CN108872569A - 利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法，属于阻断剂筛选方法领域。该筛选方法包括如下步骤：配置已构建好的带有不同标签的CD47及SIRP alpha蛋白，作为待筛选样品；在微孔板中依次加入待筛选样品CD47及SIRP alpha蛋白；室温孵育，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值为原始数据。本发明实现了生化水平的CD47/SIRP alpha各种阻断剂的筛选，可以在短时间内有效的筛选出高表达的细胞株克隆，加快了医药研发行业的进程。

Description

利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法
技术领域
本发明属于阻断剂筛选方法领域，具体涉及一种利用HTRF一步法筛选CD47/SIRPalpha阻断剂的方法。
背景技术
整合素相关蛋白CD47是广泛表达在细胞上的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，当CD47与其配体SIRP alpha(信号调节蛋白alpha)结合后，CD47就会向巨噬细胞等免疫细胞传递“不要吃我”的信号，从而抑制免疫系统激活，因此CD47与SIAP alpha就成为潜在的免疫检查点。其阻断剂可以阻断CD47/SIRP alpha复合体的形成，从而使免疫系统重新恢复免疫活性。所以在抗体药物研发领域，CD47/SIRP alpha已经成为国内外药物研发的重要靶点之一。
目前，常用的筛选方法是FACS和ELISA。FACS属于流式细胞荧光分选技术，将构建了CD47或SIRP alpha膜蛋白的细胞系经特殊荧光燃料染色或与带有荧光标记的抗体结合，CD47/SIRP alpha实验中一般采用后者。将细胞和待测样品(单抗)混合后加入带标记的而抗体，混合物中放入样品管，气体压力将样品打入含鞘液的流动室，在鞘液的压力下，细胞以单列的形式通过检测通道，被检测通道中的激发光激发，其发射光可被检测器检出，如果样品能结合到CD47或SIRP alpha上，则为阳性信号，不结合为阴性抗体。
ELISA指的是酶联免疫吸附实验，将重组纯化的CD47或SIRP alpha蛋白包被在高吸附的96孔检测板中，孵育过夜后洗掉多余蛋白，加入待测样品，孵育后再次洗掉多余未结合样品，然后加入另一个蛋白，第三次孵育并洗涤，然后加入标记有HRP(辣根过氧化物酶)的二抗，第四次孵育洗涤，最后加入HRP的显色试剂，反应半小时后在酶标仪下读数，根据信号判断样品的阳性阴性。
FACS需要特殊的流式细胞检测仪，改检测仪价格昂贵，且单个细胞过柱，通量很低，只适合做抗体药筛选，不适合小分子，筛选出的多为结合分子，即只要能结合CD47或SIRP alpha即可，并不一定就能阻断二者的结合，通常还需要其他实验佐证。ELISA作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)实验步骤多，耗时长，需要经过多次洗板，加样，显色等，至少需要一天的时间；2)无法达到高通量，难以解决药物筛选样品多的难题；3)包被的蛋白有可能会屏蔽一些蛋白位点，致使漏掉阳性，即得到假阴性结果；4)由于步骤较多容易引起实验误差，导致结果重复性差，不稳定。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用HTRF一步法筛选CD47/SIRPalpha阻断剂的方法，通过本发明，可实现短时间内高通量筛选，并提供更为经济可靠的筛选结果，为快速高效的筛选CD47/SIRP alpha阻断剂提供一种简洁有效的方法。
一种利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法，包括如下步骤：
步骤一，配置已构建好的带有不同标签的CD47及SIRP alpha蛋白，作为待筛选样品；
步骤二，在微孔板中依次加入待筛选样品CD47及SIRP alpha蛋白，
上述两种对应的带标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；
步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值为原始数据；
其中上述偶联Donor和Acceptor的两种标签抗体分别检测相互作用的蛋白CD47和SIRP alpha，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能抑制二者结合，则随着阻断剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低；待稳定后测定荧光值的变化便可量化阻断剂的效价IC50；检测的为HTRF的两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，其中665nm/620nm的比值越低，阻断剂的效应越高。
进一步，可用于筛选的阻断剂包括小分子化合物和各种来源的抗体。
进一步，上述CD47和SIRP alpha为重组蛋白，带有不同标签。
进一步，上述微孔板包括96孔板、384孔板和1536孔板。
进一步，该筛选方法的反应体系为20u l。
进一步，该筛选方法的反应体系最少为8ul。
本发明的优点在于：1.提供新的方法：实现了生化水平上筛选CD47/SIRP alpha阻断剂，无需构建细胞，更加直接快捷；2.使用于所有阻断剂筛选，无论是抗体，蛋白，多肽还是小分子化合物；3.大大节省了实验工作量和实验时间：实验操作从原来的包被、封闭、多次洗板，到现在的只需加入样品和检测试剂，实验时间由原来的1天时间缩短到1-2个小时；4.极大提高了实验的通量：由原来EL ISA的96孔或FACS单个细胞过柱，提高到384孔甚至1536孔，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选；5.结果更可靠：均相检测，抗原蛋白在液相体系里呈现自然构象，有效避免产生假阳性和假阴性；6.信号更稳定：荧光持续时间久，可以过夜后再进行检测，不影响检测结果，而ELISA的检测结果受到时间限制，时间过长或者过短都会影响检测结果。
附图说明
图1是HTRF筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的原理图。
图2是HTRF方法建立CD47/SIRP alpha的实验数据。
图3是HTRF方法检测阳性阻断剂的数据。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，图1是HTRF筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的原理图。FRET利用两种荧光集团的能量转移，这两种荧光集团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。
HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，技术是对TR-FRET技术的进一步改良。HTRF基于时间分辨荧光(TRF)其和荧光共振能量转移(FRET)两大技术。TRF利用稀土元素半衰期长的特性(毫秒级，较普通荧光纳秒级，有6个数量级差异)。所以可以通过延迟50-100微秒排除背景。FRET利用两种荧光集团的能量转移，这两种荧光集团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。较传统TR-FRET的能量供体包裹在螯合物中，HTRF的荧光能量的两种Donor铕(Eu3+cryptate)和铽(Lumi4TMTb)，他们被永久地嵌合在穴状化合物中，更加灵敏和稳定。铕和铽受激光激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰。Acceptor也有两种，一种是APC铰链复合体，商业名称为XL665，另一种是d2，为小分子化合物，分子量约1kD。XL665和d2的激发光与Donor的发射光有一定重叠，其受激后会在665nm处形成一特异波峰。
HTRF技术特点有：
1.操作简单：只需加样和检测试剂，孵育后即检测，无需洗涤。1个小时内完成实验；
2.通量高，易小型化：384或1536孔板操作，反应体系最小可达8uL；
3.信号稳定：可连续多次检测，重复性好；
4.假阳性、假阴性率低：均相检测，不破坏蛋白构象；可排除天然产物自发荧光的背景。
实施例1
1)配制蛋白，CD47从10nM开始3倍梯度稀释，得到10nM到0nM的不同浓度；SIRPalpha从11.1nM开始3倍梯度稀释，得到从11.1nM到0nM的不同浓度。
2)将配制好的蛋白各5ul加入384孔检测板中，室温孵育15分钟后，加入偶联Donor和Acceptor的标签抗体(或等量混匀后加10ul)，孵育1小时读数。根据HTRF方法原理，检测665nm/620nm的荧光比值，根据该比值，判断蛋白的结合，信号越高，结合越多，结果见图2。
实施例2
1)配置阳性阻断剂，将鼠源anti-human CD47blocking antibody进行梯度稀释，从100nM开始，3倍稀释；
2)配制蛋白，根据实例1合适的蛋白浓度做后续阻断剂的筛选，CD47为2nM，SIRPalpha为1nM；
3)配制好的阻断剂和蛋白依次加入384孔检测板中，室温孵育15分钟后，加入偶联Donor和Acceptor的标签抗体(或等量混匀后加10ul)，孵育1小时读数。
根据HTRF方法原理，检测665nm/620nm的荧光比值，根据该比值，判断蛋白的结合，信号越高，结合越多，结果见图3。
由图2和3可知，本发明适用于多种CD47或SIRP alpha阻断剂的筛选，且蛋白用量较少，方法灵敏度高。实验证明采用本发明的方法进行CD47/SIRP alpha阻断剂筛选简单可行。
综上所述，目前的主要筛选CD47/SIRP alpha的方法以传统的ELISA和FACS为主，且多为细胞实验，需要复杂的细胞系构建。而本发明首次将应用HTRF在生化水平筛选，解决了传统方法操作繁琐，时间长，通量低的问题，实现了低成本，高通量，高灵敏度和操作简单地筛选阻断剂的方法，为加快药物发现进展提供了更加稳定实用的方案。
本发明实现了生化水平的CD47/SIRP alpha各种阻断剂的筛选，同时采用的均相时间分辨荧光(HTRF)技术，耗时短，通量高，操作简单，结果稳定，可以在短时间内有效的筛选出高表达的细胞株克隆。并且此方法应用在筛选方面，有效的节省了人力物力成本，缩短了时间，加快了医药研发行业的进程。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一，配置已构建好的带有不同标签的CD47及SIRP alpha蛋白，作为待筛选样品；
步骤二，在微孔板中依次加入待筛选样品CD47及SIRP alpha蛋白，上述两种对应的带标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；
步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值为原始数据；
其中上述偶联Donor和Acceptor的两种标签抗体分别检测相互作用的蛋白CD47和SIRPalpha，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能抑制二者结合，则随着阻断剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低；待稳定后测定荧光值的变化便可量化阻断剂的效价IC50；检测的为HTRF的两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，其中665nm/620nm的比值越低，阻断剂的效应越高。
2.根据权利要求1所述的利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法，其特征在于：可用于筛选的阻断剂包括小分子化合物和各种来源的抗体。
3.根据权利要求1所述的利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法，其特征在于：上述CD47和SIRP alpha为重组蛋白，带有不同标签。
4.根据权利要求1所述的利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法，其特征在于：上述微孔板包括96孔板、384孔板和1536孔板。
5.根据权利要求1所述的利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法，其特征在于：该筛选方法的反应体系为20ul。
6.根据权利要求1所述的利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法，其特征在于：该筛选方法的反应体系最少为8ul。
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