KR102154177B1 - 세포질 침투성이 증진된 항체의 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포질 침투성이 증진된 항체의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상세하게는 항체의 신속한 합성 및 특성 분석을 가능하게 하는 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하여 세포질 투과성이 증진된 변이형 항체를 스크리닝하는 방법으로, 세포독성이 없으며, 무세포 단백질 합성 후 정제과정 없이 그대로 세포질 투과성을 평가할 수 있는 스크리닝 방법이다. 본 발명의 스크리닝 방법은 투과성이 증진된 항체를 선별하고, 선별된 항체가 표적에 대한 친화성이 야생형 수준으로 유지되는지를 확인하는 것이다.
Description
본 발명은 세포질 침투성이 증진된 항체의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
특정 리간드에 대한 높은 특이성 및 강한 결합 친화력으로 인해, 치료용 항체는 신속하게 화학 약물을 대체하고 있으며 암 및 자가 면역 질환의 치료에서 치료제의 중심이 되었다. 항체의 표적 특이적 결합은 수용체 차단, 보체 의존성 세포 독성, 항체 의존성 세포 독성 및 T 세포 기능의 조절을 비롯한 다양한 기전을 통해 증상을 완화하거나 역전시킨다.
그러나 현재까지 개발된 대부분의 항체 치료제는 세포막을 통과할 수 없기 때문에 표면 노출 또는 분비 분자만을 타겟으로 하는 실정이므로, 소분자 약물이 현재 세포 내 표적에 접근하는 유일한 선택이다. 하지만, 상기한 바와 같은 기존의 화학 약물에 대비되는 항체 치료법의 장점을 살리기 위해, 세포막을 통해 항체를 전달하는 방법의 개발이 촉구되고 있다.
본 발명자들은 이러한 항체의 일반적인 성질과 다르게 세포질 침투능을 보이는 경쇄가변영역(VL)과 이를 도입한 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체 TMab4를 개발하였다(Choi et al., 2014). 또한, 세포질 내부의 주요 종양유발인자인 활성상태의 Ras를 표적하는 중쇄가변영역과 세포질 침투능을 보이는 경쇄가변영역을 IgG 형태로 구축하여 세포질 내부의 활성상태의 Ras를 표적하는 세포질 침투 항체 RT11을 개발하였다 (Shin et al., 2017).
세포질 침투항체의 경쇄가변영역은 엔도좀의 산성 pH를 감지하여 구조적 변화가 유도되고, 이에 따라 엔도좀 탈출능을 보이는 것을 확인하였으며, 구조적 변화가 일어나는 고리 부분의 서열을 조작하여 엔도좀 탈출능을 향상시킨 TMab4-WYW (TMab4-3) 항체를 개발하였다 (Kim et al., 2016). 최종적으로, 상기 세포질 내부의 주요 종양유발인자인 활성상태의 Ras를 표적하는 중쇄가변영역과 엔도좀 탈출능이 향상된 경쇄가변영역을 조합하여 RT11-3 항체를 구축하였다.
실험을 통하여 경쇄가변영역의 서열 중 엔도좀 탈출에 관여한다고 여겨지는 서열을 확인하였으나, 본 발명자들이 예측하지 못하는 서열도 엔도좀 탈출에 관여할 가능성이 있으므로, 큰 다양성을 가지는 경쇄가변영역 변이체를 구축하여 세포질 침투능을 비교함으로써 세포질 전달 효율이 향상된 서열을 얻을 수 있을 것으로 기대하였다. 하지만 이를 위한 다양한 세포 침투 항체 변이체의 스크리닝 및 발현은 유전자 클로닝, 재조합 발현 및 정제 등의 수많은 과정을 필요로 하며, 이후 기능 분석을 추가로 진행하는 복잡한 과정을 수행해야 한다는 한계점이 있다. 그러한 이유로 현재까지는 10개 이내 정도의 제한된 변이체를 구축하여 세포질 침투능을 평가하였다.
한편 항체의 세포막의 투과에 관한 기술로는 한국등록특허 제1602870호에 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용에 관한 기술이 개시되어 있고, 세포질 침투 항체가 세포질에 위치 정도를 확인하기 위한 실험 방법으로는 한국등록특허 제1790669호에 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보시스템 및 이의 용도에 관한 기술이 개시되어 있다. 또한, 한국등록특허 제1667023호에 무세포 단백질 합성 방법을 이용하여 생산된 항체의 세포질 내로의 유입을 간편하게 분석하는 방법에 관한 기술이 개시되어 있으나, 본 발명의 세포질 침투성이 증진된 항체의 스크리닝 방법에 관한 기술은 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 세포질 침투성이 증진된 항체의 스크리닝 방법을 제공하고, 본 발명의 스크리닝 방법으로 항체의 세포질로의 침투성을 증진시킬 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 무세포 단백질 합성법으로 야생형 세포질 침투성 타겟 항체를 합성하는 단계;
(2) 상기 단계(1)에서 합성된 타겟 항체를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액을 그대로 정제 없이 희석하여, 세포독성 및 세포질 침투성 확인 가능 농도를 결정하는 단계;
(3) 상기 단계 (1)의 타겟 항체의 경쇄 가변영역의 서열이 변이된, 변이형 세포질 침투성 항체를 생산할 수 있는 유전자 서열을 PCR 증폭시키는 단계;
(4) 상기 단계 (3)에서 획득한 PCR 증폭 산물을 합성 주형으로 하여, 무세포 단백질 합성으로 변이형 세포질 침투성 항체를 생산하는 단계;
(5) 상기 단계 (4)에서 생산된 변이형 세포질 침투성 항체들을, 상기 단계 (2)에서 결정한 농도로, 리포터 세포에 처리하고, 세포의 침투성이 증진된 변이형 세포질 침투성 항체를 선별하는 단계; 및
(6) 상기 단계 (5)에서 선별된 세포의 침투성이 증진된 변이형 세포질 침투성 항체의 타겟 항원에 대한 친화성을 확인하는 단계;를 포함하는 침투성이 증진된 세포질 침투성 항체의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 세포질 침투성이 증진된 항체의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 경쇄 가변영역에 돌연변이 서열을 디자인하고, 무세포 단백질 합성을 통해 신속하게 합성할 수 있을 뿐만 아니라, 무세포 단백질 합성 반응액을 정제하지 않고, 그대로, 세포질 침투성에 대한 평가를 수행하는 간편하고 신속하게 스크리닝할 수 있는 방법이다.
도 1은 세포질-침투된 RT11-3 scFv 항체를 확인한 공초점 현미경 이미지다. 융합 및 원위치 절단에 의해 합성된 가용성 RT11-3 scFv 항체를 Ni-NTA 아가로오스 비드로 정제한 후, 상기 정제된 RT11-3scFv 항체를 0.25, 0.5, 0.75 및 1.0μM의 농도로 리포터 세포에 처리하고, 37℃에서 12시간 동안 5%(v/v) CO2 배양기에서 배양하였으며, 상기 배양된 리포터 세포를 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 리포터 세포의 GFP 형광을 분석하였고, 세포 핵은 Hoechst 33342로 염색한 것이다.
도 2는 리포터 세포에 대한 반응 혼합물의 각 성분에 대한 세포독성 시험 결과이다. 무세포 단백질 합성을 위한 반응 혼합물 중 주요 성분의 세포독성을 조사하기 위해 DMEM으로 희석한 표준 반응 혼합물과 동일한 농도로 각 성분 처리 후, 현미경을 사용하여 세포 형태를 분석한 결과이다. 희석된 혼합물 1.2㎖를 처리한 리포터 세포 1×105개를 37℃에서 12시간 동안 5%(v/v) CO2 배양기로 배양 후 확인한 것이다.
도 3은 무세포 단백질 합성된 RT11-3 scFv 항체를 다양한 비율(1, 2, 4 및 8 배)로, DMEM으로 희석하여 세포독성을 확인한 결과이다. 세포 형태와 세포 생존 능력에 최소한의 영향을 미치는 희석 비율을 최적화하기 위하여 관찰한 현미경 사진(A)과 유세포 분석(B) 결과이다.
도 4는 유비퀴틴 서열의 효과 및 RT11-3 scFv의 가용성 단백질의 양을 확인한 결과이다. (A)는 RT11-3 scFv 유전자에 유비퀴틴(UCE1)의 조작된 염기 서열을 융합시킨 후, 표준 반응 혼합물에서 무세포 단백질 합성한 단백질의 양을 TCA-침전된 방사능으로 확인한 것으로, RT11-3은 유비퀴틴(UCE1) 서열이 없는 유전자를 이용하여 합성한 것이고, UCE1-RT11-3은 유비퀴틴 서열이 융합된 유전자를 이용하여 합성한 것이며, 빈 막대는 총 단백질 합성 양이며, 채워진 막대는 가용성 단백질의 양이다. (B)는 표준 S12 추출물 및 UBP1가 풍부한 S12 추출물을 사용하여, 유비퀴틴-융합체의 발현 수준을 비교한 결과로, TCA-침전된 방사능 측정을 통해 확인한 것이다. 상단의 웨스턴블랏 결과는 유비퀴틴 태그의 절단을 확인한 것이다. (C)는 UBP1 S12 추출물의 존재하에 UCE1 융합된 RT11-3 scFv를 발현시킨 후, 반응 혼합물을 DMEM 배지에서 4배 희석시키고, 리포터 세포(1×104개)를 400㎕의 희석된 반응 혼합물 중에서 배양하였다. 처리된 리포터 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후, 공초점 현미경 하에서 GFP 형광을 확인한 것이다.
도 5는 RT11-3 scFv의 변이위치 및 변이라이브러리 제작 과정을 나타낸 것이다. (A)에 검은색으로 표시된 야생형 잔기들이 빨간색으로 표시된 아미노산으로 치환되도록 설계되었으며, (B)에 나타낸 프라이머들을 사용하여 PCR증폭된 DNA조각들의 조합을 통해 라이브러리를 구축하였다.
도 6은 변이 RT11-3 scFv의 무세포 발현 및 스크리닝 결과이다. PCR-증폭된 변이형 유전자 제작물을 무세포 단백질 합성을 위한 반응 혼합물 중에서 발현시키고, DMEM에서 4배 희석하여 리포터 세포에 첨가하여 배양 12시간 후, 리포터 세포를 PBS로 세척하고, 100㎕의 PBS에서 GFP 형광(여기파장:485nm/발광파장:528nm)을 측정한 결과이다.
도 7은 선택된 변이체의 아미노산 서열 분석 결과이다. 야생형 (WT) 및 선택된 변이 RT11-3 scFv (#1-60, #5-10, #6-32 및 #6-91)의 변이위치 아미노산 서열을 나타내는 것이다.
도 8은 채택된 변이형 클론의 세포질 투과성을 평가한 결과이다. 선별된 4 개의 클론을 5㎖의 무세포 단백질 합성 반응으로부터 발현시키고 정제한 후, 리포터 세포(1×104 세포/ 공초점 접시)를 DMEM에서 4배 희석한 후 동일한 양(1.5μM)의 정제 항체로 처리하고. 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정시킨 후, 리포터 세포의 GFP 형광을 확인한 것이다. 핵은 Hoechst 33342 염료로 염색한 것이다.
도 9는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체의 비특이적 결합능을 확인하기 위해, HSPG를 발현하지 않는 pgsD-677 세포주에서 비특이적 세포 표면 결합 ELISA를 수행한 결과이다.
도 10(A)는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체에 의한, pH7.4 및 pH5.5의 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 10(B)는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체에 따른 세포질로의 이동에 대하여, 칼세인(calcein)을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 10(C)는 GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이의 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광을 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 11(A)는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체들의 GppNHp가 결합된 KRasG12D와의 특이적 결합을 확인하기 위해, 10 또는 100nM의 KRasG12D·GppNHp와, 100nM의 KRasG12D·GDP에 대한 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 11(B)는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체들의 인간 대장암 세포주에서의 비부착 세포 성장 억제능을 spheroid proliferation 방법으로 확인한 결과이다.
도 2는 리포터 세포에 대한 반응 혼합물의 각 성분에 대한 세포독성 시험 결과이다. 무세포 단백질 합성을 위한 반응 혼합물 중 주요 성분의 세포독성을 조사하기 위해 DMEM으로 희석한 표준 반응 혼합물과 동일한 농도로 각 성분 처리 후, 현미경을 사용하여 세포 형태를 분석한 결과이다. 희석된 혼합물 1.2㎖를 처리한 리포터 세포 1×105개를 37℃에서 12시간 동안 5%(v/v) CO2 배양기로 배양 후 확인한 것이다.
도 3은 무세포 단백질 합성된 RT11-3 scFv 항체를 다양한 비율(1, 2, 4 및 8 배)로, DMEM으로 희석하여 세포독성을 확인한 결과이다. 세포 형태와 세포 생존 능력에 최소한의 영향을 미치는 희석 비율을 최적화하기 위하여 관찰한 현미경 사진(A)과 유세포 분석(B) 결과이다.
도 4는 유비퀴틴 서열의 효과 및 RT11-3 scFv의 가용성 단백질의 양을 확인한 결과이다. (A)는 RT11-3 scFv 유전자에 유비퀴틴(UCE1)의 조작된 염기 서열을 융합시킨 후, 표준 반응 혼합물에서 무세포 단백질 합성한 단백질의 양을 TCA-침전된 방사능으로 확인한 것으로, RT11-3은 유비퀴틴(UCE1) 서열이 없는 유전자를 이용하여 합성한 것이고, UCE1-RT11-3은 유비퀴틴 서열이 융합된 유전자를 이용하여 합성한 것이며, 빈 막대는 총 단백질 합성 양이며, 채워진 막대는 가용성 단백질의 양이다. (B)는 표준 S12 추출물 및 UBP1가 풍부한 S12 추출물을 사용하여, 유비퀴틴-융합체의 발현 수준을 비교한 결과로, TCA-침전된 방사능 측정을 통해 확인한 것이다. 상단의 웨스턴블랏 결과는 유비퀴틴 태그의 절단을 확인한 것이다. (C)는 UBP1 S12 추출물의 존재하에 UCE1 융합된 RT11-3 scFv를 발현시킨 후, 반응 혼합물을 DMEM 배지에서 4배 희석시키고, 리포터 세포(1×104개)를 400㎕의 희석된 반응 혼합물 중에서 배양하였다. 처리된 리포터 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후, 공초점 현미경 하에서 GFP 형광을 확인한 것이다.
도 5는 RT11-3 scFv의 변이위치 및 변이라이브러리 제작 과정을 나타낸 것이다. (A)에 검은색으로 표시된 야생형 잔기들이 빨간색으로 표시된 아미노산으로 치환되도록 설계되었으며, (B)에 나타낸 프라이머들을 사용하여 PCR증폭된 DNA조각들의 조합을 통해 라이브러리를 구축하였다.
도 6은 변이 RT11-3 scFv의 무세포 발현 및 스크리닝 결과이다. PCR-증폭된 변이형 유전자 제작물을 무세포 단백질 합성을 위한 반응 혼합물 중에서 발현시키고, DMEM에서 4배 희석하여 리포터 세포에 첨가하여 배양 12시간 후, 리포터 세포를 PBS로 세척하고, 100㎕의 PBS에서 GFP 형광(여기파장:485nm/발광파장:528nm)을 측정한 결과이다.
도 7은 선택된 변이체의 아미노산 서열 분석 결과이다. 야생형 (WT) 및 선택된 변이 RT11-3 scFv (#1-60, #5-10, #6-32 및 #6-91)의 변이위치 아미노산 서열을 나타내는 것이다.
도 8은 채택된 변이형 클론의 세포질 투과성을 평가한 결과이다. 선별된 4 개의 클론을 5㎖의 무세포 단백질 합성 반응으로부터 발현시키고 정제한 후, 리포터 세포(1×104 세포/ 공초점 접시)를 DMEM에서 4배 희석한 후 동일한 양(1.5μM)의 정제 항체로 처리하고. 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정시킨 후, 리포터 세포의 GFP 형광을 확인한 것이다. 핵은 Hoechst 33342 염료로 염색한 것이다.
도 9는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체의 비특이적 결합능을 확인하기 위해, HSPG를 발현하지 않는 pgsD-677 세포주에서 비특이적 세포 표면 결합 ELISA를 수행한 결과이다.
도 10(A)는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체에 의한, pH7.4 및 pH5.5의 트립판 블루를 획득한 세포의 수를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 10(B)는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체에 따른 세포질로의 이동에 대하여, 칼세인(calcein)을 이용하여 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 10(C)는 GFP11-SBP2 융합된 세포질 침투 항체 야생형 및 엔도좀 탈출능 향상 돌연변이의 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합에 의한 GFP 형광을 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 11(A)는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체들의 GppNHp가 결합된 KRasG12D와의 특이적 결합을 확인하기 위해, 10 또는 100nM의 KRasG12D·GppNHp와, 100nM의 KRasG12D·GDP에 대한 결합능을 ELISA로 분석한 결과이다.
도 11(B)는 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체들의 인간 대장암 세포주에서의 비부착 세포 성장 억제능을 spheroid proliferation 방법으로 확인한 결과이다.
본 발명은 (1) 무세포 단백질 합성법으로 야생형 세포질 침투성 타겟 항체를 합성하는 단계;
(2) 상기 단계(1)에서 합성된 타겟 항체를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액을 그대로 정제 없이 희석하여, 세포독성 및 세포질 침투성 확인 가능 농도를 결정하는 단계;
(3) 상기 단계 (1)의 타겟 항체의 경쇄 가변영역의 서열이 변이된, 변이형 세포질 침투성 항체를 생산할 수 있는 유전자 서열을 PCR 증폭시키는 단계;
(4) 상기 단계 (3)에서 획득한 PCR 증폭 산물을 합성 주형으로 하여, 무세포 단백질 합성으로 변이형 세포질 침투성 항체를 생산하는 단계;
(5) 상기 단계 (4)에서 생산된 변이형 세포질 침투성 항체들을, 상기 단계 (2)에서 결정한 농도로, 리포터 세포에 처리하고, 세포의 침투성이 증진된 변이형 세포질 침투성 항체를 선별하는 단계; 및
(6) 상기 단계 (5)에서 선별된 세포의 침투성이 증진된 변이형 세포질 침투성 항체의 타겟 항원에 대한 친화성을 확인하는 단계;를 포함하는 침투성이 증진된 세포질 침투성 항체의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 단계 (4)에서, PCR 증폭 산물은 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 융합파트너, 6×His tag, 중쇄영역, 링커1, 경쇄영역, 링커2, GFP11, SBP2 및 터미네이터 서열이 순차적으로 연결된 유전자인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 필요에 따라 변형이 가능하다.
상기 타겟 항체는 세포질 침투성 경쇄 가변 영역을 포함하는 RT11-3 scFv(single chain varible fragment) 항체인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 리포터 세포는 GFP1 -10를 발현하는 세포인 것이 특징이고, 상기 리포터 세포의 세포질에서 발현하는 GFP1 -10는 침투한 항체에 연결된 GFP11과 결합하여 GFP 형광을 발색하는 것이 특징이다. 또한, 상기 리포터 세포는 HeLa 세포인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 융합 파트너는 하류 유전자의 발현 및 발현된 항체의 가용성과 활성을 증대시킬 수 있는 서열이면 무방하게 사용될 수 있으며, 바람직하게는 유비퀴틴 또는 염기서열이 변이된 유비퀴틴 서열이지만, 이에 한정하지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[재료 및 방법]
1. 재료
HeLa 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하여, 10%의 소태아 혈청(GE Healthcare, Logan, UT, USA)과 1%의 항생제-항균제(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 보충한 DMEM(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다.
ATP, GTP, UTP, CTP, 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 키나아제는 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)로부터 구입하였다.
L-[U-14C] 류신은 퍼킨엘머사(Waltham, MA, USA)로부터 구입하였다. 다른 모든 화학 시약은 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 더 이상의 정제 없이 사용하였다.
S12 추출물은 종래에 알려진 방법에 따라 플라스미드 pTUM4을 포함하는 E. coli 균주 BL21Star(DE3)(Thermo Fisher Scientific)로부터 제조하였다.
2. 변형
RT11
-3
scFv
유전자의 제작
세포질에 내재되고 KRas·GTP에 결합하는 항체의 VL 및 VH 서열은 두 개 쇄(chain) 사이에 (G4S)3 링커가 있는 scFv 형식으로 조립하였다(RT11-3 scFv).
변이 RT11-3 scFvs의 3차원 구조에 대한 모델링은 ABodyBuilder 알고리즘(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabpred))을 사용하여 수행하였고, 항체의 3차원적 구조 이미지는 PyMol 프로그램(Schrodinger, Cambridge, MA, USA)을 이용하여 나타냈다.
RT11-3 scFv를 구성하는 RT11 VH 와 hT4-3 VL의 서열은 표 1에 개시하였다.
| 명칭 | 서열 | 서열번호 |
| RT11VH | 1 10 20 30 40 50 52a EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSYISRTSHTTY 60 70 8082a 90 100a 110 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFFMDYWGQGTLVTVSS |
1 |
| hT4-3VL | 1 10 20 30 40 50 DLVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYW 60 70 80 90 100 ASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYWYWMYTFGQGTKVEIKR |
2 |
| RT11-3scFv | 1 10 20 30 40 50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSYISRTSHTTY 60 70 80 90 100 110 YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFFMDYWGQGTLVTVSSGGG 120 130 140 150 160 170 GSGGGGSGGGGSDLVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPG 180 190 200 210 220 230 KAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYWYWMYTFGQ 240 GTKVEIKR |
3 |
표 2에 개시한 프라이머를 사용하여, RT11-3 scFv를 구성하는 아미노산 잔기 중에서 FR2, CDR1 및 CDR3에 위치하는 6종의 아미노산 잔기를 돌연변이시켰다.
| 프라이머 | 서열 (5' -> 3') | 변형위치 | 서열번호 |
| F1 | TCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG | 4 | |
| R1_Ori | TGCCGGGCTTCTGCTGATACCAGGCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | CDR1의 A 위치, FR2의 Y 위치 | 5 |
| R1_Mut1 | TGCCGGGCTTCTGCTGAAACCAGGCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | Y36F | 6 |
| R1_Mut2 | TGCCGGGCTTCTGCTGCCACCAGGCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | Y36F | 7 |
| R1_Mut3 | TGCCGGGCTTCTGCTGATACCAATCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | A34D | 8 |
| R1_Mut4 | TGCCGGGCTTCTGCTGAAACCAATCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | A34D 및 Y36F | 9 |
| R1_Mut5 | TGCCGGGCTTCTGCTGCCACCAATCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | A34D 및 Y36W | 10 |
| R1_Mut6 | TGCCGGGCTTCTGCTGATACCATTCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | A34E | 11 |
| R1_Mut7 | TGCCGGGCTTCTGCTGAAACCATTCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | A34E 및 Y36F | 12 |
| R1_Mut8 | TGCCGGGCTTCTGCTGCCACCATTCCAGGTAGTTCTTGCGGGTGC | A34E 및 Y36W | 13 |
| F2_Ori | CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCAC | FR2의 L 위치 | 14 |
| F2_Mut1 | CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGATGCTGATCTACTGGGCCAGCAC | L46M | 15 |
| F2_Mut2 | CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGATTCTGATCTACTGGGCCAGCAC | L46I | 16 |
| F2_Mut3 | CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAACCTGATCTACTGGGCCAGCAC | L46N | 17 |
| F2_Mut4 | CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCAGCTGATCTACTGGGCCAGCAC | L46Q | 18 |
| F2_Mut5 | CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCGTCTGATCTACTGGGCCAGCAC | L46R | 19 |
| F2_Mut6 | CAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAAACTGATCTACTGGGCCAGCAC | L46K | 20 |
| R2 | GCAGAAGTAGGTGGCGAAGTCCTCGGGCTGCAGGCTGCTG | 21 | |
| F3-deg | GACTTCGCCACCTACTTCTGCVWBCAGWDKTGGTACTGGATGWDKACCTTCGGCCAGGGC | CDR3의 Q, Y 및 Y 위치: Q89X1 (X1=E,M,L,I or N), Y91X2 (X2=T, M, F, I or K), Y96X3 (X3=T, W, F, I or K) |
22 |
| R3 | CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTA | 23 |
상기 표 2에서 개시한 프라이머 서열을 이용한 PCR 기법으로 각각 돌연변이화 하였고, 중첩-확장 PCR(overlap-extension PCR)에 의해 조합하여 조합 변형 유전자의 라이브러리를 제조하였다.
이후 상기 PCR 라이브러리는 플라스미드 pK7(pK7-RT11-3Lib)에 클로닝하여 대장균 DH5α 균주를 형질전환하는데 사용하였다. 개별 변이체 RT11-3 유전자를 콜로니 PCR에 의해 증폭시키고, 무세포 단백질 합성에서 주형으로 사용하였다. 실험에 따라, 가용성 발현을 증진시키기 위해, 변형 RT11-3 scFv 유전자의 업스트림(upstream)에 유비퀴틴 서열을 삽입하였다.
3. 변형
RT11
-3
scFvs
의
무세포
단백질 합성
RT11-3 scFv의 무세포 단백질 합성을 위한 표준 반응 혼합물은 57mM의 HEPES-KOH(pH 8.2); 1.2mM의 ATP; GTP, UTP 및 CTP 각각 0.85mM; 80mM의 암모늄 아세테이트; 34㎍/㎖의 1-5-포르밀-5,6,7,8-테트라하이드로 폴산(폴린산); 20개의 아미노산 각각 1.0mM; 2%의 PEG(8,000); 3.2 U/㎖ 크레아틴 키나아제; 67mM의 크레아틴 포스페이트; 0.01mM L-[U-14C] 루신 (11.1GBq/mmol); 27%(v/v) S12 추출물; 및 50ng/㎖의 PCR 증폭 DNA 성분으로 구성하였다.
한편, N 말단 유비퀴틴 서열을 갖는 구조물의 발현 중에 유비퀴틴의 in situ절단을 위해, 표준 S12 추출물 대신에 UBP1이 풍부한 S12 추출물을 사용하여 반응 혼합물을 제조하였고, 무세포 단백질 합성 반응은 30℃에서 1시간 동안 수행하였다.
scFv의 정량은 Tri-Carb 2810TR 액체 섬광 계수기를 사용하여 TCA 불용성 방사능 수준을 측정함으로써 정량화하였다. 가용성 항체의 양은 원심 분리(13,000×g, 10분) 후 상등액에서 TCA 불용성 방사능의 수준을 측정하여 결정하였다. 무세포 단백질 합성된 scFv의 크기는 16%의 트리신 젤(tricine gel) 상의 전기영동 후, 쿠마쉬블루 염색 또는 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
4.
무세포
단백질 합성된
RT11
-3
scFv
의 정제
무세포 단백질 합성 반응 후, 반응 혼합물을 13,000×g에서 10분 동안 원심 분리하고 상등액 5㎖를 PBS로 평형화 시킨 후, Ni-NTA 슬러리 400㎕와 혼합하였다. 2㎖의 세척 완충용액(50mM의 NaH2PO4, 300mM의 NaCl 및 10mM의 이미다졸)으로 3회 세척한 후, 수지가 결합된 scFv를 250㎕의 용출 완충용액(50mM의 NaH2PO4, 300mM의 NaCl 및 100mM의 이미다졸)으로 2번 용출하였다. 용출된 용액을 10,000 분자량의 차단막이 장착된 원심 한외 여과 장치(Merck Millipore, Burlington, MA, USA)를 사용하여 탈염시키고 농축시켰다. 용리액 500㎕를 넣은 후 14,000×g에서 10 분 동안 원심 분리하였다. 농축된 단백질(50㎕)을 PBS 450㎕로 희석하고 다시 원심 분리하였다. 이 과정을 5번 반복하였다. 최종 원심 분리 단계 후에, 탈염되고, 농축된 scFv를 회수하고 PBS로 원하는 농도로 희석시켰다.
5.
무세포
단백질 합성된
scFv
의 세포질 침투 효율 분석
RT11-3 scFv의 세포질 침투 효율은 split-GFP 보정(complementation) 어세이 에 의해 평가되었다. 스트렙트아비딘 및 GFP1 -10 단편 [HeLa (SA-GFP1 -10)]의 융합 구조를 발현하는 HeLa 세포주를 사용하여 무세포 단백질 합성된 RT11-3 scFv 변이체의 세포질-침투 효율을 측정하였다.
RT11-3 scFv 항체는 GFP11 단편에 연결된 스트렙트아비딘-결합 펩티드(streptavidin-binding peptide 2: SBP2) 서열을 포함하므로, 항체가 세포질로 전달되었을 때, 스트렙트아비딘과 SBP2 사이의 상호 작용을 통해, 쪼개진 GFP1 -10 및 GFP11 단편이 융합하여 GFP 형광을 나타내는 것으로부터 RT11-3 scFv 항체의 세포질 침투를 확인하였다.
HeLa-SA-GFP1 -10 세포를 100㎕의 DMEM에 웰당 1×104개의 세포 밀도로 96웰 플레이트에 접종하고, 37℃에서 12시간 동안 5%(v/v) CO2 조건에서 배양하였다. PBS로 세척한 후, 리포터 세포를 무세포 단백질 합성 RT11-3 scFv 50㎕로 12시간 동안 처리하였다. 그 후, 리포터 세포를 PBS로 2회 세척하고, 100㎕의 PBS에서 재 현탁시킨 후, GFP 형광(여기 파장: 485nm /발광파장: 528nm)을 측정하였다. RT11-3 scFv의 세포질 전달 여부는 리포터 세포의 공초점 현미경 이미지 분석을 통해 확인하였다.
6. 세포 형태학 및 생존력 분석
무세포 단백질 합성을 위한 반응 혼합물이 리포터 세포의 형태 및 생존력에 영향을 주는지를 결정하기 위해, 유세포 분석(FACS Canto, BD Biosciences, East Rutherford, NJ, USA)을 수행하였다.
3×105개의 리포터 세포를 다양한 비율로 희석된 1.2㎖의 반응 혼합물로 12시간 동안 처리한 후, 유세포 분석법으로 분석하였다. 세포의 형태학은 전방 산란 및 측면 산란광에 기초하여 결정되었다.
7.
RT11
-3
scFv
의
IgG
로의 전환
완전 IgG 형태의 단일클론항체 형태로 생산하기 위한 중쇄 발현벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 항체의 중쇄 가변영역(RT11 VH: 서열번호 X)과 중쇄불변영역(CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다. 또한, 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 세포질 침투 경쇄 가변영역(hT4-3, #1-60, #5-10, #6-32, #6-91)과 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
상기 경쇄, 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) (Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 200㎖ 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2×106 세포/㎖의 밀도로 배지 100㎖에 파종하여, 150rpm, 8% CO2 조건에서 배양하였다. 각각의 단일클론항체 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10㎖의 FreeStyle 293 발현 배지에 중쇄 125㎍, 경쇄 125㎍ 총 250㎍ (2.5㎍/㎖)으로 희석하여, PEI 750㎍(7.5㎍/㎖)을 희석한 10㎖의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100㎖로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150rpm, 8% CO2 조건에서 배양 후, 나머지 100㎖의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일 동안 배양하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼(Protein A Sepharose column)(GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1M 글라이신 완충용액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충용액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 7.4)로 완충용액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 280nm에서의 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
8. 변이
RT11
-3
IgG 의
비특이적
결합능
확인을 위한 세포기반
효소 결합 면역 흡착(ELISA) 분석
경쇄가변영역 서열의 조작에 따른 항체의 비특이적 결합능 변화를 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 96웰 플레이트에 웰 바닥 전체에 세포가 꽉 채워지도록 HeLa(HSPG+), pgsD-677(HSPG-) 세포주를 배양한 후, 세척 버퍼(HBSS buffer, 50MM HEPES)로 3회 세척하였다. 그 후, 블로킹 버퍼 (HBSS buffer, 50MM HEPES, 1% BSA)에 PBS, RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32, #6-91, 세툭시맙(cetuximab)을 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125ng/㎖ 농도로 희석하여 4℃에서 2시간 동안 배양했다. 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 표지항체로 HRP가 접합된 항-인간 항체(HRP-conjugated anti-human mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA 용액으로 반응시켜 450nm에서 흡광도를 정량하였다.
9. 변이
RT11
-3
IgG
항체의 세포질
침투능
분석
세포질 침투 항체의 세포질 침투능을 분석하는 3가지 어세이를 실시하였다.
(1)
트립판
블루
어세이
24웰 플레이트에, 커버슬립을 넣고 부유세포인 Ramos를 플레이트에 부착시키기 위해, 200㎕의 0.01% 폴리-L-리신 용액을 넣고 25℃ 조건에서 20분 동안 반응시켰다. PBS로 세척 후, 각 웰 당 5×104개의 Ramos 세포를 10% FBS가 포함된 0.5㎖의 배지를 넣어 37℃ 조건에서 30분 동안 배양시켰다. 세포 부착을 확인하고 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼(HBSS(Welgene), 50mM MES pH 5.5) 200㎕에, 0.5μM 및 1μM의 RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32 및 #6-91을 첨가하여 37℃ 조건에서 2시간 동안 배양시켰다. 이후 PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190㎕에, 트립판 블루(trypan blue) 10㎕을 섞어 각 웰 당 200㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다.
(2)
칼세인
어세이
24웰 플레이트에 커버슬립을 넣고 각 웰 당 2.5×104개의 HeLa 세포를 10% FBS가 포함된 배지 0.5㎖로 넣어 12시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포 부착을 확인한 후, RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32, #6-91 0.1, 0.25, 0.5μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, 항체가 담겨 있는 웰에 150μM의 칼세인을 처리하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 약산성용액(200mM의 글리신(glycine), 150mM의 NaCl pH 2.5)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거했다. PBS 세척 후, 4% 파라포름알데히드 첨가 후 25 ℃ 조건으로 10분 동안 세포를 고정했다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색 형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
(3) split-
GFP
보정(complementation)
어세이
24웰 플레이트에 커버슬립을 넣고 각 웰 당 2.5×104개의 HeLa 세포를 10% FBS가 포함된 배지 0.5㎖를 넣어 12시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포 부착을 확인한 후, 200㎕의 RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32 및 #6-91 IgG를 처리하고 6시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 리포터 세포를 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색 형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
10. 변이
RT11
-3
IgG
의 항원에 대한
효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)
경쇄가변영역의 변화에 따른 중쇄가변영역의 기능 변화를 확인하기 위하여 실험을 진행하였다. 항원 표적능이 없는 TMab4 VH와 세포질 침투 경쇄가변영역을 포함하는 세포질 침투 항체인 TMab4-3을 대조군으로 사용하였으며, 세포질 침투능이 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체 RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32 및 #6-91을 96웰 EIA/RIA 플레이트의 각각 5㎍/㎖의 농도로 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후, 0.1% TBST (12mM Tris, pH 7.4, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.1% Tween20, 5mM MgCl2)로 10분 동안 3회 세척하였다. 이후 4% TBSB (12mM Tris, pH7.4, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4% BSA, 10mM MgCl2)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% TBST로 10분 동안 3회 세척하였다. GppNHp가 결합된 KRas 단백질은 100nM 및 10nM의 농도로, GDP가 결합된 KRas 단백질은 100nM 농도로 4% TBSB로 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후, 0.1% TBST로 10분 동안 3회 세척하였다. 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시켰다. TMB ELISA 용액으로 반응시켜 450nm에서 흡광도를 정량하였다.
11.
변이
RT11
-3
IgG
의
종양 세포 성장
억제능
평가
항-Ras·GTP 세포질 침투항체의 세포질 침투능 향상에 따른 종양 세포 성장 억제능 변화를 분석하였다. 초저부착 (low-attchatment) 96웰 플레이트에 웰 당 1×103 개의 인간 대장암 세포주 SW480과 Colo320DM을 각각 1% FBS가 포함된 50㎕ 배지에 희석하고 12-18시간 후, spheroid 형성을 확인하였다. 이후 1% FBS가 포함된 배지 50㎕에, 0.5 및 2μM의 항체와 함께, 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 항체를 2회 추가 처리하여 48 시간씩 배양하였다. 마지막으로 총 144 시간 배양 후, CellTiterGlo (Promega) 50㎕를 넣고 발광을 정량하였다.
실시예
1.
무세포
단백질 합성된
RT11
-3
scFv
의 세포질 침투
RT11-3 scFv를 표현하는 플랫폼으로 대장균 추출물에서 유래한 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하였다. 상기 RT11-3 scFv는 표준 반응 혼합물을 사용한 초기 실험에서 6.4μM(221㎍/㎖)의 농도로 생산되었으며, 합성 단백질의 약 25%가 가용성 분획에 포함되었다. 5㎖ 반응에서 합성된 RT11-3 scFv를 Ni-NTA 아가 로스 수지를 이용하여 정제하였다. 상기 [재료 및 방법]에 개시한 바, 탈염 및 농축 후, 약 1.8nmole(62㎍)의 정제 단백질을 0.3㎖의 인산 완충 식염수(PBS: 6.0μM)에서 획득하였다.
정제된 RT11-3 scFv 항체를 HeLa-SA-GFP1-10 리포터 세포가 함유된 배지에 처리한 후, 공초점 현미경 이미지 분석을 통해 확인하였다. 배지에 첨가된 단백질의 양에 비례하여 증가하는 GFP 형광 세기로부터 무세포 단백질 합성된 RT11-3 scFv 항체의 세포질 침투를 확인하였다(도 1).
실시예
2. 세포질-침투
어세이
확립
세포질 침투 항체의 공학은 많은 유전자 구조의 발현과 스크리닝을 포함하며, 각 변이체가 기능 분석을 위해 정제되어야만 하는 경우 매우 어렵다. 따라서 무세포 단백질 합성된 RT11-3 scFv가 별도의 정제과정 없이 세포 기반 기능 분석에 직접 사용될 수 있는지 여부를 조사했다.
RT11-3 scFv의 무세포 단백질 합성 후, 400㎕의 반응 혼합물을 정제 없이 리포터 세포에 첨가하였다. 그 결과, 무세포 단백질 합성물이 첨가된 리포터 세포가 사멸하는 것으로 나타났는데, 12시간 동안 배양 한 후 세포가 죽고 분해되었다. 이후, 상기 세포 독성이 대장균 유래 S12 추출물의 성분에 의해 유발된 것으로 나타난다는 것을 확인하였다. 리포터 세포는 무세포 단백질 합성 시 첨가되는 대장균 유래 S12 추출물 이외의 나머지 주요 반응물(염 용액, PEG, 크레아틴 포스페이트 및 아미노산)과 별도로 배양되었을 때 거의 영향을 받지 않았다(도 2).
또한, 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 희석함으로써, 상기 나타난 세포 독성이 완화되는지 확인하기 위하여, 무세포 단백질 합성 반응 혼합물을 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 농도별로 희석하여 리포터 세포의 세포생존력을 분석하였다.
공초점 현미경 이미지 분석 결과, 반응 혼합물이 4배 이상 희석되었을 때 리포터 세포는 현저하게 영향을 받지 않았고(도 3A), 마찬가지로 유세포 분석 결과에서도 살아있는 세포의 비율이 12시간 동안 4배 이상 희석된 반응 혼합물과 함께 항온 배양하여도 영향을 받지않고, 세포가 생존하고 있다는 것을 확인하였다(도 3B).
최근 융합 단백질의 번역을 야생형 유비퀴틴 서열보다 훨씬 더 효과적으로 자극하는 유비퀴틴(이하 'UCE1'이라 함) 염기 서열을 개발하였고, UCE1 서열과의 융합은 야생형 서열과 비교하여 다양한 단백질에서의 발현을 약 2배까지 향상시킬 수 있다. 본 발명의 RT11-3을 암호화하는 유전자에 융합되었을 때는, UCE1이 융합된 RT11-3 scFv의 무세포 단백질 합성 결과, 약 2.8μM의 가용성 RT11-3 scFv를 생산하였다(도 4A).
또한 UBP1(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1)이 존재하는 S12 추출물을 사용하여 야생형 RT11-3 scFv 서열을 갖는 항체를 생산하였으며, S12 추출물에 함유된 UBP1이 무세포 단백질 합성 반응 동안 UCE1 태그를 원위치에서 절단하였다. 웨스턴 블랏 분석은 UBP1이 풍부한 추출물에서 무세포 단백질 합성하여, 유비퀴틴 서열을 제거한 RT11-3 scFv의 용해성 단백질의 농도가 유지되는 것을 확인하였다(도 4B).
실시예
3.
RT11
-3 변형의 발현 및 세포질
침투성
평가
변이주 RT11-3 유전자를 도 5에 개시된 과정을 통해 변이 시키고, 변이된 유전자 라이브러리를 pK7 플라스미드에 클로닝 하였다(pK7RT11-3).
pK7RT11-3Lib로 형질 전환된 대장균 950개의 콜로니로부터 개별 변이 유전자를 PCR 증폭하고, 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 96웰 마이크로 타이터 플레이트에서 무세포 단백질 합성을 위한 반응 혼합물로 발현시켰다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 15㎕의 각 반응 혼합물을 DMEM에서 4배 희석시키고, 50㎕를 흡인된 리포터 세포에 옮겼다. 도 6에 개시한 바와 같이 세포 내 GFP 시그널을 리포터 세포에서 분석했을 때, 돌연변이 클론은 GFP 형광의 강도가 다양하게 나타났으며, 일부 변종 클론은 부모 유전자보다 현저하게 강한 GFP 형광을 나타냈다. 이 중에서 우리는 부모 RT11-3에 비해 가장 강한 형광을 나타내는 네 개의 클론(#1-60, #5-10, #6-32 및 #6-91)을 선별하였고, 이들 변이체의 염기 서열((#1-60(서열번호 24), #5-10(서열번호 25), #6-32(서열번호 26), #6-91(서열번호 27))) 및 아미노산 서열(#1-60(서열번호 28), #5-10(서열번호 29), #6-32(서열번호 30), #6-91(서열번호 31))을 분석하였다(도 7). 상기 분석에서 세포질 침투 항체의 양은 엔도솜 탈출의 효율뿐만 아니라 그것의 발현 수준에 영향을 받을 수 있다. 따라서 우리는 정제 후 선택된 변이 scFv와 동일한 농도(1.5μM)의 리포터 세포를 처리하였다. 공초점 현미경에 의한 리포터 세포에서 GFP 형광의 강도의 측정은 GFP 형광이 #6-32의 항체가 가장 강하게 나타났고, #6-91, #1-60 및 #5-10의 항체 순으로 GFP 형광 세기를 확인할 수 있었다(도 8).
실시예
4. 선별한
엔도솜
탈출능이
향상된
경쇄가변영역(VL)을
포함하는 완전
IgG
형태의 세포질 침투 항체 변이
RT11
-3
발현 및 정제
상기 실시예 1~3에서 세포질 침투 항체를 scFv 형태로 구축하여, 엔도좀 탈출능이 향상된 경쇄가변영역을 선별하였다. 선별한 엔도좀 탈출능 향상 경쇄가변영역를 완전 IgG 형태의 단일클론항체로 동물세포에서 발현 및 정제하여 엔도좀 탈출능 향상을 확인하고자 하였다.
구체적으로는, 완전 IgG 형태의 단일클론항체 형태로 생산하기 위한 중쇄 발현벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 항체의 중쇄 가변영역(RT11 VH: 서열번호 1)과 중쇄불변영역 (CH1-hinge-CH2-CH3)를 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4(Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다. 또한, 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 5' 말단에 분비 시그널 펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 세포질 침투 경쇄 가변영역(hT4-3, #1-60, #5-10, #6-32, #6-91)과 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA를 각각 pcDNA3.4 (Invitrogen) 벡터에 NotI/HindIII로 클로닝하였다.
상기 경쇄, 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션 (transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen)에서 부유 성장하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine, PEI)(Polyscience)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크 (Corning)에 200㎖ 트랜스펙션 시, HEK293-F 세포를 2×106 세포/㎖의 밀도로 배지 100㎖에 파종하여, 150rpm, 8% CO2에서 배양하였다. 각각의 단일클론항체 생산하기 위해 알맞은 중쇄와 경쇄 플라스미드를 10㎖ FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen)에 중쇄 125μg, 경쇄 125μg 총 250μg (2.5㎍/㎖)으로 희석하여, PEI 750㎍ (7.5㎍/㎖)을 희석한 10㎖의 배지와 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 100㎖로 파종한 세포에 넣어 4시간 동안 150rpm, 8% CO2에서 배양 후, 나머지 100 ㎖의 FreeStyle 293 발현 배지를 추가하여 6일 동안 배양하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1M 글라이신 완충용액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충용액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 7.4)로 완충용액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 단백질은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
실시예
5. 선별한
엔도좀
탈출능
향상된
경쇄가변영역(VL)을
포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 비특이적 결합 확인
상기 실시예 4에서 구축한, 선별한 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의 비특이적 결합이 기존 hT4-3 경쇄를 사용하고 있는 항 Ras·GTP 세포질 침투 항체 (RT11-3)와 비교하기 위하여 세포기반 ELISA를 이용하여 관찰하였다.
구체적으로는, 96 웰 플레이트에 웰 바닥 전체에 세포가 꽉 채워지도록 HeLa (HSPG+), pgsD-677(HSGP-) 세포주를 배양한 후, 세척 버퍼 (HBSS buffer, 50mM HEPES)로 3회 세척하였다. 그 후, 블로킹 버퍼 (HBSS buffer, 50mM HEPES, 1% BSA) 에 PBS, RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32, #6-91, cetuximab을 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125ng/㎖의 농도로 희석하여 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 표지항체로 HRP가 접합된 항-인간 항체(HRP-conjugated anti-human mAb)로 결합시켰다. TMB ELISA 용액으로 반응시켜 450nm 흡광도를 정량하였다. 6-32 항체에서 가장 높은 비특이적 세포표면 결합능이 측정되었고, 다른 항체는 야생형인 RT11-3과 거의 유사한 정도의 비특이적 세포표면 결합능을 보임을 확인하였다(도 9)
실시예
6. 선별한
엔도좀
탈출능
향상된
경쇄가변영역(VL)을
포함하는 완전 IgG 형태의 세포질 침투 항체의
엔도좀
탈출능
평가
상기 실시예 5에서 scFv 형태로 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 선별하였고, 이 경쇄가변영역이 포함된 완전 IgG 형태의 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 항체의 엔도좀 탈출능 향상을 확인하고자 하였다.
(1)
트립판
블루
어세이
24웰 플레이트에, 커버슬립을 넣고 부유세포인 Ramos를 플레이트에 부착시키기 위해 0.01% poly-L-lysine 용액을 200㎕ 넣고, 25℃ 조건에서 20분 동안 반응시켰다. PBS로 세척 후, 각 웰 당 5×104개의 Ramos 세포를 10% FBS가 포함된 배지 0.5㎖로 넣어 37℃ 조건에서 30분 동안 배양시켰다. 세포 부착을 확인하고 세포질 pH인 pH 7.4 버퍼(HBSS(Welgene), 50mM HEPES pH 7.4), 초기 엔도좀 pH인 pH 5.5 버퍼 (HBSS(Welgene), 50mM MES pH 5.5) 200㎕에 RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32, #6-91 0.5 μM 과 1 μM 넣어 37℃ 조건에서 2시간 배양시켰다. PBS로 조심스럽게 세척 후, PBS 190㎕에 트립판 블루(trypan blue) 10㎕을 섞어 각 웰 당 200㎕씩 분주하여 현미경으로 관찰하였다. #6-91 항체를 제외한 #1-60, #5-10, #6-32 항체는 RT11-3에 비교하여 향상된 트립판 블루 획득을 보임을 확인하였다(도 10(A)).
(2)
칼세인
형광
어세이
24웰 플레이트에 커버슬립을 넣고 각 웰 당 2.5×104개의 HeLa 세포를 10 % FBS가 포함된 배지 0.5 ㎖로 넣어 12시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포 부착을 확인한 후, RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32, #6-91 0.1, 0.25 및 0.5μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 4시간이 지난 후, 항체가 담겨 있는 웰에 칼세인 150μM을 처리하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 약산성용액(200mM glycine, 150mM NaCl pH 2.5)으로 세포 표면에 붙은 단백질들을 제거했다. PBS 세척 후, 4 % 파라포름알데히드 첨가 후 25 도 조건으로 10분간 세포를 고정했다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색(청색형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. #1-60, #5-10, #6-32 항체를 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 RT11-3를 처리한 세포보다 뚜렷히 관찰되었다. 반면, #6-91 항체를 처리한 세포에서는 세포질에 퍼져있는 녹색 칼세인 형광이 RT11-3과 유사하게 관찰되었다(도 10(B)).
따라서, scFv 형태로 선별한 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 완전 IgG 형태의 엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 항체로 새롭게 구축 및 발현 정제하여도 야생형과 비교하여 엔도좀 탈출능이 향상됨을 확인하였다.
실시예
7. 개선된 분할 녹색 형광 단백질의 상보적인 결합을 통한 세포질 침투 단일클론항체의 세포질 위치 확인
엔도좀 탈출능 향상 세포질 침투 항체의 세포질 위치 향상을 확인하기 위해 개선된 분할 녹색 형광 단백질 상보 시스템(한국등록특허 제1790669호)을 이용하였다. 이를 위해, RT11의 중쇄 C-말단에 GFP11-SBP2 peptide가 융합된 RT11-3-GFP11-SBP2, #1-60-GFP11-SBP2, #5-10-GFP11-SBP2, #6-32-GFP11-SBP2, 및 #6-91-GFP11-SBP2를 구축하였다.
구체적으로, 실시예 2와 동일하게 SA-GFP1-10을 안정적으로 발현하는 형질전환된 HeLa 세포주를 준비하여 세포가 안정화되면, RT11-3-GFP11-SBP2, #1-60-GFP11-SBP2, #5-10-GFP11-SBP2, #6-32-GFP11-SBP2, #6-91-GFP11-SBP2 0.2, 0.4, 0.8μM을 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 이후 PBS와 약산성 용액으로 세척 후, 세포를 고정하였다. Hoechst 33342를 이용하여 핵을 염색 (청색 형광)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. #1-60, #5-10, #6-32 항체를 처리한 세포에서는 RT11-3를 처리한 세포보다 향상된 GFP 형광이 관찰되었다. 반면, #6-91 항체를 처리한 세포에서는 RT11-3과 유사한 GFP 형광이 관찰되었다. 따라서, 엔도좀 탈출하여 세포질에 위치하는 세포질 침투 항체의 양이 결과적으로 향상되었음을 확인하였다(도 10(C)).
실시예
8.
엔도좀
탈출능
향상된
경쇄가변영역을
포함하는 항-
Ras
·
GTP
세포질 침투 항체의 종양 세포 성장
억제능
평가
항원 표적능이 없는 TMab4 VH와 엔도좀 탈출 경쇄가변영역을 포함하는 세포질 침투 항체인 TMab4-3을 대조군으로 사용하였으며, 엔도좀 탈출능 향상된 경쇄가변영역을 포함하는 항-Ras·GTP 세포질 침투 항체 RT11-3, #1-60, #5-10, #6-32, #6-91을 96웰 EIA/RIA 플레이트의 각각 5㎍/㎖의 농도로 1시간동안 상온에서 결합시킨 후 0.1 % TBST (12mM Tris, pH 7.4, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.1 % Tween20, 5mM MgCl2) 로 10분동안 3회 세척한다. 이후 4% TBSB (12mM Tris, pH 7.4, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4 % BSA, 10mM MgCl2)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% TBST로 10분간 3회 세척한다. GppNHp가 결합된 KRas 단백질은 100nM, 10nM의 다양한 농도로, GDP가 결합된 KRas 단백질은 100nM 농도로 4% TBSB로 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후 0.1% TBST로 10분 동안 3회 세척했다. 표지항체로 HRP가 접합된 항-His 항체(HRP-conjugated anti-his mAb)로 결합시킨다. TMB ELISA 용액으로 반응시켜 450nm 흡광도를 정량하였다. #5-10 항체를 제외한 #1-60, #6-32, #6-91 항체는 RT11-3과 유사한 KRasG12D 결합 정도를 보이며, 경쇄가변영역의 변화에 따라 중쇄가변영역의 Ras 표적능은 영향을 거의 받지 않음을 확인하였다(도 11(A)).
또한, 초저부착(low-attchatment) 96웰 플레이트에 웰 당 1×103개의 상기 세포주들을 각각 1% FBS가 포함된 배지 50㎕에 희석하고 12-18시간 후, spheroid 형성을 확인하였다. 이후 1% FBS가 포함된 배지 50㎕에 0.5, 2μM 농도의 항체와 함께 37℃, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 항체를 2회 추가 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 마지막으로 총144시간 배양 후, CellTiterGlo (Promega) 50㎕ 넣고 발광을 정량하였다.
그 결과, 도 11(B)에서 나타난 바와 같이, 기존 RT11-3와 비교하였을 때, 엔도좀 탈출능이 향상되고 항원 표적능이 유지되는 #1-60, #6-32 항체는 Ras 돌연변이 세포주 특이적 세포 성장 억제 효과가 향상된 것을 확인하였다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC)
<120> Method for screening enhanced cytosol-penetrating antibody
<130> PN18418
<160> 31
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv VH
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Arg Thr Ser His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Phe Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (hT4-3 VL)
<400> 2
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 3
<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Arg Thr Ser His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Phe Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
130 135 140
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe
145 150 155 160
Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
210 215 220
Gln Gln Tyr Trp Tyr Trp Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F1)
<400> 4
tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta taggg 35
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Ori)
<400> 5
tgccgggctt ctgctgatac caggccaggt agttcttgcg ggtgc 45
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Mut1)
<400> 6
tgccgggctt ctgctgaaac caggccaggt agttcttgcg ggtgc 45
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Mut2)
<400> 7
tgccgggctt ctgctgccac caggccaggt agttcttgcg ggtgc 45
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Mut3)
<400> 8
tgccgggctt ctgctgatac caatccaggt agttcttgcg ggtgc 45
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Mut4)
<400> 9
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<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Mut6)
<400> 10
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<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Mut5)
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<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Mut7)
<400> 12
tgccgggctt ctgctgaaac cattccaggt agttcttgcg ggtgc 45
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R1_Mut8)
<400> 13
tgccgggctt ctgctgccac cattccaggt agttcttgcg ggtgc 45
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F2_Ori)
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<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F2_Mut1)
<400> 15
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagatg ctgatctact gggccagcac 50
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F2_Mut2)
<400> 16
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagatt ctgatctact gggccagcac 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F2_Mut3)
<400> 17
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagaac ctgatctact gggccagcac 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F2_Mut4)
<400> 18
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagcag ctgatctact gggccagcac 50
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F2_Mut5)
<400> 19
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagcgt ctgatctact gggccagcac 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F2_Mut6)
<400> 20
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagaaa ctgatctact gggccagcac 50
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R2)
<400> 21
gcagaagtag gtggcgaagt cctcgggctg caggctgctg 40
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (F3-deg)
<400> 22
gacttcgcca cctacttctg cvwbcagwdk tggtactgga tgwdkacctt cggccagggc 60
60
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (R3)
<400> 23
caaaaaaccc ctcaagaccc gttta 25
<210> 24
<211> 1227
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT11-3 scFv (1-60)
<400> 24
atgagtggcg ggcaaatatt tgtaaaaacc ctgaccggga agactattac cctggaggtg 60
gaatctagcg acacgattga caacgtcaaa agtaaaattc aggataaaga aggtataccg 120
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65 70 75 80
Glu Gly Arg Ser Ser Gly His His His His His His His Glu Val Gln
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Thr Gln Ser
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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355 360 365
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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165 170 175
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Phe Phe Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
195 200 205
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Thr Gln Ser
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385 390 395 400
Leu Glu His His Pro Gln Gly
405
Claims (6)
- (1) 무세포 단백질 합성법으로 야생형 세포질 침투성 타겟 항체를 합성하는 단계;
(2) 상기 단계(1)에서 합성된 타겟 항체를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액을 그대로 정제 없이 희석하여, 세포독성 및 세포질 침투성 확인 가능 농도를 결정하는 단계;
(3) 상기 단계 (1)의 타겟 항체의 경쇄 가변영역의 서열이 변이된, 변이형 세포질 침투성 항체를 생산할 수 있는 유전자 서열을 PCR 증폭시키는 단계;
(4) 상기 단계 (3)에서 획득한 PCR 증폭 산물을 합성 주형으로 하여, 무세포 단백질 합성으로 변이형 세포질 침투성 항체를 생산하는 단계;
(5) 상기 단계 (4)에서 생산된 변이형 세포질 침투성 항체를 포함하는 무세포 단백질 합성 반응액을 상기 단계 (2)에서 결정한 농도로, 리포터 세포에 처리하고, 세포의 침투성이 증진된 변이형 세포질 침투성 항체를 선별하는 단계; 및
(6) 상기 단계 (5)에서 선별된 세포의 침투성이 증진된 변이형 세포질 침투성 항체의 타겟 항원에 대한 친화성을 확인하는 단계;를 포함하는 침투성이 증진된 세포질 침투성 항체의 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서, 상기 단계 (4)에서, PCR 증폭 산물은 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 융합파트너, 6×His tag, 중쇄영역, 링커1, 경쇄영역, 링커2, GFP11, SBP2 및 터미네이터 서열이 순차적으로 연결된 유전자인 것을 특징으로 하는 세포질 침투성 항체의 스크리닝 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 타겟 항체는 세포질 침투성 경쇄 가변 영역을 포함하는 RT11-3 scFv(single chain varible fragment) 항체인 것을 특징으로 하는 세포질 침투성 항체의 스크리닝 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 리포터 세포는 GFP1 -10를 발현하는 세포인 것을 특징으로 하는 세포질 침투성 항체의 스크리닝 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 리포터 세포의 세포질에서 발현하는 GFP1 -10는 침투한 항체에 연결된 GFP11과 결합하여 GFP 형광을 발색하는 것을 특징으로 하는 세포질 침투성 항체의 스크리닝 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 리포터 세포는 HeLa 세포인 것을 특징으로 하는 세포질 침투성 항체의 스크리닝 방법.
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020190005297A KR102154177B1 (ko) | 2019-01-15 | 2019-01-15 | 세포질 침투성이 증진된 항체의 스크리닝 방법 |
Publications (2)
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| KR102154177B1 true KR102154177B1 (ko) | 2020-09-09 |
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Family Applications (1)
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| KR101667023B1 (ko) * | 2016-05-23 | 2016-10-17 | 충남대학교산학협력단 | 무세포 단백질 합성 방법을 이용하여 생산된 항체의 세포질 내로의 유입을 간편하게 분석하는 방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180129514A (ko) * | 2017-05-26 | 2018-12-05 | 오름테라퓨틱 주식회사 | 세포질 침투 항체 및 이의 용도 |
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2019
- 2019-01-15 KR KR1020190005297A patent/KR102154177B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101644906B1 (ko) | 2016-05-23 | 2016-08-02 | 충남대학교산학협력단 | 단일 용기 내에서 합성된 전사체 또는 단백질과 타겟 세포와의 상호작용을 분석하는 방법 |
| KR101667023B1 (ko) * | 2016-05-23 | 2016-10-17 | 충남대학교산학협력단 | 무세포 단백질 합성 방법을 이용하여 생산된 항체의 세포질 내로의 유입을 간편하게 분석하는 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200088683A (ko) | 2020-07-23 |
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