JPWO2015137441A1 - 抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクター - Google Patents
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Abstract
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
Description
本発明は、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターに関する。 本願は、２０１４年３月１４日に、日本に出願された特願２０１４−０５２５３５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットの一次配列決定の際にＮ末端にミリスチン酸が結合していることが発見されてから（非特許文献１参照。）、現在までに１００ 以上のミリストイル化タンパク質が報告され、全タンパク質の数パーセントがミリストイル化を受けているとゲノム配列から推定されている（非特許文献２参照。）。
ミリストイル化とは、タンパク質のＮ末端に炭素数１４個の飽和脂肪酸であるミリスチン酸が付加される翻訳後修飾の一種であり、この修飾はすべての真核生物に普遍的に存在するＮ−ミリストイル転移酵素（ＮＭＴ：Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、非特許文献３参照。）によって翻訳と同時に行われる。
ミリストイル化は、翻訳時にペプチド鎖がリボソームに結合した状態で、メチオニンアミノペプチダーゼによるＮ末端のメチオニンの除去により露出したグリシンのαアミノ基に、ＮＭＴがミリスチン酸をアミド結合で付加することで生じる（非特許文献４参照。）。ミリストイル化にはコンセンサス配列は存在しないが、Ｎ末端から１番目がグリシンであることは必須であり、２番目は電荷を持たないアミノ酸（但し、プロリン、芳香族アミンを除く）、５番目は電荷を持たないアミノ酸、特にセリンが存在する場合が多く、６番目はプロリン以外のアミノ酸である、という傾向がある（非特許文献５参照。）。
ミリストイル化は、翻訳時にペプチド鎖がリボソームに結合した状態で、メチオニンアミノペプチダーゼによるＮ末端のメチオニンの除去により露出したグリシンのαアミノ基に、ＮＭＴがミリスチン酸をアミド結合で付加することで生じる（非特許文献４参照。）。ミリストイル化にはコンセンサス配列は存在しないが、Ｎ末端から１番目がグリシンであることは必須であり、２番目は電荷を持たないアミノ酸（但し、プロリン、芳香族アミンを除く）、５番目は電荷を持たないアミノ酸、特にセリンが存在する場合が多く、６番目はプロリン以外のアミノ酸である、という傾向がある（非特許文献５参照。）。
細胞内シグナル伝達系に関与するタンパク質に多く見られるミリストイル化は、タンパク質と細胞膜との可逆的な相互作用のために機能している。例えば、ＨＩＶ遺伝子産物であるＮｅｆや、癌遺伝子産物であるＳｒｃ ｋｉｎａｓｅはミリストイル化がタンパク質の機能発現に関与していることが報告されている（非特許文献６，７参照。）。また、Ｎ末端グリシンに変異をいれミリストイル化できないようにしたタンパク質では細胞膜に結合できず、その結果、がんの転移活性がなくなる場合もあることも示唆されている。
タンパク質−膜間、あるいはタンパク質−タンパク質間の特異的相互作用を介して、タンパク質の細胞内局在や活性の制御を行うことにより細胞内情報伝達に深く関与しているミリストイル化タンパク質の検出は、それぞれの細胞の動作メカニズムを理解するための重要な知見を与える（非特許文献８，９参照。）。
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しかしながら、未知のミリストイル化タンパク質の存在が推定されているものの、化学的に安定で反応性の低いミリストイル基を簡便に検出する方法はこれまで存在しなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供する。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供する。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、抗体と抗原の分子間相互作用だけで抗体をクローニングすることが出来る抗体ライブラリー技術を用いて、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供するものである。
（１）（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を有する重鎖可変ドメインを含む前記（１）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（１）又は（２）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（４）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を有する重鎖可変ドメインを含む前記（１）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（１）又は（２）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（４）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（５）（ａ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（ｂ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（６）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（５）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（７）配列番号１１に示されるアミノ酸配列と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、配列番号９に示されるアミノ酸配列と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（５）又は（６）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（８）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する前記（５）〜（７）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（５）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（７）配列番号１１に示されるアミノ酸配列と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、配列番号９に示されるアミノ酸配列と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（５）又は（６）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（８）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する前記（５）〜（７）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（９）（ａ３）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ３）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ３）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（ｂ３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ３）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ３）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１０）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（９）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１１）配列番号１８に示されるアミノ酸配列と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（９）又は（１０）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１２）配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する前記（９）〜（１１）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（９）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１１）配列番号１８に示されるアミノ酸配列と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（９）又は（１０）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１２）配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する前記（９）〜（１１）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１３）（ａ４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ４）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ４）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ４）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（１３）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１５）配列番号２８に示されるアミノ酸配列と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（１３）又は（１４）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１６）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する前記（１３）〜（１５）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（ｂ４）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ４）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ４）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する前記（１３）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１５）配列番号２８に示されるアミノ酸配列と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する前記（１３）又は（１４）に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１６）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する前記（１３）〜（１５）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１７）前記（１）〜（１６）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有することを特徴とするミリストイル化タンパク質検出キット。
（１８）前記（１）〜（１６）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
（１９）前記（１）〜（１６）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子。
（１８）前記（１）〜（１６）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
（１９）前記（１）〜（１６）のいずれか一つに記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子。
（２０）（ｇ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ１）配列番号２２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ１）配列番号２２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（ｈ１）配列番号２２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ１）配列番号２２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（２１）（ｇ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ２）配列番号２３に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ２）配列番号２３に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（ｈ２）配列番号２３に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ２）配列番号２３に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（２２）（ｇ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ３）配列番号２４に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ３）配列番号２４に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（ｈ３）配列番号２４に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ３）配列番号２４に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。
（２３）（ｇ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ４）配列番号３２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ４）配列番号３２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。（２４）前記（１９）〜（２３）のいずれか一つに記載の遺伝子を発現ベクターに挿入してなることを特徴とする組換えベクター。
（ｈ４）配列番号３２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ４）配列番号３２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。（２４）前記（１９）〜（２３）のいずれか一つに記載の遺伝子を発現ベクターに挿入してなることを特徴とする組換えベクター。
本発明によれば、相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することができる。
＜抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント＞
［第一実施形態］
本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント（以下、本実施形態の抗体ともいう。）は、
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、本実施形態の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
尚、本発明において、ＣＤＲはｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎを意味する。
［第一実施形態］
本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント（以下、本実施形態の抗体ともいう。）は、
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、本実施形態の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
尚、本発明において、ＣＤＲはｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎを意味する。
本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、ミリストイル化されたタンパク質のミリストイル基を特異的に認識するものである。従って、ミリストイル基特異的認識能を保持していれば、前記（ａ１）〜（ｆ１）の配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１ 〜５個が好ましく、１ 〜 ２個がより好ましい。
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１ 〜５個が好ましく、１ 〜 ２個がより好ましい。
更に、発現精製が容易であることから、本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原を認識するために必要な最小単位である重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単可変ドメインフラグメントであることが好ましい。即ち、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましい。
具体的には、本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することが好ましく、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
具体的には、本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することが好ましく、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有することがより好ましい。
本実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法としては、特に限定されず、通常用いられる動物免疫法やハイブリドーマによる抗体作製法を用いてもよい。
しかしながら、動物細胞の増殖速度が遅く時間がかかる、動物に有害（致死性）な抗原は使用出来ない、エピトープ（抗体の抗原結合部位）や結合力が限られた特定の抗体しか得られない、抗体遺伝子を得るのが困難、等の問題があることから、抗体と抗原の分子間相互作用のみで抗体遺伝子をクローニングできる、ファージ抗体ライブラリーを用いたモノクローナル抗体の作製方法を用いることが好ましい。
抗体ライブラリーは、１固体の動物、あるいは、複数の固体の動物から全ての抗体遺伝子をクローニングし、その全ての可変ドメインを組み換え体の形（ｓｃＦｖ抗体）でそれぞれひとつの繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３）の外郭タンパク質に融合して発現させることで、全ての抗体を漏れなく提示したファージのセットを作製する技術である（図１参照。）。図２に示すように、かかる抗体ライブラリーを用いてファージ上に提示された抗体のセットを用いてパニングを行うことによって、目的の抗ミリストイル化タンパク質抗体が選択される。パニングのサイクルを数回繰り返すことによって抗体ライブラリーの中から、抗原であるミリストイル基との親和性の高い抗ミリストイル化タンパク質抗体を取得することができる。
パニングでは、標的タンパク質（抗原）であるミリストイル化タンパク質をプレートに固定化し、ファージ抗体を反応させ、結合しなかったファージは洗浄し、結合したファージ抗体を溶出し大腸菌（例えば、ＤＨ１２Ｓ）に感染させて増殖させる、という操作を繰り返す。これにより、抗原分子に発現した抗体が結合するかしないかだけで抗体を選択することが可能である。
また、実施例において示すように、ミリストイル化タンパク質をビーズに固定化してもよい。（１）提示される抗原分子の絶対数の増加、（２）適切な抗原部位の露出の２つの観点から、ビーズを用いたビーズスクリーニングが好ましい。
しかしながら、動物細胞の増殖速度が遅く時間がかかる、動物に有害（致死性）な抗原は使用出来ない、エピトープ（抗体の抗原結合部位）や結合力が限られた特定の抗体しか得られない、抗体遺伝子を得るのが困難、等の問題があることから、抗体と抗原の分子間相互作用のみで抗体遺伝子をクローニングできる、ファージ抗体ライブラリーを用いたモノクローナル抗体の作製方法を用いることが好ましい。
抗体ライブラリーは、１固体の動物、あるいは、複数の固体の動物から全ての抗体遺伝子をクローニングし、その全ての可変ドメインを組み換え体の形（ｓｃＦｖ抗体）でそれぞれひとつの繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３）の外郭タンパク質に融合して発現させることで、全ての抗体を漏れなく提示したファージのセットを作製する技術である（図１参照。）。図２に示すように、かかる抗体ライブラリーを用いてファージ上に提示された抗体のセットを用いてパニングを行うことによって、目的の抗ミリストイル化タンパク質抗体が選択される。パニングのサイクルを数回繰り返すことによって抗体ライブラリーの中から、抗原であるミリストイル基との親和性の高い抗ミリストイル化タンパク質抗体を取得することができる。
パニングでは、標的タンパク質（抗原）であるミリストイル化タンパク質をプレートに固定化し、ファージ抗体を反応させ、結合しなかったファージは洗浄し、結合したファージ抗体を溶出し大腸菌（例えば、ＤＨ１２Ｓ）に感染させて増殖させる、という操作を繰り返す。これにより、抗原分子に発現した抗体が結合するかしないかだけで抗体を選択することが可能である。
また、実施例において示すように、ミリストイル化タンパク質をビーズに固定化してもよい。（１）提示される抗原分子の絶対数の増加、（２）適切な抗原部位の露出の２つの観点から、ビーズを用いたビーズスクリーニングが好ましい。
抗体ライブラリーとしては、非免疫ライブラリー、免疫ライブラリー、合成ライブラリー等が挙げられる。非免疫ライブラリー及び免疫ライブラリーは、由来となる動物が体内で作製した抗体遺伝子を全てクローニングすることで作製する。このとき、非免疫ライブラリーでは免疫していない動物を、免疫ライブラリーでは目的の抗原で免疫した動物を使用する。前者ではどのような抗原も使用可能で、エピトープや結合力が異なる様々な抗体が得られる。後者では特異性が高く結合力が強い抗体が得られることが多い。合成ライブラリーは抗体の可変領域の中でも特に多様性を持つＣＤＲ領域の遺伝子をランダムなアミノ酸で置換をしたライブラリーである。この場合は多様性が得られるが、実際の生体内では機能する抗体だけが生み出されるのとは異なり、そこには不具合のある抗体が多数含まれている可能性があることが問題となる。
本実施形態においては、非免疫ライブラリー、免疫ライブラリーを用いることが好ましく、免疫ライブラリーを用いることがより好ましい。
本実施形態においては、非免疫ライブラリー、免疫ライブラリーを用いることが好ましく、免疫ライブラリーを用いることがより好ましい。
抗体ライブラリーは必ずしも免疫が必要ではなく、動物がもつ全ての抗体が候補となることから、毒物や本発明の抗体のような本来は生体内に大量に存在して免疫反応を惹起することが難しい分子に対する抗体も取得することが可能である。
また生体内では抗原による刺激が繰り返されることでより親和性の高い抗体を産出していくアフィニティーマチュレーション（抗体親和性成熟）がなされているが、遺伝子に変異を入れることやパニングを繰り返すことでこの現象をｉｎ ｖｉｔｒｏ で再現できる。
また抗体分子とともに抗体の遺伝子も得ることができるため、継続的な抗体の生産が可能となることや、抗体分子の改変も出来ることもメリットのひとつである。
また生体内では抗原による刺激が繰り返されることでより親和性の高い抗体を産出していくアフィニティーマチュレーション（抗体親和性成熟）がなされているが、遺伝子に変異を入れることやパニングを繰り返すことでこの現象をｉｎ ｖｉｔｒｏ で再現できる。
また抗体分子とともに抗体の遺伝子も得ることができるため、継続的な抗体の生産が可能となることや、抗体分子の改変も出来ることもメリットのひとつである。
ファージディスプレイ用の抗体発現ベクターとしては、例えば図３に示すベクターが挙げられる（藤田保健衛生大学、黒澤研究室より供与）。図３に示すベクターにおいて、抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）として、最初はファージ外膜の一部であるｃｐ３と融合した形で発現される。次に、抗体を介して抗原に結合したファージからこのベクターを回収し、ＳａｌＩ処理を行うことでｃｐ３遺伝子を除去すると、ｐｒｏｔｅｉｎＡ が融合したｓｃＦｖ抗体が得られる。そのため、得られたｓｃＦｖ抗体は、ｐｒｏｔｅｉｎＡ が結合するＩｇＧを固相化したカラムで簡便に精製され得る。
［第二実施形態］
本実施形態の抗体は、
（ａ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、本実施形態の抗体は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
本実施形態の抗体は、
（ａ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、本実施形態の抗体は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
本実施形態の抗体は、前記（ａ２）〜（ｆ２）の配列番号８〜１３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
更に、本実施形態の抗体は、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましく、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、配列番号９に示されるアミノ酸配列と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することがより好ましく、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
［第三実施形態］
本実施形態の抗体は、
（ａ３）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ３）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ３）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、本実施形態の抗体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
本実施形態の抗体は、
（ａ３）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ３）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ３）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、本実施形態の抗体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
本実施形態の抗体は、前記（ａ３）〜（ｆ３）の配列番号１５〜２０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
更に、本実施形態の抗体は、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましく、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することがより好ましく、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
［第四実施形態］
本実施形態の抗体は、
（ａ４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ４）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ４）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ４）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、本実施形態の抗体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
本実施形態の抗体は、
（ａ４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ４）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ４）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ４）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する。
更に、本実施形態の抗体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含むことが好ましい。
本実施形態の抗体は、前記（ａ４）〜（ｆ４）の配列番号２５〜３０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
更に、本実施形態の抗体は、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましく、配列番号２８に示されるアミノ酸配列と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することがより好ましく、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有することが特に好ましい。
＜遺伝子＞
本発明の遺伝子は、上述した本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなる。該遺伝子は、本発明の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含むものであれば、特に限定されず、重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含む遺伝子、及び、軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含む遺伝子の二つの遺伝子からなるものであってもよい。
ハンドリングしやすさの観点からは、上述したｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
本発明の遺伝子は、上述した本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなる。該遺伝子は、本発明の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含むものであれば、特に限定されず、重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含む遺伝子、及び、軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを含む遺伝子の二つの遺伝子からなるものであってもよい。
ハンドリングしやすさの観点からは、上述したｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
［第一実施形態］
本実施形態の遺伝子は、上述した第一実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ１）配列番号２２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ１）配列番号２２に示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本実施形態の遺伝子は、上述した第一実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ１）〜（ｊ１）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ１）配列番号２２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ１）配列番号２２に示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよい塩基の数としては、１ 〜３０個が好ましく、１ 〜１５個がより好ましく、１ 〜１０個が特に好ましく、１ 〜 ５個が最も好ましい。
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム,０．３Ｍ クエン酸溶液,ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％ホルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
［第二実施形態］
本実施形態の遺伝子は、上述した第二実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ２）〜（ｊ２）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ２）配列番号２３に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ２）配列番号２３に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本実施形態の遺伝子は、上述した第二実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ２）〜（ｊ２）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ２）配列番号２３に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ２）配列番号２３に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［第三実施形態］
本実施形態の遺伝子は、上述した第三実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ３）〜（ｊ３）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ３）配列番号２４に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ３）配列番号２４に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本実施形態の遺伝子は、上述した第三実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ３）〜（ｊ３）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ３）配列番号２４に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ３）配列番号２４に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［第四実施形態］
本実施形態の遺伝子は、上述した第四実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ４）〜（ｊ４）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ４）配列番号３２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ４）配列番号３２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本実施形態の遺伝子は、上述した第四実施形態の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなり、具体的には、以下の（ｇ４）〜（ｊ４）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡである。
（ｇ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ４）配列番号３２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ４）配列番号３２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜抗ミリストイル化タンパク質抗体組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、上述した本発明の遺伝子を発現ベクターに挿入してなるものであり、具体的には、発現ベクターに、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを、制限酵素部位を介して挿入してなるものである。
本発明の組換えベクターに挿入されるＤＮＡとしては、配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡが好ましい。
本発明の組換えベクターは、上述した本発明の遺伝子を発現ベクターに挿入してなるものであり、具体的には、発現ベクターに、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを、制限酵素部位を介して挿入してなるものである。
本発明の組換えベクターに挿入されるＤＮＡとしては、配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡが好ましい。
本発明に用いられる発現ベクターとしては、宿主細胞に抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる細胞系ベクター；適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系において抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる無細胞系ベクターが挙げられる。
細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
遺伝子が組込まれた組換えベクターの宿主への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
遺伝子が組込まれた組換えベクターの宿主への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いて、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントのＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡを合成する。係る転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質から抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを精製して用いることができる。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、精製抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの純度を高めることができる。
次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質から抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを精製して用いることができる。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、精製抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの純度を高めることができる。
＜ミリストイル化タンパク質検出キット＞
本発明のミリストイル化タンパク質検出キットは、上述した本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有するものであれば特に限定されない。
例えば、本発明のミリストイル化タンパク質検出キットとして、サンドイッチ法により比色定量するＥＬＩＳＡキットが挙げられる。具体的には、本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントでコートされた９６ウェルプレートと、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等の酵素で標識した２次抗体と、該酵素の色原性基質と、を含む。
本発明のミリストイル化タンパク質検出キットによれば、ウエスタンブロット等を行わなくとも簡便にかつ短時間で試料中のミリストイル化タンパク質の検出をすることができる。
本発明のミリストイル化タンパク質検出キットは、上述した本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有するものであれば特に限定されない。
例えば、本発明のミリストイル化タンパク質検出キットとして、サンドイッチ法により比色定量するＥＬＩＳＡキットが挙げられる。具体的には、本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントでコートされた９６ウェルプレートと、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等の酵素で標識した２次抗体と、該酵素の色原性基質と、を含む。
本発明のミリストイル化タンパク質検出キットによれば、ウエスタンブロット等を行わなくとも簡便にかつ短時間で試料中のミリストイル化タンパク質の検出をすることができる。
＜医薬＞
本発明の医薬は、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する。上述したように、タンパク質のミリストイル化は、癌遺伝子産物であるＳｒｃ ｋｉｎａｓｅ等細胞内シグナル伝達系に関与するタンパク質や、Ｎｅｆ等のＨＩＶ遺伝子産物において報告されている。本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントが中和抗体として機能する場合には、これを有効成分として含有する本発明の医薬は、種々の疾患に対する治療効果が期待される。
本発明の医薬の治療効果が期待される対象疾患としては、例えばヒトの固形がん等が挙げられる。ヒトの固形がんとしては、例えば、脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ−イング腫、軟部肉腫などが挙げられる。
また、アルツハイマー病やパーキンソン病といった神経変性疾患；糖尿病等も挙げられる。
本発明の医薬は、抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する。上述したように、タンパク質のミリストイル化は、癌遺伝子産物であるＳｒｃ ｋｉｎａｓｅ等細胞内シグナル伝達系に関与するタンパク質や、Ｎｅｆ等のＨＩＶ遺伝子産物において報告されている。本発明の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントが中和抗体として機能する場合には、これを有効成分として含有する本発明の医薬は、種々の疾患に対する治療効果が期待される。
本発明の医薬の治療効果が期待される対象疾患としては、例えばヒトの固形がん等が挙げられる。ヒトの固形がんとしては、例えば、脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ−イング腫、軟部肉腫などが挙げられる。
また、アルツハイマー病やパーキンソン病といった神経変性疾患；糖尿病等も挙げられる。
本発明の医薬における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明の医薬の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
また、本発明の一側面は、治療のための前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、治療剤を製造するための前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、治療方法を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、治療剤を製造するための前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、前記抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、治療方法を提供する。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（抗原作製）
［発現株の決定］
ＮＡＰ２２（ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｘｏｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２２ｋＤａ:脳に特異的に発現しているミリストイル化蛋白質）の発現には、ｐＥＴ１４ｂ ｖｅｃｔｏｒにラット由来ＮＡＰ２２遺伝子の挿入されたプラスミド(ｐＥＴ１４ｂ＿ＮＡＰ２２)を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。ｐＥＴ１４ｂ＿ＮＡＰ２２で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（以下「Ａｍｐ.」と記す。）を含むＬＢプレート（以下、ＬＢＡプレートと記す。）で３７℃、一晩培養した。
生育したコロニーのうち、５つをｐｉｃｋ ｕｐし、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐ.を含むＬＢ培地（以下、ＬＢＡ培地と記す。）５ｍＬで３７℃、一晩培養した。各前培養液から、１）プラスミド抽出、２）グリセロールストック作製、３）発現確認を行った。
［発現株の決定］
ＮＡＰ２２（ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｘｏｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２２ｋＤａ:脳に特異的に発現しているミリストイル化蛋白質）の発現には、ｐＥＴ１４ｂ ｖｅｃｔｏｒにラット由来ＮＡＰ２２遺伝子の挿入されたプラスミド(ｐＥＴ１４ｂ＿ＮＡＰ２２)を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。ｐＥＴ１４ｂ＿ＮＡＰ２２で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（以下「Ａｍｐ.」と記す。）を含むＬＢプレート（以下、ＬＢＡプレートと記す。）で３７℃、一晩培養した。
生育したコロニーのうち、５つをｐｉｃｋ ｕｐし、１００μｇ／ｍＬのＡｍｐ.を含むＬＢ培地（以下、ＬＢＡ培地と記す。）５ｍＬで３７℃、一晩培養した。各前培養液から、１）プラスミド抽出、２）グリセロールストック作製、３）発現確認を行った。
１）プラスミド抽出
Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、上述した前培養液２ｍＬ分のプラスミドを抽出した。、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い５つのコロニーすべてからプラスミドが抽出されていることを確認した。
Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、上述した前培養液２ｍＬ分のプラスミドを抽出した。、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い５つのコロニーすべてからプラスミドが抽出されていることを確認した。
２）グリセロールストック作製
あらかじめ１５分間のＵＶ照射により滅菌したグリセロールを終濃度１５％になるように各前培養液と混和し、２０μＬ×１０本で分注し−８０℃保存した。
あらかじめ１５分間のＵＶ照射により滅菌したグリセロールを終濃度１５％になるように各前培養液と混和し、２０μＬ×１０本で分注し−８０℃保存した。
３）発現確認
５つのクローンの各前培養液１００μＬをそれぞれＬＢＡ培地５ｍＬに加え、３０℃で培養した。Ｏ．Ｄ６００＝０．８４で、誘導前培養液１ｍＬを取り分けた後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ ｍＭとなるよう加えた。さらに８時間、３０℃で培養し、その後、誘導後菌体として１ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃で回収した。先に取り分けた誘導前培養液１ｍＬについても同様の方法で誘導前菌体を回収した。
回収した誘導前・後菌体それぞれを６０μＬｃｅｌｌ ｌｙｔｉｃ Ｂ（ＳＩＧＭＡ社）で懸濁し、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で培養上清を回収した。続いて、９５℃、１５ｍｉｎで上清を煮沸し、生じた沈殿を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により除去した。これを改めて誘導前・後サンプルとし、発現量を１２．５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
結果を図４に示す。図４より、最も多く発現しているｃｌｏｎｅ２をＮＡＰ２２の発現株とし、大量発現を行った。
５つのクローンの各前培養液１００μＬをそれぞれＬＢＡ培地５ｍＬに加え、３０℃で培養した。Ｏ．Ｄ６００＝０．８４で、誘導前培養液１ｍＬを取り分けた後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ ｍＭとなるよう加えた。さらに８時間、３０℃で培養し、その後、誘導後菌体として１ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃で回収した。先に取り分けた誘導前培養液１ｍＬについても同様の方法で誘導前菌体を回収した。
回収した誘導前・後菌体それぞれを６０μＬｃｅｌｌ ｌｙｔｉｃ Ｂ（ＳＩＧＭＡ社）で懸濁し、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で培養上清を回収した。続いて、９５℃、１５ｍｉｎで上清を煮沸し、生じた沈殿を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により除去した。これを改めて誘導前・後サンプルとし、発現量を１２．５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
結果を図４に示す。図４より、最も多く発現しているｃｌｏｎｅ２をＮＡＰ２２の発現株とし、大量発現を行った。
［ＮＡＰ２２の大量発現］
発現株となるクローンのグリセロールストック１０μＬをＬＢＡ培地３ｍＬに加えた。３７℃、一晩培養した後、この前培養液２ｍＬをＬＢＡ培地２００ｍＬに加え、３０℃で本培養を行った。４時間後、誘導前培養液２ｍＬを取り分けた後、終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧを加え、さらに８時間、３０℃で培養を続けた。その後、１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で菌体を回収し誘導後菌体とした。
発現株となるクローンのグリセロールストック１０μＬをＬＢＡ培地３ｍＬに加えた。３７℃、一晩培養した後、この前培養液２ｍＬをＬＢＡ培地２００ｍＬに加え、３０℃で本培養を行った。４時間後、誘導前培養液２ｍＬを取り分けた後、終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧを加え、さらに８時間、３０℃で培養を続けた。その後、１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で菌体を回収し誘導後菌体とした。
［ＮＡＰ２２の精製］
ＮＡＰ２２の精製には疎水性クロマトグラフィーを利用した。上記の手順に従い、２００ｍＬ ＬＢＡ培地でＮＡＰ２２を発現させ、１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で菌体を回収した。この培養液２００ｍＬ分の誘導後菌体を１２ｍＬのＴＥＧ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．５）で懸濁した。ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ２５０を用いてＤｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ : ５０％、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ: ｐｏｗｅｒ４、５ｍｉｎ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ→２．５ｍｉｎ ｉｎｔｅｒｖａｌを氷上にて３回繰り返すことで、菌体を破砕した。１２，０００ｒｐｍ、３０ ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収した。
続いて、終濃度２．５％で過塩素酸を添加し、氷上で１０ｍｉｎ ｉｎｃｕｂａｔｅした。１２，０００ｒｐｍ、３０ ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。この上清に８０％飽和硫酸アンモニウム溶液となるように、硫酸アンモニウムを加えた。４℃で一晩撹拌しながら硫安沈殿を行い、１０，０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎで遠心した。沈殿を回収し、４０％飽和の硫酸アンモニウムを加えた４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液で可溶化した。この可溶画分を精製前サンプルとし、ＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＦＰＬＣにかけた。
精製にはＨｉＰｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ(ｈｉｇｈ ｓｕｂ)１６／１０カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。あらかじめ４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液で平衡化した本カラムに５ｍＬの精製前サンプルをインジェクトし、４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液を流速１ｍＬ／ｍｉｎ、１０ｍｉｎ流し、洗浄した。Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒとして０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液を調製し、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、３０ ｍｉｎで硫酸アンモニウムの割合を４０％から０％へと段階的に減少させることで、タンパク質を溶出した。ＦＰＬＣ後、吸光度の値からタンパク質を含むと考えられるｆｒａｃｔｉｏｎに関して１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図５に示す。図５中、矢印で示したバンドがＮＡＰ２２を示す。シングルバンドが確認されたｆｒａｃｔｉｏｎ１１０〜１２０ の画分がタンパク溶液として使用可能であると考え、この区間の画分を精製ＮＡＰ２２として回収した。
精製が確認されたｆｒａｃｔｉｏｎを回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社)を用いて８，０００ｒｐｍ、４℃でＴｒｉｓ緩衝液からＰＢＳ緩衝液へのｂｕｆｆｅｒ置換と濃縮を行った。濃縮後、ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ(ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社)を用いて、ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質の濃度を定量した。
ＮＡＰ２２の精製には疎水性クロマトグラフィーを利用した。上記の手順に従い、２００ｍＬ ＬＢＡ培地でＮＡＰ２２を発現させ、１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で菌体を回収した。この培養液２００ｍＬ分の誘導後菌体を１２ｍＬのＴＥＧ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．５）で懸濁した。ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ２５０を用いてＤｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ : ５０％、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ: ｐｏｗｅｒ４、５ｍｉｎ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ→２．５ｍｉｎ ｉｎｔｅｒｖａｌを氷上にて３回繰り返すことで、菌体を破砕した。１２，０００ｒｐｍ、３０ ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収した。
続いて、終濃度２．５％で過塩素酸を添加し、氷上で１０ｍｉｎ ｉｎｃｕｂａｔｅした。１２，０００ｒｐｍ、３０ ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。この上清に８０％飽和硫酸アンモニウム溶液となるように、硫酸アンモニウムを加えた。４℃で一晩撹拌しながら硫安沈殿を行い、１０，０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎで遠心した。沈殿を回収し、４０％飽和の硫酸アンモニウムを加えた４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液で可溶化した。この可溶画分を精製前サンプルとし、ＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＦＰＬＣにかけた。
精製にはＨｉＰｒｅｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ(ｈｉｇｈ ｓｕｂ)１６／１０カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。あらかじめ４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液で平衡化した本カラムに５ｍＬの精製前サンプルをインジェクトし、４０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液を流速１ｍＬ／ｍｉｎ、１０ｍｉｎ流し、洗浄した。Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒとして０％飽和硫酸アンモニウムＴＥＧ溶液を調製し、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、３０ ｍｉｎで硫酸アンモニウムの割合を４０％から０％へと段階的に減少させることで、タンパク質を溶出した。ＦＰＬＣ後、吸光度の値からタンパク質を含むと考えられるｆｒａｃｔｉｏｎに関して１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
結果を図５に示す。図５中、矢印で示したバンドがＮＡＰ２２を示す。シングルバンドが確認されたｆｒａｃｔｉｏｎ１１０〜１２０ の画分がタンパク溶液として使用可能であると考え、この区間の画分を精製ＮＡＰ２２として回収した。
精製が確認されたｆｒａｃｔｉｏｎを回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社)を用いて８，０００ｒｐｍ、４℃でＴｒｉｓ緩衝液からＰＢＳ緩衝液へのｂｕｆｆｅｒ置換と濃縮を行った。濃縮後、ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ(ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社)を用いて、ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質の濃度を定量した。
［ｍｙｒＮＡＰ２２の作製］
ｍｙｒＮＡＰ２２はＮＡＰ２２とＮ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ(以下ＮＭＴと略す。)の共発現株を構築し、作製した。
上記３）発現確認により最も発現量の多いとされたＮＡＰ２２発現株にｙｅａｓｔ Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢＢ１３１ベクターを導入した。
ｍｙｒＮＡＰ２２はＮＡＰ２２とＮ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ(以下ＮＭＴと略す。)の共発現株を構築し、作製した。
上記３）発現確認により最も発現量の多いとされたＮＡＰ２２発現株にｙｅａｓｔ Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢＢ１３１ベクターを導入した。
上記３）発現確認により最も発現量の多いとされたＮＡＰ２２発現株をコンピテントセル化した。
ＮＡＰ２２発現株のグリセロールストックを起こし、ＬＢＡプレートで３７℃、一晩培養した。プレート上で生育した直径２〜３ｍｍのコロニーを一つｐｉｃｋ ｕｐし、５０ ｍＬのＳＯＢ培地（組成は表１参照。）で１８℃、２００ｒｐｍで培養した。４０時間後、Ｏ.Ｄ６００＝０．６０で培養を止め、氷上で１０ｍｉｎ冷やした。４℃、３，０００ ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心し、菌体を回収した。続いて、氷冷したＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ２０ｍＬで菌体を懸濁、ｏｎ ｉｃｅで１０ｍｉｎ ｉｎｃｕｂａｔｅした後、４℃、３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心し、上清を除去した。再び５ｍＬのｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにて菌体を懸濁し、終濃度７％のＤＭＳＯを加えた後、ｏｎ ｉｃｅにて１０ ｍｉｎ静置した。その後、１００ μＬずつに分注し、液体窒素にて瞬間冷凍させ、−８０℃で保存した。
尚、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは表２の組成をＫＯＨでｐＨ６．７〜６．８に調整し、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ５．４５ｇ添加し、ｍｉｌｌｉＱで５００ｍＬにメスアップし、フィルター滅菌して調製した。
ＮＡＰ２２発現株のグリセロールストックを起こし、ＬＢＡプレートで３７℃、一晩培養した。プレート上で生育した直径２〜３ｍｍのコロニーを一つｐｉｃｋ ｕｐし、５０ ｍＬのＳＯＢ培地（組成は表１参照。）で１８℃、２００ｒｐｍで培養した。４０時間後、Ｏ.Ｄ６００＝０．６０で培養を止め、氷上で１０ｍｉｎ冷やした。４℃、３，０００ ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心し、菌体を回収した。続いて、氷冷したＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ２０ｍＬで菌体を懸濁、ｏｎ ｉｃｅで１０ｍｉｎ ｉｎｃｕｂａｔｅした後、４℃、３，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心し、上清を除去した。再び５ｍＬのｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにて菌体を懸濁し、終濃度７％のＤＭＳＯを加えた後、ｏｎ ｉｃｅにて１０ ｍｉｎ静置した。その後、１００ μＬずつに分注し、液体窒素にて瞬間冷凍させ、−８０℃で保存した。
尚、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは表２の組成をＫＯＨでｐＨ６．７〜６．８に調整し、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ５．４５ｇ添加し、ｍｉｌｌｉＱで５００ｍＬにメスアップし、フィルター滅菌して調製した。
［発現株の構築］
このコンピテントセルにｙｅａｓｔ Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢＢ１３１ベクター（ｐＢＢ１３１＿ｙＮＭＴ）をヒートショック法にて導入した。
１μＬのｐＢＢ１３１＿ｙＮＭＴと２０μＬのＮＡＰ２２発現株コンピテントセルを混和した。３０ ｍｉｎ、ｏｎ ｉｃｅにて静置した後、４２℃、４５ ｓｅｃでインキュベートし、ただちに２ ｍｉｎ、ｏｎ ｉｃｅに静置した。４倍量のＬＢ培地を加えて混合し、３７℃、１時間で振盪培養した。培養後、５０μＬを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＡプレート（以下、「ＬＢＡＫプレート」と記す。）、残り５０μＬをＬＢＡプレートにまき、３７℃、一晩培養した。コントロールとして、形質転換していないＮＡＰ２２発現株コンピテントセル２０μＬを、ＬＢ培地８０μＬで希釈した後、ＬＢＡＫ 、ＬＢＡプレートに各５０μＬずつまき、同様に３７℃、一晩培養した。
生育したコロニーを５つｐｉｃｋ ｕｐし、５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢＡ培地（以下、「ＬＢＡＫ培地」と記す。）２ｍＬで３７℃、一晩培養した。各前培養液から、１）プラスミド抽出、２）グリセロールストック作製、３）発現確認を行った。
このコンピテントセルにｙｅａｓｔ Ｎ−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢＢ１３１ベクター（ｐＢＢ１３１＿ｙＮＭＴ）をヒートショック法にて導入した。
１μＬのｐＢＢ１３１＿ｙＮＭＴと２０μＬのＮＡＰ２２発現株コンピテントセルを混和した。３０ ｍｉｎ、ｏｎ ｉｃｅにて静置した後、４２℃、４５ ｓｅｃでインキュベートし、ただちに２ ｍｉｎ、ｏｎ ｉｃｅに静置した。４倍量のＬＢ培地を加えて混合し、３７℃、１時間で振盪培養した。培養後、５０μＬを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＡプレート（以下、「ＬＢＡＫプレート」と記す。）、残り５０μＬをＬＢＡプレートにまき、３７℃、一晩培養した。コントロールとして、形質転換していないＮＡＰ２２発現株コンピテントセル２０μＬを、ＬＢ培地８０μＬで希釈した後、ＬＢＡＫ 、ＬＢＡプレートに各５０μＬずつまき、同様に３７℃、一晩培養した。
生育したコロニーを５つｐｉｃｋ ｕｐし、５０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＬＢＡ培地（以下、「ＬＢＡＫ培地」と記す。）２ｍＬで３７℃、一晩培養した。各前培養液から、１）プラスミド抽出、２）グリセロールストック作製、３）発現確認を行った。
１）プラスミド抽出
前培養液１ｍＬを用い、上記と同様の方法で抽出、アガロース電気泳動を行い確認した。
前培養液１ｍＬを用い、上記と同様の方法で抽出、アガロース電気泳動を行い確認した。
２）グリセロールストック作製
各前培養液１４０μＬを用い、上記と同様の方法で行った。
各前培養液１４０μＬを用い、上記と同様の方法で行った。
３）発現確認
５つのクローンの各前培養液４００μＬをそれぞれＬＢＡＫ培地２０ｍＬに加え、３０℃で培養した。Ｏ.Ｄ６００＝０．８９で、誘導前培養液２ｍＬを取り分けた後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ ｍＭとなるように加えた。さらに８時間、３０℃で培養し、その後、誘導後菌体として１８ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で回収した。
回収した誘導後菌体を表３で示したＩｎｉｔｉａｌ ｂｕｆｆｅｒ１．２ｍＬで懸濁した後、懸濁液を６００μＬずつエッペンドルフチューブに分注した。ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ２５０を用いてＤｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ: ５０％、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ: ｐｏｗｅｒ３、３０ｍｉｎ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ→１ｍｉｎ ｉｎｔｅｒｖａｌを２回繰り返した。これを１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、培養上清を回収した。これを誘導後サンプルとした。
誘導前培養液２ｍＬからは１２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃の遠心処理により、誘導前菌体を回収した。２４０μＬ ｃｅｌｌ ｌｙｔｉｃ Ｂを加え、ピペッティングにより菌体を破砕した後、２，０００ｒｐｍ、５ ｍｉｎ、４℃で培養上清を回収し誘導前サンプルとした。
５つのクローンに関して、上記のサンプルを調製し、ｍｙｒＮＡＰの発現を１２．５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。結果を図６に示す。コントロールのバンドを基準にｍｙｒＮＡＰ２２と考えられるバンドは矢印で示したものである。誘導をかけたことによる発現量がもっとも高いと考えられるのはｃｌｏｎｅ２であった。このｃｌｏｎｅ２をｍｙｒＮＡＰ２２発現株の候補とした。
５つのクローンの各前培養液４００μＬをそれぞれＬＢＡＫ培地２０ｍＬに加え、３０℃で培養した。Ｏ.Ｄ６００＝０．８９で、誘導前培養液２ｍＬを取り分けた後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ ｍＭとなるように加えた。さらに８時間、３０℃で培養し、その後、誘導後菌体として１８ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で回収した。
回収した誘導後菌体を表３で示したＩｎｉｔｉａｌ ｂｕｆｆｅｒ１．２ｍＬで懸濁した後、懸濁液を６００μＬずつエッペンドルフチューブに分注した。ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ２５０を用いてＤｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ: ５０％、Ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏｌ: ｐｏｗｅｒ３、３０ｍｉｎ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ→１ｍｉｎ ｉｎｔｅｒｖａｌを２回繰り返した。これを１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、培養上清を回収した。これを誘導後サンプルとした。
誘導前培養液２ｍＬからは１２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃の遠心処理により、誘導前菌体を回収した。２４０μＬ ｃｅｌｌ ｌｙｔｉｃ Ｂを加え、ピペッティングにより菌体を破砕した後、２，０００ｒｐｍ、５ ｍｉｎ、４℃で培養上清を回収し誘導前サンプルとした。
５つのクローンに関して、上記のサンプルを調製し、ｍｙｒＮＡＰの発現を１２．５％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。結果を図６に示す。コントロールのバンドを基準にｍｙｒＮＡＰ２２と考えられるバンドは矢印で示したものである。誘導をかけたことによる発現量がもっとも高いと考えられるのはｃｌｏｎｅ２であった。このｃｌｏｎｅ２をｍｙｒＮＡＰ２２発現株の候補とした。
［ミリストイル化の確認］
この候補株で発現したタンパク質がミリストイル化されているかを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる質量分析で確認した。図７中、Ａは、ＮＡＰ２２の結果を示し、Ｂは、ｍｙｒＮＡＰ２２の結果を示す。ＮＡＰ２２で確認されたピークからの２１３．５Ｄａ（ミリストイル基の分子量に相当する）のずれを考慮すると、Ｂのピークはミリストイル化されたＮＡＰ２２と考えるのが妥当である。
この候補株で発現したタンパク質がミリストイル化されているかを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる質量分析で確認した。図７中、Ａは、ＮＡＰ２２の結果を示し、Ｂは、ｍｙｒＮＡＰ２２の結果を示す。ＮＡＰ２２で確認されたピークからの２１３．５Ｄａ（ミリストイル基の分子量に相当する）のずれを考慮すると、Ｂのピークはミリストイル化されたＮＡＰ２２と考えるのが妥当である。
［ｍｙｒＮＡＰ２２の大量発現］
上記でタンパク質の発現とそのミリストイル化が確認された株を用いて、２００ｍＬスケールでｍｙｒＮＡＰ２２を大量発現させた。ｍｙｒＮＡＰ２２発現株のグリセロールストックを起こし、ＬＢＡＫ培地３ｍＬに植菌し、３７℃、一晩培養した。この前培養液をＬＢＡＫ ２００ｍＬに加え、３０℃、４時間培養した。終濃度１ ｍＭ ＩＰＴＧで発現誘導をかけ、その後８時間培養を続けた。
１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心し、菌体を回収した後、１２ｍＬのｉｎｉｔｉａｌ ｂｕｆｆｅｒを加え、上記と同様の方法でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを行った。 回収した可溶画分を９５℃、１５ｍｉｎで上清を煮沸し、生じた沈殿を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により除去した。さらに、終濃度１０ｍＭとなるようＣａＣｌ２を加え、１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により、上清をタンパク質溶液として回収した。そのうち６ｍＬ分のタンパク質溶液に関して、透析によりｂｕｆｆｅｒをＰＢＳ緩衝液へと置換した。その後、この６ｍＬ誘導後サンプルをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて８，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で１ｍＬに濃縮した。これをＰＢＳ系誘導後サンプルとした。一方、透析を行わなかった６ｍＬタンパク質溶液に関してもＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５、１０，０００ ＭＷＣＯを用いた濃縮を同様に行い、Ｔｒｉｓ系誘導後サンプル１ｍＬを回収した。
大量培養によるｍｙｒＮＡＰ２２の発現とそのミリストイル化の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと質量分析を用いて行った。
上記でタンパク質の発現とそのミリストイル化が確認された株を用いて、２００ｍＬスケールでｍｙｒＮＡＰ２２を大量発現させた。ｍｙｒＮＡＰ２２発現株のグリセロールストックを起こし、ＬＢＡＫ培地３ｍＬに植菌し、３７℃、一晩培養した。この前培養液をＬＢＡＫ ２００ｍＬに加え、３０℃、４時間培養した。終濃度１ ｍＭ ＩＰＴＧで発現誘導をかけ、その後８時間培養を続けた。
１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心し、菌体を回収した後、１２ｍＬのｉｎｉｔｉａｌ ｂｕｆｆｅｒを加え、上記と同様の方法でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを行った。 回収した可溶画分を９５℃、１５ｍｉｎで上清を煮沸し、生じた沈殿を１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により除去した。さらに、終濃度１０ｍＭとなるようＣａＣｌ２を加え、１２，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃の遠心により、上清をタンパク質溶液として回収した。そのうち６ｍＬ分のタンパク質溶液に関して、透析によりｂｕｆｆｅｒをＰＢＳ緩衝液へと置換した。その後、この６ｍＬ誘導後サンプルをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて８，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃で１ｍＬに濃縮した。これをＰＢＳ系誘導後サンプルとした。一方、透析を行わなかった６ｍＬタンパク質溶液に関してもＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５、１０，０００ ＭＷＣＯを用いた濃縮を同様に行い、Ｔｒｉｓ系誘導後サンプル１ｍＬを回収した。
大量培養によるｍｙｒＮＡＰ２２の発現とそのミリストイル化の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと質量分析を用いて行った。
（ラビット免疫ライブラリーの作製）
［ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出］
ミリストイル基は、分子量が小さく、かつ生体内に含まれるものであるため、ミリストイル基をそのまま免疫しても、抗原性を示さない。そこでＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、４５０ｋＤａ−１３０００ｋＤａ）にミリストイル基をコンジュゲートさせた。ミリストイル基は結合するタンパク質のＮ末端がグリシンでないと結合しない、またＫＬＨも被結合分子がペプチド又はタンパク質でないと結合しないことから、条件を満たすようにリンカー用のペプチドを挟んで両者をマレイミド法で結合させた。リンカーペプチドにはミリストイル化タンパク質の中で天然には存在しない配列を設計した。具体的には、ミリストイル化タンパク質のＮ末端の配列傾向、ＫＬＨ結合用にＣ末端はシステインにする必要があることを踏まえて下記のように設計した。
ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ＧＫＲＫＣ−ＫＬＨ（ｍｙｒＫＬＨと略す。）
［ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出］
ミリストイル基は、分子量が小さく、かつ生体内に含まれるものであるため、ミリストイル基をそのまま免疫しても、抗原性を示さない。そこでＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、４５０ｋＤａ−１３０００ｋＤａ）にミリストイル基をコンジュゲートさせた。ミリストイル基は結合するタンパク質のＮ末端がグリシンでないと結合しない、またＫＬＨも被結合分子がペプチド又はタンパク質でないと結合しないことから、条件を満たすようにリンカー用のペプチドを挟んで両者をマレイミド法で結合させた。リンカーペプチドにはミリストイル化タンパク質の中で天然には存在しない配列を設計した。具体的には、ミリストイル化タンパク質のＮ末端の配列傾向、ＫＬＨ結合用にＣ末端はシステインにする必要があることを踏まえて下記のように設計した。
ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ＧＫＲＫＣ−ＫＬＨ（ｍｙｒＫＬＨと略す。）
ｍｙｒＫＬＨによる免疫を７回行ったラビット（ＳＰＦ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔ）から脾臓を抽出し、すぐにＲＮＡｌａｔｅｒ ＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により安定化した後、ハサミを用いて細かくした。抽出した脾臓の一部（５０ｍｇ）からＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。吸光度にて抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡの濃度を見積もった。
［ｃＤＮＡの合成］
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３０μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３０μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
表５に示す組成の溶液を混合し、６５℃５分、氷上２分インキュベートした。
表４に示す組成の溶液に、表５に示す組成の溶液をさらに混合し、４２℃２分インキュベートした。次いで、この溶液に逆転写酵素６μＬをさらに混合し、４２℃５０分、７０℃１５分、氷上５分インキュベートした。次いで、ＲＮＡを分解するために、この溶液にＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、３７℃２０分インキュベートした。次いで、合成したｃＤＮＡ溶液を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて精製した。
［ＰＣＲ法の最適サイクル数の検討］
合成したｃＤＮＡを鋳型として用い、各抗体遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ法にて、各抗体遺伝子を増幅した。その際に最適なサイクル数を見積もった。各特異的プライマーはそれぞれ可変領域の両端にあるＶ遺伝子群（Ｖ ｐｒｉｍｅｒ）、Ｊ遺伝子群（Ｊ ｐｒｉｍｅｒ）に共通する配列をミックスしたものである。
各遺伝子の増幅におけるサイクル数を２４サイクルから３６サイクルに振り分けてＰＣＲ反応を行い、増幅産物をそれぞれアガロース電気泳動で確認した。ＰＣＲ反応における反応液の組成を表６に示し、ＰＣＲ反応の反応条件を表７に示す。
合成したｃＤＮＡを鋳型として用い、各抗体遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ法にて、各抗体遺伝子を増幅した。その際に最適なサイクル数を見積もった。各特異的プライマーはそれぞれ可変領域の両端にあるＶ遺伝子群（Ｖ ｐｒｉｍｅｒ）、Ｊ遺伝子群（Ｊ ｐｒｉｍｅｒ）に共通する配列をミックスしたものである。
各遺伝子の増幅におけるサイクル数を２４サイクルから３６サイクルに振り分けてＰＣＲ反応を行い、増幅産物をそれぞれアガロース電気泳動で確認した。ＰＣＲ反応における反応液の組成を表６に示し、ＰＣＲ反応の反応条件を表７に示す。
［コントロールによるレパートリーチェック］
逆転写したｃＤＮＡが十分なレパートリーを保有しているかを予測するためにレパートリーチェックを行った。各鎖に特異的なプライマーを用いて、最適サイクル数でそれぞれ抗体遺伝子を増幅した。
各ＰＣＲ反応溶液を１／５等量の６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（ＴａＫａＲａ社製）と混ぜ、２％アガロースゲルで電気泳動し、コントロールとＤＮＡ量を比較することでレパートリーを見積もった。
逆転写したｃＤＮＡが十分なレパートリーを保有しているかを予測するためにレパートリーチェックを行った。各鎖に特異的なプライマーを用いて、最適サイクル数でそれぞれ抗体遺伝子を増幅した。
各ＰＣＲ反応溶液を１／５等量の６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（ＴａＫａＲａ社製）と混ぜ、２％アガロースゲルで電気泳動し、コントロールとＤＮＡ量を比較することでレパートリーを見積もった。
［ＰＣＲ法による抗体遺伝子の増幅］
十分なレパートリーを含んでいることを確認した上で検討した最適サイクル数により抗体遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応における反応液の組成を表８に示し、ＰＣＲ反応の反応条件を表９に示す。
十分なレパートリーを含んでいることを確認した上で検討した最適サイクル数により抗体遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応における反応液の組成を表８に示し、ＰＣＲ反応の反応条件を表９に示す。
各ＰＣＲ反応液をフェノールクロロホルム処理し、エタノール沈殿をした後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。各反応溶液を１／５等量の６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（ＴａＫａＲａ社製）と混ぜ、２％アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンドがあることを確認した。
［軽鎖ライブラリーの作製］
精製した抗体遺伝子の軽鎖（ｋ鎖、λ鎖）、及び図３に記載のファージディスプレイ用の抗体発現ベクターをＮｃｏＩ、ＡｓｃＩで制限酵素処理をした。各抗体遺伝子４μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを各１．２μＬ加え３７℃で２時間インキュベートした。ｖｅｃｔｏｒ３０μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを１８μＬ、ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを各９μＬ加え３７℃で２時間インキュベートした。
制限酵素処理後の抗体遺伝子をＱＩＡ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、制限酵素処理後のベクターをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、アガロース電気泳動にて切断を確認した。
制限酵素処理済みのサンプルを、以下の反応組成で１５℃、３時間、ライゲーションを行った。
精製した抗体遺伝子の軽鎖（ｋ鎖、λ鎖）、及び図３に記載のファージディスプレイ用の抗体発現ベクターをＮｃｏＩ、ＡｓｃＩで制限酵素処理をした。各抗体遺伝子４μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを各１．２μＬ加え３７℃で２時間インキュベートした。ｖｅｃｔｏｒ３０μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを１８μＬ、ＮｃｏＩ、ＡｓｃＩを各９μＬ加え３７℃で２時間インキュベートした。
制限酵素処理後の抗体遺伝子をＱＩＡ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、制限酵素処理後のベクターをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、アガロース電気泳動にて切断を確認した。
制限酵素処理済みのサンプルを、以下の反応組成で１５℃、３時間、ライゲーションを行った。
ｋ鎖、λ鎖のライゲーション産物をアガロース電気泳動にて確認をし、エタノール沈殿を行った。そのサンプル各５μＬとＤＨ１２Ｓ １００μＬを混合し、エレクトロポレーション法にて（２５μＦ、２．５ｋＶ、２００Ω）形質転換し、２×ＹＴ培地１０ｍＬで３７℃１時間培養し、その一部（１００μＬ、１０μＬ、１μＬ）をＬＢＧＡプレートにまき、３７℃一晩インキュベートした。また、１０ｍＬ培養液に２×ＹＴＧＡ１９０ｍＬを加え３０℃一晩培養した。
用いた培地の組成を以下に示す。
２×ＹＴ：ｔｒｉｐｔｏｎｅ １６ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＮａＣｌ １０ｇ（１Ｌ)
２×ＹＴＧＡ：２×ＹＴ＋Ａｍｐ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍＬ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｉｎａｌ １％
ＬＢプレート：ｔｒｉｐｔｏｎｅ １０ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＮａＣｌ １０ｇ，ａｇａｒ １５ｇ（１Ｌ)
ＬＢＧＡプレート：ＬＢプレート＋Ａｍｐ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍＬ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｉｎａｌ １％
用いた培地の組成を以下に示す。
２×ＹＴ：ｔｒｉｐｔｏｎｅ １６ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＮａＣｌ １０ｇ（１Ｌ)
２×ＹＴＧＡ：２×ＹＴ＋Ａｍｐ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍＬ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｉｎａｌ １％
ＬＢプレート：ｔｒｉｐｔｏｎｅ １０ｇ，ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，ＮａＣｌ １０ｇ，ａｇａｒ １５ｇ（１Ｌ)
ＬＢＧＡプレート：ＬＢプレート＋Ａｍｐ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍＬ，Ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｉｎａｌ １％
各培養液２００ｍＬからＭａｘｉ ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出し、アガロース電気泳動で目的のバンドを確認し、これをそれぞれラビット免疫ｋ鎖、λ鎖ライブラリープラスミドとした。プレートのコロニー数からレパートリーを見積もり、コロニーを１０個ピックアップして、選択したコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析した。シークエンス反応に用いた溶液の組成を表１１に示し、シークエンス反応の条件を表１２に示す。
［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］
精製した重鎖遺伝子（Ｈ 鎖）と軽鎖（ｋ鎖、λ鎖）ライブラリーをＳｆｉＩで５０℃、２時間制限酵素処理をした。具体的には、４μｇ重鎖遺伝子に、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＳｆｉＩを６μＬ加え、５０℃で２時間インキュベートしアガロース電気泳動にて切断を確認した。また、軽鎖ｋ鎖遺伝子と軽鎖λ鎖遺伝子を９：１に混合した軽鎖ライブラリー５μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを２０μＬ、ＳｆｉＩを１０μＬ加え、５０℃で２時間インキュベートしアガロース電気泳動にて切断を確認した。
さらに重鎖遺伝子、軽鎖ライブラリーにＸｈｏＩを５μＬ加え３７℃２時間インキュベートし、アガロース電気泳動にて切断を確認した。軽鎖ライブラリーについては、制限酵素処理後、エタノール沈殿をし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。軽鎖ライブラリーに重鎖遺伝子を組み込むために、以下の反応組成で１５℃、３時間、ライゲーションを行った。
精製した重鎖遺伝子（Ｈ 鎖）と軽鎖（ｋ鎖、λ鎖）ライブラリーをＳｆｉＩで５０℃、２時間制限酵素処理をした。具体的には、４μｇ重鎖遺伝子に、１０×ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ、ＳｆｉＩを６μＬ加え、５０℃で２時間インキュベートしアガロース電気泳動にて切断を確認した。また、軽鎖ｋ鎖遺伝子と軽鎖λ鎖遺伝子を９：１に混合した軽鎖ライブラリー５μｇに、１０×ｂｕｆｆｅｒを２０μＬ、ＳｆｉＩを１０μＬ加え、５０℃で２時間インキュベートしアガロース電気泳動にて切断を確認した。
さらに重鎖遺伝子、軽鎖ライブラリーにＸｈｏＩを５μＬ加え３７℃２時間インキュベートし、アガロース電気泳動にて切断を確認した。軽鎖ライブラリーについては、制限酵素処理後、エタノール沈殿をし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。軽鎖ライブラリーに重鎖遺伝子を組み込むために、以下の反応組成で１５℃、３時間、ライゲーションを行った。
重鎖のライゲーション産物を電気泳動にて確認をし、エタノール沈殿を行った。そのサンプル１９μＬとＤＨ１２Ｓ １００μＬを混合し、エレクトロポレーション法にて形質転換し、２×ＹＴ培地１０００ｍＬに加え、３７℃１時間培養し、その一部（１００μＬ、１０μＬ、１μＬ）をＬＢＧＡプレートにまき、３７℃一晩インキュベートした。また培養液にＧｌｕｃｏｓｅ ｆｉｎａｌ １％、Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍｌになるように加え、３０℃一晩培養した。プレートのコロニー数からレパートリー数を見積もり、コロニーを１０個ピックアップして、選択したコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析した。シークエンス反応に用いた溶液の組成は、表１１と同様であり、シークエンス反応の条件は、表１２と同様である。
[プラスミド抽出]
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、３０℃一晩培養した培養液２００ｍＬから、Ｍａｘｉ ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを１本使用してプラスミドを抽出し、これをラビット抗体ライブラリープラスミドとした。
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、３０℃一晩培養した培養液２００ｍＬから、Ｍａｘｉ ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを１本使用してプラスミドを抽出し、これをラビット抗体ライブラリープラスミドとした。
[グリセロールストックの作製１]
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］の培養液のうち４０ｍＬを８０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し菌体を回収した。上清を捨て４０％グリセロールを５００μＬ加えて懸濁し−８０℃で保存した。同じものを計４本作り、これをラビット抗体ライブラリーグリセロールストックとした。
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］の培養液のうち４０ｍＬを８０００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し菌体を回収した。上清を捨て４０％グリセロールを５００μＬ加えて懸濁し−８０℃で保存した。同じものを計４本作り、これをラビット抗体ライブラリーグリセロールストックとした。
[ｃｐ３ ｆｏｒｍの作製１]
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、一晩培養した培養液０．５ｍＬを２×ＹＴＡＩ １０ｍＬに加え３０℃一晩培養した。この培養液を１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を回収し、飽和硫安を同量加え、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を完全に捨てきり硫安沈殿を行った。沈殿をＮａＮ３（ｆｉｎａｌ０．０５％）入りＰＢＳ １ｍＬで懸濁、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を回収した。これをラビット抗体ライブラリーｃｐ３ ｆｏｒｍ溶液とした。
用いた培地及び試薬の組成を以下に示す。
培地組成
２×ＹＴＡＩ：２×ＹＴ＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍｌ、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）ｆｉｎａｌ ０．５ｍＭ
試薬組成
ＰＢＳ：ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ １３７ｍＭ），ＫＣｌ（ｆｉｎａｌ ２．７ｍＭ)， ＮａＨＰＯ４ （ｆｉｎａｌ １０ｍＭ) ，ＫＨ２ＰＯ４ （ｆｉｎａｌ １．７６ｍＭ)ｐＨ ７．４
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、一晩培養した培養液０．５ｍＬを２×ＹＴＡＩ １０ｍＬに加え３０℃一晩培養した。この培養液を１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を回収し、飽和硫安を同量加え、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を完全に捨てきり硫安沈殿を行った。沈殿をＮａＮ３（ｆｉｎａｌ０．０５％）入りＰＢＳ １ｍＬで懸濁、１００００ｒｐｍ、４℃、１０分遠心し上清を回収した。これをラビット抗体ライブラリーｃｐ３ ｆｏｒｍ溶液とした。
用いた培地及び試薬の組成を以下に示す。
培地組成
２×ＹＴＡＩ：２×ＹＴ＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍｌ、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）ｆｉｎａｌ ０．５ｍＭ
試薬組成
ＰＢＳ：ＮａＣｌ（ｆｉｎａｌ １３７ｍＭ），ＫＣｌ（ｆｉｎａｌ ２．７ｍＭ)， ＮａＨＰＯ４ （ｆｉｎａｌ １０ｍＭ) ，ＫＨ２ＰＯ４ （ｆｉｎａｌ １．７６ｍＭ)ｐＨ ７．４
[ファージ抗体の作製１]
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、一晩培養した培養液１ｍｌを２×ＹＴＡ培地２０ｍＬに加えＯＤ＝０．５６になるまで３７℃にて振盪培養し、Ｍ１３ヘルパーファージＫＯ７を１ｍＬ加え１．５時間感染させた。その後、終濃度５０μｇ ／ｍＬ カナマイシンを加え、感染効率の確認のため１０μＬの培養液を取り分けた後、３０℃、一晩培養した。取り分けた培養液は希釈系列を作製し、１／１０μＬ分、１／１００μＬ分、１／１０００μＬ分でそれぞれ一晩、３７℃ＬＢＡＫプレートにて培養した。
２００ｍＬ液体培地から１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎの遠心により菌体を除去し、ファージ抗体を含む培養上清を回収した。２０％ポリエチレングリコ―ル（以下「ＰＥＧ」と略す。）を４ｍＬ加え、ボルテックスにより激しく混和した後、１０ｍｉｎ、Ｒｏｏｍ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（以下「Ｒ.Ｔ.」と略す。）で静置した。続いて、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ ｍｉｎの遠心により上清を除去した後、再度１０，０００ ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎで上清を完全に取り除いた。残った沈殿を０．０５％ ＮａＮ３／ ＰＢＳにて４００μＬで懸濁し、溶解しなかった不純物を１２，０００ ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎの遠心で除去した。回収した上清を０．４５μｍのフィルターで滅菌し、これをファージ抗体溶液とした。
この溶液中に含まれるファージ抗体のタイターを確認した。まず、菌株ＤＨ１２Ｓを２×ＹＴ培地でＯ.Ｄ６００＝０．５まで培養した。続いて、１０６、１０７、１０８、１０９倍希釈したファージ抗体溶液１０μＬを、ＤＨ１２Ｓ（Ｏ.Ｄ６００＝０．５）の菌液１ｍＬにそれぞれ加え、ファージを大腸菌に感染させた。１．５ 時間後、各感染後菌液５０μＬずつをＬＢＡプレートにまき、３７℃、一晩培養した。
用いた培地及び試薬の組成を以下に示す。
培地組成
２×ＹＴＡＫ：２×ＹＴ＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍＬ，Ｋａｎａｍｉｃｉｎｅ ｆｉｎａｌ ５０μｇ／ｍＬ
ＬＢＡＫ：ＬＢ培地＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍＬ，Ｋａｎａｍｉｃｉｎｅ ｆｉｎａｌ ５０μｇ／ｍＬ
試薬組成
ＰＥＧ：ＰＥＧ６０００ ２０％，ＮａＣｌ ２．５Ｍ
上記［重鎖軽鎖抗体ライブラリーの作製］において、一晩培養した培養液１ｍｌを２×ＹＴＡ培地２０ｍＬに加えＯＤ＝０．５６になるまで３７℃にて振盪培養し、Ｍ１３ヘルパーファージＫＯ７を１ｍＬ加え１．５時間感染させた。その後、終濃度５０μｇ ／ｍＬ カナマイシンを加え、感染効率の確認のため１０μＬの培養液を取り分けた後、３０℃、一晩培養した。取り分けた培養液は希釈系列を作製し、１／１０μＬ分、１／１００μＬ分、１／１０００μＬ分でそれぞれ一晩、３７℃ＬＢＡＫプレートにて培養した。
２００ｍＬ液体培地から１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎの遠心により菌体を除去し、ファージ抗体を含む培養上清を回収した。２０％ポリエチレングリコ―ル（以下「ＰＥＧ」と略す。）を４ｍＬ加え、ボルテックスにより激しく混和した後、１０ｍｉｎ、Ｒｏｏｍ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（以下「Ｒ.Ｔ.」と略す。）で静置した。続いて、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ ｍｉｎの遠心により上清を除去した後、再度１０，０００ ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎで上清を完全に取り除いた。残った沈殿を０．０５％ ＮａＮ３／ ＰＢＳにて４００μＬで懸濁し、溶解しなかった不純物を１２，０００ ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎの遠心で除去した。回収した上清を０．４５μｍのフィルターで滅菌し、これをファージ抗体溶液とした。
この溶液中に含まれるファージ抗体のタイターを確認した。まず、菌株ＤＨ１２Ｓを２×ＹＴ培地でＯ.Ｄ６００＝０．５まで培養した。続いて、１０６、１０７、１０８、１０９倍希釈したファージ抗体溶液１０μＬを、ＤＨ１２Ｓ（Ｏ.Ｄ６００＝０．５）の菌液１ｍＬにそれぞれ加え、ファージを大腸菌に感染させた。１．５ 時間後、各感染後菌液５０μＬずつをＬＢＡプレートにまき、３７℃、一晩培養した。
用いた培地及び試薬の組成を以下に示す。
培地組成
２×ＹＴＡＫ：２×ＹＴ＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍＬ，Ｋａｎａｍｉｃｉｎｅ ｆｉｎａｌ ５０μｇ／ｍＬ
ＬＢＡＫ：ＬＢ培地＋Ａｍｐｉｃｉｌｉｎｅ ｆｉｎａｌ ２０μｇ／ｍＬ，Ｋａｎａｍｉｃｉｎｅ ｆｉｎａｌ ５０μｇ／ｍＬ
試薬組成
ＰＥＧ：ＰＥＧ６０００ ２０％，ＮａＣｌ ２．５Ｍ
［グリセロールストックの作製］
上記の前培養液１４０μＬを用いてグリセロールストックを作製した。作製方法は前記と同様であった。
上記の前培養液１４０μＬを用いてグリセロールストックを作製した。作製方法は前記と同様であった。
［抗原ビーズの作製］
スクリーニングを行うために作製したｍｙｒＮＡＰ２２を用いた抗原ビーズを作製した。ストレプトアビジンを介したビーズへの固定化のために、ｍｙｒＮＡＰ２２をビオチン化した。
スクリーニングを行うために作製したｍｙｒＮＡＰ２２を用いた抗原ビーズを作製した。ストレプトアビジンを介したビーズへの固定化のために、ｍｙｒＮＡＰ２２をビオチン化した。
［ｍｙｒＮＡＰ２２のビオチン化］
ビオチン化はＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ−ＮＨ２（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いて行った。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果をもとに、ｍｙｒＮＡＰ２２の濃度を見積もり、約５０μｇのｍｙｒＮＡＰ２２を含むサンプル溶液を、ＰＢＳで希釈した１／１０×ＷＳ ｂｕｆｆｅｒ２００ μＬと混和した。あらかじめ純水で湿らせておいたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて、５，０００ ｇ、Ｒ.Ｔ.、１５ ｍｉｎで遠心し、不純物除去・濃縮を行った。ろ液を捨て、再度同様の方法で洗浄した後、サンプル約２０μＬを回収し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。
ＤＭＳＯ １０μＬで付属のＮＨ２−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｉｎを懸濁し、１００ μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと共に１０μＬ全量をサンプルに添加した。３７℃、１２ ｍｉｎ、ｉｎｃｕｂａｔｅした後、１×ＷＳ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬでピペッティングし、あらかじめ純水で湿らせておいたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて５，０００ ｇ、Ｒ.Ｔ.、１５ ｍｉｎで遠心した。ろ液を破棄し、サンプルを回収し、再度同様の方法で洗浄した後、約２０ μＬのサンプルを回収し、ＷＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて２００ μＬまでメスアップした。これをビオチン化ｍｙｒＮＡＰ２２（以下、「Ｂｉｏ−ｍｙｒＮＡＰ２２」と記す。）とした。
ビオチン化はＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ−ＮＨ２（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いて行った。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果をもとに、ｍｙｒＮＡＰ２２の濃度を見積もり、約５０μｇのｍｙｒＮＡＰ２２を含むサンプル溶液を、ＰＢＳで希釈した１／１０×ＷＳ ｂｕｆｆｅｒ２００ μＬと混和した。あらかじめ純水で湿らせておいたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて、５，０００ ｇ、Ｒ.Ｔ.、１５ ｍｉｎで遠心し、不純物除去・濃縮を行った。ろ液を捨て、再度同様の方法で洗浄した後、サンプル約２０μＬを回収し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。
ＤＭＳＯ １０μＬで付属のＮＨ２−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｉｎを懸濁し、１００ μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと共に１０μＬ全量をサンプルに添加した。３７℃、１２ ｍｉｎ、ｉｎｃｕｂａｔｅした後、１×ＷＳ ｂｕｆｆｅｒ ２００μＬでピペッティングし、あらかじめ純水で湿らせておいたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ４、１０，０００ ＭＷＣＯを用いて５，０００ ｇ、Ｒ.Ｔ.、１５ ｍｉｎで遠心した。ろ液を破棄し、サンプルを回収し、再度同様の方法で洗浄した後、約２０ μＬのサンプルを回収し、ＷＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて２００ μＬまでメスアップした。これをビオチン化ｍｙｒＮＡＰ２２（以下、「Ｂｉｏ−ｍｙｒＮＡＰ２２」と記す。）とした。
［ビーズへの固定化］
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅ（商標） Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１ (１０ｍｇ／ｍＬ) ２５０μＬを用意した。マグネットトラッパーを用いて上清を破棄した後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＴＢＳ (以下「ＴＢＳ−Ｔ０．０５」と記す。)４００μＬを用いて懸濁、上清を破棄した。これを２回繰り返しビーズを洗浄した後、ＴＢＳ−Ｔ０．０５ ４００μＬで懸濁し、上記で作製したＢｉｏ−ｍｙｒＮＡＰ２２溶液１０μＬ（＝約３．５μｇに相当）と混和した。４℃で一晩回転攪拌した後、フリーのストレプトアビジンをマスクするために、ビオチンが付加された１ ｍＭ ＧＡＰ４３−ｐｅｐ（Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＨＨＨＨＨ−ＭＬＣＣＭＲＲＴＫ）を６μＬ加えた。１時間、４℃、回転攪拌した後、マグネットトラッパーを用いて、未反応物を除去した。これを素通り画分とし、続いて、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＰＢＳ(以下「ＰＢＳ−Ｔ０．０５」と記す。)４００μＬで懸濁、マグネットトラッパーを用いて洗浄という操作を２回繰り返した。各ろ液を画分ｗａｓｈ１・ｗａｓｈ２として回収した。最終的にビーズを２％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ ４００μＬ で懸濁し、これをｍｙｒＮＡＰ２２の抗原ビーズとした。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅ（商標） Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１ (１０ｍｇ／ｍＬ) ２５０μＬを用意した。マグネットトラッパーを用いて上清を破棄した後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＴＢＳ (以下「ＴＢＳ−Ｔ０．０５」と記す。)４００μＬを用いて懸濁、上清を破棄した。これを２回繰り返しビーズを洗浄した後、ＴＢＳ−Ｔ０．０５ ４００μＬで懸濁し、上記で作製したＢｉｏ−ｍｙｒＮＡＰ２２溶液１０μＬ（＝約３．５μｇに相当）と混和した。４℃で一晩回転攪拌した後、フリーのストレプトアビジンをマスクするために、ビオチンが付加された１ ｍＭ ＧＡＰ４３−ｐｅｐ（Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＨＨＨＨＨ−ＭＬＣＣＭＲＲＴＫ）を６μＬ加えた。１時間、４℃、回転攪拌した後、マグネットトラッパーを用いて、未反応物を除去した。これを素通り画分とし、続いて、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＰＢＳ(以下「ＰＢＳ−Ｔ０．０５」と記す。)４００μＬで懸濁、マグネットトラッパーを用いて洗浄という操作を２回繰り返した。各ろ液を画分ｗａｓｈ１・ｗａｓｈ２として回収した。最終的にビーズを２％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ ４００μＬ で懸濁し、これをｍｙｒＮＡＰ２２の抗原ビーズとした。
［スクリーニング］
スクリーニング前のｐｒｅｓｏａｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを表１４のように調製し、１時間、Ｒ.Ｔ.、回転攪拌にて反応させた。
スクリーニング前のｐｒｅｓｏａｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを表１４のように調製し、１時間、Ｒ.Ｔ.、回転攪拌にて反応させた。
１時間の反応の後、作製したｍｙｒＮＡＰ２２抗原ビーズを４００μＬ加え、１時間、Ｒ.Ｔ.、回転攪拌でファージ抗体ライブラリーと反応させた（図８参照）。終了後、マグネットトラッパーを用いてろ液を捨て、続いて１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｉｎ ＰＢＳ(以下「ＰＢＳ−ＴＸ１」と略す。)７００μＬで懸濁し、ろ液を捨てた。この操作を５回繰り返し洗浄した後、７００μＬのＰＢＳで懸濁した。
平行して菌株ＤＨ１２Ｓを２×ＹＴ培地でＯ.Ｄ６００＝０．５まで培養した。この培養液１ｍＬを、ライブラリーと反応したｍｙｒＮＡＰ２２抗原ビーズ７００μＬと試験管内で混和させ、１時間、３７℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。１時間後、１００ｍｌ ２×ＹＴＡ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ培地( 以下ＹＴＧＡと略す。) に移し、一部をプレート培養用に取り分けた後、一晩、１３０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養した。プレート培養は１００ｍＬ培地から５０μＬ、５μＬ、１μＬで取り分け、それぞれをＬＢＡプレートで３７℃、一晩培養した。
培養終了後、１００ｍＬを次の３つの用途にそれぞれ取り分けた。すなわち、１）グリセロールストック、２）ファージ抗体調整、３）抗体タンパク質発現である。
平行して菌株ＤＨ１２Ｓを２×ＹＴ培地でＯ.Ｄ６００＝０．５まで培養した。この培養液１ｍＬを、ライブラリーと反応したｍｙｒＮＡＰ２２抗原ビーズ７００μＬと試験管内で混和させ、１時間、３７℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。１時間後、１００ｍｌ ２×ＹＴＡ＋Ｇｌｕｃｏｓｅ培地( 以下ＹＴＧＡと略す。) に移し、一部をプレート培養用に取り分けた後、一晩、１３０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養した。プレート培養は１００ｍＬ培地から５０μＬ、５μＬ、１μＬで取り分け、それぞれをＬＢＡプレートで３７℃、一晩培養した。
培養終了後、１００ｍＬを次の３つの用途にそれぞれ取り分けた。すなわち、１）グリセロールストック、２）ファージ抗体調整、３）抗体タンパク質発現である。
１）グリセロールストック作製
上記の培養液６０ｍＬを取り分け、２本のグリセロールストックを作製した。３０ｍＬ×２本分の培養液を１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎで遠心し、菌体を回収した。回収した菌体を５０％グリセロール５００μＬで激しく懸濁し、これを１ｓｔスクリーニングライブラリグリセロールストックとして、−８０℃で保存した。
上記の培養液６０ｍＬを取り分け、２本のグリセロールストックを作製した。３０ｍＬ×２本分の培養液を１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎで遠心し、菌体を回収した。回収した菌体を５０％グリセロール５００μＬで激しく懸濁し、これを１ｓｔスクリーニングライブラリグリセロールストックとして、−８０℃で保存した。
２）ファージ抗体調整
上記の培養液５００μＬを５ｍＬ ２×ＹＴ培地に移し、そこにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ５０μＬを加え１時間、３７℃で感染させた。その後、全量４０ｍＬとなるように２×ＹＴＡを加え、さらに終濃度５０μＭカナマイシンを添加し、３０℃、一晩震盪培養した。
培養終了後、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。２０％ ＰＥＧを５ｍＬ添加し、ｖｏｒｔｅｘにて激しく混和した。５ｍｉｎ、Ｒ.Ｔ.にてｉｎｃｕｂａｔｅした後、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ遠心し、上清を除去した。再度、８，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎで遠心し、上清を完全に除去した。生じた沈殿物を０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ １ ｍＬで懸濁し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。これを１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。この上清を０．４５μｍのフィルターを通して滅菌し、これを１ｓｔスクリーニングファージ抗体とした。
上記の培養液５００μＬを５ｍＬ ２×ＹＴ培地に移し、そこにＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ５０μＬを加え１時間、３７℃で感染させた。その後、全量４０ｍＬとなるように２×ＹＴＡを加え、さらに終濃度５０μＭカナマイシンを添加し、３０℃、一晩震盪培養した。
培養終了後、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。２０％ ＰＥＧを５ｍＬ添加し、ｖｏｒｔｅｘにて激しく混和した。５ｍｉｎ、Ｒ.Ｔ.にてｉｎｃｕｂａｔｅした後、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ遠心し、上清を除去した。再度、８，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎで遠心し、上清を完全に除去した。生じた沈殿物を０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ １ ｍＬで懸濁し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。これを１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎで遠心し、上清を回収した。この上清を０．４５μｍのフィルターを通して滅菌し、これを１ｓｔスクリーニングファージ抗体とした。
この一連のスクリーニング操作を３回繰り返し、それぞれを１ｓｔ、２ｎｄ、３ｒｄスクリーニングとした。各スクリーニング段階でそれぞれの培養液を用いて、１）グリセロールストック作製、２）ファージ抗体調製を行った。
［モノクローナル抗体作製］
各スクリーニングでのプレート培養からモノクローナル抗体の作製を行った。各スクリーニング段階のプレート培養にて生育したコロニーをｐｉｃｋ ｕｐし、各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体の発現とその一部の抗体遺伝子のアミノ酸配列の決定を試みた。
各スクリーニングでのプレート培養からモノクローナル抗体の作製を行った。各スクリーニング段階のプレート培養にて生育したコロニーをｐｉｃｋ ｕｐし、各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体の発現とその一部の抗体遺伝子のアミノ酸配列の決定を試みた。
［ｃｐ３ ｆｏｒｍ発現］
ファージの感染した大腸菌の一部をプレート培養した。各プレートからコロニーをｐｉｃｋ ｕｐし、それぞれを２×ＹＴＡ培地 ２ｍＬで、３７℃、一晩培養した。各前培養液５０μＬを終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを含む２×ＹＴＡ培地（以下２×ＹＴＡＩと略す。）１ ｍＬに継代し、さらに３０℃、一晩培養した。また、各前培養液７０μＬを５０％グリセロール３０μＬと混和し、各モノクローナル抗体グリセロールストックとした。
１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎの遠心により上清を回収し、各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液とした。続いて、硫安沈殿による濃縮を行った。サンプルと等量の飽和硫安を加え、ｖｏｒｔｅｘを用いて激しく混和した後、５ ｍｉｎ、Ｒ.Ｔ.でｉｎｃｕｂａｔｅした。１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎで遠心し、生じた沈殿をサンプルの１／１０量の０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳで懸濁した。再び１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎで遠心し、不溶物を除去し、これを最終的なｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液とした。
ファージの感染した大腸菌の一部をプレート培養した。各プレートからコロニーをｐｉｃｋ ｕｐし、それぞれを２×ＹＴＡ培地 ２ｍＬで、３７℃、一晩培養した。各前培養液５０μＬを終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを含む２×ＹＴＡ培地（以下２×ＹＴＡＩと略す。）１ ｍＬに継代し、さらに３０℃、一晩培養した。また、各前培養液７０μＬを５０％グリセロール３０μＬと混和し、各モノクローナル抗体グリセロールストックとした。
１２，０００ｒｐｍ、４℃、５ ｍｉｎの遠心により上清を回収し、各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液とした。続いて、硫安沈殿による濃縮を行った。サンプルと等量の飽和硫安を加え、ｖｏｒｔｅｘを用いて激しく混和した後、５ ｍｉｎ、Ｒ.Ｔ.でｉｎｃｕｂａｔｅした。１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎで遠心し、生じた沈殿をサンプルの１／１０量の０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳで懸濁した。再び１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎで遠心し、不溶物を除去し、これを最終的なｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液とした。
［ＥＬＩＳＡを用いた発現確認］
発現させたｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液、各５０μＬをそれぞれＰＢＳ ５０μＬと混和し、Ｎｕｎｃ Ｐｌａｔｅ Ｆ８ＷＥＬＬＭＯＤ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の各ｗｅｌｌにそれぞれ４℃、一晩、震盪させながらコーティングした。
終了後、各抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで各ｗｅｌｌの洗浄を２回行った。続いて、２％ ＢＳＡ ＋０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ ２００μＬを添加し、３７℃、１時間、静置してブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、一次抗体として１／２０００×α−ｃｐ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加した。１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた後、抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、二次抗体として１／４０００×α−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ）(Ｒａｂｂｉｔ)ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加し、１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた。抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した後、検出のために ＯＰＤ ｔａｂｌｅｔを用いた基質溶液を作製し２００μＬを各ｗｅｌｌに添加した。添加してから５分後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ７５μＬを添加することで酵素反応を停止し、４９０ ｎｍの発色をＢｉｏＲａｄ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅｒで検出した。
１ｓｔスクリーニングから５３個、２ｎｄスクリーニングから４７個、３ｒｄスクリーニングから８個、計１０８個をモノクローナル化した。
発現させたｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体溶液、各５０μＬをそれぞれＰＢＳ ５０μＬと混和し、Ｎｕｎｃ Ｐｌａｔｅ Ｆ８ＷＥＬＬＭＯＤ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の各ｗｅｌｌにそれぞれ４℃、一晩、震盪させながらコーティングした。
終了後、各抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで各ｗｅｌｌの洗浄を２回行った。続いて、２％ ＢＳＡ ＋０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ ２００μＬを添加し、３７℃、１時間、静置してブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、一次抗体として１／２０００×α−ｃｐ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加した。１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた後、抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、二次抗体として１／４０００×α−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ）(Ｒａｂｂｉｔ)ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加し、１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた。抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した後、検出のために ＯＰＤ ｔａｂｌｅｔを用いた基質溶液を作製し２００μＬを各ｗｅｌｌに添加した。添加してから５分後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ７５μＬを添加することで酵素反応を停止し、４９０ ｎｍの発色をＢｉｏＲａｄ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅｒで検出した。
１ｓｔスクリーニングから５３個、２ｎｄスクリーニングから４７個、３ｒｄスクリーニングから８個、計１０８個をモノクローナル化した。
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた発現確認］
発現量を見積もるために、発現したｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体を１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） 染色を行った。泳動の終わったゲルを取り出し、表１２に示す固定液に浸し３０ｍｉｎ、２回ゲルを振とうした。ｍｉｌｌｉＱ で１０ｍｉｎ、振とうしながらゲルをゆすいだ後、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙに浸し、遮光下で一晩振とうした。ゲルを１０ｍｉｎ、ｍｉｌｌｉＱ でゆすぎ、遮光下で表１５に示す脱色液に浸しながら３０ｍｉｎ振とうした。遮光下でｍｉｌｌｉＱ に浸し１０ｍｉｎ洗浄し、Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によりゲルを撮影した。
発現量を見積もるために、発現したｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体を１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） 染色を行った。泳動の終わったゲルを取り出し、表１２に示す固定液に浸し３０ｍｉｎ、２回ゲルを振とうした。ｍｉｌｌｉＱ で１０ｍｉｎ、振とうしながらゲルをゆすいだ後、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙに浸し、遮光下で一晩振とうした。ゲルを１０ｍｉｎ、ｍｉｌｌｉＱ でゆすぎ、遮光下で表１５に示す脱色液に浸しながら３０ｍｉｎ振とうした。遮光下でｍｉｌｌｉＱ に浸し１０ｍｉｎ洗浄し、Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によりゲルを撮影した。
［プラスミド抽出］
作製したグリセロールストックを起こし、２×ＹＴＡ ５ｍＬで３７℃、一晩振盪培養した。終了後、培養液２ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎの遠心により回収し、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプラスミドを抽出した。プラスミドの抽出はアガロース電気泳動で確認した。
作製したグリセロールストックを起こし、２×ＹＴＡ ５ｍＬで３７℃、一晩振盪培養した。終了後、培養液２ｍＬ分の菌体を１２，０００ｒｐｍ、４℃、７ｍｉｎの遠心により回収し、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプラスミドを抽出した。プラスミドの抽出はアガロース電気泳動で確認した。
［アミノ酸配列決定］
アガロース電気泳動の結果をもとにプラスミドの濃度を見積もった。表１６の組成でＰＣＲ反応溶液を調製し、表１７の反応条件でＰＣＲを行うことで、抗体遺伝子を増幅させた。反応後、１２５ ｍＭ ＥＤＴＡ ５μＬ、１００％ ＥｔＯＨ ６０μＬを添加しタッピングした。２０ ｍｉｎ、−２０℃でインキュベートし、１２，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４ ℃で遠心分離して上清を取り除いた。７０％ ＥｔＯＨ ６０μＬを添加し、１２，０００ｒｐｍ、１０ ｍｉｎ、４ ℃で遠心分離して再び上清を取り除いた。エッペンドルフチューブのフタを開けて、５ｍｉｎ室温で乾燥させ、ホルムアミド ２０μＬを添加、ピペッティングした。９５℃、３ ｍｉｎでヒーティングブロックして、解析した。
アガロース電気泳動の結果をもとにプラスミドの濃度を見積もった。表１６の組成でＰＣＲ反応溶液を調製し、表１７の反応条件でＰＣＲを行うことで、抗体遺伝子を増幅させた。反応後、１２５ ｍＭ ＥＤＴＡ ５μＬ、１００％ ＥｔＯＨ ６０μＬを添加しタッピングした。２０ ｍｉｎ、−２０℃でインキュベートし、１２，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４ ℃で遠心分離して上清を取り除いた。７０％ ＥｔＯＨ ６０μＬを添加し、１２，０００ｒｐｍ、１０ ｍｉｎ、４ ℃で遠心分離して再び上清を取り除いた。エッペンドルフチューブのフタを開けて、５ｍｉｎ室温で乾燥させ、ホルムアミド ２０μＬを添加、ピペッティングした。９５℃、３ ｍｉｎでヒーティングブロックして、解析した。
［モノクローナル抗体の性能評価］
各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体の特異性を評価するためにＥＬＩＳＡを行った。
上記で発現させたＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２それぞれの抗原吸着量を確認した。発現させたＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２について、それぞれ１０μｇ、５μｇ、２．５μｇ、１．２５μｇ、０．６７５μｇ、０．３３７５μｇのタンパク質を含む１００μＬ ＰＢＳを調製し、Ｎｕｎｃ Ｐｌａｔｅ Ｆ８ＷＥＬＬＭＯＤ Ｍａｘｉｓｏｒｐの各ｗｅｌｌにそれぞれ４℃、一晩、震盪させながらコーティングした。
終了後、各抗原溶液を破棄し、ＰＢＳで各ｗｅｌｌの洗浄を２回行った。続いて、２％ ＢＳＡ＋０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ ２００μＬを添加し、３７℃、１時間、静置してブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、一次抗体として１／１００×α−ＮＡＰ２２ (Ｍ−６５) : ｓｃ−６６９９５ (ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社) ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加した。１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた後、抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、二次抗体として１／４０００ × α−ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ ）（Ｒａｂｂｉｔ）ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加し、１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた。抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した後、検出のためにＯＰＤ ｔａｂｌｅｔを用いた基質溶液を作製し２００μＬを各ｗｅｌｌに添加した。添加してから５分後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ７５μＬを添加することで酵素反応を停止し、４９０ ｎｍの発色をＢｉｏＲａｄ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅｒで検出した。
１ｓｔ〜３ｒｄスクリーニングにおいて、発色強度比（ｍｙｒＮＡＰ／ＮＡＰ）の高かったクローンのＥＬＩＳＡの結果を表１８に示す。
各ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体の特異性を評価するためにＥＬＩＳＡを行った。
上記で発現させたＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２それぞれの抗原吸着量を確認した。発現させたＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２について、それぞれ１０μｇ、５μｇ、２．５μｇ、１．２５μｇ、０．６７５μｇ、０．３３７５μｇのタンパク質を含む１００μＬ ＰＢＳを調製し、Ｎｕｎｃ Ｐｌａｔｅ Ｆ８ＷＥＬＬＭＯＤ Ｍａｘｉｓｏｒｐの各ｗｅｌｌにそれぞれ４℃、一晩、震盪させながらコーティングした。
終了後、各抗原溶液を破棄し、ＰＢＳで各ｗｅｌｌの洗浄を２回行った。続いて、２％ ＢＳＡ＋０．０５％ ＮａＮ３ ｉｎ ＰＢＳ ２００μＬを添加し、３７℃、１時間、静置してブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、一次抗体として１／１００×α−ＮＡＰ２２ (Ｍ−６５) : ｓｃ−６６９９５ (ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社) ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加した。１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた後、抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、二次抗体として１／４０００ × α−ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ ）（Ｒａｂｂｉｔ）ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＰＢＳＴ０．０５ １００μＬを添加し、１時間、Ｒ.Ｔ.で振盪しながら反応させた。抗体溶液を破棄し、ＰＢＳで３回洗浄した後、検出のためにＯＰＤ ｔａｂｌｅｔを用いた基質溶液を作製し２００μＬを各ｗｅｌｌに添加した。添加してから５分後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ７５μＬを添加することで酵素反応を停止し、４９０ ｎｍの発色をＢｉｏＲａｄ ｍｉｃｒｏ ｐｌａｔｅｒで検出した。
１ｓｔ〜３ｒｄスクリーニングにおいて、発色強度比（ｍｙｒＮＡＰ／ＮＡＰ）の高かったクローンのＥＬＩＳＡの結果を表１８に示す。
[ＳＰＲ法を用いた結合力評価]
抗体の抗原との結合力を定量するために、ＳＰＲ法を用いた。解析にはＢＩＡｃｏｒｅ−Ｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。リガンドには上記で精製したＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２を用いた。濃度はＮＡＰ２２についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥと紫外吸収法、ｍｙｒＮＡＰ２２についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて算出した。アナライトには、発色強度比（ｍｙｒＮＡＰ／ＮＡＰ）の高かった上記３つのクローンの未精製ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体を用いた。ｃｐ３ ｆｏｒｍの濃度は、１２．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色の結果から見積もった。アナライトのコントロールとして、抗体遺伝子をクローニングする前のベクター（ｐＴＺ１９Ｒ＿ｏｒｉｇｉｎａｌ）で形質転換された大腸菌でタンパク質を発現させ、そのｌｙｓａｔｅを用いた。
抗体の抗原との結合力を定量するために、ＳＰＲ法を用いた。解析にはＢＩＡｃｏｒｅ−Ｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。リガンドには上記で精製したＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２を用いた。濃度はＮＡＰ２２についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥと紫外吸収法、ｍｙｒＮＡＰ２２についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥに加えｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて算出した。アナライトには、発色強度比（ｍｙｒＮＡＰ／ＮＡＰ）の高かった上記３つのクローンの未精製ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体を用いた。ｃｐ３ ｆｏｒｍの濃度は、１２．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色の結果から見積もった。アナライトのコントロールとして、抗体遺伝子をクローニングする前のベクター（ｐＴＺ１９Ｒ＿ｏｒｉｇｉｎａｌ）で形質転換された大腸菌でタンパク質を発現させ、そのｌｙｓａｔｅを用いた。
[ＢＩＡｃｏｒｅ測定]
リガンドを結合させるセンサーチップは、アミノカップリング法で結合させるＣＭ５を用いた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）を用いてシステムを置換した後、リガンド希釈用緩衝液の最適ｐＨを検討した。１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ４．０、４．５、５．０ 各固定化緩衝液でリガンド溶液を希釈し、１０μＬ ／ ｍｉｎで流した。最も固定化量の多い緩衝液を最適ｐＨとした。１００ ｍＭ ＮＨＳ : ４００ ｍＭ ＥＤＣ ＝ １ ： １混合液を５μＬ ／ ｍｉｎで１４分 ７０μＬ 流し、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化させたのち、２つの流路のうち一方に最適ｐＨの固定化緩衝液で希釈したリガンド溶液を５μＬ ／ｍｉｎ、７分、３５μＬ流し結合させた。リガンドが結合していることを確認した後、１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ (ｐＨ ８．５)を５μＬ ／ ｍｉｎ、７ 分、３５μＬ流し、ブロッキングをした。残るもう一つの流路はカルボキシル基の活性化の後、ただちにブロッキングを行いコントロール流路とした。
続いて上述したアナライトを２０μＬ ／ ｍｉｎ、３ ｍｉｎ、６０μＬで流し、リガンドとの相互作用を測定した。３ ｍｉｎ後からは解離もモニタリングした。反応終了後はＮａＯＨを３０μＬ ／ ｍｉｎ、１ ｍｉｎ、３０μＬ流すことでセンサーチップを再生した。
結果を図９〜図１１に示す。また、各抗体のＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２それぞれに対するＫＤ値を表１９に示す。このように、ｍｙｒＮＡＰ２２に対して特異性の高い抗体が得られた。
リガンドを結合させるセンサーチップは、アミノカップリング法で結合させるＣＭ５を用いた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）を用いてシステムを置換した後、リガンド希釈用緩衝液の最適ｐＨを検討した。１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ４．０、４．５、５．０ 各固定化緩衝液でリガンド溶液を希釈し、１０μＬ ／ ｍｉｎで流した。最も固定化量の多い緩衝液を最適ｐＨとした。１００ ｍＭ ＮＨＳ : ４００ ｍＭ ＥＤＣ ＝ １ ： １混合液を５μＬ ／ ｍｉｎで１４分 ７０μＬ 流し、センサーチップ上のカルボキシル基を活性化させたのち、２つの流路のうち一方に最適ｐＨの固定化緩衝液で希釈したリガンド溶液を５μＬ ／ｍｉｎ、７分、３５μＬ流し結合させた。リガンドが結合していることを確認した後、１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ (ｐＨ ８．５)を５μＬ ／ ｍｉｎ、７ 分、３５μＬ流し、ブロッキングをした。残るもう一つの流路はカルボキシル基の活性化の後、ただちにブロッキングを行いコントロール流路とした。
続いて上述したアナライトを２０μＬ ／ ｍｉｎ、３ ｍｉｎ、６０μＬで流し、リガンドとの相互作用を測定した。３ ｍｉｎ後からは解離もモニタリングした。反応終了後はＮａＯＨを３０μＬ ／ ｍｉｎ、１ ｍｉｎ、３０μＬ流すことでセンサーチップを再生した。
結果を図９〜図１１に示す。また、各抗体のＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２それぞれに対するＫＤ値を表１９に示す。このように、ｍｙｒＮＡＰ２２に対して特異性の高い抗体が得られた。
[ｃｐ３ ｆｏｒｍモノクローナル抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ]
上述したｃｌｏｎｅ２１，１６１，１８７を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
未精製ＮＡＰ２２、精製ｍｙｒＮＡＰ２２の３段階希釈系列を調製して１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に、ＰＶＤＦメンブレンをメタノールに６０秒ほど浸したのち、ｍｉｌｌｉＱでゆすぎ、表２０に示す組成のＳｅｍｉ−Ｗｅｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒに一時間以上浸し、振盪した。泳動が終わったゲルを、ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙とメンブレンで空気が入り込まないよう挟み、２５ Ｖ、１００ ｍＡ ／ メンブレンの条件で９０分間転写した。
上述したｃｌｏｎｅ２１，１６１，１８７を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
未精製ＮＡＰ２２、精製ｍｙｒＮＡＰ２２の３段階希釈系列を調製して１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に、ＰＶＤＦメンブレンをメタノールに６０秒ほど浸したのち、ｍｉｌｌｉＱでゆすぎ、表２０に示す組成のＳｅｍｉ−Ｗｅｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒに一時間以上浸し、振盪した。泳動が終わったゲルを、ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙とメンブレンで空気が入り込まないよう挟み、２５ Ｖ、１００ ｍＡ ／ メンブレンの条件で９０分間転写した。
転写の終わったメンブレンを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＴＢＳ（以下「ＴＢＳ−Ｔ０．０５」と略す。）で５分間ゆすぎ、５ ％ Ｓｋｉｍ−ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳ−Ｔで室温、１時間ブロッキングした。続いて５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳ−Ｔ０．０５で５倍希釈した上記３つのクローンを一次抗体として用いて反応させた。二次抗体にはモノクロ―ナル抗体のｃｐ３を認識できる１／２０００×α−ｃｐ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ＴＢＳ−Ｔ０．０５を用いた。この二次抗体はｒａｂｂｉｔ由来ＩｇＧ型であるので、三次抗体に１／４０００×α− ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ ）（Ｒａｂｂｉｔ）ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＴＢＳ−Ｔ０．０５を用いることで、検出可能であった。また、ＮＡＰ２２, ｍｙｒＮＡＰ２２の存在を確認するために、１／１００×α−ＮＡＰ２２ （Ｍ−６５ ） : ｓｃ−６６９９５ （ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社） ｉｎ ＴＢＳ−Ｔ０．０５を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇも行った。この場合二次抗体には１／４０００×α− ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ ｃｈａｉｎ ）（Ｒａｂｂｉｔ）ｐＡｂ−ＨＲＰ（ＭＢＬ社）ｉｎ ＴＢＳ−Ｔ０．０５を用いた。抗体反応の後はその都度ＴＢＳ−Ｔ０．０５で10 min × ３回洗浄を行った。二次（三次）抗体反応後に、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて化学発光させ、ｉｍａｇｅ ｓｃａｎｎｅｒ ＡＴＴＯを用いて発光を検出した。
結果を図１２に示す。図１２Ａに示すように、コントロールとして行ったα−ＮＡＰ２２ ａｎｔｉｂｏｄｙ によるＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇではＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２ どちらのレーンにも抗体が反応したバンドが検出された。
図１２Ｂ〜図１２Ｄに示すように、本発明に係るモノクローナル抗体、特にｃｌｏｎｅ２１や１６７ではミリストイル化を受けていないＮＡＰ２２ のレーンにはほとんどバンドが検出されず、ｍｙｒＮＡＰ２２に対する特異性が確認された。
また、上記３つのクローンについて全て遺伝子配列を確認したところ、４種類のクローンが得られたことが確認された。ＣＤＲ 領域の決定はＩｇＧ ＢＬＡＳＴを参考にした。
クローン２１のアミノ酸配列は配列番号７で表され、クローン１６１のアミノ酸配列は配列番号１４で表され、クローン１８７のアミノ酸配列は配列番号２１で表される。
結果を図１２に示す。図１２Ａに示すように、コントロールとして行ったα−ＮＡＰ２２ ａｎｔｉｂｏｄｙ によるＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇではＮＡＰ２２、ｍｙｒＮＡＰ２２ どちらのレーンにも抗体が反応したバンドが検出された。
図１２Ｂ〜図１２Ｄに示すように、本発明に係るモノクローナル抗体、特にｃｌｏｎｅ２１や１６７ではミリストイル化を受けていないＮＡＰ２２ のレーンにはほとんどバンドが検出されず、ｍｙｒＮＡＰ２２に対する特異性が確認された。
また、上記３つのクローンについて全て遺伝子配列を確認したところ、４種類のクローンが得られたことが確認された。ＣＤＲ 領域の決定はＩｇＧ ＢＬＡＳＴを参考にした。
クローン２１のアミノ酸配列は配列番号７で表され、クローン１６１のアミノ酸配列は配列番号１４で表され、クローン１８７のアミノ酸配列は配列番号２１で表される。
上記１ｓｔ〜３ｒｄスクリーニングにおいて、発色強度比（ｍｙｒＮＡＰ／ＮＡＰ）の高かったクローンとして、クローン１１９に注目した。クローン１１９のＥＬＩＳＡの結果を表２１に示す。
［抗体ビーズの調製］
図３に示した抗体発現ベクターには、３’末端にＰｒｏｔｅｉｎＡをコードする配列が挿入されている（図３中、ＰＡの部分）。そのため、この発現ベクターを用いて作製した抗体には、Ｆｃ部分のＣ末端側にＰｒｏｔｅｉｎＡがついている。このＰｒｏｔｅｉｎＡを介してＩｇＧセファロースビーズにクローン１１９を結合させた。
詳細に説明すると、クローン１１９の発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌（ＪＭ−１０９）を前培養後、１Ｌの０．５ｍＭ ＩＰＴＧを含む２×ＹＴ培地で３０℃、１２ｈ培養した。培養液を遠心後、上清を回収し、硫安沈殿で得られた沈殿をＰＢＳ、４０ｍＬに溶かして抗体溶液を得た。
次いで、ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ (ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製) ５０μＬをカラムに充填し、先に得られた抗体溶液（４０ ｍＬ）を、全量、そのカラムに通して反応させて抗体ビーズを得た。
抗体ビーズを、ＳＤＳ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２％ ＳＤＳ, １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５, １０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ, ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ, １００ｍＭ ＤＴＴ, ＢＰＢ）で溶出して、結合したクローン１１９の発現チェックとビーズへの結合量のチェックをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行った。クマシー染色した結果を図１３に示す。
図１３中、レーン１は、ビーズに結合していたクローン１１９を示し、レーン２は、コントロールとして用いたビーズに結合していたコントロールクローン（ライブラリーからランダムにクローニングした抗体クローン）を示す。４０ｋＤａの位置にバンドが確認でき、２種類の抗体のバンドが同じ濃さであることから、等量のクローン１１９及びコントロールクローンをそれぞれのビーズに結合できたことが確認された。
図３に示した抗体発現ベクターには、３’末端にＰｒｏｔｅｉｎＡをコードする配列が挿入されている（図３中、ＰＡの部分）。そのため、この発現ベクターを用いて作製した抗体には、Ｆｃ部分のＣ末端側にＰｒｏｔｅｉｎＡがついている。このＰｒｏｔｅｉｎＡを介してＩｇＧセファロースビーズにクローン１１９を結合させた。
詳細に説明すると、クローン１１９の発現ベクターを用いて形質転換した大腸菌（ＪＭ−１０９）を前培養後、１Ｌの０．５ｍＭ ＩＰＴＧを含む２×ＹＴ培地で３０℃、１２ｈ培養した。培養液を遠心後、上清を回収し、硫安沈殿で得られた沈殿をＰＢＳ、４０ｍＬに溶かして抗体溶液を得た。
次いで、ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ (ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製) ５０μＬをカラムに充填し、先に得られた抗体溶液（４０ ｍＬ）を、全量、そのカラムに通して反応させて抗体ビーズを得た。
抗体ビーズを、ＳＤＳ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２％ ＳＤＳ, １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５, １０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ, ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ, １００ｍＭ ＤＴＴ, ＢＰＢ）で溶出して、結合したクローン１１９の発現チェックとビーズへの結合量のチェックをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行った。クマシー染色した結果を図１３に示す。
図１３中、レーン１は、ビーズに結合していたクローン１１９を示し、レーン２は、コントロールとして用いたビーズに結合していたコントロールクローン（ライブラリーからランダムにクローニングした抗体クローン）を示す。４０ｋＤａの位置にバンドが確認でき、２種類の抗体のバンドが同じ濃さであることから、等量のクローン１１９及びコントロールクローンをそれぞれのビーズに結合できたことが確認された。
［免疫沈降］
得られた抗体ビーズが、抗原を免疫沈降できるかどうかの確認を行った。抗体ビーズ８０μＬ（クローン１１９ ４μｇ）を［ｍｙｒＮＡＰ２２の大量発現］で調製したリコンビナントｍｙｒＮＡＰ２２と４℃一晩反応させた後、遠心分離し、上清を用いて１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。クマシー染色した結果を図１４に示す。
図１４中、レーン１は、クローン１１９を用いたものの上清を示し、レーン２は、コントロールクローンを用いたものの上清を示し、レーン３は、インプットに用いたリコンビナントｍｙｒＮＡＰを示す。レーン３とレーン１を比較すると、レーン１のシグナル強度は、レーン３のシグナル強度の６１％であった。一方、レーン２とレーン３を比較すると、レーン２のシグナル強度は、レーン３のシグナル強度の９０％であった。即ち、クローン１１９を用いてインプットの約３０％〜４０％のｍｙｒＮＡＰ２２抗原を免疫沈降できることが確認された。
得られた抗体ビーズが、抗原を免疫沈降できるかどうかの確認を行った。抗体ビーズ８０μＬ（クローン１１９ ４μｇ）を［ｍｙｒＮＡＰ２２の大量発現］で調製したリコンビナントｍｙｒＮＡＰ２２と４℃一晩反応させた後、遠心分離し、上清を用いて１２．５％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。クマシー染色した結果を図１４に示す。
図１４中、レーン１は、クローン１１９を用いたものの上清を示し、レーン２は、コントロールクローンを用いたものの上清を示し、レーン３は、インプットに用いたリコンビナントｍｙｒＮＡＰを示す。レーン３とレーン１を比較すると、レーン１のシグナル強度は、レーン３のシグナル強度の６１％であった。一方、レーン２とレーン３を比較すると、レーン２のシグナル強度は、レーン３のシグナル強度の９０％であった。即ち、クローン１１９を用いてインプットの約３０％〜４０％のｍｙｒＮＡＰ２２抗原を免疫沈降できることが確認された。
本実施例においてこのように特異性の高い抗体が多種類得られた理由として、ビーズスクリーニングを用いたことによる（１）提示される抗原分子の絶対数の増加（２）適切な抗原部位の露出、の２点が挙げられる。本実施例で用いたビーズは１ｍｇあたり１，０００ ｐｍｏｌの分子と結合できる。
プレートスクリーニングで１つのｗｅｌｌあたりに固相化できるタンパク量が約１０ ｐｍｏｌであることを考えると、提示される抗原分子の数には数十倍以上の差があることになる。加えて、プレートスクリーニングには、プレートに吸着していることで部分的にまったく抗体が反応できない箇所ができてしまう、という大きな問題点がある。
本実施例で抗原として用いたミリストイル基は、タンパク質を膜へアンカーできるほど疎水性に富んでいる。そのため、疎水性相互作用を利用したプレート吸着方法では、この脂肪酸部分がプレートと面する形になってしまい、抗体との反応が妨げられている可能性も十分考えられる。
一方、ビーズスクリーニングでは、ビーズの表面に抗原が提示されることで、脂肪酸部分も含む一つの抗原分子の様々な面に対し抗体集団が相互作用することが可能になったと推測される。このように抗原の絶対量、そして提示の仕方に変化があったことで、特異性の高い多種類のモノクローナル抗体を得ることが可能になったと考察される。
プレートスクリーニングで１つのｗｅｌｌあたりに固相化できるタンパク量が約１０ ｐｍｏｌであることを考えると、提示される抗原分子の数には数十倍以上の差があることになる。加えて、プレートスクリーニングには、プレートに吸着していることで部分的にまったく抗体が反応できない箇所ができてしまう、という大きな問題点がある。
本実施例で抗原として用いたミリストイル基は、タンパク質を膜へアンカーできるほど疎水性に富んでいる。そのため、疎水性相互作用を利用したプレート吸着方法では、この脂肪酸部分がプレートと面する形になってしまい、抗体との反応が妨げられている可能性も十分考えられる。
一方、ビーズスクリーニングでは、ビーズの表面に抗原が提示されることで、脂肪酸部分も含む一つの抗原分子の様々な面に対し抗体集団が相互作用することが可能になったと推測される。このように抗原の絶対量、そして提示の仕方に変化があったことで、特異性の高い多種類のモノクローナル抗体を得ることが可能になったと考察される。
相互作用だけで認識できる抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント、ミリストイル化タンパク質検出キット、医薬、遺伝子、及びベクターを提供できる。
Claims (24)
- （ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項１に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項１又は２に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
- （ａ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項５に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号１１に示されるアミノ酸配列と、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と、配列番号８に示されるアミノ酸配列と、配列番号９に示されるアミノ酸配列と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項５又は６に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する請求項５〜７のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
- （ａ３）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ３）配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ３）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ３）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ３）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項９に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号１８に示されるアミノ酸配列と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列と、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項９又は１０に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
- （ａ４）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ４）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ４）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ４）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ４）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有することを特徴とする抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項１３に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 配列番号２８に示されるアミノ酸配列と、配列番号２９に示されるアミノ酸配列と、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と、配列番号２７に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項１３又は１４に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有することを特徴とするミリストイル化タンパク質検出キット。
- 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
- 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ミリストイル化タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子。
- （ｇ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ１）配列番号２２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ１）配列番号２２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ１）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。 - （ｇ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ２）配列番号２３に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ２）配列番号２３に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ２）配列番号２３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。 - （ｇ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ３）配列番号２４に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ３）配列番号２４に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ３）配列番号２４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。 - （ｇ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｈ４）配列番号３２に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ４）配列番号３２に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、
（ｊ４）配列番号３２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつミリストイル化タンパク質認識能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする遺伝子。 - 請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子を発現ベクターに挿入してなることを特徴とする組換えベクター。
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| WO2015137441A1 (ja) | 2015-09-17 |
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