CN108519486A - 利用htrf高通量筛选lag3/mhcii抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，属于抑制剂筛选方法领域。一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一，配置已构建好的带有不同标签的LAG3及MHCII蛋白，待筛选样品；步骤二，在微孔板中依次加入待筛选样品LAG3蛋白和MHCII蛋白，上述两种对应的抗标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测读数，665nm/620nm的比值为原始数据。本发明应用在细胞株筛选方面，有效的节省了人力物力成本，缩短了时间，加快了生物制药行业的进程。

Description

利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法
技术领域
本发明属于抑制剂筛选方法领域，具体涉及一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法。
背景技术
目前，在免疫检查点抑制剂药物研发领域，LAG3已经成为国内外药物研发的最热靶点之一。国内有多家外资和本土药企正在开发LAG3/MHCII的抑制剂。然而现阶段，国内外生物制药行业尚无生化水平直接筛选LAG3/MHCII抑制剂的均相方法，一是由于MHCII蛋白结构复杂(由多个不同亚型单体组合成的复合蛋白)，结合LAG3的结构域也不明确，二是由于均相方法的开发难度，需要实验多种标签蛋白及荧光能量的供体受体。在筛选蛋白相互作用的抑制剂时，经常通过FACS和ELISA的方法。FACS单个细胞过柱，通量很低。ELISA作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)实验步骤多，耗时长。需要经过多次洗板，加样，显色等，至少需要一天的时间；2)无法达到高通量，难以解决药物筛选样品多的难题；3)包被的蛋白有可能会屏蔽一些蛋白位点，致使漏掉阳性，即得到假阴性结果；4)由于步骤较多容易引起实验误差，导致结果重复性差，不稳定。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用HTRF筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，通过本发明，实现了在短时间内高通量筛选，为快速高效的筛选LAG3/MHCII提供一种简洁有效的方法。
一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，包括如下步骤：
步骤一，配置已构建好的带有不同标签的LAG3及MHCII蛋白，待筛选样品；
步骤二，在微孔板中依次加入待筛选样品LAG3蛋白和MHCII蛋白，上述两种对应的抗标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；
步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测读数，665nm/620nm的比值为原始数据；
其中上述偶联Donor和Acceptor的两种标签抗体分别检测相互作用的蛋白LAG3和MHCII，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能抑制二者结合，则随着抑制剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低。待稳定后测定荧光值的变化便可量化抑制剂的效价IC50；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，当665nm/620nm的比值越低，抑制剂的效应越高。
进一步，可用于筛选的抑制剂包括小分子化合物和各种来源的抗体。
进一步，上述LAG3和MHCII为重组蛋白，带有不同标签，其中MHCII为复杂的蛋白复合体，极难构建有结合活性的蛋白。
进一步，上述微孔板包括96孔板，384孔板和1536孔板。
进一步，该筛选方法的反应体系为20ul，最少可至8ul。
HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，技术是对TR-FRET技术的进一步改良。HTRF基于时间分辨荧光(TRF)其和荧光共振能量转移(FRET)两大技术。TRF利用稀土元素半衰期长的特性(毫秒级，较普通荧光纳秒级，有6个数量级差异)。所以可以通过延迟50-100微秒排除背景。
FRET利用两种荧光集团的能量转移，这两种荧光集团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。
较传统TR-FRET的能量供体包裹在螯合物中，HTRF的荧光能量的两种Donor铕(Eu3+cryptate)和铽(Lumi4TMTb)，他们被永久地嵌合在穴状化合物中，更加灵敏和稳定。铕和铽受激光激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰。Acceptor也有两种，一种是APC铰链复合体，商业名称为XL665，另一种是d2，为小分子化合物，分子量约1kD。XL665和d2的激发光与Donor的发射光有一定重叠，其受激后会在665nm处形成一特异波峰。
HTRF技术特点有：
1.操作简单：只需加样和检测试剂，孵育后即检测，无需洗涤。1个小时内完成实验；
2.通量高，易小型化：384或1536孔板操作，反应体系最小可达8uL；
3.信号稳定：可连续多次检测，重复性好；
4.假阳性、假阴性率低：均相检测，不破坏蛋白构象；可排除天然产物自发荧光的背景。
本发明的优点在于：1.提供新的方法：实现了生化水平上筛选LAG3/MHCII抑制剂，无需构建细胞实验。更加直接快捷；2.大大节省了实验工作量和实验时间：实验操作从原来的包被、封闭、多次洗板，到现在的只需加入样品和检测试剂，实验时间由原来的1天时间缩短到1-2个小时；3.极大提高了实验的通量：由原来ELISA的96孔或FACS单个细胞过柱，提高到384孔甚至1536孔，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选；4.结果更可靠：均相检测，抗原蛋白在液相体系里呈现自然构象，有效避免产生假阳性和假阴性；5.信号更稳定：荧光持续时间久，可以过夜后再进行检测，不影响检测结果，而ELISA的检测结果受到时间限制，时间过长或者过短都会影响检测结果。
因此，本发明实现了生化水平筛选LAG3/MHCII抑制剂，同时采用的均相时间分辨荧光(HTRF)技术，耗时短，通量高，操作简单，结果稳定，可以在短时间内有效的筛选出高表达的细胞株克隆。此方法应用在细胞株筛选方面，有效的节省了人力物力成本，缩短了时间，加快了生物制药行业的进程。
附图说明
图1是HTRF筛选LAG3/MHCII抑制剂的原理图。
图2是HTRF方法建立LAG3/MHCII的实验数据。
图3是HTRF方法检测BMS阳性人源化抗体Human anti-LAG3mAb的数据。
图4是HTRF方法检测阳性鼠源抑制抗体Mouse anti-LAG3mAb的数据。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
如图1所示，图1是HTRF筛选LAG3/MHCII抑制剂的原理图。FRET利用两种荧光集团的能量转移，这两种荧光集团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。
实施例1
1)配制蛋白，LAG3从30nM开始3倍梯度稀释，分别得到30nM，10nM，3.3nM和0nM；MHCII从100nM开始3倍梯度稀释，至0.02nM。
2)将配制好的蛋白各5ul加入384孔检测板中，室温孵育15分钟后，加入偶联Donor和Acceptor的标签抗体(或等量混匀后加10ul)，孵育1小时读数。
根据HTRF方法原理，检测665nm/620nm的荧光比值，根据该比值，判断蛋白的结合，信号越高，结合越多，结果见图2。
实施例2
1)配置抑制剂，将BMS的人源化阳性单抗anti-LAG3blocking antibody进行梯度稀释，从100nM开始，4倍稀释到0.00002nM；
2)配制蛋白，根据实例1合适的蛋白浓度做后续抑制剂的筛选，LAG3为10nM，MHCII为20nM；
3)配制好的抑制剂和蛋白依次加入384孔检测板中，室温孵育15分钟后，加入偶联Donor和Acceptor的标签抗体(或等量混匀后加10ul)。孵育1小时读数。
根据HTRF方法原理，检测665nm/620nm的荧光比值，根据该比值，判断蛋白的结合，信号越高，结合越多，结果见图3。
实施例3
对Abcam的鼠单抗anti-LAG3blocking antibody进行抑制曲线测定，按照实施例2的方法，进行检测，结果见图4。
由图2，3，4可知，本发明适用于多种LAG3抑制剂的筛选，且蛋白用量较少，方法灵敏度高。实验证明采用本发明的方法进行LAG3/MHCII抑制剂筛选简单可行。
综上所述，目前的主要筛选LAG3/MHCII的方法以传统的ELISA，FACS为主，且多为细胞实验，需要复杂的细胞系构建。而本发明首次将应用HTRF在生化水平筛选，解决了传统方法操作繁琐，时间长，通量低的问题，实现了低成本，高通量，高灵敏度和稳定性，操作简单地筛选抑制剂的方法，为加快药物发现进展提供了更加稳定实用的方案。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种利用HTRF高通量筛选LAG3/MHCII抑制剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一，配置已构建好的带有不同标签的LAG3及MHCII蛋白，待筛选样品；
步骤二，在微孔板中依次加入待筛选样品LAG3蛋白和MHCII蛋白，上述两种对应的抗标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；
步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测读数，665nm/620nm的比值为原始数据；
其中上述偶联Donor和Acceptor的两种标签抗体分别检测相互作用的蛋白LAG3和MHCII，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能抑制二者结合，则随着抑制剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低。待稳定后测定荧光值的变化便可量化抑制剂的效价IC50；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，当665nm/620nm的比值越低，抑制剂的效应越高。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：可用于筛选的抑制剂包括小分子化合物和各种来源的抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：上述LAG3和MHCII为重组蛋白，带有不同标签，其中MHCII为复杂的蛋白复合体，极难构建有结合活性的蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：上述微孔板包括96孔板，384孔板和1536孔板。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：该筛选方法的反应体系为20ul，最少可至8ul。
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