CN109813915A - 利用htrf一步法筛选激酶抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法，属于抑制剂筛选方法领域。一种利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法，包括如下步骤：在微孔板中依次加入待检测的化合物、激酶、底物和ATP，进行共同孵育；在微孔板中依次加入偶联有Donor的识别底物磷酸化位点的抗体和偶联Acceptor的识别底物上生物素的链霉亲和素；室温孵育，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值为原始数据；本发明的优点在于，提供新的方法，实现了生化水平上筛选激酶抑制剂，无需构建细胞，更加直接快捷。

Description

利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法

技术领域

本发明属于抑制剂筛选方法领域，具体涉及一种利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法。

背景技术

在生物化学中，蛋白激酶是一类催化蛋白质磷酸化的酶。它能催化磷酸基团从腺苷三磷酸(ATP)转移并共价结合到特定底物上，从而改变底物的构象及活性。蛋白激酶按照对底物磷酸化位点的选择性，可分为酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶两大类。蛋白激酶在细胞生物学的几乎每个方面都起着关键的调节作用。它们参与调控细胞凋亡、细胞周期进程、细胞骨架重排、分化、发育、免疫反应、神经系统功能和信号转导。而一旦激酶失调，将会引起很多疾病，例如癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、心血管疾病、炎症反应以及神经功能紊乱。因而激酶已经成为国内外药物研发的最热靶点之一。

目前，常用的检测方法是同位素标记分析法和ELISA。同位素标记法使用放射性同位素32P-ATP或者33P-ATP标记的ATP进行激酶活性检测，当激酶发挥作用，通过检测底物放射性，即可判断激酶的活性。

ELISA，酶联免疫吸附实验，其原理是将特异性磷酸化抗体固定在固定载体上，加入反应液，再加入酶偶联的磷酸化抗体与之形成复合物，最后加入HRP的显色试剂，反应半小时后在酶标仪下读数，利用酶催化反应的信号值来体现反应液中待检测物的量，信号值越高，酶活越强。

放射性同位素方法有以下一些缺点：1.产生大量的放射性垃圾。对人体有一定的损害；2.放射性ATP的半衰期非常短，只有14天(32P)或者25天(33P)，因此需要经常订购新的同位素；3.放射性同位素的能量非常高，有比较明显的交叉干扰现象，较难应用于化合物的高通量或者超高通量筛选。

ELISA作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)实验步骤多，耗时长,需要经过多次洗板、加样、显色等，至少需要一天的时间；2)无法达到高通量，难以解决药物筛选样品多的难题；3)包被的蛋白有可能会屏蔽一些蛋白位点，致使漏掉阳性，即得到假阴性结果；4)由于步骤较多容易引起实验误差，导致结果重复性差、不稳定。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用HTRF一步法检测激酶活性，从而可以筛选激酶抑制剂的方法。通过本发明，可实现短时间内高通量筛选，提供更为经济可靠的筛选结果，为快速高效的筛选激酶抑制剂提供一种简洁有效的方法。

一种利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法，包括如下步骤：

步骤一，在微孔板中依次加入待检测的化合物、激酶、底物和ATP，进行共同孵育；

步骤二，在微孔板中依次加入偶联有Donor的识别底物磷酸化位点的抗体和偶联Acceptor的识别底物上生物素的链霉亲和素；

步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值为原始数据；

其中上述偶联Donor的抗体识别磷酸化位点，偶联Acceptor的链霉亲和素与底物一端的生物素结合，从而形成三个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能抑制底物磷酸化，则随着抑制剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低；待稳定后测定荧光值的变化便可量化阻断剂的效价IC50；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，当665nm/620nm的比值越低，阻断剂的效应越高。

进一步，上述微孔板包括96孔板，384孔板和1536孔板。

进一步，该筛选方法的反应体系为8ul-20ul。

进一步，可用于筛选的阻断剂包括各种来源的抗体，蛋白，多肽及小分子。

HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，技术是对TR-FRET技术的进一步改良。HTRF基于时间分辨荧光(TRF)其和荧光共振能量转移(FRET)两大技术。TRF利用稀土元素半衰期长的特性(毫秒级，较普通荧光纳秒级，有6个数量级差异)。所以可以通过延迟50-100微秒排除背景。

FRET利用两种荧光集团的能量转移，这两种荧光集团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。

较传统TR-FRET的能量供体包裹在螯合物中，HTRF的荧光能量的两种Donor铕(Eu3+cryptate)和铽(Lumi4Tb)，他们被永久地嵌合在穴状化合物中，更加灵敏和稳定。铕和铽受激光激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰。Acceptor也有两种，一种是APC铰链复合体，商业名称为XL665，另一种是d2，为小分子化合物，分子量约1kD。XL665和d2的激发光与Donor的发射光有一定重叠，其受激后会在665nm处形成一特异波峰。

HTRF技术特点有：

1.操作简单：只需加样和检测试剂，孵育后即检测，无需洗涤，1个小时内完成实验；

2.通量高，易小型化：384或1536孔板操作，反应体系最小可达8uL；

3.信号稳定：可连续多次检测，重复性好；

4.假阳性、假阴性率低：均相检测，不破坏蛋白构象；可排除天然产物自发荧光的背景。

本发明的优点在于：1.提供新的方法，实现了生化水平上筛选激酶抑制剂，无需构建细胞，更加直接快捷；2.使用于所有抑制剂筛选，无论是抗体、蛋白、多肽还是小分子化合物；3.大大节省了实验工作量和实验时间：实验操作从ELISA的包被、封闭、多次洗板，到现在的只需加入样品和检测试剂，实验时间由原来的1天时间缩短到1-2个小时；4.极大提高了实验的通量：由原来ELISA的96孔，提高到384孔甚至1536孔，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选；5.结果更可靠：均相检测，激酶在液相体系里呈现自然构象，有效避免产生假阳性和假阴性；6.信号更稳定：荧光持续时间久，可以过夜后再进行检测，不影响检测结果，而ELISA的检测结果受到时间限制，时间过长或者过短都会影响检测结果；7.对人体及环境没有伤害。

附图说明

图1为本发明提供的筛选激酶抑制剂的原理图。

图2为本发明提供的HTRF方法建立反应体系的实验数据(以酪氨酸激酶EGFR为例)的示意图。

图3为本发明提供的HTRF方法检测阳性抑制剂的数据的示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明中的利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法，包括如下步骤(以EGFR为例)：

步骤一，在微孔板中依次加入待检测的化合物、EGFR、底物，进行共同孵育，加入ATP后起始酶反应；

步骤二，在微孔板中加入含有EDTA的检测试剂终止酶反应，检测试剂包括偶联有Donor的识别底物磷酸化位点的抗体和偶联Acceptor的识别底物上生物素的链霉亲和素；

步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值为原始数据；

其中上述偶联Donor的抗体识别磷酸化位点，偶联Acceptor的链霉亲和素与底物一端的生物素结合，从而形成三个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光。若样品能抑制激酶活性，则随着抑制剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低；待稳定后测定荧光值的变化便可量化抑制剂的效价IC50；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，当665nm/620nm的比值越低，阻断剂的效应越高。

作为优选而非限定，上述底物为激酶的通用底物，带有生物素标签。酪氨酸激酶和丝/苏氨酸激酶底物有所不同，根据激酶类型选择对应的通用底物即可。

作为优选而非限定，上述微孔板包括96孔板，384孔板和1536孔板。

作为优选而非限定，该筛选方法的反应体系为8ul-20ul。

作为优选而非限定，可用于筛选的抑制剂包括各种来源的抗体，蛋白，多肽及小分子。

如图1所示，图1是HTRF筛选酪氨酸激酶抑制剂的原理图。FRET利用两种荧光集团的能量转移，这两种荧光集团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。

实施例1

1)配制EGFR激酶，从1ng/ul开始3倍梯度稀释。底物浓度固定为1uM,ATP浓度100uM,酶反应时间分别为10，20，30，40，50，60分钟；

2)将配制好的激酶，底物，ATP加入384孔检测板中，室温孵育相应的时间后，加入偶联Donor和Acceptor的检测试剂(或等量混匀后加10ul)，孵育1小时读数；

根据HTRF方法原理，检测665nm/620nm的荧光比值，根据该比值，判断底物磷酸化的情况，信号越高，底物磷酸化程度越高，激酶活性越高，结果见图2。图2中通过MCL1和BAK结合测试，确定Kd值。

实施例2

1)配置阳性化合物，将化合物staurosporine进行梯度稀释，从100000nM开始，10倍稀释；

2)配制EGFR，根据实例1合适的激酶浓度做后续抑制剂的筛选，EGFR为0.0041ng/ul，酶反应时间为40min；

3)配制好的抑制剂，EGFR，底物，ATP依次加入384孔检测板中，室温孵育40分钟后，加入偶联Donor和Acceptor的检测试剂(或等量混匀后加10ul),孵育1小时读数；

根据HTRF方法原理，检测665nm/620nm的荧光比值，根据该比值，判断激酶被抑制的情况。信号越弱，激酶活性越低，抑制剂抑制效果越强。结果见图3。图3中检测化合物SelleckA-1210477、APExBIO S63845、Selleck ABT-737抑制MCL-1/BAK结合的IC50。

由图1，2，3可知，本发明适用于激酶抑制剂的筛选，且激酶用量较少，方法灵敏度高。实验证明采用本发明的方法进行激酶抑制剂的筛选简单可行。

综上所述，目前的主要筛选激酶抑制剂的方法以传统的ELISA，放射性同位素为主，实验步骤繁琐或对人体有一定损害。而本发明首次将HTRF应用在生化水平筛选，解决了传统方法操作繁琐，时间长，通量低的问题，实现了低成本，安全，高通量，高灵敏度和稳定性，操作简单地筛选抑制剂的方法，为加快药物发现进展提供了更加稳定实用的方案。

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一，在微孔板中依次加入待检测的化合物、激酶、底物和ATP，进行共同孵育；

步骤二，在微孔板中依次加入偶联有Donor的识别底物磷酸化位点的抗体和偶联Acceptor的识别底物上生物素的链霉亲和素；

步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值为原始数据；

其中上述偶联Donor的抗体识别磷酸化位点，偶联Acceptor的链霉亲和素与底物一端的生物素结合，从而形成三个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能抑制底物磷酸化，则随着抑制剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低；待稳定后测定荧光值的变化便可量化阻断剂的效价IC50；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，当665nm/620nm的比值越低，阻断剂的效应越高。

2.根据权利要求1所述的利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法，其特征在于：上述微孔板包括96孔板，384孔板和1536孔板。

3.根据权利要求1所述的利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法，其特征在于：该筛选方法的反应体系为8ul-20ul。

4.根据权利要求1所述的利用HTRF一步法筛选激酶抑制剂的方法，其特征在于：可用于筛选的阻断剂包括各种来源的抗体，蛋白，多肽及小分子。