈출 기작으로 제안되어 있지만, 항체에서 이와 같은 엔도좀 탈출 기작은 구체적으로 규명된 바 없다.
위와 같은 엔도좀 탈출 기작에서 공통적으로 관찰되는 현상은 엔도좀 및 라이소좀 환경인 산성 pH 조건에서 엔도좀 탈출이 일어난다는 점이다. pH에 따라 기능이 변화하는 단백질의 경우, pH에 따라 구조가 변화하는 특성을 가진다. 음전하를 띠는 아미노산 (아스파라긴산(D), 글루탐산(E))과 소수성 아미노산 (메티오닌(M), 류신(L), 이소류신(I))은 중성 pH 조건에서 상호작용이 없으나, pH가 낮아짐에 따라 음전하를 띠는 아미노산 곁가지의 카르복실산 (carboxyl acids, COO-)이 수소화되어 (protonation) 소수성을 띠고 (Korte et al., 1992), 이어 주변의 소수성 아미노산과 소수성 상호작용(Hydrophobic interaction)을 할 수 있게 된다. 그 결과, 두 아미노산 간의 거리가 가까워지게 되며, 전체적인 단백질의 구조 및 기능이 변화한다. 이러한 변화를 일으키는 현상은 탄포드 트랜지션(Tanford transition) 이라고 명명되어 있다(Qin et al., 1998).
일 예로, 질소 수송 효소인 나이트로포린 4 (Nitrophorin 4)는 중성 수소이온 농도 조건에서 개방형 구조를 갖지만, pH가 중성 (pH 7.4)에서 약산성 (pH 6.0)으로 낮아짐에 따라, 아스파라긴산과 류신의 소수성 상호작용에 의해 폐쇄형 구조로 변화함에 따라 질소 수송 기능을 수행하게 된다 (Di Russo et al., 2012).
하지만, 현재까지 항체에서는 이러한 pH 의존적 구조 변화가 밝혀져 있지 않으며, 특히 세포 내재화를 하는 항체에서는 보고된 바 없다.
일 예로, 종래 항체 기술에서 pH 의존적 항원결합을 유도하기 위한 항체공학적 개량 기술은 항원 결합 부위, 즉 CDRs (Complementary Determining Regions)의 히스티딘 (H) 도입 또는 하스티딘 (H)를 포함한 무작위 돌연변이가 도입된 라이브러리에서 pH 의존적 항원 결합 항체 선별 방법이다 (Bonvin P et al., 2015). 하지만, 두가지 방법 모두 구조의 변화를 초래하지 않으며, pH 의존적 항원 결합을 유도하기 위해 라이브러리 기반의 선별작업이 선행되어야 하는 한계점을 가지고 있다.
세포질 내부에서 활성을 나타내는 물질의 효과를 높이기 위해, 궁극적으로 세포질에 위치하는 물질의 양이 증가해야 하므로, 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위한 연구가 진행된 바 있다. 이러한 연구는 세포 침투 펩타이드 (Cell-penetrating peptides, CPP) 에서 주로 진행되어 왔다. 일부 세포 침투 펩타이드가 엔도좀 탈출 경로를 통해 세포질로 위치한다고 보고 되었으나, 정확한 엔도좀 탈출 기작에 대한 자세한 연구가 없으며, 엔도좀 탈출 효율도 매우 낮아, 세포 내재화된 펩타이드 중 약 0.1 ~ 4% 정도만이 세포질로 분포한다고 알려져 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 세포 내부로 침투하여 세포질에 분포하는 세포질 침투 항체 (Cytotransmab) (Choi et al., 2014) 의 엔도좀 탈출 효능을 높일 수 있는 엔도좀 탈출 구조 모티프를 규명하고, 이를 기반으로 엔도좀 탈출능이 향상된 엔도좀 탈출 구조 모티프를 지닌 경쇄 또는 중쇄 가변영역 및 이를 포함한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개발할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 출원의 발명자들은 이러한 엔도좀 탈출 구조 모티프를 기타 다른 종류의 경쇄 또는 중쇄 가변영역에 그라프팅하여 엔도좀 탈출능을 가지는 세포질 침투 항체를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 엔도좀 탈출능을 가지는 세포질 침투 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포질 내 활성물질 전달용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 일반식으로 표시되는 서열을 CDR3에 포함하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역을 포함하고,
X1-X2-X3-Z1
여기서, X1-X2-X3는 엔도좀 탈출능 모티프이고,
X1-X2-X3 각각은 트립토판(W), 타이로신(Y), 히스티딘(H) 및 페닐알라닌(F)으로 구성된 군에서 선택되며,
Z1 은 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L), 히스티딘 (H), 아스파라긴산 (D) 및 글루탐산 (E)으로 이루어진 그룹에서 선택되고,
상기 Z1을 포함하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역이 엔도좀 산성 pH 조건에서 항체의 특성변화가 일어나고,
상기 항체의 특성 변화를 통해 항체가 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에 의한 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산은 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포질 내 활성물질 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, X1-X2-X3 엔도좀 탈출 모티프 (X1-X2-X3 는 트립토판(W), 타이로신(Y), 히스티딘(H) 및 페닐알라닌(F)으로)를 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역의 CDR3에 옮기는 그라프팅(grafting) 단계를 포함하는 상기 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 엔도좀 탈출 모티프를 포함하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역을 포함하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 살아있는 세포 침투를 통하여 세포질에 위치되므로, 궁극적으로 특별한 외부 단백질 전달 시스템 없이 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 살아 있는 세포 내부로 침투시켜 세포질에 분포시킬 수 있다.
본 발명에 따른 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다양한 인간 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역과 결합이 용이하면서도 엔도좀 탈출 기능을 통해 세포질에 위치하는 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역을 포함하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 세포 내부에 침투하여 세포질에 분포하며, 세포에 비특이적 세포독성을 보이지 않는다.
본 발명에 따른 고효율 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 엔도좀 탈출 기작을 토대로 엔도좀 탈출능 향상을 위한 항체 라이브러리 및 돌연변이 디자인을 진행할 수 있다.
본 발명에 따른 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함된 엔도좀 탈출 모티프를 기타 다른 항체에 도입하여 엔도좀 탈출능 부여를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 살아있는 세포의 세포질 내부로 활성물질을 전달하는 운반체로 활용될 수 있으며, 질병 치료 및 예방을 위한 약학 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 세포 내로 유입된 세포질 침투 항체 (cytotransmab) TMab4 또는 세포 침투 펩타이드 TAT의 수송과정과 안정도를 관찰하기 위해, 펄스 추적 실험 (pulse-chase)을 진행하여 공초점 현미경 (confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
도 2a는 세포질 침투 항체 TMab4 또는 세포 침투 펩타이드 TAT의 억제자 유무에 따른 세포질 침투능을 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2b는 도 2a의 공초점 현미경 사진의 FITC (녹색형광) 형광을 정량한 막대 그래프이다.
도 2c는 세포질 침투 항체 TMab4 또는 세포 침투 펩타이드 TAT의 억제자 유무에 따른 세포질로의 이동을 칼세인 (calcein)을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2d는 도 2c의 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 3a는 siRNA (short interfering RNA)로 헤파라나제의 발현을 억제한 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 3b는 헤파라나제의 발현을 억제함에 따른 세포질 침투 항체와 라이소좀과의 중첩을 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3c는 헤파라나제의 발현을 억제함에 따른 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는 세포질 침투 항체가 세포 내재화 되어 세포질에 위치하기까지의 전체적인 트래피킹 과정을 나타낸 전반적인 모식도이다.
도 5은 pH에 따라 세포막을 통과하여 세포질 침투 항체가 유입될 수 있는지, 또한, 다른 물질의 세포막 통과를 유도할 수 있는지 항체를 직접 형광표지하여 Ramos 세포주에서 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 6a는 pH에 따른 세포질 침투 항체에 의해 막투과능이 없는 트립판 블루 (trypan blue)를 천공으로 획득 가능한지 Ramos 세포주에서 광학현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 6b는 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 7a는 pH 5.5 조건에서 세포질 침투 항체에 의해 생성된 세포막 천공이 일시적이며, 가역적인 현상인지 광학현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 7b는 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 8는 pH에 따른 세포질 침투 항체와 대조군 항체 아달리무맙 (adalimumab)의 세포막 결합을 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
도 9는 pH에 따른 세포질 침투 항체와 대조군 항체 아달리무맙의 세포막 지질 플립-플랍 유도능을 유세포분석기 (FACS)로 분석한 결과이다.
도 10는 상기 실험들을 통하여 예상한 세포질 침투 항체의 천공 형성 모델을 나타낸 모식도이다.
도 11는 세포질 침투 항체의 경쇄가변영역(VL) 의 WAM 모델링 구조를 기반으로 pH에 따른 세포질 침투 항체의 구조적 변화를 예측하여 구조적 변화에 관여하는 아미노산 및 구조적 변화에 의해 노출되는 아미노산을 나타낸 도이다.
도 12는 산성 pH에서 세포질 침투 항체의 특성 변화를 유도하는 경쇄가변영역(VL) 1번째 아미노산 아스파라긴산, 95번째 아미노산 메티오닌을 각각 알라닌, 글루탐산, 류신으로 치환한 돌연변이들에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 13는 세포질 침투 항체의 경쇄가변영역(VL) CDR3 의 아미노산들 중 엔도좀 탈출에 관여할 가능성이 있는 아미노산들을 각각 알라닌으로 치환한 돌연변이들에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 14a는 HSPG 수용체에 결합하여 세포질 침투능을 담당하는 세포질 침투 항체 경쇄가변영역(VL) CDR1 과 CDR2을 인간 유래 생식선 서열로 치환한 돌연변이의 세포질 침투능을 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 14b는 HSPG 수용체에 결합하여 세포질 침투능을 담당하는 세포질 침투 항체 경쇄가변영역(VL) CDR1 과 CDR2을 인간 유래 생식선 서열로 치환한 돌연변이에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 15a는 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 15b는 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이의 세포질 침투능이 유지되는지 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 16은 pH에 따른 세포질 침투 항체 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 17a는 세포질 침투 항체 야생형 또는 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이 TMab4-WYW의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 17b는 도 17a의 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 18은 세포질 침투 항체 야생형 또는 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이가 세포질에 위치하는 경우 개선된 분할 녹색 형광 스플릿 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
도 19은 GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 20a는 GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이의 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 20b는 도 20a의 공초점 현미경 사진의 GFP 형광을 정량한 그래프이다.
도 21a는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이의 세포막 결합을 유세포분석기 (FACS)로 분석한 그래프이다.
도 21b는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
도 21c는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 22a은 엔도좀 탈출능 향상된 세포질 침투 항체 돌연변이의 활성을 확인하기 위해, 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
도 22b은 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 22c은 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체와 세포질에 위치한 세포골격인 튜블린과의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 23a은 엔도좀 탈출능 향상된 돌연변이의 활성을 확인하기 위해, 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투항체 구축을 설명한 모식도이다.
도 23b는 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체들의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
도 23c는 K-RAS 돌연변이체 K-RAS G12D의 GppNHp가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태에서의 친화도를 측정하기 위한 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)를 수행한 결과이다.
도 24는 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체들과 세포내 활성화된 H-RAS G12V 돌연변이와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 25a는 산성 pH 5.5에서 세포질 침투 항체의 특성 변화를 유도하는 경쇄가변영역(VL) 1번째 아미노산 아스파라긴산을 다양한 아미노산으로 치환한 돌연변이의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 25b는 산성 pH 5.5에서 세포질 침투 항체의 특성 변화를 유도하는 경쇄가변영역(VL) 95번째 아미노산 메티오닌을 다양한 아미노산으로 치환한 돌연변이의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 26a은 추가적인 산성 pH 인지 특성변화를 유도할 목적으로 디자인한 돌연변이들의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 26b은 추가적인 산성 pH 인지 특성변화를 유도할 목적으로 디자인한 돌연변이의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 27은 세포질 침투 항체 경쇄가변영역의 CDR3 를 구성하는 아미노산의 개수를 다르게 한 돌연변이들의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 28a는 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
도 28b는 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체의 HSPG 결합능 및 세포질 침투능이 감소 혹은 제거되었는지 형광 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 28c는 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체에 의한 산성 pH에 의한 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 29a는 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체의 K-RAS 돌연변이체 K-RAS G12D의 GppNHp가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태에서의 친화도를 측정하기 위한 ELISA를 수행한 결과이다.
도 29b는 RGD10 펩타이드 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
도 29c는 RGD10 펩타이드 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체와 세포내 활성화된 H-RAS G12V 돌연변이와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 30a는 엔도좀 탈출능을 제거한 세포질 침투 항체 경쇄가변영역과 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄가변영역을 가진 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
도 30b는 엔도좀 탈출능을 제거한 세포질 침투 항체 경쇄가변영역과 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄가변영역을 가진 세포질 침투 항체에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 30c는 GFP11-SBP2 융합된, 엔도좀 탈출능을 제거한 세포질 침투 항체 경쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역을 가진 세포질 침투 항체의 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 30d는 엔도좀 탈출능을 제거한 세포침 침투 항체 경쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역을 가진 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 calcein을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 31a는 산성 pH 5.5에서 세포질 침투 항체의 특징 변화를 하는 중쇄가변영역(VH) 1번째 아미노산 글루탐산을 다양한 아미노산으로 치환한 돌연변이의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 31b는 산성 pH 5.5에서 세포질 침투 항체의 특징 변화를 유도하는 중쇄가변영역(VH) 102번째 아미노산 류신을 다양한 아미노산으로 치환한 돌연변이의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 32a 는 3개의 트립토판으로 치환한 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 32b 는 3개의 트립토판으로 치환한 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 33a는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 EpCAM 표적 펩타이드를 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
도 33b는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 EpCAM 표적 펩타이드를 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
도 33c는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 EpCAM 표적 펩타이드를 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 34a은 기존 치료용 항체 중쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
도 34b는 기존 치료용 항체 중쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 35는 아스파라긴산을 도입한 중쇄가변영역 및/또는 경쇄가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의해 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 36a는 Index G1 조건에서 형성된 CT-59 Fab의 크리스탈을 RI1000 (Rock Imager1000; 전자동단백질결정이미지분석장치)로 관찰한 결과이다.
도 36b는 pymol 프로그램을 사용하여 Refinement 및 validation이 완료된 CT-59의 3차 구조를 나타낸 구조이다. 1번 아스파라긴산 (D)와 95번째 메티오는 (M)은 노란색으로 표시하였으며, 92번부터 94번까지의 아미노산은 주황색으로 표시하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 하기 일반식으로 표시되는 서열을 CDR3에 포함하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역을 포함하고,
X1-X2-X3-Z1
여기서, X1-X2-X3는 엔도좀 탈출능 모티프이고, X1-X2-X3 각각은 트립토판(W), 타이로신(Y), 히스티딘(H) 및 페닐알라닌 (F) 으로 구성된 군에서 선택되며,
Z1 은 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L), 히스티딘 (H), 아스파라긴산 (D) 및 글루탐산 (E)으로 이루어진 그룹에서 선택되고,
상기 Z1을 포함하는 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역이 엔도좀 산성 pH 조건에서 항체의 특성변화가 일어나고,
상기 항체의 특성 변화를 통해 항체가 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명에서 "엔도좀 탈출"은 세포 내재화를 통해서 능동적으로 살아있는 세포에 침투한 후 산성조건에서 엔도좀을 벗어나 세포질에 위치하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "엔도좀 탈출 모티프"는 산성조건에서 엔도좀 탈출을 유도하는 특징을 가지는 특정 아미노산 서열을 포함하는 1차 구조, 이에 의해 형성된 3차 구조를 포함하며, "엔도좀 탈출능 모티프" 또는 "엔도좀 탈출능 보유 모티프"와 혼용할 수 있다. "엔도좀 탈출 모티프"를 포함하는 경쇄 가변영역 (VL) 또는 중쇄 가변영역 (VH)을 포함하는 항체는 "세포질 침투"가 가능하며, "세포질 침투 항체"는 세포 내재화에 의해 세포 내부로 침투한 항체가 산성조건에서 엔도좀에서 세포질로 탈출된 것을 의미하며, "세포질 침투능을 가진 항체"와 혼용할 수 있다.
본 발명에서 엔도좀 탈출 모티프 X1-X2-X3-Z1을 구성하는 Z1은 카밧 (Kabat) 넘버링에 따라 경쇄 가변영역의 95번 또는 중쇄가변영역의 102번 아미노산에 위치할 수 있으며, 소수성을 띄는 아미노산인 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L), 음전하를 띄는 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E), 양전하를 띄는 아미노산인 히스티딘 (H)으로, 본 발명에 따른 세포질 침투 항체의 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역은 엔도좀의 산성 pH조건에서 1번째 아미노산이 음전하를 띄는 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)과 경쇄 가변영역의 95번 또는 중쇄 가변영역의 102번 아미노산의 Z1이 상호작용하여 특성 변화를 유도하여 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 보유할 수 있다.
본 발명에서 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산이 상기 Z1과 엔도좀 산성 pH 조건에서 상호작용하여 특성변화유도를 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
또한 pH 7.4에서 엔도좀의 산성조건 pH 5.5로 변경됨에 따라 상기 엔도좀 탈출 모티프 Z1과 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산 상호작용이 변하게 된다. 즉, Z1이 소수성을 띄는 아미노산인 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L) 또는 음전하를 띄는 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)으로 구성 시, 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)과 상호작용에서 음전하를 띄는 아미노산 곁가지의 카르복실산이 상기 산성조건에서 일정부분 수소화되어 (protonation) 소수성을 띄는 특징에 의한 소수성 상호작용 (Hydrophobic interaction)을 한다.
또한 상기 엔도좀 탈출 모티프 Z1과 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역 1번 아미노산과의 pH 의존적 특성 변화 유도 중 Z1이 소수성을 띄는 아미노산인 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L)과 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역 1번 아미노산인 음전하를 띠는 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E) 상호작용의 경우, 중성 pH 조건에서 상호작용이 없으나, pH가 낮아짐에 따라 음전하를 띠는 아미노산의 수소화에 따른 소수성 결합 (Hydrophobic interaction)을 통해서 두 아미노산 간의 거리가 가까워지게 되어 단백질 구조 및 기능의 변화를 유도하는 현상인 탄포드 트랜지션 (Tanford transition) 과정을 포함할 수 있다.
또한 Z1이 히스티딘 (H)로 구성 시 pH 7.4에서 pH 5.5로 변경됨에 따라 아미노산 곁가지의 순전하 (Net charge)가 양전하를 띄게 되며, 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)과 정전기적 상호작용 (Electrostatic interaction)을 한다.
본 발명의 실시예에서, 경쇄가변영역의 1번과 95번 아미노산 쌍에 의한 pH 의존적 특성 변화 유도를 확인하기 위해 각각 알라닌 치환 돌연변이를 통한 엔도좀 탈출능을 분석한 결과, 각각의 알라닌 치환 돌연변이는 pH에 의한 엔도좀 탈출능을 보이지 않았으며, 95번 아미노산을 20가지 아미노산으로 치환한 각각의 돌연변이를 이용한 엔도좀 탈출능을 분석한 결과, 본 발명에 따른 세포질 침투 항체의 경쇄가변영역 95번 아미노산이 메티오닌 (M), 류신 (L), 이소류신 (I), 아스파라긴산 (D), 글루탐산 (E) 과 히스티딘 (H)으로 구성된 돌연변이에서 pH 의존적 엔도좀 탈출능을 보였다.
또한 본 발명의 실시예에서, 동일한 방법으로 알라닌 치환 돌연변이 실험을 통해 발견한 pH 의존적 특성 변화 유도 아미노산인 중쇄가변영역 1번과 102번 아미노산 쌍에 대해서 13가지 아미노산으로 친환한 각각의 돌연변이를 이용하여 엔도좀 탈출능을 분석한 결과, 본 발명에 따른 세포질 침투 항체의 중쇄가변영역 102번 아미노산이 메티오닌 (M), 류신 (L), 이소류신 (I), 아스파라긴산 (D), 글루탐산 (E) 과 히스티딘 (H)으로 구성된 돌연변이에서 pH 의존적 엔도좀 탈출능을 보였다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 X3 와 Z1 사이에 (a1-...-an)(n 은 1 이상 10 이하의 정수) 으로 표시되는 아미노산 서열을 더 포함하는 것이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서 (a1-...-an) )(n 은 1 이상 10 이하의 정수)으로 표시되는 아미노산 서열을 더 포함하는 경우 CDR3 의 길이가 증가하면서 본 발명에 의한 엔도좀 탈출 모티프의 특성 변화가 용이해질 수 있다.
본 발명에서 엔도좀 탈출 모티프는 경쇄 가변영역; 중쇄 가변영역; 경쇄 가변영역 및 중쇄가변영역에 포함되는 X1-X2-X3-Z1의 구조이며, X1-X2-X3 각각은 트립토판 (W), 타이로신 (Y), 히스티딘 (H) 및 페닐알라닌 (F) 으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에서 상기 엔도좀 탈출 모티프 X1-X2-X3는 세포 내부 엔도좀의 약산성 pH 예를 들어, 초기 엔도좀의 pH 조건인 5.5-6.5에 반응하여 Z1과 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역 1번 아미노산과 상호작용에 의하여 특성이 변화된 항체의 엔도좀 탈출 효율을 현저히 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 엔도좀 탈출 모티프 X1, X2 및 X3은 엔도좀 내막을 이루는 인지질 주요 구성성분인 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)의 친수성 머리부분과 소수성 꼬리부분에 상호작용이 용이한 아미노산으로 구성된 군에서 선택된다.
구체적으로, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)와 20가지 아미노산 간의 평균 결합력은 트립토판 (W), 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 류신 (L), 이소류신 (I), 시스테인 (C), 메티오닌 (M) 순으로 높다.
구체적으로, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)의 친수성 머리부분과 20가지 아미노산 간의 결합력은 아르지닌 (R), 트립토판 (W), 타이로신 (Y), 히스티딘 (H), 아스파라진 (N), 글루타민 (Q), 라이신 (K), 페닐알라닌 (F) 순으로 높으며, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)의 소수성 꼬리부분과 20가지 아미노산 간의 결합력은 트립토판 (W), 페닐알라닌 (F), 류신 (L), 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 발린 (V), 타이로신 (Y) 순으로 높다.
본 발명에서 엔도좀 탈출 모티프 X1, X2, 및 X3를 구성하는 아미노산은 야생형 세포질 침투 항체를 구성하고 있는 타이로신 (Y)과 히스티딘 (H)을 포함하여, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)와 평균 결합력이 타이로신 (Y) 보다 높은 트립토판 (W), 페닐알라닌 (F)을 포함 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 문헌조사를 통해 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)과 상호작용이 용이한 아미노산을 분석하였으며, 친수성 머리부분과 소수성 꼬리부분에 결합력이 가장 높은 트립토판 (W) 엔도좀 탈출 모티프 X1, X2 및 X3에 도입하여 엔도좀 탈출능을 분석한 결과, 본 별명에 따른 개선된 세포질 침투 항체는 기존 X1, X2, X3에 타이로신 (Y), 타이로신 (Y) 및 히스티딘 (H)로 구성된 야생형 세포질 침투 항체보다 pH 의존적 높은 엔도좀 탈출능이 관찰되었다.
또 하나의 실시예에서, 엔도좀 탈출을 위한 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)와 상호작용이 머리부분 또는 꼬리부분이 중요한지 확인하기 위해, 엔도좀 모티프 X1, X2, X3에 머리부분과 결합만 용이한 아르지닌 (R), 꼬리부분과 결합만 용이한 이소류신 (I) 및 지질과 상호작용이 현저히 낮은 글라이신 (G)이 도입된 돌연변이 구축 및 엔도좀 탈출능을 분석한 결과, 본 발명에 따른 트립토판 (W)가 도입된 세포질 침투 항체를 제외한 두 돌연변이 모두 엔도좀 탈출능이 현저히 감소하였다. 따라서, 지질의 친수성 머리와 소수성 꼬리와의 상호작용이 모두 엔도좀 탈출에 관여한다.
또 하나의 실시예에서, 상기 경쇄 가변영역의 엔도좀 탈출능 모티프는 트립토판을 하나 이상, 하나 또는 둘을 포함할 수 있다.
세포질 내부에서 활성을 나타내는 물질의 효과를 높이기 위해, 궁극적으로 세포질에 위치하는 물질의 양이 증가해야 하므로, 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위해 연구가 진행되었다. 이러한 연구는 세포 침투 펩타이드 (Cell-penetrating peptides, CPP) 에서 주로 진행되어 왔으며, 특히 세포 지질막의 통과를 위한 지질막과의 상호작용을 필수적이므로 이를 향상시키기 위한 전략을 도입하였다. 한 예로, 아르기닌이 풍부한 세포 침투 펩타이드에 트립토판을 N-말단과 펩타이드 중간에 추가한 바 있다.
그러나, 이러한 접근이 항체에 대하여 이루어진 바는 없다. 트립토판 (Tryptophan, W)은 세포막을 이루는 주요 인지질인 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)의 친수성 머리부분과 소수성 꼬리부분과의 상호작용이 모두 우수한 아미노산이므로, 엔도좀 내막과의 상호작용 및 엔도좀 탈출이 증가할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 엔도좀 탈출능 모티프 X1-X2-X3는 다음의 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다: W-W-H, W-Y-W, Y-W-W, W-Y-H, Y-W-H 및 W-W-W.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 엔도좀 탈출능 모티프 X1-X2-X3는 엔도좀 산성 pH 조건에서 상호작용이 유도되어 특성변화를 통해 엔도좀 탈출능을 향상시킴을 확인하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, "엔도좀 산성 pH"는 초기 엔도좀과 말기 엔도좀 pH 조건을 충족하며, 아스파라긴산 (D) 와 글루탐산 (E)의 곁가지의 특성이 변경이 가능한 pH 6.0 ~ 4.5 범위를 말한다.
상기 엔도좀 탈출 모티프를 포함한 경쇄 가변영역의 CDR3는 다음의 서열번호 8 내지 12, 51로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다:
QQYWWHMYT (서열번호 8);
QQYWYWMYT (서열번호 9);
QQYYWWMYT (서열번호 10);
QQYWYHMYT (서열번호 11);
QQYYWHMYT (서열번호 12)
QQYWWWMYT (서열번호 51)
상기 엔도좀 탈출 모티프를 포함하는 경쇄 가변영역은 예를 들어, 서열번호 1 내지 5, 13 내지 23, 25 내지 37, 50, 60 내지 64로 구성된 군에서 선택된 경쇄 가변영역의 서열과 80% 이상의 상동성, 예를 들어 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
개선된 엔도좀 탈출 효율은 중쇄 가변영역에 엔도좀 탈출 모티프를 포함시키는 경우에도 동일하게 달성할 수 있으며, X1-X2-X3-Z1(여기서 X1-X2-X3 각각은 트립토판(W), 타이로신(Y), 히스티딘(H) 및 페닐알라닌(F) 으로 구성된 군에서 선택)인 CDR3를 포함하고, 상기 중쇄 가변영역의 Z1이 1번째 아미노산과 엔도좀 산성 pH 조건에서 상호작용하여 변화된 세포질 침투항체의 특성변화를 통해 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 보유하는 중쇄 가변영역에 관한 것이다.
모티프상기 엔도좀 탈출 모티프를 포함한 중쇄 가변영역의 CDR3는 다음의 서열번호 46 내지 49, 53로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다:
GWYWMDL (서열번호 46);
GWYWFDL (서열번호 47);
GWYWGFDL (서열번호 48);
YWYWMDL (서열번호 49); 및
GWWWMDL (서열번호 53)
상기 엔도좀 탈출 모티프를 포함하는 중쇄 가변영역은 예를 들어, 서열번호 39 내지 42, 52, 54 내지 59로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변영역의 서열과 80% 이상의 상동성, 예를 들어 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에서 상기 X1과 연결되는 Z2 를 더 포함하여 아래 일반식으로 표시되는 것이 가능하다.
Z2-X1-X2-X3-Z1
(상기 Z2 는 글루타민 (Q), 류신 (L) 및 히스티딘 (H) 으로 이루어진 그룹에서 선택됨)
상기와 같이 Z2-X1-X2-X3-Z1으로 표시되는 경우 상기 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산이 상기 Z1 및/또는 Z2 상호작용하여 엔도좀 산성pH 의존적 엔도좀 탈출을 유도하는 것을 특징으로 한다.
상기 엔도좀 탈출 모티프를 포함한 경쇄 가변영역의 CDR3는 다음의 서열번호 24 의 서열을 포함할 수 있다:
QHYWYWMYT (서열번호 24)
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"에는 타겟 특이적 결합을 나타내는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 세포질 침투 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있으며, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있으며, 가장 바람직하게는 완전 IgG 타입의 단일클론항체일 수 있다.
또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메 인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
상기 단일 클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
다른 관점에서, 본 발명은 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포질 내 활성물질 전달용 조성물에 관한 것이다.
상기 활성물질은 항체에 융합 또는 결합된 형태일 수 있으며, 활성물질은 예를 들어 펩타이드, 단백질, 독소, 항체, 항체절편, RNA, siRNA, DNA, 소분자 약물, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질은 항체, 항체 단편, 면역글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등일 수 있다.
상기 RNA 또는 리보핵산(Ribonucleic acid)는 오탄당의 일종인 리보스를 기반으로 사슬구조의 뉴클레오타이드를 이루는 핵산의 한 종류이며, 하나의 나선이 길게 꼬여 있는 구조를 지니며 DNA의 일부가 전사되어 만들어진다. 일구체에에 있어 상기 RNA는 rRNA, mRNA, tRNA, miRNA, snRNA, snoRNA, aRNA로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
상기 siRNA (Small interfering RNA)는 dsRNA로 구성된 작은 사이즈를 가지고 있는 RNA 간섭(RNA interference) 물질로서, 표적 서열을 가지고 있는 mRNA와 결합하여 분해하는 역할을 하며, 질병의 치료제 또는 실험적로서 표적 mRNA의 분해하여 표적 mRNA에 의해 번역(Translation)되는 단백질의 발현을 억제하는 활성을 이용하여 본원에서 광범위하게 사용된다.
상기 DNA 또는 데옥시리보 핵산 (Deoxyribonucleic acid)는 핵산의 일종이며, 단당류인 디옥시리보스에 인산기가 결합된 형태의 뼈대(Backbone chain)과 퓨린(Purin), 피리미딘(Pyrimidine)의 두가지 종류를 가지고 있는 핵염기(Nucleobase)로 구성되어 있으며, 세포의 유전 정보를 저장하는 물질이다.
상기 소분자 약물은 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니며 질병의 치료제로서 활성도를 지니는 유기 화합물, 무기 화합물 또는 유기금속 화합물을 나타내는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 본 발명에서 사용되는 소분자 약물은 올리고펩티드 및 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니는 그 밖의 바이오분자 (biomolecule)를 포함한다.
상기 나노입자 (nanoparticle)는 직경 1 내지 1000 nm 크기를 갖는 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노 입자는 금속 나노 입자, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 금속/금속 코어쉘 복합체, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 비금속 쉘로 구성되는 금속/비금속 코어쉘 또는 비금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 비금속/금속 코어쉘 복합체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 백금, 자성철 및 그의 산화물로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 비금속은 실리카, 폴리스티렌, 라텍스 및 아크릴레이트 계열의 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 리포좀은 자기 스스로 회합할 수 있는, 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특정 수 있다. 작은 유니라멜라 소포(SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포(LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에서 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포 (multivesicular vesicle)라고 한다.
상기 "융합" 또는 "결합"은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 활성물질과의 융합을 중계할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이에 의해 전달되는 세포질 내 활성물질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
항체가 가지는 항원 고특이성 및 고친화도에 영향주지 않으면서 상기 활성물질을 이용하여 세포 내부로 침투하여 세포질에 잔류하는 특성을 부여할 수 있으며, 이를 통해 현재 소분자 약물을 이용한 질병 치료에 표적물질로 분류되고 있는 세포질 내에 존재하면서 단백질과 단백질 사이에 넓고 평평한 표면을 통해 구조복합성 상호작용을 이루는 종양 및 질환 관련 인자에 대한 치료 및 진단에 높은 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기존 다양한 종양치료제의 주요 약물 저항성 관련 인자인 KRas 돌연변이를 선택적 저해가 가능하면서 기존 치료제와의 병행 치료를 통해 효과적인 항암 활성을 기대할 수 있다.
상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 조성물이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이에 의해 전달되는 세포질 내 활성물질을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 암의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.
상기 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체 및 이의 절편은 영상을 통하여 암을 진단하기 위하여 분자 영상용 형광체와 결합할 수 있다.
상기 분자 영상용 형광체는 형광을 발생시키는 모든 물질을 말하며, 적색이나 근적외선(near-infrared)의 형광을 발광하는 것이 바람직하며, 양자 수득량(quantaum yield)이 높은 형광체가 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 분자 영상용 형광체는 상기 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체 및 이의 절편에 특이적으로 결합하는 종양 침투성 펩타이드와 결합할 수 있는 형광체, 형광 단백질 또는 기타 영상용 물질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형광체는 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로드아민 (Trtramethylrhodamine), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine), 알로피코시아닌 (allopicocyanine) 또는 이들의 유도체가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형광 단백질은 드론파 (Dronpa) 단백질, 형광 발색 유전자 (EGFP), 적색 형광 프로테인 (red fluorescent protein, DsRFP), 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5 또는 기타 형광 단백질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
기타 영상용 물질은 산화철, 방사성 동위원소 등이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, MR, PET과 같은 영상 장비에 응용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
상기 핵산은 폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)로, 상기 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 엔도좀 탈출능이 향상된 경쇄 가변영역 (VL) 및 중쇄 가변영역 (VH)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 1 내지 5, 13 내지 23, 25 내지 37, 50, 60 내지 64 및 서열번호 39 내지 42, 52, 54 내지 59로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 경쇄 가변영역 (VL) 및 중쇄 가변영역 (VH)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열도 포함할 수 있다.
상기 핵산은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다.
본 발명은 다른 관점에서, X1-X2-X3 엔도좀 탈출능 모티프 (X1-X2-X3 각각은 트립토판(W), 타이로신(Y), 히스티딘(H) 및 페닐알라닌(F)으로 구성된 군에서 선택됨)를 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역의 CDR3에 옮기는 그라프팅(grafting) 단계를 포함하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
기존 종래 항체의 경쇄 가변영역(VL)을 엔도좀 탈출능이 향상된 경쇄가변영역(VL)으로 치환하여, 중쇄 가변영역(VH)을 엔도좀 탈출능이 향상된 중쇄 가변영역(VH)으로 치환하여, 세포질 침투능을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공할 수 있다.
하나의 실시예에서, 엔도좀 탈출능 향상된 세포질 침투 경쇄 가변영역(VL) 및 엔도좀 탈출능 부여된 세포질 침투 중쇄 가변영역(VH)을 이용한 세포내부로 침투하여 세포질에 분포하는 완전 이뮤노글로불린 형태의 항체를 제조하는 방법은 다음과 같다:
경쇄 가변영역(VL) 및 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 경쇄에서 경쇄 가변영역(VL)을 엔도좀 탈출능이 부여된 경쇄 가변영역(VL)으로 치환하거나, 중쇄 가변영역(VH) 및 중쇄 불변영역 (VH)을 엔도좀 탈출능이 부여된 중쇄 가변영역(VH)으로 치환한 핵산을 벡터에 클로닝하고, 숙주세포에 형질전환하여 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
이를 통해, 엔도좀 탈출능 향상된 세포질 침투능을 가지는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 제조할 수 있다. 또한, 세포내부의 특정 단백질을 인지할 수 있는 중쇄가변영역을 포함하는 중쇄를 발현하는 벡터와 함께 형질전환을 통하여, 세포내부로 침투하고 세포질에 분포하여 특정 단백질과 결합할 수 있는 항체를 발현할 수 있다.
본 발명에서 벡터는 경쇄와 중쇄를 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주 세포로 도입될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 본 발명에서 제공하는 경쇄 가변영역, 및 경쇄 불변영역(CL), 중쇄 가변영역(VH) 및 중쇄 불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)은 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공할 수 있다.
숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포내부로 침투하여 세포질에 위치하는 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나 당화 (glycosylation) 문제로 인해 인택트 (intact)한 Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않지만, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.
상기 형질전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 세포질 침투 항체 (Cytotransmab)의 발현 및 정제.
세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출 기작을 밝히고 이를 향상시키기 위한 개발에 사용하기 위해 세포질 침투 항체를 정제하였다.
구체적으로는, 완전 IgG 형태의 단일클론항체 형태로 생산하기 위한 중쇄 발현벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 항체의 중쇄 가변영역(인간화 hT0 VH: 서열번호 38)과 중쇄불변영역 (CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
또한, 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 세포질 침투 경쇄 가변영역(hT4 VL : 서열번호 65)과 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
상기 경쇄, 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 200mL 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2 X 106세포/ml의 밀도로 배지 100ml에 파종하여, 150 rpm, 8 % CO2에서 배양하였다. 각각의 단일클론항체 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10ml FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 중쇄 125μg, 경쇄 125μg 총 250μg (2.5 μg/ml)으로 희석하여, PEI 750 μg (7.5 μg/ml)을 희석한 10ml의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100ml로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150 rpm, 8% CO2에서 배양 후, 나머지 100 ml의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일 동안 배양하였다.
표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 글라이신 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
실시예 2. 세포질 침투 항체의 세포내재화 후 트래피킹 확인.
개발한 세포질 침투 항체가 세포내재화 후 세포질에 위치하기까지의 트래피킹을 확인하였다. 이는 세포질에 위치하기 위해 엔도좀을 탈출하는 기작 규명에 중요한 단서가 될 수 있다.
도 1은 세포 안으로 유입된 세포질 침투 항체 TMab4 또는 세포 침투 펩타이드 TAT의 수송과정과 안정도를 관찰하기 위해 펄스 추적 실험(pulse-chase)을 진행하여 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 커버슬립을 넣고 각 웰 당 2.5 x 104개의 HeLa 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 0.5 ml로 넣어 12시간 동안 5 % CO2,37℃조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 되면, pcDNA3.4-flag-rab11를 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 일시적 트랜스펙션의 효율을 최대화하기 위하여 Opti-MEM media (Gibco)을 사용하였다. 일시적 트랜스펙션할 500ng의 pcDNA3.4-flag-rab11를 튜브상에서 Opti-MEM media 50㎕, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) 2㎕와 함께 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 각 웰에 첨가하였다. 추가적으로 항생제가 없는 DMEM 배지 450㎕ 을 넣고 6시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 500 ㎕로 교환한 후, 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각 웰에 새로운 배지 0.5 ml에 TMab4 3 μM을 37℃에서 30분 처리 후, 빠르게 PBS로 세 번 세척하고 배지를 첨가하여 0시간, 2시간, 6시간 37℃ 조건에서 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 약산성용액(200mM glycine, 150mM NaCl pH 2.5)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거하였다. PBS 세척 후, 4% 파라포름알데히드 첨가 후 25℃ 조건으로 10분간 세포를 고정하였다.
이후 PBS로 세척하고, PBS에 0.1% 사포닌, 0.1% 아지드화 나트륨, 1% BSA가 첨가되어있는 완충액으로 25℃, 10분간 배양하여 세포막에 구멍을 형성하는 과정을 거쳤다. 다시 PBS로 세척 후, 비특이적 결합을 억제하기 위해 PBS에 2% BSA가 첨가된 완충액으로 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, FITC (녹색형광) 또는 TRITC (적색형광)이 결합되어있는 인간 Fc를 특이적으로 인지하는 항체 (Sigma)로 염색하였다. Rab5은 초기 엔도좀의 마커인 rab5을 표지하는 anti-rab5. 리사이클링 엔도좀의 마커인 rab11의 flag-tag을 표지하는 anti-flag 항체들을 25℃에서 1시간 반응시키고, TRITC (적색형광) 또는 FITC (녹색형광)이 연결된 이차 항체를 25℃에서 1시간 반응시켰다. 말기 엔도좀과 라이소좀은 세포 고정하기 30분 전에, LysoTracker Red DND-99 1mM을 배양중인 세포에 직접 처리하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. TMab4는 TAT과 달리, 2시간까지 초기 엔도좀에 위치하여 있다가 이후 라이소좀 또는 리사이클링 엔도좀으로 수송되지 않았다.
실시예 3. 초기 엔도좀에서의 산성화가 엔도좀 탈출에 미치는 영향 확인.
본 발명에 의한 세포질 침투 항체가 초기 엔도좀에서 엔도좀을 탈출한다는 좀 더 명확한 증거를 얻기 위해 억제자를 이용하여 실험하였다.
구체적으로 사용한 억제자는 초기 엔도좀으로부터 말기 엔도좀으로의 성숙을 억제하는 wortmannin, ATPase 수소 펌프를 억제하여 엔도좀 산화를 막는 bafilomycin, 엔도좀에서 소포체 및 골지로의 수송을 억제하는 brefeldin A이다.
도 2a는 본 발명에 의한 세포질 침투 항체 TMab4 또는 세포 침투 펩타이드 TAT의 억제자 유무에 따른 세포질 침투능을 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, wortmannin 200 nM, bafilomycin 200 nM, brefeldin A 7 μM을 30분 동안 배양하였다. 그 후, PBS, TMab4, TAT 2 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다. TMab4는 FITC (녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색 (청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. TMab4는 bafilomycin을 처리한 세포에서만 세포질에 퍼진 녹색형광이 관찰되지 않고 전부 반점형태의 형광을 보였다.
도 2b은 도 2a 의 공초점 현미경 사진의 FITC(녹색형광) 형광을 정량한 막대 그래프이다.
구체적으로는, Image J software (National Institutes of Health, USA)을 이용하여 각 조건에서 세포 20개를 각각 지정한 후, 얻은 형광의 평균값(mean)을 도표로 나타내었다.
도 2c는 본 발명에 의한 세포질 침투 항체 TMab4 또는 세포 침투 펩타이드 TAT의 억제자 유무에 따른 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 혈청이 없는 배양액에 wortmannin 200 nM, bafilomycin 200 nM, brefeldin A 7 μM을 30분 동안 배양하였다. 그 후, PBS, TMab4 2 μM, TAT 20 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, PBS 또는 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150 μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다.
Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색 (청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 본 발명에 의한 세포질 침투 항체 TMab4와 TAT에 의해 칼세인이 엔도좀에서 벗어나 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광을 나타냈다. 그러나, TMab4의 경우, bafilomycin을 처리한 세포에서만 다른 억제자를 처리한 세포와 달리 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광을 관찰할 수 없었다.
도 2d 는 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다. 구체적으로는, Image J software (National Institutes of Health, USA)을 이용하여 각 조건에서 세포 20개를 각각 지정한 후, 얻은 형광의 평균값 (mean)을 도표로 나타내었다.
실시예 4. 초기 엔도좀에서의 HSPG 분해가 엔도좀 탈출에 미치는 영향 확인.
세포질 침투 항체는 세포표면에 HSPG와 결합을 통해 세포 내재화된다. 이 때 프로-헤파라나제와 함께 세포 내재화된다. 프로-헤파라나제는 엔도좀이 산화됨에 따라 활성화된다 (Gingis-Velitski et al., 2004). 활성화된 헤파라나제는 HSPG를 분해하여 세포질 침투 항체가 엔도좀 내부에 자유롭게 존재할 수 있다.
도 3a는 siRNA(short interfering RNA)로 헤파라나제의 발현을 억제한 것을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
구체적으로는, 6웰 플레이트에 각 웰 당 1 x 104개의 HeLa 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 1 ml로 넣어 12시간 동안 5 % CO2,37℃조건에서 배양하였다. 24시간 배양한 후, siRNA를 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)한다. 일시적 트랜스펙션할 표적능이 없는 대조군 siRNA와 헤파라네제 발현 억제를 표적하는 siRNA 각각 500 ng을 튜브 상에서 Opti-MEM media(Gibco) 500 ㎕, Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA) 3.5㎕와 함께 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 각 웰에 첨가하였다. 추가적으로 항생제가 없는 DMEM media 500㎕을 넣고 6시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 1 ml로 교환한 후, 72시간 동안 배양하였다.
배양 후 세포 용해물을 얻기 위해 용해 버퍼 (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl, 1% SDS, 1mM EDTA, Inhibitor cocktail(sigma))를 넣어준다. 세포 용해물은 BCA protein assay kit (Pierce)를 이용하여 정량하였다. SDS-PAGE를 수행한 겔을 PVDF 막(membrane)에 옮기고 각각 heparanase와 β-actin을 인지하는 항체(SantaCruz)와 25℃ 2시간 반응시키고, HRP가 결합된 이차항체 (SantaCruz) 을 25℃ 1시간 반응시킨 후 검출하였다. 분석은 ImageQuant LAS4000 mini(GE Healthcare)를 이용하였다.
도 3b는 헤파라나제의 발현을 억제함에 따른 세포질 침투 항체와 라이소좀과의 중첩을 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는 실시예 2와 동일하게 헤파라나제 발현을 억제한 HeLa과 대조군 HeLa 세포를 준비하여 TMab4 3 μM, FITC-TAT 20 μM을 37℃에서 30분 처리 후, 빠르게 PBS로 세 번 세척하고 배지를 첨가하여 37℃, 2시간 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다.
TMab4는 FITC(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. 라이소좀의 마커인 LAMP-1을 표지하는 anti-LAMP-1(santa cruz)를 25℃ 1시간 반응시키고 TRITC (적색형광)이 연결된 이차 항체를 25℃에서 1시간 반응시켰다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색 (청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. TMab4는 헤파라나제의 발현을 억제하였을 때, LAMP-1과의 중첩이 확인되었다.
도 3c는 헤파라나제의 발현을 억제함에 따른 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 헤파라나제 발현을 억제한 HeLa과 대조군 HeLa 세포를 실시예 2와 동일하게 준비하여 TMab4 2 μM, TAT 20 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, PBS 또는 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150 μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색 (청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 헤파라나제 발현을 억제한 세포에서는 TMab4에 의해 세포질에 퍼진 칼세인 형광을 관찰할 수 없었다.
도 4는 본 발명에 의한 세포질 침투 항체가 세포내재화 되어 세포질에 위치하기까지의 전체적인 트래피킹 과정을 나타낸 모식도이다.
실시예 5. pH에 따른 세포질 침투 완전 IgG 형태의 단일클론항체의 세포막 통과에 의한 항체의 유입 확인.
본 발명에 의한 세포질 침투 항체가 세포 내재화된 후 최종적으로 세포질에 위치하기 위해서는 엔도좀을 탈출하는 과정이 필수적으로 필요하다. 지금까지 항체의 엔도좀 탈출에 관련하여 보고된 바 없다. 엔도좀 탈출 기작을 규명하기 위하여, 우선 엔도좀의 pH를 모사하여 실험을 진행하였다.
초기 엔도좀의 내부 인지질층과 세포막 외부 인지질층은 구성성분이 유사하며 (Bissig and Gruenberg, 2013), 주요 구성 성분은 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)이다. 따라서, HSPG가 발현되지 않는 Ramos 세포주의 세포막 외부 인지질층을 초기 엔도좀의 내부 인지질층과 동일시하여 실험하였다.
도 5는 pH에 따라 세포막을 통과하여 세포질 침투 항체가 유입될 수 있는지, 다른 물질의 세포막 통과를 유도할 수 있는지 항체를 직접 형광 표지하여 Ramos 세포주에서 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에, 커버슬립을 넣고 부유세포인 ramos를 플레이트에 부착시키기 위해 0.01% poly-L-lysine 용액을 200 ㎕ 넣고 25℃ 조건에서 20분 반응시켰다. PBS 로 세척 후, 각 웰 당 5 x 104개의 ramos 세포를 10% FBS가 포함된 배지 0.5ml로 넣어 37℃ 조건에서 30분 배양시켰다. 세포 부착을 확인하고 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 PBS 및 형광 시약인 DyLight-488으로 직접 표지한 TMab4 10 μM 및 표지하지 않은 TMab4 10 μM 와 DyLight-488으로 직접 표지한 대조군 항체 아달리무맙 (adalimumab) 2 μM 을 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. 대조군으로 사용하는 아달리무맙은 세포 외부 사이토카인을 표적하는 치료용 항체이다.
실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. pH 5.5 조건에서 DyLight-488으로 직접 표지한 TMab4의 형광이 관찰되었으며, pH 5.5 조건에서 TMab4와 DyLight-488으로 직접 표지한 아달리무맙을 처리한 세포에서 녹색 FITC 형광이 관찰됨을 확인하였다. 세포질 침투 항체가 산성 pH에서 세포막을 통과하여 유입되며, 자기 자신이 아니라 다른 물질 역시 같이 유입시킬 수 있음을 확인하였다.
또한 물질이 외부에서 유입되었음에도 불구하고 세포막의 형태는 유지됨을 확인하였다.
실시예 6. pH에 따른 세포질 침투 항체의 트립판 블루 획득에 의한 천공 형성 여부 확인.
알려진 엔도좀 탈출 기작 중 상기 실험 결과처럼 엔도좀의 형태를 유지하면서 물질이 엔도좀을 탈출하며, 완전 IgG 형태에서 구현할 수 있는, 가장 유력한 엔도좀 탈출 기작은 천공 형성이라고 예상하였다.
실시예 5의 실험을 유사하게 세포질 침투 항체가 세포막을 통과할 때의 세포막의 형태를 확인하기 위해 실험을 진행하였다.
도 6a는 pH에 따른 세포질 침투 항체에 의한 천공 형성에 의해 막투과능이 없는 트립판 블루(trypan blue)를 획득 가능한지 Ramos 세포주에서 광학현미경을 통해 확인한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 실시예 5와 동일하게 각 웰 당 5 x 104개의 ramos 세포를 부착시켰다. 세포 부착을 확인하고 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4, adalimumab 1 μM 과 10 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루(trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다.
도 6b는 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다. 구체적으로는, 전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다.
도 6b에서 pH 5.5 조건에서만, 본 발명에 의한 세포질 침투 항체인 TMab4를 첨가한 세포에서 농도에 비례하여 트립판 블루(trypan blue)가 획득됨을 확인하였다. 또한, 세포질 침투 항체가 세포막을 통과할 때의 세포막의 형태가 유지됨을 확인하였다.
실시예 7. 세포질 침투 항체에 의한 일시적, 가역적 천공 형성 확인
기존의 엔도좀 탈출 기작으로 천공 형성 기작을 나타내는 것으로 알려진 펩타이드의 경우, 펩타이드의 알파-나선 구조가 세포막을 관통하는 천공을 형성하는 것으로 알려져 있다.
하지만 항체의 경우, 알파-나선 구조를 띠고 있지 않아, 전체적으로 세포막을 관통하는 천공을 형성하는 것은 거의 불가능하다고 판단하였다. 따라서, 일시적으로 천공을 형성하여 항체가 엔도좀을 탈출한 후, 세포막은 가역적으로 다시 회복될 것이라고 가정하였으며, 이를 증명하기 위하여 실험을 진행하였다.
도 7a는 pH 5.5 조건에서 세포질 침투 항체에 의해 생성된 세포막 천공이 일시적, 가역적 현상인지 여부를 광학현미경을 통해 확인한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 실시예 5와 동일하게 각 웰 당 5 x 104개의 ramos 세포를 부착시켰다. 세포 부착을 확인하고 초기 엔도좀 pH인 5.5로 유지하기 위해 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4 10 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. 또한, 버퍼를 제거하고 새로운 배지로 바꿔준 후 2시간 배양하여, 세포가 회복할 수 있도록 한다. 이 후, PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루(trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다.
도 7b는 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다. 도 7b에서 pH 5.5 조건에서 본 발명에 의한 엔도좀 탈출 기능을 가진 TMab4를 첨가한 세포에서 TMab4를 첨가한 직후 트립판 블루 획득이 관찰되었지만 배지에서 회복시간을 가진 세포의 경우, 트립판 블루 획득이 일어나지 않음을 확인하였다. 즉, 세포질 침투 항체에 의한 천공 형성은 일시적이며, 가역적인 현상임을 확인하였다.
실시예 8. pH에 따른 세포질 침투 완전 IgG 형태의 단일클론항체의 막 결합 및 지질막 플립-플랍 확인.
천공 형성 기작은 막의 전체적인 형태는 유지하면서 천공을 형성하여 그 천공을 통해 엔도좀 내부 물질이 세포질로 탈출하는 기작이다. 천공을 형성하기 위해서는 우선 엔도좀 내부 인지질층과 상호작용하고, 이후 플립-플랍 기작에 의해 막 천공이 형성된다고 알려져 있다(H. D. Herce et al., 2009)
따라서, 초기 엔도좀에서 천공 형성에 의한 엔도좀 탈출이 일어나기 위해서는 우선적으로 항체가 엔도좀 산화됨에 따른 막 결합을 확인하고자 하였다.
도 8는 pH 조건에 따른 세포질 침투 항체와 대조군 항체 아달리무맙의 세포막 결합을 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1x105개의 Ramos 세포를 준비한다. 세포를 PBS로 세척한 후 세포질 pH 조건인 7.4로 유지하기 위해 pH 7.4 버퍼(TBS, 2% BSA, 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (TBS, 2% BSA, 50 mM MES pH 5.5)에 TMab4, 아달리무맙 5 μM을 넣어 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 각 pH 버퍼로 세척한 후, TMab4, 아달리무맙은 FITC(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체와 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, pH가 5.5 인 조건에서 TMab4 만 세포막에 결합함을 확인하였다.
도 9는 pH 조건에 따른 세포질 침투 항체와 대조군 항체 아달리무맙의 세포막 지질 플립-플랍 유도능을 유세포분석기(FACS)로 분석한 결과이다.
구체적으로는, 각 샘플 당 1x105개의 Ramos 세포를 준비한다. 세포를 PBS로 세척한 후 pH 를 세포질 조건인 7.4 로 유지하기 위해 pH 7.4 버퍼(TBS, 2% BSA, 50 mM HEPES pH 7.4), pH 를 초기 엔도좀 조건인 5.5 로 유지하기 위해 pH 5.5 버퍼 (TBS, 2% BSA, 50 mM MES pH 5.5)에 TMab4, 아달리무맙 5 μM을 넣어 4℃에서 1시간 동안 배양하였다.
각 pH 버퍼로 세척한 후, FITC(녹색형광)이 연결된 Annexin-V 를 25℃ 조건에서 15분간 반응시켰다. Annexin-V는 세포막 내부에만 존재하는 지질인 포스파티딜세린 (phosphatidylserine)을 표적하는 물질로, 세포막 지질 플립-플랍이 일어날 경우에만, 지질이 외부로 노출되어 Annexin-V이 결합할 수 있다. 반응 후, PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, pH 5.5 조건에서 TMab4만 Annexin-V가 결합함을 확인하였다.
도 10은 상기 실험들을 통하여 예상한 세포질 침투 항체의 천공 형성 모델을 나타낸 모식도이다.
실시예 9. pH 의존적 특성 변화 예측 논리
본 발명에 의한 세포질 침투 항체가 pH 조건에 따른 세포질 침투 특성의 차이를 보이는 것은 pH 조건 의존적으로 항체 잔기 간의 상호작용의 변화로 특성 변화를 야기된 것이라고 예상하였다.
이 가설을 증명하기 위해 문헌을 조사한 결과, 아미노산 중 아스파라긴산 (D) 및 글루탐산 (E)은 중성 pH 7.4에서 pH 5.0으로 감소함에 따라 양성자 첨가되어 음전하를 잃고, 소수성을 띠게 됨을 확인하였다(Korte et al., 1992).
구체적으로, 소수성을 띠게 된 아스파라긴산 (D) 및 글루탐산 (E)은 본래 소수성을 띠고 있는 아미노산인 메티오닌 (M), 류신 (L) 및 이소류신 (I)과의 소수성 상호작용(Hydrophobic interaction)이 형성된다. 새롭게 형성된 상호작용을 통해 주변 아미노산들이 영향을 받아 구조적 변형을 유도하는 현상을 탄포드 트랜지션(Tanford transition) 이라고 정의하며(Qin et al., 1998), 이러한 pH 의존적 특성 변화를 유도하기 위한 예를 확인하였다(Di Russo et al., 2012).
세포질 침투 경쇄 가변영역인 hT4 VL 구조를 통해서 경쇄 가변영역에서 pH 7,4와 pH 5.0에서 차이를 보일 수 있는 아미노산인 히스티딘 (H), 아스파라긴산 (D) 및 글루탐산 (E)를 중심으로, 주변 인접한 소수성 아미노산인 메티오닌 (M), 이소류신 (I) 및 류신 (L)을 조사하였다.
이 중, 두 아미노산의 곁사슬 간 거리가 6-7 Å 미만의 후보 아미노산을 확인하여 N 말단으로부터 1 번째, 95 번째 아미노산 쌍이 탄포드 트랜지션 효과를 보일 수 있는 후보로 선정하였다.
상기 1번, 95번 아미노산 쌍 중 95번 아미노산은 세포질 침투 경쇄 가변영역인 hT4 VL 고유의 서열인 VL-CDR3에 존재하는 아미노산이며, 1번 아미노산과 상호작용에 의해 탄포드 트랜지션과 같은 현상을 통해 VL-CDR3 고리 구조의 변화를 유도할 수 있는 가능성을 확인하였다.
세포질 침투 경쇄 가변영역인 hT4 VL에서 상기 1번, 95번 아미노산에 의해 구조 변화가 유도된 VL-CDR3 고리를 구성하는 아미노산은 초기 엔도좀 내부 인지질층의 주요 구성성분인 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(POPC)와 상호작용이 용이한 타이로신 (Y)이 매우 높은 비중으로 있음을 확인하였다 (Morita et al., 2011).
도 11은 세포질 침투 항체의 경쇄 가변영역(VL) 의 WAM 모델링 구조를 기반으로 pH 조건에 따른 세포질 침투 항체의 구조적 변화를 예측하여 구조적 변화에 관여하는 아미노산 및 구조적 변화에 의해 노출되는 아미노산을 나타낸 도이다.
상기 1번, 95번 아미노산 쌍에 의한 pH 의존적 특성 변화 유도 및 그로 인한 엔도좀 탈출을 확인하기 위해 상기 1번과 95번 아미노산을 알라닌 (A) 치환한 돌연변이를 구축하였다.
또한, 상기 1번, 95번 아미노산 쌍에 의한 pH 의존적 특성 변화 유도 및 그로 인한 엔도좀 탈출을 확인하기 위해 상기 1번과 95번 아미노산을 각 아미노산과 유사한 성질을 가지는 글루탐산 (E), 류신 (L) 치환한 돌연변이를 구축하였다.
표 1는 overlap PCR 기법을 사용하여 구축한 돌연변이의 명칭 및 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00001
실시예 1과 동일하게, 클로닝 진행하여 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
실시예 10. 세포질 침투 항체 돌연변이의 pH 의존적 특성 변화 확인.
도 12는 산성 pH에서 세포질 침투 항체의 구조적 변화를 유도에 관여하는 경쇄 가변영역(VL) 1번째 아미노산인 아스파라긴산 (D)을 알라닌 (A)으로 치환한 돌연변이(TMab4-D1A), 95번째 아미노산인 메티오닌 (M)을 알라닌 (A)으로 치환한 돌연변이(TMab4-M95A), 1번째 아미노산인 아스파라긴산 (A)을 글루탐산 (E)으로 치환한 돌연변이(TMab4-D1E), 95번째 아미노산인 메티오닌 (M)을 류신 (L)으로 치환한 돌연변이(TMab4-M95L)에 대해 pH 조건 변화에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 5 와 동일하게 ramos 세포를 플레이트에 부착시킨 후, 세포질 pH 조건인 7.4로 유지하기 위해 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH 조건인 5.5 로 유지하기 위해 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4, 아달리무맙, TMab4-D1A, TMab4-M95A, TMab4-D1E, TMab4-M95L 10μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다.
PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루(trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다.
TMab4와 달리 돌연변이인 TMab4-D1A, TMab4-M95A은 트립판 블루 획득이 거의 일어나지 않음을 확인하였다. TMab4-D1E, TMab4-M95L은 TMab4와 유사한 정도의 트립판 블루 획득을 확인하였다. 즉, 엔도좀 탈출에 1 번째 아미노산과 95번째 아미노산이 중요한 역할을 하고 있음을 확인하였다.
실시예 11. 세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출능에 기여하는 아미노산 및 모티프 탐색
앞선 실시예의 실험 결과를 통하여, 세포질 침투 항체의 1번과 95번 아미노산의 상호작용에 의해서 pH 의존적 항체 특성 변화가 일어남을 확인하였고, 그 특성 변화에 의하여 엔도좀 탈출능이 유도됨을 확인하였다.
상기 pH 의존적 특성 변화에 따른 엔도좀 탈출을 확인하기 위해 VL-CDR3를 구성하는 아미노산 중 인지질과 직접적으로 상호작용할 것으로 예상되는 아미노산들에 대해서 각각 알라닌(Alanine, A) 치환한 돌연변이를 구축하였다.
구체적으로, 구조 모델링으로 분석한 결과 가장 표면으로 노출될 것으로 예상하는 92번, 93번, 94번 아미노산을 한번에 알라닌(Alanine, A) 치환한 돌연변이를 구축하였다.
표 2는 overlap PCR 기법을 사용하여 구축한 돌연변이의 명칭 및 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00002
실시예 1과 동일하게, 클로닝 진행하여 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
도 13는 경쇄 가변영역(VL) 의 CDR3 의 아미노산들 중 엔도좀 탈출에 관여할 가능성이 있는 92번, 93번, 94번 아미노산을 알라닌으로 치환한 돌연변이들에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 5과 동일하게 ramos 세포를 플레이트에 부착시킨 후, 세포질 pH 조건인 7.4로 유지하기 위해 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH 조건인 5.5로 유지하기 위해 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 buffer, TMab4, TMab4-Y91A, TMab4-Y92A, TMab4-Y93A, TMab4-H94A, TMab4-AAA, TMab4-Y96A 10 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다.
PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루(trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다. TMab4-Y92A, TMab4-Y93A, TMab4-H94A는 TMab4와 비교하여 트립판 블루 획득이 유의미하게 감소함을 확인하였다. 특히, TMab4-AAA는 트립판 블루 획득이 거의 일어나지 않았다. 반면, TMab4-Y91A, TMab4-Y96A은 TMab4와 유사한 정도의 트립판 블루 획득을 확인하였다. 즉, 엔도좀 탈출에 92, 93, 94번 아미노산가 크게 기여하고 있음을 확인하였다.
실시예 12. 세포질 침투 항체 경쇄 가변영역(VL) CDR1과 CDR2의 엔도좀 탈출능 기여도 확인.
지금까지의 실험 결과를 통해서 경쇄 가변영역(VL) CDR3 이 엔도좀 탈출에 관여함을 증명하였다. 그 다음으로 세포내재화를 담당하는 (VL) CDR1 과 CDR2 이 엔도좀 탈출에 미치는 영향을 밝히기 위해 실험을 진행하였다.
경쇄 가변영역(VL) CDR1 과 CDR2을 인간 유래 생식선 서열 중에서 아미노산 개수가 같거나, 세포내재화를 담당하는 CDR1의 양이온 패치 서열이 포함되지 않은 아미노산 서열을 가지는 CDR 서열로 치환하였다. 이 때, 기존 경쇄 가변영역 안정성에 중요하다고 알려진 아미노산은 보존하였다.
표 3은 유전자 합성을 사용하여 구축한 돌연변이의 명칭 및 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00003
실시예 1과 동일하게, 클로닝 진행하여 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
도 14a는 HSPG 수용체에 결합하여 세포질 침투능을 담당하는 경쇄 가변영역(VL) CDR1과 CDR2을 인간 유래 생식선 서열로 치환한 돌연변이의 세포질 침투능을 공초점 현미경을 통해 확인한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, TMab4, TMab4-01, TMab4-02, TMab4-03 2 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다.
TMab4는 Alexa-488(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 세 돌연변이 모두 야생형 TMab4 에 비하여 세포 내부의 형광이 감소하였으며, 특히 TMab4-03의 경우 거의 세포 내부의 형광이 관찰되지 않았다.
도 14b는 HSPG 수용체에 결합하여 세포질 침투능을 담당하는 경쇄 가변영역(VL) CDR1 과 CDR2을 인간 유래 생식선 서열로 치환한 돌연변이에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 5과 동일하게 ramos 세포를 플레이트에 부착시킨 후, 세포질 pH 조건인 7.4로 유지하기 위해 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH 조건인 5.5로 유지하기 위해 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 Buffer, TMab4, TMab4-01, TMab4-02, TMab4-03 10 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루(trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다. 돌연변이인 TMab4-01, TMab4-03은 TMab4와 유사한 정도의 트립판 블루 획득을 확인하였다. 즉, 경쇄 가변영역 내에서 세포내재화를 담당하는 부위(VL-CDR1과 VL-CDR2)와 엔도좀 탈출을 담당하는 부위 (VL-CDR3)가 구분되어 있음을 증명하였다.
실시예 13. 세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출능 향상 논리
세포질 침투 경쇄 가변영역인 hT4 VL의 1번, 95번 아미노산 쌍의 상호작용에 의한 VL-CDR3 특성 변화를 통해서 엔도좀 탈출의 초기 기작인 초기 엔도좀 내막의 인지질과 결합을 위해 용매접근성이 향상될 것으로 예상되는 아미노산은 92번, 93번, 94번 아미노산으로, 각각 타이로신(Tyrosine, Y), 타이로신(Tyrosine, Y), 히스티딘(Histidine, H) 이다.
상기 아미노산들은 엔도좀 내부 인지질층의 주요 구성성분인 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(POPC) 와 상호작용이 용이하다.
pH 조건 변화에 따라 노출될 것으로 예상되는 상기 3 개의 아미노산이 초기 엔도좀 내부 인지질층과 상호작용 및 엔도좀 탈출에 관여함을 확인하며, 엔도좀 탈출하는 세포질 침투 항체의 비율을 향상시키기 위하여, 92번, 93번, 94번 아미노산에 대한 돌연변이를 제작하였다.
돌연변이 구축 논리는 기존 문헌조사를 통해 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(POPC)과 상호작용이 용이한 아미노산을 파악하여(Morita et al., 2011), 해당 92번, 93번 및 94번 아미노산에 선정된 아미노산을 도입하는 방향으로 디자인되었다.
구체적으로, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)와 20가지 아미노산 간의 평균 결합력은 트립토판 (W), 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 류신 (L), 이소류신 (I), 시스테인 (C), 메티오닌 (M) 순으로 높다.
구체적으로, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)의 친수성 머리부분과 20가지 아미노산 간의 결합력은 아르지닌 (R), 트립토판 (W), 타이로신 (Y), 히스티딘 (H), 아스파라진 (N), 글루타민 (Q), 라이신 (K), 페닐알라닌 (F) 순으로 높으며, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 (POPC)의 소수성 꼬리부분과 20가지 아미노산 간의 결합력은 트립토판 (W), 페닐알라닌 (F), 류신 (L), 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 발린 (V), 타이로신 (Y) 순으로 높다.
이러한 결과를 바탕으로, 초기 엔도좀 내부 인지질층의 주요 구성성분인 POPC와 가장 상호작용이 용이한 아미노산은 트립토판 (Tryptophan, W)이다(Morita et al., 2011). 따라서 본 발명에서는 아미노산 1 혹은 2 개를 트립토판(Tryptophan, W)으로 치환하는 전략을 택하였다.
하기 표 4, 5, 6는 디자인된 세포질 침투능을 갖는 인간 항체의 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이들의 경쇄 가변영역 서열을 나타낸다. 표 4은 인간항체 경쇄 가변영역 전체 서열을 Kabat 넘버링에 맞게 나타낸 표이며, 표 5, 6는 상기 표 4의 항체 서열에서 CDR1, CDR2 서열 또는 CDR3 서열만 따로 표기한 내용이다.
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Figure 112019119995761-pat00005
Figure 112019119995761-pat00006
실시예 14. 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이들의 발현 정제 및 세포질 침투능 유지 확인
세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상이 기대되는 돌연변이의 동물세포 발현을 위해 상시 실시예 1와 같이 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 세포질 침투 경쇄 가변영역 (hT4 VL) 또는 돌연변이 항체의 경쇄 가변영역 (hT4-WWH VL, hT4-WYW VL, hT4-YWW VL, hT4-WYH VL, hT4-YWH VL)과 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
이후 인간화 hT0 VH를 코딩하고 있는 동물발현벡터와 구축된 엔도좀 탈출능 향상 기대 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. 이후 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이의 정제는 실시예 1와 동일하게 진행하였다.
도 15a는 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
구체적으로는, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상이 기대되는 돌연변이들이 용액 상태에서 단일체 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
도 15b는 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이의 세포질 침투능이 유지되는지 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, TMab4, TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH, TMab4-YWH 2 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다.
실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다. 각 항체는 FITC(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 5가지 돌연변이에서 모두 세포질 침투능은 유지됨을 확인하였다.
실시예 15. 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이들의 pH 의존성 확인.
도 16은 pH에 따른 세포질 침투 항체 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 기대 돌연변이에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 5과 동일하게 ramos 세포를 플레이트에 부착시킨 후, 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4, 아달리무맙, TMab4-WWH, TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH, TMab4-YWH 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루(trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다. 5 가지 돌연변이 중 TMab4-WYW, TMab4-YWW, TMab4-WYH, TMab4-YWH은 트립판 블루 획득 비율이 증가하였으며, 그 중 TMab4-WYW는 pH 의존적인 트립판 블루 획득이 일어남을 확인하였다.
야생형의 세포질 침투능이 유지되면서, pH 의존적 트립판 블루 획득이 증가한 TMab4-WYW를 최종 클론으로 선정하였다.
실시예 16. 세포질 침투 항체 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이의 세포질 위치 향상 확인.
도 17a는 세포질 침투 항체 야생형 또는 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이TMab4-WYW의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 혈청이 없는 배양액에 PBS, TMab4, TMab4-WYW 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, PBS 또는 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150 μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 실시예와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. TMab4-WYW는 TMab4에 비해 더 낮은 농도에서도 강한 강도의 녹색 칼세인 형광이 관찰됨을 확인하였다.
도 17b는 도 17a의 공초점 현미경 사진 중 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
구체적으로는, Image J software (National Institutes of Health, USA)을 이용하여 각 조건에서 세포 20개를 각각 지정한 후, 얻은 형광의 평균값(mean)을 도표로 나타내었다.
실시예 17. 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합을 통한 세포질 침투 단일클론 항체의 세포질 위치 확인
도 18은 세포질 침투 항체가 세포질에 위치하는 경우 개선된 분할 녹색 형광단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광이 관찰되는 과정을 그린 모식도이다.
구체적으로는, 세포질 침투 항체가 세포질에 위치한다는 것을 직접적으로 확인하기 위해 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적 시스템을 사용하였다. 녹색형광단백질인 GFP를 1-10번, 11번 조각으로 나누게 되면 형광을 띠는 특성이 제거되고, 만약 두 조각의 거리가 가까워져 결합한다면, 형광을 띠는 특성을 회복할 수 있다 (Cabantous et al., 2005).
이러한 특성을 이용하여 GFP 1-10번 조각은 세포질에 발현시키고, GFP 11번 조각은 세포질 침투 항체의 중쇄 C-말단에 융합시켰다. 또한, GFP 단편간의 상보적인 결합을 보완하기 위하여, 높은 친화도를 가지는 스트렙타비딘(Streptavidin)과 스트렙타비딘-결합 펩타이드 2 (SBP2)를 각각 GFP 단편에 융합한다. 따라서, GFP 형광이 관찰된다는 것은 세포질 침투 항체가 세포질에 위치한다는 것을 반증한다.
실시예 18. GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체의 발현 및 정제.
GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체의 동물세포 발현을 위해 GFP11-SBP2를 중쇄 C-말단에 GGGGS 3개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하였다. 이후 상기 세포질 침투 경쇄와 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 경쇄를 코딩하고 있는 동물발현벡터와 GFP11-SBP2가 융합된 중쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. 이후 GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체의 정제는 실시예 1와 동일하게 진행하였다.
도 19은 GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
구체적으로는, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체가 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
실시예 19. GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체의 세포질 위치에 따른 GFP 형광 확인.
도 20a는 GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이의 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, TMab4-GFP11-SBP2, TMab4-WYW-GFP11-SBP2 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.6, 3.2 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다.
실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색 (청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. TMab4-WYW는 TMab4 에 비해 더 낮은 농도에서도 강한 강도의 녹색 GFP 형광이 관찰됨을 확인하였다.
도 20b는 도 20a의 공초점 현미경 사진의 GFP 형광을 정량한 그래프이다.
구체적으로는, Image J software (National Institutes of Health, USA)을 이용하여 각 조건에서 세포 20개를 각각 지정한 후, 얻은 형광의 평균값(mean)을 도표로 나타내었다.
세포질 내부에 위치하는 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체와 엔도좀 탈출능 향상된 세포질 침투 항체의 세포질 내 농도와 엔도좀 탈출 효율을 정량적으로 나타내고 비교하기 위하여 실험을 진행하였다.
하기 표 7은 세포질 내부에 위치하는 GFP11-SBP2 융합된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체와 엔도좀 탈출능 향상된 세포질 침투 항체의 세포질 내 농도와 엔도좀 탈출 효율을 나타낸 표이다.
Figure 112019119995761-pat00007
실시예 20. 엔도좀 탈출능 향상된 세포질 침투 항체와 지질의 상호작용 심층 분석
야생형 세포질 침투 항체의 경쇄 가변영역 CDR3 92, 94번 째 아미노산을 트립토판으로 치환하였을 때, 엔도좀 탈출능이 향상됨을 확인하였다.
이러한 엔도좀 탈출능 향상은 지질의 어느 부분과의 상호작용이 향상되었기 때문인지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 트립토판 (W)은 지질의 친수성 머리와 소수성 꼬리와의 상호작용이 모두 용이한 아미노산이다. 친수성 머리와 상호작용이 용이한 아르기닌 (R), 소수성 꼬리와 상호작용이 용이한 이소류신 (I), 지질과의 상호작용이 매우 약한 글라이신 (G)으로 치환하여 그 활성을 비교하면 지질의 어느 부분과의 상호작용이 중요한 역할을 하는지 알 수 있다.
엔도좀 탈출능 향상된 세포질 침투 항체 과 지질의 상호작용을 심층적으로 분석하기 위해, 트립토판을 각각 아르기닌 (R), 이소류신 (I), 글라이신 (G)으로 치환한 돌연변이를 구축하였다.
표 8은 overlap PCR 기법을 사용하여 구축한 돌연변이의 명칭 및 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00008
실시예 1과 동일하게, 클로닝 진행하여 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
실시예 21. 세포질 침투 항체 과 지질의 상호작용 심층 분석
도 21a는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이의 세포막 결합을 유세포분석기(FACS)로 분석한 그래프이다.
구체적으로는, 각 샘플당 1x105개의 Ramos 세포를 준비한다. 세포를 PBS로 세척한 후 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(TBS, 2% BSA, 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (TBS, 2% BSA, 50 mM MES pH 5.5)에 TMab4, TMab4-WYW, TMab4-RYR, TMab4-IYI, TMab4-GYG 3 μM을 넣어 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 각 pH 버퍼로 세척한 후, TMab4, TMab4-WYW, TMab4-RYR, TMab4-IYI, TMab4-GYG 은 FITC(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체와 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세척 후 유세포분석기로 분석한 결과, pH 5.5 조건에서 TMab4만 세포막에 결합함을 확인하였다.
도 21b는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이에 의한 pH 조건에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 5와 동일하게 ramos 세포를 플레이트에 부착시킨 후, 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4, TMab4-WYW, TMab4-RYR, TMab4-IYI, TMab4-GYG 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루(trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다. TMab4-WYW에 비교하여 TMab4-RYR, TMab4-IYI, TMab4-GYG는 트립판 블루 획득이 감소하였다.
도 21c는 트립토판과 반대되는 성질을 가진 아미노산인 아르기닌, 이소류신 및 글라이신으로 각각 치환한 돌연변이의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 TMab4, TMab4-WYW, TMab4-RYR, TMab4-IYI, TMab4-GYG 0.5 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, PBS 또는 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150 μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. TMab4-RYR, TMab4-IYI, TMab4-GYG를 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 TMab4-WYW를 처리한 세포에 비하여 세기가 약하였다.
따라서, 지질의 친수성 머리와 소수성 꼬리와의 상호작용이 모두 엔도좀 탈출에 관여하며, 그러한 이유로 트립토판으로 치환하였을 때 엔도좀 탈출능이 향상하였음을 확인하였다.
실시예 22. 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체의 발현, 정제
엔도좀 탈출능 향상된 돌연변이는 최종적으로 세포질에 위치하는 항체의 양이 증가할 것이기 때문에, 세포질 내부에 위치하는 단백질을 보다 효과적으로 표적할 수 있다.
도 22a은 엔도좀 탈출능 향상된 돌연변이의 활성을 확인하기 위해, 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 단일클론항체의 동물세포 발현을 위해 실시예 1와 같이 5' 말단에 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합되며 세포골격인 튜블린에 특이적 결합하는 중쇄 가변영역과 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 pcDNA3.4(Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다(Laurence et al., 2011).
이후 상기 세포질 침투 경쇄와 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 경쇄를 코딩하고 있는 동물발현벡터와 구축된 튜블린에 특이적 결합하는 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. 이후 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체의 정제는 실시예 1와 동일하게 진행하였다.
도 22b는 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
구체적으로는, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체가 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
실시예 23. 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체의 세포골격 튜블린과 특이적 결합 확인.
도 22c는 완전 IgG 형태의 항-튜블린 세포질 침투 항체 과 세포질에 위치한 세포골격인 튜블린과의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여, 10% FBS 가 포함된 배지 500 ㎕에 PBS, TuT4, TuT4-WYW 3 μM를 넣어 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다.
세포골격인 튜블린은 anti-tubulin 항체(santa cruz)을 이용하여 25℃에서 1시간 반응시키고, TRITC(적색형광)이 연결된 이차항체를 25℃에서 1시간 반응시켰다. 각 항체는 FITC(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
도 22c에 나타난 바와 같이, 적색형광의 튜블린이 위치하는 세포질 부분에 녹색형광의 TuT4-WYW가 섬유 모양으로 중첩된 반면, TuT4는 중첩되지 않았다.
실시예 24. 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체 발현, 정제 및 K-RAS 돌연변이들의 친화도 분석.
세포 골격인 튜블린 외에, 다른 세포질 내부의 단백질을 효과적으로 표적할 수 있는지 실험을 진행하였다.
도 23a은 엔도좀 탈출능 향상된 돌연변이의 활성을 확인하기 위해, 완전 IgG 형태의 Ras 표적 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
완전 IgG 형태의 Ras 표적 세포질 침투 항체의 동물세포 발현을 위해 실시예 5와 같이 5' 말단에 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합되며 중쇄 가변영역 의존적으로 GTP가 결합된 K-RAS에 특이적 결합하는 중쇄 가변영역(RT11 VH)과 중쇄불변영역 (CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
이후 상기 세포질 침투 경쇄와 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 경쇄를 코딩하고 있는 동물발현벡터와 구축된 GTP가 결합된 K-RAS에 특이적 결합하는 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. 이후 완전 IgG 형태의 Ras 표적 세포질 침투 항체의 정제는 실시예 1와 동일하게 진행하였다.
도 23b는 완전 IgG 형태의 Ras 표적 세포질 침투 항체의 정제 후 환원성 또는 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 것이다.
구체적으로는, 비환원성 조건에서 약 150 kDa의 분자량을 확인하였으며, 환원성 조건에서 중쇄 50 kDa의 분자량 및 경쇄 25 kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 완전 IgG 형태의 Ras 표적 세포질 침투 항체이 용액상태에서 단일체로 존재하며, 비자연적 이황화 결합을 통해 이중체 또는 올리고머를 형성하지 않음을 보여준다.
도 23c는 K-RAS 돌연변이체 K-RAS G12D의 GTP가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태에서의 친화도를 측정하기 위한 ELISA를 수행한 결과이다.
구체적으로는, GTP는 매우 가수분해가 잘되기 때문에 GTP가 결합된 형태의 K-RAS G12D 형태를 유지하기 어렵다. 이에 안정하게 GTP와 같이 K-RAS가 활성화된 구조를 갖을 수 있도록 가수분해가 되지 않는 GTP 유사체인 GppNHp를 사용하여 GTP 결합형태의 K-RAS G12D 항원을 구축하였다. 표적분자 K-RAS G12D의 GppNHp가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태를 96 웰 EIA/RIA 플레이트 (COSTAR Corning)에 1시간동안 37℃에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 12mM phosphate, 2.7 mM KCl) (SIGMA)로 10분간 3회 씻어낸다. 5% PBSS (5% Skim milk, pH7.4, 137 mM NaCl, 12mM phosphate, 2.7 mM KCl) (SIGMA)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% PBST로 10분간 3회 씻어낸다. 이후 IgG 형태의 세포질 침투 항체 TMab4, RT11, RT11-WYW를 결합시킨 후 0.1 % PBST로 10분간 3회 씻어낸다. 표지항체로 염소유래 AP가 접합된 항-인간 항체(alkaline phosphatase-conjugated anti-human mAb) (SIGMA)로 결합시켰다. pNPP(p-nitrophenyl palmitate) (Sigma)로 반응시켜 405 nm 흡광도를 정량하였다.
K-RAS 돌연변이에 대해서 친화도 분석 결과 야생형인 RT11과 돌연변이인 RT11-WYW 간의 친화도 차이를 거의 없음을 확인하였다. 음성 대조군으로 사용된 TMab4의 경우, 결합하지 않았으며, GDP가 결합된 K-RAS들에서는 모든 클론이 결합하지 않았다.
실시예 25. 완전 IgG 형태의 항-RAS cytotransmab 의 세포내의 GTP가 결합된 K-RAS와 특이적 결합 확인.
도 24는 완전 IgG 형태의 Ras 표적 세포질 침투 항체와 세포내 활성화된 H-RAS G12V 돌연변이와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
구체적으로는, 24 웰 플레이트에 fibronectin (sigma)를 코팅한 후, mCherry(적색형광) H-RAS G12V, 가 발현되는 NIH3T3 세포주를 각각 웰 당 2 x 104개를 0.5 ml에 희석하여 12시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후, TMab4, RT11, RT11-WYW 2μM을 처리하여 37℃, 12시간 배양하였다. 이후 실시예 2와 동일한 조건으로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
도 24에 나타난 바와 같이, 적색형광의 활성화된 RAS가 위치하는 세포내막 부분에 녹색형광의 RT11, RT11-WYW가 중첩된 반면, TMab4는 중첩되지 않았다.
상기 실험 결과로 세포내의 활성화된 RAS와 완전 IgG 형태의 Ras 표적 세포질 침투 항체가 특이적으로 결합하는 것을 확인 하였고, 중첩되는 정도는 RT11-WYW, RT11순이다.
실시예 26. pH 조건에 따른 구조변화를 유도하는 D1-M95 의 특성 분석.
pH에 따른 세포질 침투 항체의 특성 변화를 유도하는 경쇄가변영역(VL) 1번째 아미노산 아스파라긴산 (D), 95번째 아미노산 메티오닌 (M)의 특성을 보다 자세하게 분석하기 위해, 항체 골격에 위치하는 1번째 아미노산을 생식선 유래 서열에 존재하는 글루탐산(E), 알라닌(A), 아르파라긴(N)으로 치환하며, CDR3에 위치하는 95번째 아미노산은 20개 아미노산으로 모두 치환하여 돌연변이를 구축하였다.
또한, 이 돌연변이를 구축할 때, 개선된 엔도좀 탈출능 모티프에 의하여 감소한 단백질 발현 수율을 높이기 위하여 87 번째 아미노산 타이로신(Tyrosine)을 페닐알라닌(Phenylalanine)으로 치환하였다. 페닐알라닌은 중쇄 가변영역의 골격에 위치하는 아로마틱 고리를 가진 아미노산 및 소수성 아미노산과의 상호작용이 용이하여, 경쇄 가변영역과 중쇄 가변영역의 인터페이스를 강화할 수 있는 아미노산이다. 87 번째 아미노산이 페닐알라닌으로 치환되고, 92-94 번째 아미노산을 개선된 엔도좀 탈출능 모티프인 WYW으로 갖는 경쇄가변영역을 'hT4-3'으로 명명하였다. 따라서, 상기 경쇄 가변영역을 포함하는 세포질 침투 완전 IgG 형태의 항체는 'TMab4-3'으로 명명하였다.
각 돌연변이는 실시예 1과 동일하게, 클로닝 진행하여 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
도 25a는 산성 pH에서 세포질 침투 항체의 구조적 변화를 유도에 관여하는 경쇄가변영역(VL) 1번째 아미노산 아스파라긴산을 다양한 아미노산으로 치환한 돌연변이의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, HSPG 수용체를 발현하지 않는 부착세포 pgsD-677 세포주 (1x104)를 24웰 플레이트에 배양한다. 다음 날, 실시예 5와 동일하게 pH 를 세포질 pH 조건으로 유지하기 위해 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), pH 를 초기 엔도좀 pH 조건으로 유지하기 위해 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4-3, TMab4-3 D1A, TMab4-3 D1E, TMab4-3 D1N 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다. 이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
TMab4-3 D1E는 거의 유사한 정도의 트립판 블루 획득을 보이고, TMab4-3 D1A, TMab4-3 D1N 돌연변이는 트립판 블루 획득이 감소하였다.
도 25b는 산성 pH에서 세포질 침투 항체의 구조적 변화를 유도에 관여하는 경쇄가변영역(VL) 95번째 아미노산인 메티오닌을 다양한 아미노산으로 치환한 돌연변이의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 상기 실시예 26과 동일하게 pgsD-677 세포를 준비하고, 실시예 5와 동일하게 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4-3, TMab4-3 M95X 돌연변이 19종 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다.
이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. TMab4-3과 비교하여, TMab4-3 M95L, M95I, M95H는 유사한 정도의 트립판 블루 획득을 보이고, TMab4-3 M95A, M95S, M95V, M95G, M95P 돌연변이는 트립판 블루 획득이 감소하였다. 또한 TMab4-3 M59D, M59E는 pH 의존적 트립판 블루 획득이 증가하였으나 TMab4-3 M95K, M95R 돌연변이는 중성 pH 에서의 트립판 블루 획득이 증가하였다.
이를 통해, 산성 pH를 인지하여 구조변화를 일으키기 위해서는 곁사슬의 길이가 긴 소수성 아미노산들과, 음전하를 띠는 아미노산 및 히스티딘 (H)의 상호작용이 가장 효과적임을 확인하였다.
경쇄 가변영역의 95번 아미노산이 소수성을 띄는 아미노산인 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 류신 (L) 또는 음전하를 띄는 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)으로 구성 시, 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)과 상호작용에서 일정부분의 음전하를 띄는 아미노산 곁가지의 카르복실산이 수소화되어 (protonation) 소수성을 띄는 특징에 의한 소수성 상호작용 (Hydrophobic interaction)을 할 것으로 예상된다 (Du Z et al., 2011; Di Russo et al., 2012).
또한, 경쇄가변영역 95번 아미노산이 히스티딘 (H)로 구성 시 pH 7.4에서 pH 5.5로 변경됨에 따라 아미노산 곁가지의 순전하 (Net charge)가 양전하를 띄게 되며, 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번 아미노산인 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)과 정전기적 상호작용 (Electrostatic interaction)을 통해 엔도좀 탈출을 유도할 것으로 예상된다.
실시예 27. 'pH 인지 특성변화 유도'아미노산 도입 돌연변이 디자인
본 연구진은 기존의 D1-M95 외에 pH 조건에 따른 상호작용 변화를 통해 엔도좀 탈출능을 유도할 수 있는 아미노산을 도입하고자 하였다.
구조 모델링 분석을 통해 1 번째 아미노산인 아스파라긴산 (D)과 상호작용할 수 있는 90번째, 91번째 아미노산을 가능성 있는 후보로 선정하였다. 산성 pH 조건에서 상호작용할 수 있도록 상기 90번째 아미노산을 히스티딘으로 치환(TMab4-3 Q90H), 91번째 아미노산을 히스티딘으로 치환(TMab4-3 Y91H) 하였다.
또한, 소수성을 띠는 2번째 아미노산과의 추가적인 상호작용을 할 수 있는 91번째 아미노산을 아스파라긴산(TMab4-3 Y91D) 으로 치환하였다.
또한, 음전하를 띠는 1번째 아미노산과 상호 작용할 수 있도록 2번째 아미노산 역시 음전하를 띠는 글루탐산(E)으로 치환하고, 소수성을 띠는 95번째 아미노산과 상호 작용할 수 있도록 90번째 아미노산을 류신(L)으로 치환(TMab4-3 L2E Q90L) 하고, 음전하를 띠는 1번째 아미노산과 상호 작용할 수 있도록 2번째 아미노산 역시 음전하를 띠는 글루탐산(E)으로 치환하고, 소수성을 띠는 95번째 아미노산과 상호 작용할 수 있도록 97번째 아미노산을 이소류신(I)으로 치환(TMab4-3 L2E T97I) 하였다.
하기 표 9는 overlap PCR 기법을 사용하여 구축한 돌연변이의 명칭 및 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00009
각 돌연변이는 실시예 1과 동일하게, 클로닝 진행하여 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
실시예 28. 'pH 인지 특성변화 유도'아미노산 도입 돌연변이의 엔도좀 탈출능 향상 확인.
도 26a은 'pH 인지 특성변화 유도'목적 디자인 돌연변이들의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 26과 동일하게 세포를 준비한 후, 실시예 5와 동일하게 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4-3, TMab4-3 D1E-M95L 등 돌연변이 7종 0.5 또는 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다. 이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
TMab4-3과 비교하여, TMab4-3 Q90H 돌연변이는 0.5 μM에서 높은 트립판 블루 획득을 보였다. 추가적으로, 야생형과 유의미한 차이를 보인 TMab4-3 Q90H 돌연변이를 이용하여 실험을 진행하였다.
도 26b은 pH 인지 특성변화 유도 목적 디자인 돌연변이의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 TMab4-3, TMab4-3 Q90H 0.25, 0.5, 1μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, PBS 또는 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150 μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
TMab4-3를 처리한 세포와 비교하여, TMab4-3 Q90H를 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 향상되었다. 따라서, 세포질 침투 항체 경쇄가변영역의 95번 아미노산 이외에도 90번 아미노산이 1번 아미노산과 상호작용하여 pH 의존적 상호작용 변화를 통한 엔도좀 탈출능을 유도함을 확인했다.
하기 표 10는 추가적인 pH 인지 특성변화 유도에 의해 엔도좀 탈출능 향상된 돌연변이의 경쇄 가변영역 CDR3 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00010
실시예 29. 경쇄가변영역의 CDR3 길이에 따른 엔도좀 탈출능 탐색
경쇄가변영역의 CDR3 는 85% 이상 아미노산 9개로 구성되어 있다. 아미노산 개수와 구성에 따라 CDR3 고리 구조가 달라지게 된다. 본 발명에서는 아미노산 개수와 구성에 따라 엔도좀 탈출능이 어떻게 변하는지 분석하고자 CDR3 를 구성하는 아미노산의 개수를 각 8, 10, 11 개로 이루어진 돌연변이를 구축하였다.
표 11은 overlap PCR 기법을 사용하여 구축한 돌연변이의 명칭 및 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00011
각 돌연변이는 실시예 1과 동일하게, 클로닝 진행하여 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
도 27은 경쇄가변영역의 CDR3 를 구성하는 아미노산의 개수를 다르게 한 돌연변이들의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 26과 동일하게 세포를 준비한 후, 실시예 5와 동일하게 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4-3, TMab4-3 L8-1 등 돌연변이 7종 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다. 이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
TMab4-3과 비교하여, 아미노산의 개수가 늘어날수록 중성 pH에서의 트립판 블루 획득이 증가하였다. 이는 아미노산의 개수가 늘어나 전체 CDR3 고리 구조가 늘어지게 되며, 엔도좀 탈출을 위해 엔도좀 세포막에 결합하는 엔도좀 탈출 모티프인 WYW 가 외부로 노출되어 중성 pH에서도 트립판 블루 획득이 일어나게 되는 것으로 판단된다.
또한 상기 실험 결과에서 기존 pH 의존적 상호작용 변화를 통해 엔도좀 탈출을 유도하는 95번 아미노산과 인지질과 결합을 통해 엔도좀 탈출에 영향을 미치는 92번, 93번, 94번 잔기 사이에 거리가 증가하여도 엔도좀 탈출 모티프의 특성이 유지가 되는 것을 확인했다.
실시예 30. 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 부여 가능 논리.
현재 시판되고 있는 치료용 항체 중 세포 표면 수용체, 특히 세포 내제화가 일어나는 세포 표면 수용체를 표적하는 단일클론항체의 종류는 매우 많다. 그러나, 종래 이러한 항체들은 세포 내제화된 이후, 항원과의 결합이 끊어지지 않고, 엔도좀 탈출능이 없기 때문에 세포질로 이동하지 못하고 다시 세포 밖으로 내뱉어진다. 따라서, 이러한 세포 내제화가 일어나는 수용체 표적 항체에 엔도좀 탈출능을 부여할 수 있게 되면 지금보다 더 넓은 범위로 응용이 가능하다는 장점이 있다.
또한, 시판되고 있는 치료용 항체의 안정적인 골격을 이용하여 전체적인 발현 수율 증가를 기대할 수 있고, 종양 조직 특이적이지 않은 수용체인 HSPG 과의 친화도를 제거하여 종양 조직 특이적 특성을 부여를 가능하게 한다는 장점을 가지고 있다.
개선된 엔도좀 탈출능 모티프를 부여하기 위하여, 세포 내제화가 일어나는 수용체 표적 항체의 경쇄 가변영역의 서열과 세포질 침투 항체의 경쇄 가변영역의 서열를 비교하여, 1번째 아미노산이 음전하를 띠며, CDR3 고리 구조에 영향을 줄 수 있는 골격에 위치하는 주요 아미노산이 동일한 후보 경쇄 가변영역 서열을 정리하였다.
후보 경쇄 가변영역의 CDR3 서열을 세포질 침투 항체의 CDR3 서열로 치환하는 돌연변이를 구축하였다.
표 12은 유전자 합성 기법을 사용하여 구축한 돌연변이의 명칭 및 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00012
도 28a는 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
실시예 1과 동일하게, 경쇄 가변영역 클로닝 진행하여 GTP가 결합된 K-RAS에 특이적 결합하는 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션 (transient transfection) 하였다. 이후 완전 IgG 형태의 항-RAS cytotransmab의 정제는 실시예 1와 동일하게 진행하였다.
실시예 31. 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 부여 가능 확인.
도 28b는 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체의 HSPG 결합능 및 세포질 침투능이 감소 혹은 제거되었는지 형광 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, RT11-3, RT11-Neci-WYW, RT11-Nimo-WYW, RT11-Pani-WYW, RT11-Pert-WYW, RT11-Lumr-WYW, RT11-Emib-WYW 1 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다.
실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정, 세포 천공, 블로킹 과정을 거쳤다. 각 항체는 FITC(녹색형광)이 연결된 인간 Fc를 특이적 인지하는 항체로 염색하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 6가지 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 단일클론항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체에서 모두 세포 내부에서의 형광이 관찰되지 않았다.
도 28c는 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체에 의한 산성 pH에 의한 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 5와 동일하게 ramos 세포를 플레이트에 부착시킨 후, 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 RT11-3, RT11-Neci-WYW, RT11-Nimo-WYW, RT11-Pani-WYW, RT11-Pert-WYW, RT11-Lumr-WYW, RT11-Emib-WYW 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다.
전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다. RT11-Pert 를 제외한 5가지 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 치료용 항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체의 경우 RT11-3 와 유사한 트립판 블루 획득이 관찰하였다.
실시예 32. 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 치료용 항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체의 GTP가 결합된 K-RAS와 특이적 결합 유지 확인.
도 29a는 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체의 K-RAS 돌연변이체 K-RAS G12D의 GppNHp가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태에서의 친화도를 측정하기 위한 ELISA를 수행한 결과이다.
구체적으로는, 표적분자 K-RAS G12D의 GppNHp가 결합된 형태와 GDP가 결합된 형태를 96 웰 EIA/RIA 플레이트 (COSTAR Corning)에 1시간동안 37℃에서 결합시킨 후 0.1 % PBST (0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 12mM phosphate, 2.7 mM KCl) (SIGMA)로 10분간 3회 씻어내었다. 5% PBSS (5% Skim milk, pH7.4, 137 mM NaCl, 12mM phosphate, 2.7 mM KCl) (SIGMA)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% PBST로 10분간 3회 씻어내었다. 이후 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투항체 RT11-3, RT11-Neci-WYW, RT11-Nimo-WYW, RT11-Pani-WYW, RT11-Pert-WYW, RT11-Lumr-WYW, RT11-Emib-WYW 를 결합시킨 후 0.1 % PBST로 10분간 3회 씻어낸다. 표지항체로 염소유래 AP가 접합된 항-인간 항체(alkaline phosphatase-conjugated anti-human mAb) (SIGMA)로 결합시켰다. pNPP(p-nitrophenyl palmitate) (Sigma)로 반응시켜 405 nm 흡광도를 정량하였다.
K-RAS 돌연변이에 대해서 친화도 분석 결과 RT11-Nimo를 제외한 5가지 개선된 엔도좀 탈출능 부여한 치료용 항체 골격을 포함하는 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체의 경우 RT11-3 와 친화도 차이를 보이지 않았고, 음성 대조군으로 사용된 GDP가 결합된 K-RAS들에는 모든 클론이 결합하지 않았다.
도 29b는 RGD10 펩타이드 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체은 세포 침투능이 제거되었기 때문에 세포 침투가 가능하도록 신생혈관세포 및 다양한 종양에서 과발현되는 인테그린(Integrin αvβ3)에 특이성을 갖는 RGD10 펩타이드를 경쇄 N-말단에 GGGGS 2 개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하였다. RGD10 펩타이드의 경우, RGD4C 펩타이드와 유사한 친화도를 가지고 있지만 두 개의 시스테인에 의한 하나의 이황화결합만 존재하며, 유전공학적 융합이 가능하다는 특징이 있다.
또한, 발현 수율, 엔도좀 탈출능, Ras에 대한 친화도 분석 실험 결과를 기반으로, 우수한 후보 항체인 RT11-Pani-WYW, RT11-Neci-WYW의 경쇄 가변영역의 N-말단에 RGD10 펩타이드를 융합하였다.
도 29c는 RGD10 펩타이드 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체와 세포내 활성화된 H-RAS G12V 돌연변이와의 중첩 여부를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
구체적으로는, K-RAS G12V 돌연변이를 가지는 인간 대장암 세포주인 SW480 세포주를 24 웰 플레이트의 각각의 웰 당 2x104개를 0.5ml에 희석하여 12시간, 37℃, 5% CO2조건에서 배양한 후, RT11-i3, RT11-i-Neci-WYW, RT11-i-Pani-WYW 1 μM을 처리하여 37℃, 12시간 배양하였다. 이후 실시예 2와 동일한 조건으로 항체와 핵을 표지하고, Ras 표지 항체를 1 시간, 37℃ 조건에서 반응 후, 이차 항체로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
도 29c에 나타난 바와 같이, 적색형광의 활성화된 RAS가 위치하는 세포내막 부분에 녹색형광의 RT11-i3, RT11-i-Neci-WYW, RT11-i-Pani-WYW가 중첩하였다.
상기 실험 결과로 세포내의 활성화된 RAS와 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 RAS 표적 세포질 침투 항체가 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 33. 중쇄 가변영역의 CDR에 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 부여 가능 논리.
중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역은 베타-병풍구조를 골격으로 하고 고리 구조를 가지는 3개의 CDR로 이루어져 있다는 구조적 공통점이 있다. 따라서, 경쇄 가변영역의 pH 의존적 상호작용 변화에 따른 엔도좀 탈출능 유도 모티프를 중쇄 가변영역에도 부여할 수 있다고 판단하였다.
이러한 현상을 중쇄 가변영역에서 재현할 수 있는지 중쇄 가변영역 서열 및 3차 구조를 통해 분석한 결과, 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산인 글루탐산 (E) 과 상호작용할 수 있는 거리에 있는 CDR3 에 개선된 엔도좀 탈출능 모티프를 옮길 수 있었다.
야생형 중쇄 가변영역의 CDR3 의 아미노산 개수는 11개이며, 구조 상 이미 표면쪽으로 고리의 중심부가 많이 노출되어 있어, 경쇄 가변영역과 같이 pH 의존적인 현상이 일어나기 힘들다고 판단하였다. 그에 따라, 서열을 일부 유지하면서, CDR3의 아미노산 개수를 7 또는 8개로 줄였다.
또한, 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산과 초기 엔도좀 pH 5.5 조건에서 상호작용할 수 있는 아미노산으로는, 중쇄 가변영역의 102번째 아미노산이 적합한 거리에 위치한다고 판단하여 이 아미노산을 류신 (L)으로 치환하였다.
개선된 엔도좀 탈출능 모티프를 중쇄 가변영역의 CDR3에 도입한 돌연변이를 구축하였다.
하기 표 13, 14과 15는 디자인된 엔도좀 탈출능 모티프를 중쇄 가변영역에 옮긴 중쇄 가변영역 돌연변이 서열을 나타낸다. 표 13은 인간항체 경쇄 가변영역 전체 서열을 Kabat 넘버링에 맞게 나타낸 표이며, 표 14, 15는 상기 표 13의 항체 서열에서 CDR1, CDR2 서열 또는 CDR3 서열만 따로 표기한 내용이다.
Figure 112019119995761-pat00013
Figure 112019119995761-pat00014
Figure 112019119995761-pat00015
도 30a는 엔도좀 탈출능을 제거한 경쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 도입 중쇄 가변영역을 가진 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
이 때, 개선된 엔도좀 탈출능 모티프가 도입된 중쇄 가변영역의 엔도좀 탈출능을 평가하기 위하여, 기존의 경쇄 가변영역에 존재하는 엔도좀 탈출능 담당하는 92-94번째 아미노산인 WYW 를 AAA (연속된 3개의 알라닌)으로 치환하여, 그 기능을 제거한다. 실시예 1과 동일하게, 중쇄 가변영역 클로닝 진행하여 엔도좀 탈출능이 제거된 경쇄가변영역을 포함하는 경쇄와 함께 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
개선된 엔도좀 탈출능 모티프가 도입된 중쇄 가변영역을 포함하는 세포질 침투 항체를 보다 명료하게 명명하기 위하여, 상기 TMab4를 CT 로 약칭한다. 즉, TMab4-AAA는 CT-AAA 이다.
실시예 34. 중쇄 가변영역의 CDR에 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 부여 가능 확인.
도 30b는 엔도좀 탈출능을 제거한 경쇄 가변영역과 엔도좀 탈출능 모티프 도입 중쇄 가변영역을 가진 세포질 침투 항체에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 5와 동일하게 ramos 세포를 플레이트에 부착시킨 후, 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 TMab4-WYW, TMab4-AAA, CT01-AAA, CT02-AAA, CT03-AAA, CT04-AAA 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다. CT01-AAA, CT02-AAA, CT03-AAA, CT04-AAA 돌연변이 모두 TMab4-3 에 비하여 절반 정도의 트립판 블루 획득이 관찰하였다. 하지만, CT04-AAA 돌연변이에서는 중성 pH에서도 트립판 블루 획득이 관찰되었다.
도 30c는 GFP11-SBP2 융합된, 엔도좀 탈출능을 제거한 경쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 도입 중쇄 가변영역을 가진 세포질 침투 항체의 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, PBS, CT01-AAA-GFP11-SBP2, CT02-AAA-GFP11-SBP2, CT03-AAA-GFP11-SBP2, CT04-AAA-GFP11-SBP2 1.6 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. CT01-AAA-GFP11-SBP2, CT02-AAA-GFP11-SBP2, CT03-AAA-GFP11-SBP2, CT04-AAA-GFP11-SBP2를 처리한 세포 내부에서 녹색 GFP 형광이 관찰됨을 확인하였다.
도 30d는 엔도좀 탈출능을 제거한 경쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 도입 중쇄 가변영역을 가진 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 CT01-AAA, CT02-AAA, CT03-AAA 0.2, 0.5, 1μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, PBS 또는 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150 μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. CT01-AAA, CT02-AAA를 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 TMab4를 처리한 세포와 유사하였다. 반면, CT03-AAA를 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 CT보다 형광이 약하게 관찰되었다.
따라서, 개선된 엔도좀 탈출능 모티프를 중쇄 가변영역에 부여하여도 엔도좀 탈출이 가능하며, 최종적으로 세포질 내부에 위치함을 확인하였다.
실시예 35. 중쇄가변영역에 위치하는 pH에 따른 구조변화를 유도하는 E1-L102 의 특성 분석.
pH에 따른 구조변화를 유도하는 중쇄가변영역(VH) 1번째 아미노산 글루탐산산, 102번째 아미노산 류신의 특성을 보다 자세하게 분석하기 위해, 항체 골격에 위치하는 1번째 아미노산은 생식선 유래 서열에 존재하는 아르파라긴산, 알라닌, 글루타민으로 치환하며, CDR3에 위치하는 102번째 아미노산은 경쇄가변영역에서 중성 또는 산성 pH 조건에 트립판 블루 획득을 보인 12개 아미노산으로 치환하여 구축하였다. 각 돌연변이는 실시예 1과 동일하게, 클로닝 진행하여 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
도 31a는 산성 pH에서 세포질 침투 항체의 구조적 변화를 유도에 관여하는 중쇄가변영역(VH) 1번째 아미노산 글루탐산을 다양한 아미노산으로 치환한 돌연변이의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 상기 실시예 26과 동일하게, pgsD-677 세포주 (1x104)를 24웰 플레이트에 배양한다. 다음 날, 실시예 5와 동일하게 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 CT01-AAA, CT01-AAA E1A, CT01-AAA E1D, CT01-AAA E1Q 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다. 이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. CT01-AAA E1D는 거의 유사한 정도의 트립판 블루 획득을 보이고, CT01-AAA E1A, CT01-AAA E1Q 돌연변이는 트립판 블루 획득이 감소하였다.
도 31b는 산성 pH에서 세포질 침투 항체의 구조적 변화를 유도에 관여하는 중쇄가변영역(VH) 102번째 아미노산 류신을 다양한 아미노산으로 치환한 돌연변이의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 상기 실시예 26과 동일하게 pgsD-677 세포를 준비하고, 실시예 5와 동일하게 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 CT01-AAA, CT01-AAA L102X 돌연변이 19종 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다. 이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. CT01-AAA과 비교하여, CT01-AAA L102I, L102M, L102H는 유사한 정도의 트립판 블루 획득을 보이고, CT01-AAA L102K, L102R 돌연변이는 중성 pH 에서의 트립판 블루 획득이 증가하였다.
이를 통해, 경쇄가변영역 95번 아미노산과 동일하게 중쇄가변영역에서도 102번 아미노산이, 초기 엔도좀 pH 5.5를 인지하여 상호작용 변화를 통해 엔도좀 탈출을 일으키기 위해서는 곁사슬의 길이가 긴 소수성 아미노산, 음전하를 띠는 아미노산 및 히스티딘 (H)의 상호작용이 가장 효과적임을 확인하였다.
실시예 36. 3개의 트립토판을 가지고 있는 엔도좀 탈출 모티프 돌연변이 구축.
2개의 트립토판을 가지고 있는 엔도좀 탈출 모티프의 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위해, 92-94번째 아미노산을 모두 트립토판으로 치환하여, 총 3개의 트립토판을 가지고 있는 엔도좀 탈출 모티프를 구축하였다.
하기 표 16과 17는 각각 3개의 트립토판을 가지고 있는 엔도좀 탈출 모티프를 도입한 경쇄 가변영역 돌연변이 서열을 나타낸다. 표 16은 인간항체 경쇄 가변영역 전체 서열을 Kabat 넘버링에 맞게 나타낸 표이며, 표 17는 상기 표 16의 항체 서열에서 CDR3 서열만 따로 표기한 내용이다.
Figure 112019119995761-pat00016
Figure 112019119995761-pat00017
하기 표 18과 19는 각각 3개의 트립토판을 가지고 있는 엔도좀 탈출 모티프를 도입한 중쇄 가변영역 돌연변이 서열을 나타낸다. 표 18은 인간항체 중쇄 가변영역 전체 서열을 Kabat 넘버링에 맞게 나타낸 표이며, 표 19는 상기 표 18의 항체 서열에서 CDR3 서열만 따로 표기한 내용이다.
Figure 112019119995761-pat00018
Figure 112019119995761-pat00019
이 때, 3개의 트립토판으로 구성된 엔도좀 탈출능 모티프를 포함하는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 엔도좀 탈출능을 평가하기 위하여, 엔도좀 탈출능 모티프를 포함하지 않는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역과 함께 HEK293F 세포주에서 상기 실시예 1과 동일하게 발현 및 정제하여 실험하였다.
실시예 37. 2개 또는 3개의 트립토판으로 이루어진 엔도좀 탈출능 모티프 도입 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출능 향상 확인.
엔도좀 탈출능을 향상시키기 위한 하나의 전략으로, 중쇄가변영역과 경쇄가변영역에 모두 엔도좀 탈출능 모티프를 부여하였다. 따라서, 하나의 완전한 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 총 4개의 엔도좀 탈출능 모티프를 포함하게 된다.
2개 또는 3개의 트립토판으로 구성된 엔도좀 탈출능 모티프를 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄가변영역을 함께 HEK293F 세포주에서 상기 실시예 1과 동일하게 발현 및 정제하여 실험하였다.
도 32a 는 3개의 트립토판으로 치환한 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 상기 실시예 26과 동일하게, pgsD-677 세포를 준비하고, 실시예 5와 동일하게 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 CT-3, CT-3_WWW, CT01-AAA, CT01_WWW-AAA, CT01-3, CT01_WWW-3_WWW 0.5 또는 1 μM 넣어 37 ℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다. 이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
기존의 엔도좀 탈출 모티프를 포함하는 CT-3, CT01-AAA, CT01-3과 비교하여, CT-3_WWW, CT01_WWW-AAA, CT01_WWW-3_WWW는 유의미하게 향상된 트립판 블루 획득을 보인다. 또한, CT-3, CT01-AAA 와 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변영역에 모두 엔도좀 탈출 모티프를 포함하는 CT01-3, CT01_WWW-3_WWW은 보다 높은 트립판 블루 획득을 보인다.
도 32b 는 3개의 트립토판으로 치환한 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 HeLa 세포주를 준비하여 CT-3, CT-3_WWW, CT01-AAA, CT01_WWW-AAA, CT01-3, CT01_WWW-3_WWW 0.25, 0.5, 1μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, PBS 또는 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150 μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
기존의 엔도좀 탈출 모티프를 포함하는 CT-3, CT01-AAA, CT01-3을 처리한 세포와 비교하여, CT-3_WWW, CT01_WWW-AAA, CT01_WWW-3_WWW를 처리한 세포에서 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 강하게 관찰되었다. 또한, CT-3, CT01-AAA 와 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변영역에 모두 엔도좀 탈출 모티프를 포함하는 CT01-3, CT01_WWW-3_WWW를 처리한 세포에서 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 강하게 관찰되었다.
트립토판의 개수가 3개인 엔도좀 탈출능 모티프가 기존의 엔도좀 탈출능 모티프보다 엔도좀 탈출능이 향상되었으며, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역에 엔도좀 탈출 모티프를 부여하였을 때에도, 엔도좀 탈출능이 향상됨을 확인하였다.
실시예 38. 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 치료용 항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출능 향상 확인.
중쇄가변영역과 경쇄가변영역에 모두 엔도좀 탈출능 모티프를 부여하였을 때의 엔도좀 탈출능 향상을 확인하기 위해, 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 엔도좀 탈출능을 부여한 치료용 항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 함께 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험을 진행하였다.
구체적으로, 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 치료용 항체 골격을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체은 세포 침투능이 제거되었기 때문에 세포 침투가 가능하도록 대장암을 비롯한 다양한 종양에 세포막표면에 과발현되는 EpCAM에 특이성을 갖는 EpCAM 표적 원형 펩타이드를 경쇄 N-말단에 GGGGS 2 개의 링커를 사용하여 유전공학적으로 융합하였다 (US 2015/0246945 A1).
도 33a는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 EpCAM 표적 펩타이드를 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
구체적으로는, 실시예 1과 동일하게, 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄와 개선된 엔도좀 탈출능을 부여한 단일클론항체 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄가 코딩된 동물 발현 벡터를 HEK293F 단백질 발현 세포에 동시에 일시적 트랜스펙션 (transient transfection) 하였다. 이후 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 정제는 실시예 1와 동일하게 진행하였다.
도 33b는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 EpCAM 표적 펩타이드를 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 세포질로의 이동을 칼세인을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰하고 공초점 현미경 사진의 칼세인 형광을 정량한 막대그래프이다.
구체적으로는, 실시예 2와 동일하게 K-RAS G13D 돌연변이를 가지는 인간 대장암 세포주인 HCT116 세포주를 준비하여 CT-ep41, CT01-ep41 0.1, 0.25, 0.5 μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, PBS 또는 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150 μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 실시예 2와 같은 방법을 통해 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. CT01-ep41를 각 농도별로 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 CT-ep41를 처리한 세포에 비하여 세기가 강하였다.
도 33c는 개선된 엔도좀 탈출 모티프 도입 중쇄 가변영역과 EpCAM 표적 펩타이드를 융합한 기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 실시예 5와 동일하게 ramos 세포를 플레이트에 부착시킨 후, pH 를 세포질 pH 인 7.4로 유지하기 위해 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), pH 를 초기 엔도좀 pH인 5.5로 유지하기 위해 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 CT-ep41, CT01-ep41 0.5, 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 전체 세포 중 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 세어 퍼센트로 나타내었다. 총 400개 이상의 세포 수를 세어 평균값(mean)을 도표로 나타내었다. CT01-ep41 의 경우, CT-ep41에 대비하여 농도 의존적으로 트립판 블루 획득이 증가하였음을 관찰하였다.
따라서, 엔도좀 탈출 모티프를 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역에 각각 도입하였을 때, 경쇄 가변영역에만 엔도좀 탈출 모티프가 존재하는 경우에 비하여 엔도좀 탈출능이 향상되었다.
실시예 39. 기존 치료용 항체 중쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 부여 가능 논리.
기존 치료용 항체 경쇄가변영역에 엔도좀 탈출능 모티프를 부여한 논리와 동일하게, 시판되고 있는 치료용 항체의 안정적인 골격을 이용하여 전체적인 발현 수율 증가를 기대할 수 있으며, 엔도좀 탈출능 모티프가 하나의 모티프로서 작동할 수 있는지 확인하기 위하여 기존 치료용 항체 중쇄가변영역에도 엔도좀 탈출능 모티프를 부여하였다.
후보 중쇄 가변영역의 CDR3 를 세포질 침투 항체의 CDR3로 치환하는 돌연변이를 구축하였다.
표 20은 유전자 합성 기법을 사용하여 구축한 돌연변이의 명칭 및 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00020
도 34a은 기존 치료용 항체 중쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체 구축을 설명한 모식도이다.
실시예 1과 동일하게, 중쇄 가변영역 클로닝 진행하여 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 도입된 단일클론항체 경쇄가변영역을 포함하는 경쇄와 함께 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
실시예 40. 단일클론항체 중쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 부여 가능 확인.
도 34b는 기존 치료용 항체 중쇄가변영역에 개선된 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의한 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 상기 실시예 26과 동일하게 pgsD-677 세포를 준비하고, 실시예 5와 동일하게 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 CT01-ep41, Hu01-ep41, Her01-ep41, Ava01-ep41 0.5, 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다. 이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 모든 돌연변이가 CT01-ep41와 유사한 트립판 블루 획득 정도를 보였다.
실시예 41. 세포질 침투 항체의 물성을 개량 목적으로 아스파라긴산을 도입한 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역 구축.
세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위하여, 엔도좀 탈출 모티프를 중쇄가변영역과 경쇄가변영역의 CDR3 에 도입하였다. 이 때, 엔도좀 탈출 모티프를 구성하고 있는 소수성 아미노산인 트립토판 (W) 과 타이로신 (Y)에 의해, 세포질 침투 항체는 높은 소수성을 띠게 된다. 본 연구진은 이러한 소수성을 상쇄하기 위하여, 엔도좀 탈출 모티프와 인접하는 아미노산을 음전하를 띠는 아스파라긴산으로 치환하는 돌연변이를 구축하였다. 항체 가변영역의 골격 및 CDR 부위에 아스파라긴산을 도입하여, 항체 전반적인 안정성을 높이고, 항체의 높은 소수성에 의한 단백질 집성 (aggregation) 을 감소시키는 연구를 참고하여 돌연변이를 구축하였다 (Perchiacca et al., 2011; Dudgeon et al., 2012).
중쇄가변영역의 32번째, 33번째, 58번째 아미노산은 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역의 엔도좀 탈출 모티프와 인접하여 있으므로, 이 아미노산을 아스파라긴산으로 치환하였다. 이를 CT11 VH (F32D, S33D), CT12 VH (F32D, S33D, Y58D)라고 명명하였다.
또한, 경쇄가변영역의 27b번째, 50번째, 51번째 아미노산은 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역의 엔도좀 탈출 모티프와 인접하여 있으므로, 이 아미노산을 아스파라긴산으로 치환하였다. 이를 hT4-60 VL (L27bD), hT4-61 VL (W50D) hT4-62 VL (W50D, A51D) hT4-63 VL (L27Bd, W50D, A51D) 라고 명명하였다.
이 때, 돌연변이의 주형이 된 중쇄가변영역과 경쇄가변영역은 동물세포 발현시스템에서 높은 수율을 보이면서 엔도좀 탈출 모티프가 도입된 항체 가변영역이며, 각 CT01 VH, hT4-59 VL 이라 명명하였다.
하기 표 21과 22은 항체 가변영역의 골격 및 CDR 부위에 아스파라긴산을 도입한 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역 돌연변이 서열을 나타낸다.
Figure 112019119995761-pat00021
Figure 112019119995761-pat00022
실시예 1과 동일하게, 각 중쇄 가변영역 클로닝 진행하여 개선된 엔도좀 탈출능 모티프 도입된 단일클론항체 경쇄가변영역을 포함하는 경쇄와 함께 HEK293F 세포주에서 발현 및 정제하여 실험하였다.
실시예 42. 아스파라긴산을 도입한 중쇄가변영역 및/또는 경쇄가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출능 향상 확인.
도 35는 아스파라긴산을 도입한 중쇄가변영역 및/또는 경쇄가변영역을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체에 의해 pH에 따른 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
구체적으로는, 상기 실시예 26과 동일하게 pgsD-677 세포를 준비하고, 실시예 5와 동일하게 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50 mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50 mM MES pH 5.5) 200 ㎕에 CT10-ep59, CT11-ep59, CT12-ep59, CT10-ep60, CT10-ep61, CT10-ep62, CT10-ep63, CT12-ep63 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190 ㎕에 트립판 블루 (trypan blue) 10 ㎕을 섞어 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. 그 후 PBS로 조심스럽게 세척 후, 1 % SDS(Sodium dodecyl sulfate) 50 ㎕씩 넣어 세포를 용해시킨다. 이를 96 웰 플레이트에 옮겨 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 모든 돌연변이가 이전 실시예에서 실험한 CT01-ep41와 유사한 트립판 블루 획득 정도를 보였다. 따라서, 아스파라긴산이 도입되어도, 엔도좀 탈출능은 감소하지 않음을 확인하였다. 상기 항체에 대한 항체 안정성 실험은 추후에 진행할 예정이다.
실시예 43. 세포질 침투 항체 구조 분석
IgG 형태의 세포질 침투 항체 구조를 규명하기 위해 엔도좀 산성 pH 조건에서 엔도좀 탈출능을 갖는 세포질 침투 항체 중 생산 수율이 매우 높은 CT-59 항체를 사용하였다. 이는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역이 각각 hT0 VH와 hT4-59 VL로 구성된 IgG 형태의 세포질 침투 항체이다.
3차 구조를 규명하기 위해 기존 HEK293 세포주를 이용하여 생산된 IgG 형태의 CT-59를 파파인(papain) 처리한 이후 Protein A 컬럼 및 크기배제 크로마토그래피 (Size exclusion chromatograpy)를 이용하여 고순도의 Fab을 분리 정제하였으며, 이후 Mosquito-LCP 기기 상에서 스크리닝 버퍼 Index G1 조건 (0.2 M NaCl, 0.1 M Tris, pH 8.5, 25 % (w/v) PEG3350) 조건에서 구조 규명을 위한 크리스탈이 형성되었다. 세포질 침투 항체와 스크리닝 버퍼 혼합시 최종 pH는 8.1이다.
도 36a는 Index G1 조건에서 형성된 CT-59 Fab의 크리스탈을 RI1000 (Rock Imager1000; 전자동단백질결정이미지분석장치)로 관찰한 결과이다.
X선 회절 데이터는 5C beamline (Pohang Accelerator Laboratory(PAL))을 이용하여 획득하였고, HKL2000 package(HKL Research Inc., 미국)을 통해 indexing 및 scaliing 한 후 molecular replacement (MR) 방법을 통해 CT-59 Fab의 초기 전자밀도 지도를 얻었다. MR 방법을 이용 하기 위해서 CT-59와 비슷한 구조를 가진 단백질의 3차원 구조 데이터가 필요한데, FFAS사이트 (http://ffas.sanfordburnham.org/ffas-cgi/cgi/ffas.pl)를 사용하여 유사한 구조를 모델로 사용하였다. CT-59 Fab의 초기 위상정보는 CCP4을 이용하여 획득하였고, 획득한 초기 위상정보를 토대로 COOT(Crystallographic Object-Oriented Toolkit, http://www.biop.ox.ac.uk/coot/)을 이용해 model building 작업을 수행하였으며 Refmac5(http://www.ccp4.ac.uk/html/refmac5.html)와 PHENIX(Python-based Hierarchical ENvironment for Integrated Xtallography, http:// www.phenix-online.org/) software를 이용하여 refinement 및 validation 작업을 완료하였다 (도 36b 참조).
그 결과, 최종 pH 8.1 조건에서 1.8 Å 수준의 고해상도 3차 구조를 규명하였으며, CT-59의 경쇄가변영역의 1번 아스파라긴산 (D) 과 95번째 메티오닌 (M)의 곁가지 (side chain) 간의 거리가 6.87 Å 임을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Orum Therapeutics <120> Cytosol-Penetrating Antibodies and Uses Thereof <130> P19-B325 <150> KR 10-2016-0065365 <151> 2016-05-27 <150> KR 10-2016-0065379 <151> 2016-05-27 <160> 78 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-WWH VL <400> 1 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Trp Trp His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-WYW VL <400> 2 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr 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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Tyr His Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 70 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-Y91A VL <400> 70 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ala Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly 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Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ala His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 73 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-H94A VL <400> 73 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 74 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-AAA VL <400> 74 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Ala Ala Ala Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 75 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-Y96A VL <400> 75 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Tyr His Met Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 76 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-01 VL <400> 76 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Tyr His Met Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 77 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-02 VL <400> 77 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 78 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT4-03 VL <400> 78 Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg

Claims (16)

  1. 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기 일반식으로 표시되는 서열을 CDR3에 포함하는 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역을 포함하고,
    X1-X2-X3-Z1
    여기서, X1-X2-X3는 엔도좀 탈출능 모티프이고,
    X1-X2-X3는 W-W-W(상기에서 W는 트립토판),
    Z1은 메티오닌 (M), 이소류신 (I) 또는 류신 (L)이고,
    상기 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산은 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)이며,
    상기 Z1을 포함하는 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역이 엔도좀 산성 pH 조건에서 항체의 특성변화가 일어나고,
    상기 항체의 특성 변화를 통해 항체가 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포질 내 활성물질 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산이 상기 Z1과 엔도좀 산성 pH 조건에서 상호작용하여 특성변화유도를 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 활성물질은 펩타이드, 단백질, 독소, 항체, 항체절편, RNA, siRNA, DNA, 소분자 약물, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 하기 일반식으로 표시되는 서열을 CDR3에 포함하는 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역을 포함하고,
    X1-X2-X3-Z1
    여기서, X1-X2-X3는 엔도좀 탈출능 모티프이고,
    상기 엔도좀 탈출능 모티프 X1-X2-X3는 W-W-W(상기에서 트립토판 (W)),
    Z1은 메티오닌 (M), 이소류신 (I) 또는 류신 (L) 이고,
    상기 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산은 아스파라긴산 (D) 또는 글루탐산 (E)이며,
    상기 Z1을 포함하는 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역이 엔도좀 산성 pH 조건에서 항체의 특성변화가 일어나고,
    상기 항체의 특성 변화를 통해 항체가 엔도좀에서 세포질로의 탈출능을 나타내며,
    중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 X1과 연결되는 Z2 를 더 포함하여 아래 일반식으로 표시되는 것인 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
    Z2-X1-X2-X3-Z1
    (상기 Z2 는 글루타민 (Q), 류신 (L) 및 히스티딘 (H)으로 이루어진 그룹에서 선택됨)
  6. 제4항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역 또는 중쇄 가변영역의 1번째 아미노산이 상기 Z1 또는 Z2 와 엔도좀의 산성 pH 조건에서 상호작용하여 특성변화가 유도되는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제4항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역의 CDR3는 서열번호 51의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 서열번호 16 내지 23, 25 내지 37, 50, 60 내지 64로 구성된 군에서 선택된 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 서열번호 52, 54 내지 59로 구성된 군에서 선택된 중쇄 가변영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제4항에 있어서, 완전 이뮤노글로불린(immunoglobulin) G 형태인 것을 특징으로 하는 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  12. 제11항의 핵산을 포함하는 벡터.
  13. 제12항의 벡터로 형질전환된 분리된 세포.
  14. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포질 내 활성물질 전달용 조성물.
  15. 엔도좀 탈출능 모티프 X1-X2-X3-Z1 (X1-X2-X3는 W-W-W 트립토판(W) 아미노산 잔기이고, Z1은 메티오닌 (M), 이소류신 (I) 또는 류신 (L)인 것을 특징으로 함)를 경쇄 또는 중쇄 가변영역의 CDR3에 옮기는 그라프팅(grafting) 단계를 포함하는 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포질 침투 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 활성물질은 펩타이드, 단백질, 독소, 항체, 항체절편, RNA, siRNA, DNA, 소분자 약물, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
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