JP2003535337A - 混合体における液体の存在の検出方法 - Google Patents
混合体における液体の存在の検出方法Info
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Abstract
Description
在を検出することに関連してより詳細に説明される。
ペット操作は、例えば実験室において種々の液体を一般にウェルと呼ばれる試験
セルに導入するために使われている。液体は、試験結果が有効なものとなるよう
に十分な量を、試験セルに導入しなければならない。ピペット操作の間違いは重
大な問題を引き起こす。これはとくに次のような場合であって、ピペット操作に
より吸引される液体が、例えばがんのスクリーニングのような病理スクリーニン
グ試験を実施するためのしょう液の場合である。
唯一の装置は、ピペット操作時において実施される測定にもとづくものである。
これらは、圧力測定(空気のピペット操作と液体のピペット操作との間における
圧力差の測定)、あるいはピペット操作時における液体の検出信号の測定である
。
開示している。そのような装置は、大きくして使用することがむつかしい特殊な
圧力測定手段の使用を必要とする。さらにピペット操作時における液体の途切れ
だけを検出することができる。途切れにもとづかない誤まったピペット操作を検
出することはできない。
って、検出方法が: 検出される液体を含んでいない第一混合体を作る段階と; 波長λの光信号により第一混合体を励起する段階と; 検出される液体の寿命τ1特性に近い時間Δtを通して、第一混合体により放
出された蛍光信号S1を測定する段階であって、測定された蛍光信号S1の函数
である基準量R0をもたらすようになっている、測定する段階と; 第一混合体を作っている成分に同一な成分と、検出される液体の量とから混合
体を作る段階と; 波長λの光信号により、混合体を励起する段階と; 寿命τ1に近い時間Δtを通して、混合体により放出された蛍光信号S11を
測定する段階であって、測定された蛍光信号S11の函数である量Rをもたらす
ようになっている、測定する段階と; 量Rを量K×R0と比較する段階と; を含んでいることを特徴としている。
存在している混合体において、検出された信号はこの液体が存在していることを
疑う余地もなく示している。
導入することにより作られる。
実質的に同一の第二混合体に混合することにより作られる。
は整数である。第一混合体を作る段階と、第一混合体を励起する段階と、第一混
合体により放出された蛍光信号の測定段階と、基準量R0の計算段階とは、Mが
1以上でN以下の整数であるM個のサンプルに対し実施されており;ところが混
合体を励起する段階と、混合体により放出された蛍光信号を測定する段階と、量
Rを計算する段階と、RとK×R0とを比較する段階とが、N個の独立ウェル各
々に対して実施されている。
る方法は、ピペット操作の誤差を検出できるようになっている。従って本発明は
、液体のピペット操作における誤差検出方法に関するものでもあって、その誤差
検出方法は、本発明による前述の方法のような液体の存在検出方法を使用してい
ることを特徴としている。
体の存在:有無)だけではなく定量的な測定をも可能としている。本発明の他の
利点は、液体を混合体に導入した後は、いつでも液体の検出が可能なことである
。
を検討することにより明瞭になるであろう。
してしょう液(serum )である。しかしながら本発明は、時間分散蛍光発光(em
ission of time-resolved fluorescence)により検出可能なより一般的ないずれ
の種類の液体にも関するものである。
。
合体はどのようなしょう液も含んでいない。第一混合体は、波長λの励起信号の
作用により、波長λiの蛍光信号を放射することが可能な少なくとも一つの成分
Ciを含んでいる。
光信号の作用により、蛍光信号が混合体の一成分(又は複数成分)Ciにより放
出される。
トルの解析は、パルス励起として放出された信号が個々の信号の合計であって、
個々の信号各々は混合体の一つの成分Ciの特性であることを示している。従っ
て、蛍光信号Fは以下の式で表わすことができて: F=Σ(Ai×exp(−t/τi))、 上式においてAi及びτiは、成分Ciの個々の信号特性における振幅と寿命と
をそれぞれ表わしている。
ヤーにもとづく読取装置を介して見られる蛍光信号は、Sμsオーダの表命τ1
により特性づけられる。
性に近い時間幅Δt内で測定される。検出される液体がしょう液の場合Δtは、
例えば、混合体の励起直後から始まる時間間隔(5μs、20μs)である。従
って測定された信号は、計算段階4における基準量R0の計算に使用される。
い。第二変更例において、第二蛍光信号S2は、段階3において、時間Δtに属
さない時間幅ΔTにおいて測定される。時間幅ΔTは、例えば、混合体の励起直
後から継続する時間間隔(100μs、3000μs)であってもよい。従って
、段階4において計算された基準量R0は信号S2に対する信号S1の比率に等
しくなる。
される(例えば段階8)。
の信号により混合体を励起する段階6が、段階5に続き、そして新しく蛍光を測
定する(段階7)が段階6に続く。従って、蛍光信号S11は前述したように時
間幅Δtにおいて測定される。続いて段階8において、S11は、混合体に存在
するしょう液量の函数である量Rの計算に使用される。
等しい。第二変更例において、第二信号S22が段階7で測定される。信号S2
2は前述したように時間幅ΔTにおいて測定される。段階8において計算された
量Rは、従って信号S22に対する信号S11の比率に等しくなる。従ってRは
次のように表わすことができる: R=S11/S22
2で割り算した因数は、しょう液に誘発された、混合体の光学的吸収率を考りょ
することにより、測定値S11を基準化することを可能にしている。従って、量
Rは、しょう液の吸収特性とは無関係で、しょう液信号の相対レベルだけを表わ
している。
0以上である場合、段階5において混合体へ導入されたしょう液量は十分なもの
と見なされる。導入量が不十分と見なされる場合、しょう液を導入する新しい段
階が実施される(段階5へもどる)。例えばどのような正しくない検出をも回避
するために、係数KはRの静的変動を考りょして選択することができる。R及び
R0が誘導サイクルにおいて実質的に同時に測定される場合、係数Kは1より大
きい数となる。R及びR0が誘導サイクルにおいて実質的に異なる時点で測定さ
れる場合、誘導時における信号変動のために、係数Kは1未満となるかも知れな
い。
る。段階2、3及び4はN本のウェルの数本だけあるいは1本だけに対して実施
されるのに対し、段階5、6、7、8及び9はN本すべてに関係している。
1)と、第一混合体の励起段階(2)と、第一混合体により発光された蛍光信号
の測定段階(3)と、基準量R0の計算段階(4)とを含んでいる。
れる液体を第一混合体に導入することによるのではなく、検出される液体量を第
一混合体と実質的に同一である第二混合体に混合することにより作られる(段階
10において)。表現“第一混合体と実質的に同一である第二混合体”は、第二
混合体が第一混合体と実質的に同一量の同一成分を含んでいるとの意味であるこ
とを理解するべきである。検出される液体を含んでいる混合体は、混合体を構成
する種々の構成成分をピペットで操作することにより作られてもよい。
蛍光の測定(段階7)と量Rの計算(段階8)との連続する段階が含まれている
。続いて量Rは量R0と比較される(段階9)。RがK×R0以上である場合、
段階10において作られた混合体におけるしょう液含有量は十分であると見なさ
れる。しょう液量が不十分であると見なされる場合新しい混合体が作られねばな
らない(段階10へ戻る)。
を示さない液体を含んでいる。蛍光特性の観点からすると不活性なこの液体は、
第一混合体が検出される液体を含んでいる混合体の全体積に実質的に同一な全体
積となることを可能にしている。従って測定装置の最適設定を保証することが可
能となる。
より測定する場合の用途においても特に利点のあることが判明している。
る液体が十分であるかどうかを示す測定を行なうためにも使用することができる
。従って利点のあることに、液体検出用のさらなる装置は必要とされない。
ある。欧州特許出願公開第539477号明細書に開示されているような、均一
相における時間分散蛍光を用いた免疫試験の場合、成分の混合体はドナー配合体
(donor conjugate )とアクセプター配合体(acceptor comjugate)とを含んで
いる。ドナー配合体は、緩衝剤で処理した希土類キレートあるいはクリプテート
により標識化された、生物学的活性分子を含んでいてもよくて、アクセプター配
合体は、緩衝剤で処理した蛍光アクセプター化合物により標識化された生物学的
活性分子を含んでいてもよい。これに制限するものではないが例として、生物学
的活性分子は、抗体、抗原、ペプチド、蛋白質、レセプター、リガンド、核酸、
ヌクレオチド又は薬剤から選択されてもよくて、蛍光アクセプター化合物は、蛍
光フィコビリンプロテイン(アロフィコシアニン、アロフィコシアニンB、C−
フィコシアニン若しくはR−フィコシアニン)又は蛍光有機分子から選択されて
もよい。
rnational により出願された欧州出願公開第180492号(EP018049
2)、第321353号(EP0321353)及び第601113号(EP0
601113)明細書に開示されている。
る。例示として図3に例示の装置は、本発明による方法を実施するための時間分
散式蛍光測定装置の実施例である。
体は緩衝剤で処理したユーロピウム・クリプテートにより標識化された抗体を含
んでいる配合体であり、アクセプター配合体は蛍光アクセプター化合物により標
識化された抗体を含んでいる配合体である。混合体に導入される液体はしょう液
である。
nm帯域用バンドパスフィルタ13に接続した焦点合わせ用レンズ12と、ダイク
ロイックミラー14と、集光対物レンズ15と、ダイクロイックビームスプリッ
タ16と、焦点合わせ用レンズ18に接続した665nm帯域用バンドパスフィル
タ17と、焦点合わせ用レンズ20に接続した620nm帯域用バンドパスフィル
タ19と、665nmの波長の陽子検出用フォトマルチプライヤーPMTAと、6
20nmの波長の陽子検出用フォトマルチプライヤーPMTBと、調査される混合
体(アクセプター配合体、ドナー配合体及びしょう液)の入っている試験セル2
1とを備えている。
わせ(12)かつフィルタ(13)した後に試験セル(21)へ導入することを
可能にしている。混合体の成分は受光した光により励起される。アクセプターに
より放出された665nmの波長における検量用蛍光信号はフォトマルチプライヤ
ーPMTAにより測定される。同時にユーロピウム・クリプテートにより放出さ
れた620nmにおける蛍光信号はフォトマルチプライヤーPMTBにより測定さ
れる。ユーロピウム・クリプテートにより放出された信号は基準信号として使用
される。測定結果は、ユーロピウム・クリプテートにより放出された基準信号に
対する、アクセプターにより放出された検量用信号の比率の形になる。従って励
起エネルギのあるいは放射エネルギの吸収は、比率を修正することなしに弱い信
号を提供することができる。
、波長λの励起信号は、レーザ源11により放出された337nmの波長の信号で
あって、しょう液の寿命τ1に近い時間Δtを通して測定された信号S1及びS
11は、波長が620nmか665nmかのどちらかに等しい信号であり、さらに時
間Δtに属さない時間ΔTを通して測定された信号S2及びS22は、波長が6
20nmか665nmかのどちらかに等しい信号である。
配合体における広範囲に使用することができる。従ってレーザ源11は、波長が
ほぼ300nmと400nmとの間で変化する光源であってもよい。同様に、ドナー
配合体により放出された蛍光信号は、ほぼ500nmと750nmとの間で変化する
波長λ1であってもよく、さらにアクセプター配合体により放出される蛍光信号
は、ほぼ550nmと850nmとの間で変化する波長λ2であってもよい。
nmとの間にあって、さらに蛍光信号S1、S2、S11及びS22の波長が、例
えば〔500nm−750nm〕の範囲に、又は〔550nm−850nm〕の範囲にあ
る、実施例にも関連する。
Claims (16)
- 【請求項1】 混合体における液体の存在を検出する方法において、検出方
法が: 検出される液体を含んでいない第一混合体を作る段階(1)と; 波長λの光信号により第一混合体を励起する段階(2)と; 検出される液体の寿命τ1特性に近い時間Δtを通して、第一混合体により放
出された蛍光信号S1を測定する段階(3)であって、測定された蛍光信号S1
の函数である基準量R0をもたらす(4)ようになっている、測定する段階(3
)と; 第一混合体を作っている成分に同一な成分と、検出される液体の量とから混合
体を作る段階(5,10)と; 波長λの光信号により、混合体を励起する段階(6)と; 寿命τ1に近い時間Δtを通して、混合体により放出された蛍光信号S11を
測定する段階(7)であって、測定された蛍光信号S11の函数である量Rをも
たらす(8)ようになっている、測定する段階(7)と; 量Rを量K×R0と比較する段階(9)と; を含んでいることを特徴とする検出方法。 - 【請求項2】 混合体が、検出される液体の量を第一混合体に導入すること
(5)により作られることを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。 - 【請求項3】 検出される液体の量が、ピペット操作により導入される(5
)ことを特徴とする、請求項2に記載の検出方法。 - 【請求項4】 混合体が、検出される液体の量を実質的に第一混合体と同一
の第二混合体に混合することにより作られること(10)を特徴とする、請求項
1に記載の検出方法。 - 【請求項5】 第一混合体は、波長λの蛍光特性を有していない液体を含ん
でいるので、第一混合体の全体積は混合体の全体積と実質的に同一となっている
ことを特徴とする、請求項4に記載の検出方法。 - 【請求項6】 第一混合体と検出される液体を含んでいる混合体とは、各々
が構成される構成成分をピペット操作により作られることを特徴とする、請求項
4または5に記載の検出方法。 - 【請求項7】 第一混合体が、波長λの励起信号の作用により波長λiの蛍
光信号を放出することができる少なくとも一つの成分Ciを含んでいることを特
徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の検出方法。 - 【請求項8】 量R0及びRが、それぞれ測定された蛍光信号S1及びS1
1に等しいことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の検出方法。 - 【請求項9】 第一混合体が、それぞれ波長λ1及びλ2に関連する少なく
とも二つの成分C1及びC2を含んでいることと;蛍光信号S1及びS11は、
波長がλ1かλ2かのどちらか一方に等しい信号であることと;を特徴とする、
請求項8に記載の検出方法。 - 【請求項10】 量R0が、時間ΔTに属さない集積時間ΔTを通して測定
された蛍光信号S2に対する測定された蛍光信号S1の比率に等しいことと、量
Rは、集積時間ΔTを通して計測された蛍光信号S22に対する測定された蛍光
信号S11の比率に等しいこととを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に
記載の検出方法。 - 【請求項11】 第一混合体が、それぞれ波長λ1と波長λ2とに関連する
少なくとも二つの成分C1とC2とを含んでいることと、蛍光信号S1、S2、
S11及びS22は、波長がλ1かλ2かのどちらか一方に等しいこととを特徴
とする、請求項10に記載の検出方法。 - 【請求項12】 第一成分C1が、緩衝剤で処理した希土類キレート又はク
リプテートにより標識化された生物学的活性分子を含んでいる配合体であって、
かつ第二成分C2が、緩衝剤で処理した蛍光アクセプター化合物により標識化さ
れた生物学的活性分子を含んでいる配合体であり、波長λはほぼ300nmと40
0nmとの間であり、波長λはほぼ500nmと750nmとの間であり、波長λ2は
ほぼ550nmと850nmとの間であることを特徴とする、請求項7〜11のいず
れか一項に記載の検出方法。 - 【請求項13】 生物学的活性分子は、抗体、抗原、ペプチド、蛋白質、レ
セプター、リガンド、核酸、ヌクレオチド又は薬剤から選択されていることと;
蛍光アクセプター化合物は、フィコビリンプロテイン(アロフィコシアニン、ア
ロフィコシアニンB、C−フィコシアニン若しくはR−フィコシアニン)又は蛍
光有機分子から選択されていることと;を特徴とする、請求項12に記載の検出
方法。 - 【請求項14】 検出される液体がしょう液であることを特徴とする、請求
項1〜13のいずれか一項に記載の検出方法。 - 【請求項15】 第一混合体を作る段階(1)と、第一混合体を励起する段
階(2)と、第一混合体により放出された蛍光信号の測定段階(3)とは、Mが
1以上の整数であるM個のサンプルに対し実施されていることと;混合体がN個
の独立ウェルにおいて作られ、NはM以上の整数であり、混合体を励起する段階
と、混合体により放出された蛍光信号を測定する段階とが、N個の独立ウェル各
々に対して実施されることと;を特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に
記載の検出方法。 - 【請求項16】 液体のピペット操作における誤差検出方法において、誤差
検出方法が、請求項3、又は6、又は7〜15のいずれか一項に記載の検出方法
を利用していることを特徴とする誤差検出方法。
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