JPH07229835A - エネルギー移動検出法およびその装置 - Google Patents

エネルギー移動検出法およびその装置

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JPH07229835A
JPH07229835A JP6019500A JP1950094A JPH07229835A JP H07229835 A JPH07229835 A JP H07229835A JP 6019500 A JP6019500 A JP 6019500A JP 1950094 A JP1950094 A JP 1950094A JP H07229835 A JPH07229835 A JP H07229835A
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Abstract

(57)【要約】 【目的】エネルギー移動を起こしていない分子が多数存
在する条件においても、エネルギー移動を起こしている
少数の分子が存在することを検出することが可能なエネ
ルギー移動検出方法およびその装置を提供する。 【構成】 本発明のエネルギー移動検出装置は、励起光
源４０、試料ホルダ３０、波長選別器２０、ゲート付光
検出器１０、データ処理部５０および処理装置６０を具
備している。励起光源４０は励起光を照射する装置であ
り、励起光は試料が設置された試料ホルダ３０に照射さ
れる。試料はエネルギー移動を起こしうる発光寿命の異
なる２種類の発光分子であり、励起光の照射により発光
を生じるものである。励起光の照射により発生した発光
は、波長選別器２０を介することにより特定の（２つ
の）波長域ごとに選別され、この波長域で分離された光
はゲート付光検出器１０で検出される。ゲート付光検出
器１０は、処理装置６０により（２つの）時間域でその
検出が出力されるようにされている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２分子間で生ずるエネ
ルギー移動を利用した物質の検出や定量に用いられるエ
ネルギー移動検出法およびその装置に関し、特に、エネ
ルギー移動を用いた生細胞での微量物質を検出、さらに
は、これらの生体の遺伝子情報を有するＤＮＡやＲＮＡ
の配列決定や遺伝子の発現の検出において、これらに相
補的に結合するオリゴヌクレオチドにラベルされた蛍光
分子（蛍光色素）間のエネルギー移動を検出するエネル
ギー移動検出法およびその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】２種類の分子間で起こる相互作用として
の共鳴エネルギー移動は、分子の性質を研究する上で有
用な現象であり、また、この共鳴エネルギー移動現象
は、特定分子の検出などの用途にも利用されている。こ
のような現象は、特に、生体内での微量物質の測定に利
用することができ、これを遺伝子情報の解析に応用すれ
ば、高い精度で１次構造上の変化や遺伝子の発現を検出
することができる。
【０００３】そして、蛍光分子間のエネルギー移動にお
いては、エネルギーを供与する分子をドナー、受け取る
分子をアクセプターとして以下のようなエネルギー移動
検出法が一般に使用されている。
【０００４】蛍光スペクトルを測定する（スペクトル
の変化を見る）。 ドナーの蛍光強度の減少またはアクセプターの蛍光強
度の増加を測定する。 パルス励起後のドナーの蛍光強度の減衰の速さ（蛍光
寿命）を測定する。しかし、上記〜の検出方法で
は、測定試料内においてエネルギー移動を起こしていな
い分子（フリーの分子）の数がエネルギー移動を起こし
ている分子の数よるも多い場合やエネルギー移動してい
るドナーおよびアクセプターの濃度が決定できない場合
にエネルギー移動の検出が不可能となる。これは、や
の検出方法では、エネルギー移動を起こしている分子
からの蛍光と起こしていない分子からの蛍光とをともに
測定するため、エネルギー移動に起因する蛍光の特性変
化がエネルギー移動を起こしていない分子からの蛍光の
中に埋もれてしまうからである。また、のようにアク
セプターの蛍光強度の増加を測定する場合には、励起光
により直接励起されたアクセプターからの蛍光の強度
が、エネルギー移動によるアクセプターからの蛍光強度
に比して無視できなくなるほど大きくなり、エネルギー
移動によるアクセプターからの蛍光のみを決定すること
が不可能となることによる。
【０００５】そこで、このような条件下におけるエネル
ギー移動検出法として、ドナーの蛍光寿命がアクセプタ
ーの蛍光寿命よりも相当長くなるようなドナー／アクセ
プターの組合せを選び、これらの蛍光分子をパルス光で
励起した後、一定時間の遅延のゲートをかけてアクセプ
ターからの蛍光を検出することにより、直接励起による
アクセプターからの蛍光とエネルギー移動によるアクセ
プターからの蛍光とを分別する方法が、「Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ Ｌ．Ｅ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１７４，ｐｐ１０１−１２０，１９８８」に記載
されている。
【０００６】この方法はエネルギー移動を起こしていな
いアクセプターからの蛍光の寄与を除去することができ
る点でエネルギー移動検出について改善が見られる。ま
た、一定時間の遅延のゲートをかけてそれぞれの蛍光分
子からの蛍光を分離するとともに、散乱光や目的の蛍光
以外の光の混入を防止し、光路長の違いなどによる蛍光
強度の測定精度を向上させ、未知分子濃度の影響の低減
して顕微鏡下で培養細胞内のエネルギー移動を検出する
方法として、ドナーの励起波長で励起したときのドナー
の蛍光強度とアクセプターの蛍光強度との比をとりイメ
ージ化する方法が、「Ｔｓｅｉｎ，Ｒ．Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｏｉｌｏｇｙ
３ ２４２−２４５，１９９３」に、時間分解イメー
ジングを行う方法が「Ｏｉｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６４ ６７６−６８５，１９９３」
に記載されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
のエネルギー移動検出方法においても、エネルギー移動
を起こしていないドナーの比率が相当大きくなると、ド
ナーの蛍光の長波長域部分が混入してくるため、アクセ
プター、ドナーそれぞれからの蛍光を分離することがで
きなくなる。特に、エネルギー移動検出の測定対象が培
養細胞などの生物試料の場合には一般に上述した条件が
適合し、エネルギー移動の検出は極めて困難となる。
【０００８】本発明は以上の問題に鑑みてなされたもの
であり、エネルギー移動を起こしていない分子が多数存
在する条件においても、エネルギー移動を起こしている
少数の分子が存在することを検出することが可能となる
エネルギー移動検出法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】以上の問題を解決するた
め、本発明は、発光寿命の異なる２以上の発光分子へ励
起光を照射するとともに、この照射により生じた発光分
子からの発光（例えば、蛍光、燐光、化学発光）を光検
出器で測定することにより、発光分子間で生じるエネル
ギー移動を検出するエネルギー移動検出法を対象とする
ものであり、この発光を少なくとも２つの異なる波長域
で測定するとともに、各波長域での発光の経時的な変化
を少なくとも２つの時間域で評価し、得られた各波長域
における各時間域の発光を評価することにより発光分子
間のエネルギー移動を検出することとした。
【００１０】また、このような発光を生じる分子として
は、蛍光寿命の異なる２以上の蛍光分子が有効である。
本発明は、この蛍光分子へ励起光を照射するとともに、
この照射により生じた蛍光分子からの蛍光を光検出器
（例えば、光電子増倍管、フォトダイオード、アバラン
シェフォトダイノードオート、、ストリーク管、ＣＣＤ
等）で測定することにより、蛍光分子間で生じるエネル
ギー移動を検出するエネルギー移動検出法を対象とする
ものであり、この蛍光を少なくとも２つの異なる波長域
で測定するとともに、各波長域での発光の経時的な変化
を少なくとも２つの時間域で測定し、得られた各波長域
における各時間域の蛍光を評価することにより蛍光分子
間のエネルギー移動を検出することを特徴とする。
【００１１】そして、このようなエネルギー移動検出法
においては、蛍光を波長選別器（例えば、フィルター、
プリズム、回折格子等）を用いて第１および第２の波長
域に分離した後、光検出器を用いて第１および第２の波
長域に分離された蛍光の時間的な変化が第１および第２
の時間域に分割されるように測定して、得られた各波長
域における各時間域の蛍光を評価することにより蛍光分
子間のエネルギー移動を検出することとしてもよい。な
お、励起光の生成にあたっては、窒素レーザ、ヘリウム
ネオンレーザ、アルゴンレーザ等の気体レーザ、半導体
レーザ、紫外光源等の励起光を用いることが可能である
が、励起光生成の観点からは、レーザ光、さらにはその
強度の観点からは、気体レーザを用いることが好まし
い。
【００１２】また、第１の時間域は、蛍光分子の一方の
蛍光強度の減衰が実質的に終了する時間と蛍光分子がエ
ネルギー移動を起こした場合の蛍光強度の減衰が実質的
に終了する時間との間に設定し、第２の時間域は、蛍光
分子がエネルギー移動を起こした場合の蛍光強度の減衰
が実質的に終了する時間と蛍光分子の他方の蛍光強度の
減衰が実質的に終了する時間との間に設定することが好
ましい。
【００１３】そして、各時間域をこのように設定した場
合、エネルギー移動の有無についての評価は、第１の波
長域で得られた第１の時間域の蛍光と第２の時間域の蛍
光との割合と、第２の波長域で得られた第１の時間域の
蛍光と第２の時間域の蛍光との割合との差が、第１の波
長域で得られた第１の時間域の蛍光と第２の時間域の蛍
光との割合に占める比率（この値をパラメータＺとす
る）に基づいて行うことができる。なお、この評価は、
各波長域の各時間域の蛍光の割合や比率を求める場合に
は、例えば、除算回路を用いて、それぞれの差を求める
場合には例えば差動増幅器を用いて実現することができ
る。
【００１４】そして、このような蛍光分子間で生じるエ
ネルギー移動検出装置は、蛍光寿命の異なる２以上の蛍
光分子へ励起光を照射する光源と、照射により生じた蛍
光分子からの蛍光を第１および第２の波長域に分離する
波長選別器と、第１および第２の波長域の蛍光をそれぞ
れ検出する光検出器と、光検出器で検出された第１およ
び第２の波長域の蛍光の経時的な変化を第１および第２
の時間域に分割する処理装置とを備え、光検出器で検出
した第１および第２の波長域の蛍光の第１および第２の
時間域における蛍光量に基づいて、蛍光分子間で生じる
エネルギーの移動を検出することとした。
【００１５】
【作用】本発明のエネルギー移動検出法によれば、ま
ず、発光寿命（蛍光寿命）の異なる発光分子（蛍光分
子）への励起光の照射により発生した発光（蛍光）を波
長選別器を用いる等して、少なくとも２つの異なる波長
域で測定する。この際、これらの相異なる波長域を第１
および第２の波長域とすれば、各波長域で測定される発
光（蛍光）の経時的な変化を少なくとも２つの時間域で
評価（測定）する。この時間域を第１および第２の時間
域とすれば、得られた各波長域における各時間域の発光
（蛍光）を評価して発光（蛍光）分子間のエネルギー移
動を検出することができる。
【００１６】この時間域の設定は、光検出器に遅延ゲー
トをかける等して達成することができ、第１の時間域
は、発光（蛍光）分子の一方の発光（蛍光）強度の減衰
が実質的に終了する時間と発光（蛍光）分子がエネルギ
ー移動を起こした場合の発光（蛍光）強度の減衰が実質
的に終了する時間との間に設定することが好ましく、第
２の時間域は、発光（蛍光）分子がエネルギー移動を起
こした場合の発光（蛍光）強度の減衰が実質的に終了す
る時間と発光（蛍光）分子の他方の発光（蛍光）強度の
減衰が実質的に終了する時間との間に設定することが好
ましい。特に、このように時間域を設定した場合には、
パラメータＺは、エネルギー移動の有無やエネルギー移
動の効率、エネルギー移動を起こしている分子と起こし
ていない分子との比率に依存するので、パラメータＺに
もとづけば、このようなエネルギー移動に関する一連の
情報を得ることが可能である。
【００１７】さらに、遺伝子の発現等の遺伝子情報の解
析において、これらにハイブリダイゼーションする相補
的な核酸に標識された発光（蛍光）分子のエネルギー移
動の情報を検出することにより、ＤＮＡおよびＲＮＡの
１次構造上の変化や遺伝子の発現の有無を検出すること
ができる。なお、このような蛍光分子間で生じるエネル
ギーの移動検出装置は、まず、光源から蛍光寿命の異な
る２以上の蛍光分子へ励起光を照射する。つぎに、この
照射により生じた蛍光分子からの蛍光を波長選別器によ
り第１および第２の波長域に分離し、光検出器で第１お
よび第２の波長域の蛍光をそれぞれ検出する。そして、
処理装置で光検出器で検出された第１および第２の波長
域の蛍光の経時的な変化を第１および第２の時間域に分
割して、光検出器で検出した第１および第２の波長域の
蛍光の第１および第２の時間域における蛍光量に基づい
て上記のようにしてエネルギー移動の有無や種々の微量
物質の量や性質を判定するパラメータの同定を行うこと
ができる。
【００１８】
【実施例】以下、本発明に係るエネルギー移動検出法お
よびその装置を添付した図面を用いて説明する。なお、
説明において同一要素には同一符号を用いることとし、
重複する説明は省略する。
【００１９】図１は、本発明に係るエネルギー移動検出
装置の構成を説明するための説明図である。本装置は、
励起光源４０（窒素レーザ、ヘリウムネオンレーザ、ア
ルゴンレーザ等の気体レーザ、半導体レーザ、紫外光源
等）、試料ホルダ３０、波長選別器２０（フィルタ、プ
リズム、回折格子等）、ゲート付光検出器１０（光電子
増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイノ
ードオート、、ストリーク管、ＣＣＤ等）、データ処理
部５０および処理装置６０を具備している。励起光源４
０は励起光を照射する装置であり、励起光は試料が設置
された試料ホルダ３０に照射される。
【００２０】ここで、試料はエネルギー移動を起こしう
る発光寿命の異なる２種類の発光分子であり、励起光の
照射により発光を生じるものである。（共鳴）エネルギ
ー移動は、２分子間の相互作用であり、エネルギーを与
えるドナー（蛍光、燐光、化学発光などの発光を生じる
発光分子）とエネルギーを受け取るアクセプターが相互
作用することにより生じる。このエネルギー移動の起こ
る条件としては、ドナーの発光スペクトルとアクセプタ
ーの吸収スペクトルとが重なりをもつこと、およびドナ
ーとアクセプターとが一定の距離以内（＜８ｎｍ）に存
在することが必要である。本方法を使用することのでき
るドナー／アクセプターの組み合わせは、その発光の組
み合わせが「蛍光−蛍光」、「蛍光−燐光」、「燐光−
燐光」、「燐光−蛍光」のものが考えられる。
【００２１】そして、励起光の照射により発生した発光
は、波長選別器２０を介することにより特定の（２つ
の）波長域ごとに選別される。しかる後、この波長域で
分離された光は、ゲート付光検出器１０で検出される。
ゲート付光検出器１０は、その検出が励起光源４０の照
射に一定の遅延時間をおいて同期して出力されるように
なっている。すなわち、励起光源４０からパルス光（励
起光）を照射する場合には、パルス光の立ち下がり後に
ゲート付光検出器１０にトリガをたててゲート付光検出
器１０を駆動する。そして、ゲート付光検出器１０から
の検出出力は、そお時間減衰出力が（少なくとも）２つ
の時間域で取り出されてデータ処理部５０に伝送され
る。この時間域ごとの検出出力の取り出しは、ゲート付
光検出器１０に前述の一定の遅延時間をおいて２つの時
間域にゲートをかけることにより達成することが可能で
ある。なお、これら一連の励起光源４０とゲート付光検
出器１０の駆動制御およびデータ処理部５０の処理は処
理装置６０が制御する。
【００２２】また、このような取り出しをゲート付光検
出器１０で行わなくても、全ての時間の検出出力をデー
タ処理部５０に入力した後に、データ処理部５０で検出
出力を時間域ごとに分離することも可能であるが、励起
光の照射時間とこの時間域との設定の観点および検出出
力の応答速度の観点からは、直接、ゲート付光検出器１
０で２つの時間域を設定することが望ましい。
【００２３】このような構成とすると、ゲート付光検出
器１０からは、試料から励起された光が２つの波長域で
２つの時間域に分割されて出力されることになる（すな
わち、２×２＝４物理量）。そして、このようなデータ
を用いることにより、後述のようにデータ処理部５０で
このデータを処理すれば、エネルギー移動の有無の判定
やエネルギー移動の状態等を推定を行うことができる。
【００２４】図２は、図１に示したエネルギー移動検出
装置の詳細な一構成例を説明するための説明図である。
なお、本例では測定試料はドナー／アクセプターとも蛍
光分子とする。このエネルギー移動検出装置では、励起
光源４０は気体レーザであるレーザ光源４０ａを用いる
こととし、これをパルスレーザ駆動回路４０ｂを用いて
パルス駆動する。光の照射と同時に試料ホルダ３０内に
設置された試料ＳＭから蛍光が観察される。試料ＳＭ
は、ドナーおよびアクセプターの蛍光分子を含んでいる
ので各蛍光分子からの蛍光は波長の広がりを有する。そ
こで、一定の波長域の蛍光を分離する波長選別器２０と
して、透過波長域の異なるドナー波長域（ΓD とする）
の透過フィルタ２０１およびアクセプター波長域（ΓA
とする）の透過フィルタ２０２を用い、発生した蛍光を
これらのフィルタ２０１，２０２を透過させることによ
り波長域ごとに分離する。
【００２５】そして、波長域ΓD およびΓA の光はゲー
ト付イメージインテンシファイア１０１ａ，１０１ｂに
それぞれ入力される。ゲート付イメージインテンシファ
イアは、入射した光のエネルギーを光の平面的広がりを
保持しつつ電子に変換して増倍する一種の光電子増倍管
を備えている。なお、ゲート付イメージインテンシファ
イア１０１ａ，１０１ｂは、励起された蛍光をその入射
面に設置された光電面で光電変換して電子を放出し、こ
の電子の軌道上に配置されたマルチチャネルプレート
（ＭＣＰ）で電子を増倍する。
【００２６】この電子はゲート付イメージインテンシフ
ァイア１０１ａ，１０１ｂの出力面に設置された蛍光物
質に照射されて、増倍された電子を蛍光に変換する。マ
ルチチャネルプレートは、内壁に２次電子増倍面を有し
た複数を管を束ねた電子増倍装置であり、この管内を通
過する電子を増幅する。マルチチャネルプレートの電子
の入射部と出射部との間には一定の電圧が印加されるこ
ととしてあり、この電圧を印加する（ゲートをかける）
ことによりかかるゲート付イメージインテンシファイア
１０１ａ，１０１ｂは動作する構成としてある。
【００２７】そして、このゲート付イメージインテンシ
ファイア１０１ａ，１０１ｂから出力された蛍光像は、
−４０℃程度に冷却したＣＣＤカメラ１０２ａおよび１
０２ｂでそれぞれ撮像される。なお、ゲート付イメージ
インテンシファイア１０１ａ，１０１ｂには、ゲート制
御回路６０ａからレーザ光源４０ａのパルス発光に遅れ
て同時にトリガが入力されて、一定の時間の間のみその
出力がされる。このトリガは、ゲート付イメージインテ
ンシファイア１０１ａ，１０１ｂからの出力が試料ＳＭ
の蛍光寿命の終了前に２つの時間域（第１時間域：
Ｔ1 、第２時間域：Ｔ2 とする）で行われるように設定
され、ＣＣＤカメラ１０２ａおよび１０２ｂでは、この
２つの時間域での空間分解した蛍光強度が得られる。
【００２８】なお、ＣＣＤカメラ１０２ａおよび１０２
ｂのピクセルあたりの各時間域での蛍光強度の時間積分
値をピクセル蛍光量と定義し、全ピクセルの各時間域で
の蛍光強度の時間積分値の総和（空間積分値）を蛍光量
と定義する。ＣＣＤカメラ１０２ａおよび１０２ｂから
の信号電荷は、それぞれＡ／Ｄ変換器５０１ａ，５０１
ｂでアナログ／デジタル変換されてフレームメモリ５０
ａおよび５０ｂに格納される。よって、各フレームメモ
リ５０ａおよび５０ｂには、ΓD およびΓA に対応した
Ｔ1 およびＴ2 でのピクセル蛍光量が記憶されることに
なる。なお、ピクセル蛍光量を演算装置５０ｃにより時
間域で積分することにより蛍光量を算出することができ
る（ΓD でのＴ1 およびＴ2 での蛍光量をそれぞれＩD1
およびＩD2とし、ΓA でのＴ1 およびＴ2 での蛍光量を
それぞれＩA1およびＩA2とする）。演算装置５０ｃで
は、この蛍光量（ＩD1，ＩD2，ＩA1，ＩA2）を演算する
ことによりエネルギー移動に係る情報を得ることができ
る。このような蛍光量およびエネルギー移動の情報は、
制御装置６０ｂに伝送され、外部出力装置であるＣＲＴ
７０上に出力することができる。
【００２９】図３は、図２に示したエネルギー移動検出
装置のさらに具体的な構成を説明するための説明図であ
り、レーザ光源４０ａから出射された励起光（コヒーレ
ント光）は、平面反射鏡１０１、励起光透過フィルタ３
０ｂおよび設置ガラス３０ａを介して試料に照射され
る。この照射により試料ＳＭから発生した蛍光は、顕微
鏡ＭＳ、で集束されてハーフミラー１００に入射する。
ハーフミラー１００は、この蛍光を２方向に分離してド
ナー波長域ΓD の透過フィルタ２０１およびアクセプタ
ー波長域ΓA の透過フィルタ２０２に照射する。これら
の透過フィルタ２０１，２０２を透過した蛍光は、図２
のエネルギー移動検出装置において説明したのと同様の
処理が施されて、ＣＲＴ７０上に蛍光量やエネルギー移
動に関する情報等が表示される。
【００３０】なお、励起光透過フィルタ３０ｂは、蛍光
の励起に必要な波長域の励起光を透過させるフィルタで
あり、外乱光や背景光などの余分な光を遮蔽する。ま
た、顕微鏡ＭＳは、試料ＳＭ側に設置された対物レンズ
ＯＬ１，ＯＬ２およびフィルタ２０１，２０２側に設置
された接眼レンズＣＬ１，ＣＬ２を備えている。
【００３１】そして、このエネルギー移動検出装置は、
試料ＳＭやＣＣＤカメラ１０１ｂ，１０２ｂへの外部か
らの外乱光の入射を遮断する遮蔽容器ＶＥを備えてお
り、より精密なエネルギー移動の検出が可能である。
【００３２】次に、このエネルギー移動検出装置の波長
選別器である透過フィルタ２０１および透過フィルタ２
０２によって分離されるドナー波長域ΓD およびアクセ
プター波長域ΓA の設定方法について説明する。
【００３３】図４は、試料から生じる蛍光の蛍光強度の
波長依存性を示すグラフである。実線はドナーからの蛍
光強度、点線はアクセプターからの蛍光強度を示してい
る。波長λ1 からλ2 の波長域をドナー波長域ΓD 、波
長λ3 以上の波長域をアクセプター波長域ΓA とする。
ここで、ドナー波長域ΓD はλ2 をアクセプターの蛍光
スペクトルの立上がり前に設定することとし、アクセプ
ター波長域ΓA はλ3をドナー蛍光量の長波長側の５％
がこの波長域ΓA に混入するように設定することとす
る。
【００３４】次に、本エネルギー移動検出装置のゲート
付イメージインテンシファイアへのゲートのかけかたに
ついて詳説する。
【００３５】図５（ａ）は、同図（ｂ）のタイミングチ
ャートに示したクロックパルスを、図２および図３に示
したエネルギー移動検出装置の制御装置６０ｂからパル
スレーザ駆動回路４０ｂに入力により蛍光物質（試料Ｓ
Ｍ）から励起された蛍光の蛍光強度の時間的変化を示す
グラフである。また、同図（ｃ）および（ｄ）は、ゲー
ト付イメージインテンシファイア１０１ａ，１０１ｂの
ゲートのかけ方を説明するタイミングチャートである。
【００３６】同図（ａ）に示される励起光の入射により
蛍光物質からは発せられた蛍光は、寿命ｔend で発光す
る。この蛍光強度の減衰から２つの時間域Ｔ1 およびＴ
2 で蛍光量は図２，３における同図（ｃ）のように、ゲ
ート付イメージインテンシファイア１０１ａ，１０１ｂ
での１回の励起によって得られた蛍光の増倍中に、ゲー
ト付イメージインテンシファイア１０１ａ，１０２ａの
ＭＣＰに２つの時間域（Ｔ1 ，Ｔ2 ）で（電圧）ゲート
をかけることによって、得ることができる（ゲート方法
Ａ）。
【００３７】また、ＣＣＤカメラ１０２ａ，１０２ｂに
おいて信号雑音比を向上させるためにＣＣＤカメラ１０
２ａ，１０２ｂをスロースキャンで駆動しつつゲート付
イメージインテンシファイア１０１ａ，１０１ｂから出
力される光像を撮像することとすると、ＣＣＤカメラ１
０２ａ，１０２ｂの１フレームの走査に時間を要するの
で、同図（ｄ）のように１回の励起によって得られた蛍
光の増倍中に、ゲート付イメージインテンシファイア１
０１ａ，１０２ａのＭＣＰに１つの時間域（Ｔ1 とす
る）で（電圧）ゲートをかけることとが望ましい。ただ
し、このままでは、Ｔ1 においてのみしかその蛍光量を
得ることができないので、２回目の励起によって得られ
た蛍光の増倍中に、ゲート付イメージインテンシファイ
ア１０１ａ，１０１ｂのＭＣＰに１つの時間域（Ｔ2 と
する）で（電圧）ゲートをかけることとする（ゲート方
法Ｂ）。
【００３８】さらに、上記ゲート方法Ａ，Ｂにおいて
は、ゲートをかけることによる所定時間域での蛍光量の
サンプリングを複数回繰り返して、得られた蛍光量を積
算することにより、Ｓ／Ｎ比を向上させることができ
る。なお、これらの方法において、ゲートはゲート付イ
メージインテンシファイア１０１ａおよび１０１ｂに同
時にかけるものとする。また、蛍光量は、ＣＣＤフレー
ム内のピクセル蛍光量を図２，３の演算装置５０ｃで積
分することにより求めることができる。
【００３９】次に、上記エネルギー移動検出装置での時
間域Ｔ1 およびＴ2 の設定方法について説明する。
【００４０】時間域Ｔ1 およびＴ2 の設定は、エネルギ
ー移動検出装置で測定する蛍光分子（発光分子）の蛍光
寿命（発光寿命）に応じて行う。エネルギー移動が生じ
るドナーとして蛍光試薬ＩＥＡＤＡＮＳ（５−（２−
（（ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏ）−ｅｔｙｌ）
ａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）、
【００４１】
【化１】
【００４２】アクセプターとして蛍光試薬テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙ
ｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ−５−（ａｎｄ−６）−ｉｓｏｔ
ｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、
【００４３】
【化２】
【００４４】が挙げられる。
【００４５】ドナーであるＩＥＡＤＡＮＳのテトラメチ
ルローダミンイソチオシアネートが存在しない条件下
（フリー）での蛍光寿命は１５ｎｓ、アクセプターであ
るテトラメチルローダミンイソチオシアネートのＩＥＡ
ＤＡＮＳが存在しない条件下（フリー）での蛍光寿命は
１．５ｎｓである。このようにドナーの蛍光寿命がアク
セプターの蛍光寿命よりも長い蛍光分子の組み合わせを
試料とした場合に、時間域Ｔ1 およびＴ2 は図６のよう
に設定する。
【００４６】図６は、１パルスの励起光の照射によりフ
リーのドナー（同図（ａ））およびフリーでのアクセプ
ター（同図（ｂ））から生じた蛍光の蛍光強度の時間的
な変化を示すグラフである。なお、同図（ｃ）は、１パ
ルスの励起光の強度の時間的な変化を示しており、縦軸
は対数表示としてある。同図に示すように、フリーのド
ナーおよびフリーのアクセプターの蛍光強度は時間の経
過とともに減衰しており、それぞれの蛍光強度の減衰が
実質的に終了する時間はｔF-D-end およびｔF-A-end で
ある。このような蛍光強度の減衰において、時間域Ｔ1
はｔF-A-end の後に、時間域Ｔ2 は、時間域Ｔ1 後であ
ってｔF-D-end の前に設定する。
【００４７】以上のようにして、試料からの蛍光をドナ
ー波長域ΓD およびアクセプター波長域ΓA に分離し、
この波長域ΓD およびΓA における時間域Ｔ1 およびＴ
2 における蛍光量（ＩD1，ＩD2，ＩA1，ＩA2）を測定す
る。
【００４８】図７は、図３に示したエネルギー移動検出
装置において、試料から生じた蛍光が透過フィルタ２０
１および透過フィルタ２０２を透過直前のこの蛍光の蛍
光強度の時間的変化を示したグラフである。この蛍光に
対して時間域Ｔ1 およびＴ2が設定されてそれぞれの時
間域での蛍光量（斜線部分）が求められることになる。
この蛍光は、透過フィルタ２０１および透過フィルタ２
０２を透過することによって波長域ΓD 、ΓA に分離さ
れて図８に示すドナーは波長域（ａ）およびアクセプタ
ー波長域（ｂ）での蛍光がゲート付イメージインテンシ
ファイア１０１ａ，１０１ｂに入力されて増倍されるこ
とになる。すなわち、これらの蛍光を時間域Ｔ1 および
Ｔ2 で時間積分するこにより、同図（ａ），（ｂ）中の
斜線で示す部分の蛍光量（ＩD1，ＩD2，ＩA1，ＩA2）を
測定・演算することができる。
【００４９】そして、エネルギー移動の有無やエネルギ
ー移動に関する情報は、このようにして得られた蛍光量
（ＩD1，ＩD2，ＩA1，ＩA2）から以下のような方法およ
び装置を用いて得ることができる。
【００５０】まず、測定された蛍光量からパラメータＺ
を演算する。なお、このパラメータＺは、 Ｚ＝｛（ＩD2／ＩD1）−（ＩA2／ＩA1）｝／（ＩD2／ＩD1）…（式１） で与えられる。
【００５１】図３の演算装置５０ｃ内には、図９に示し
た構成の回路が組み込んであり、演算装置５０ｃ内にお
ける記憶領域に記憶された蛍光量（ＩD1，ＩD2，ＩA1，
ＩA2）をこの回路に読み込んでパラメータＺを演算する
ことができる。まず、ＩD1とＩD2、ＩA1とＩA2はそれぞ
れ除算回路５０１ｃ、５０２ｃに入力される。それぞれ
の除算回路５０１ｃ、５０２ｃでは、入力されたデータ
の除算を行う。除算回路５０１ｃからの出力データ（Ｉ
D1／ＩD2）および除算回路５０２ｃからの出力データ
（ＩA1／ＩA2）は減算回路５０３ｃに入力されて（ＩD1
／ＩD2）−（ＩA1／ＩA2）が出力される。この減算回路
５０３ｃからの出力データ（ＩD1／ＩD2）−（ＩA1／Ｉ
A2）および除算回路５０１ｃからの出力データ（ＩD1／
ＩD2）は、除算回路５０４ｃに入力されてＺ＝｛（ＩD2
／ＩD1）−（ＩA2／ＩA1）｝／（ＩD2／ＩD1）で定義さ
れるパラメータを算出することができる。判定回路５０
５ｃでは、パラメータＺが入力され、Ｚが閾値ｚ0 より
も高い場合にはエネルギー移動を行っている分子が存在
していると判定し、Ｚが閾値ｚ0 よりも低い場合にはエ
ネルギー移動を行っている分子が存在しないと判定す
る。
【００５２】なお、閾値ｚ0 の設定は、エネルギー移動
に関する既知の情報（Ｔ1 、Ｔ2 、λ1 、λ2 、λ3 、
τF-D 、τF-A （蛍光寿命）、ドナー／アクセプター分
子数比率：Ｎd ／Ｎa 、エネルギー移動条件下とフリー
条件下でのドナー（またはアクセプター）の比率：Ｆ／
Ｂ、エネルギー移動効率：Ｅ* ）に応じてなされる。但
し、Ｅ* はドナーとアクセプターとの距離ｒの６乗に依
存する。また、これらの情報のうちいくつかが未知であ
る場合には、判定回路５０５ｃはエネルギー移動に関す
るこれらの情報をある範囲を有して特定することができ
る。以下詳説する。
【００５３】図１０は、時刻ｔ0 で励起されたフリーで
のドナーおよびアクセプターからの蛍光強度の時間的変
化を示した図である。同図（ａ）はドナー波長域ΓD で
のドナーからの蛍光強度（Ｉa （ｔ）とする）、同図
（ｂ）はドナー波長域ΓD でのアクセプターからの蛍光
強度（Ｉb （ｔ）とする）、同図（ｃ）はアクセプター
波長域ΓA でのドナーからの蛍光強度（Ｉc （ｔ）とす
る）、同図（ｄ）はアクセプター波長域ΓA でのアクセ
プターからの蛍光強度（Ｉd （ｔ）とする）をそれぞれ
示している。
【００５４】各蛍光強度の時刻ｔにおける減衰は、 Ｉa （ｔ）＝Ａｅｘｐ（−ｔ／τF-D ） …（式２） Ｉb （ｔ）＝０ …（式３） Ｉc （ｔ）＝Ｃｅｘｐ（−ｔ／τF-D ） …（式４） Ｉd （ｔ）＝Ｄｅｘｐ（−ｔ／τF-A ） …（式５） Ａ〜Ｄは定数で表される。
【００５５】よって、フリーの状態でのドナーおよびア
クセプターの蛍光強度の減衰を計測すれば、τF-D ，τ
F-A および時間域Ｔ1 およびＴ2 における蛍光量を演算
装置により演算して求めることができる。
【００５６】一方、これらのドナーおよびアクセプター
が近接（約８ｎｍ以内）している場合（フリーでない場
合：エネルギー移動条件とする）には、ドナーとアクセ
プターとの間でエネルギー移動が生じる。このようなエ
ネルギー移動をし得る条件下でドナーおよびアクセプタ
ーを励起した場合には、フリーでのドナーおよびアクセ
プターからの蛍光の他にエネルギー移動条件下でのドナ
ーおよびアクセプターからの蛍光が観測される。
【００５７】図１１は、このような条件下にあるドナー
およびアクセプターからの蛍光強度の時間依存性を示す
図である。同図（ａ）は、フリー条件でのドナー波長域
ΓDでのドナーからの蛍光強度（Ｉa （ｔ）とする）、
同図（ｂ）はフリー条件でのドナー波長域ΓD でのアク
セプターからの蛍光強度（Ｉb （ｔ）とする）、同図
（ｃ）はフリー条件でのアクセプター波長域ΓA でのド
ナーからの蛍光強度（Ｉc （ｔ）とする）、同図（ｄ）
はフリー条件でのアクセプター波長域ΓA でのアクセプ
ターからの蛍光強度（Ｉd （ｔ）とする）をそれぞれ示
している。
【００５８】また、同図（ｅ）は、エネルギー移動条件
でのドナー波長域ΓD でのドナーからの蛍光強度（Ｉe
（ｔ）とする）、同図（ｆ）はエネルギー移動条件での
ドナー波長域ΓD でのアクセプターからの蛍光強度（Ｉ
f （ｔ）とする）、同図（ｇ）はエネルギー移動条件で
のアクセプター波長域ΓA でのドナーからの蛍光強度
（Ｉg （ｔ）とする）、同図（ｈ）はエネルギー移動条
件でのアクセプター波長域ΓA でのアクセプターからの
蛍光強度（Ｉh （ｔ）とする）をそれぞれ示している。
【００５９】そして、エネルギー移動条件下のドナーか
らエネルギー移動条件下のアクセプターにエネルギー移
動がおこることにより、このドナーの蛍光寿命は短くな
る（蛍光寿命τE-DA）。ドナーの蛍光寿命は短くなるこ
とにより、波長域ΓD における時間域Ｔ2 ではこのドナ
ーからの蛍光が観察されなくなり、また、波長域ΓA に
おける時間域Ｔ2 でのこのドナーからの蛍光は観察され
なくなる。また、アクセプターの蛍光強度が減衰するの
に要する時間が長くなることにより、波長域ΓA におけ
る時間域Ｔ1 でのこのアクセプターからの蛍光が観察さ
れることとなる。
【００６０】各蛍光強度の時刻ｔにおける減衰は、 Ｉa （ｔ）＝Ａｅｘｐ（−ｔ／τF-D ） …（式６） Ｉb （ｔ）＝０ …（式７） Ｉc （ｔ）＝Ｃｅｘｐ（−ｔ／τF-D ） …（式８） Ｉd （ｔ）＝Ｄｅｘｐ（−ｔ／τF-A ） …（式９） Ｉe （ｔ）＝Ｅｅｘｐ（−ｔ／τE-DA） …（式１０） Ｉf （ｔ）＝０ …（式１１） Ｉg （ｔ）＝Ｇｅｘｐ（−ｔ／τE-DA） …（式１２） Ｉh （ｔ）＝Ｈ1 Ｉd （ｔ）＋Ｈ2 Ｉe （ｔ） …（式１３） で表される。
【００６１】但し、Ａ〜Ｈ1,2 は定数、τE-DAはエネル
ギー移動を起こしているドナーの蛍光寿命である。
【００６２】また、 Ｅ* ＝１−（τE-DA／ｔF-DA） …（式１４） ∫t=∞ （Ｉa （ｔ））ｄｔ×５％ ＝∫t=∞ （Ｉc （ｔ））ｄｔ…（式１５） （Ｆ／Ｂ） ＝∫t=∞ （Ｉa （ｔ））ｄｔ／∫t=∞ （Ｉe （ｔ））ｄｔ…（式１６） （Ｆ／Ｂ） ＝∫t=∞ （Ｉc （ｔ））ｄｔ／∫t=∞ （Ｉg （ｔ））ｄｔ…（式１７） （Ｆ／Ｂ） ＝∫t=∞ （Ｉd （ｔ））ｄｔ／∫t=∞ （Ｉh （ｔ））ｄｔ、（ＮD ／ＮA ＝１） …（式１８） であるので、 ＩD1＝∫T1（Ｉa （ｔ））ｄｔ＋∫T1（Ｉe （ｔ））ｄｔ…（式１９） ＩD2＝∫T2（Ｉa （ｔ））ｄｔ＋∫T2（Ｉe （ｔ））ｄｔ…（式２０） ＩA1＝∫T1（Ｉc （ｔ））ｄｔ＋∫T1（Ｉg （ｔ））ｄｔ ＋∫T1（Ｉd （ｔ））ｄｔ＋∫T1（Ｉh （ｔ））ｄｔ…（式２１） ＩA2＝∫T2（Ｉc （ｔ））ｄｔ＋∫T2（Ｉd （ｔ））ｄｔ ＋∫T2（Ｉg （ｔ））ｄｔ＋∫T2（Ｉh （ｔ））ｄｔ…（式２２） （ただし、∫T2（Ｉe （ｔ））ｄｔ，∫T1（Ｉ
d （ｔ））ｄｔ，∫T2（Ｉd （ｔ））ｄｔ，∫T2（Ｉg
（ｔ））ｄｔ，∫T2（Ｉh （ｔ））ｄｔ≒０）からＩD1
／ＩD2およびＩA1／ＩA2を演算することができ、パラメ
ータＺはこれらの値から（式１）により演算することが
できる。
【００６３】図１２は、上式により算出される時間域Ｔ
2 を２１〜２７ｎｓと設定した場合のパラメータＺの時
間域Ｔ1 依存性を示す図である。同図では、簡単のた
め、ｔ F-D-end ＝１５ｎｓ、ｔA-D-end ＝１．５ｎｓ，
λ1 ＝４６０ｎｍ、λ2 ＝５１０ｎｍ、λ3 ＝５３０ｎ
ｍ、ＮD ／ＮA ＝１とてＺを演算した。なお、同図では
エネルギー移動効率Ｅ* およびエネルギー移動条件下と
フリー条件下でのドナー（またはアクセプター）の比率
（Ｆ／Ｂ）の値を変化させて、これらの値の場合のパラ
メータＺの値も示してある。なお、図１３は、図１２と
時間域以外は同様のパラメータを設定し、上式により算
出される時間域Ｔ1 を９〜１２ｎｓと設定した場合のパ
ラメータＺの時間域Ｔ2 依存性を示す図である。
【００６４】すなわち、図１２または図１３においてＺ
が０．０４９以上では、ドナー／アクセプター間でエネ
ルギー移動が行われていることがわかる。すなわち、閾
値ｚ0 をｚ0 ＝０．０４９と設定することができるの
で、図２または図３に示したエネルギー移動検出装置で
測定・演算されたパラメータＺの値が閾値ｚ0 よりも大
きければ、エネルギー移動を行っている分子が存在する
と判定し、閾値ｚ0 よりも小さければ、エネルギー移動
を行っている分子が存在しないと判定することができ
る。
【００６５】また、図１２および図１３から、閾値ｚ1
を０．１１６と設定した場合には、測定されたＺがｚ1
よりも大きい場合には同図からエネルギー移動効率Ｅ*
が０．３〜０．７でエネルギー移動を行っている分子が
存在すると判定し、また、ｚ1 よりも小さい場合には同
図からエネルギー移動効率Ｅ* が０．３〜０．７でエネ
ルギー移動を行っている分子が存在しないと判定するこ
とができる。すなわち、図１４は、パラメータＺのエネ
ルギー移動効率Ｅ* 依存性を示すグラフである。同図か
ら明らかなように、ＺはＥ* に密接に関連しており、測
定により得られたＺがｚ0 ＝０．０４９以下では、エネ
ルギー移動が存在しないと判定することができる。な
お、同図では（Ｆ／Ｂ）＝２０とし、２１≦Ｔ2 ≦２７
としてある。また、この対応図から測定されたＺがｚ1
＝０．１１６以上では、エネルギー移動効率Ｅ* が０．
３以上０．７以下であると判断することができる。Ｅ*
はドナーとアクセプターとの距離ｒの６乗に反比例する
ので、このエネルギー移動効率Ｅ* の値から距離ｒを同
定することができる。さらに、上記Ｚを決定する（エネ
ルギー移動に関する情報を有する）パラメータのいずれ
かが未知である場合には、この未知のパラメータの範囲
を算出でき、エネルギー移動に関する情報を得ることが
できることはいうまでもない。
【００６６】本発明を実証すべく、図３に示したエネル
ギー移動検出装置を用いて実験を行い、上記パラメータ
Ｚを測定・演算することにより、実際にエネルギー移動
の判定を行った。
【００６７】測定試料には、上記エネルギー移動が生じ
るドナーとして蛍光試薬ＩＥＡＤＡＮＳ（５−（２−
（（ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏ）−ｅｔｙｌ）
ａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）…（蛍光分子Ｄとする）を用い、ア
クセプターとして蛍光試薬テトラメチルローダミンイソ
チオシアネート（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍ
ｉｎｅ−５−（ａｎｄ−６）−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎ
ａｔｅ）…（蛍光分子Ａとする）を用いた。
【００６８】（実験手順）まず、タンパク質であるスト
レプトアビジンを蛍光分子Ｄで標識したもの、蛍光分子
Ｄで標識したもの、蛍光分子ＤおよびＡの双方で標識し
たものを用意した。すなわち、ストレプトアビジンには
蛍光分子Ｄが、
【００６９】
【化３】
【００７０】のように標識され、蛍光分子Ａが、
【００７１】
【化４】
【００７２】のように標識された。
【００７３】蛍光分子Ｄと蛍光分子Ａとで２重標識され
たストレプトアビジンでは、これらの蛍光分子が近接し
ているので蛍光分子Ｄから蛍光分子Ａへエネルギー移動
が起こる。次に、図３に示したエネルギー移動検出装置
において、トリガにより動作するゲート付イメージイン
テンシファイア１０１ａ，１０１ｂの動作時間域を変化
させて、蛍光分子Ａおよび蛍光分子Ｂの蛍光寿命を測定
した。この測定により得られた蛍光分子Ｄから蛍光分子
Ａの蛍光寿命は、それぞれ１５ｎｓおよび１．５ｎｓで
あった。
【００７４】次に、試料からの蛍光量を測定した。これ
らの試料の励起にはレーザ光源４０ａとして波長３３７
ｎｍの窒素レーザを用い、フィルタ２０１および２０２
を透過する波長域Γ1 およびΓ2 はそれぞれ４６０〜５
１０ｎｍおよび５３０〜ｎｍに設定した。なお、この測
定にあたってゲート付イメージインテンシファイア１０
１ａ，１０１ｂの動作する時間域Ｔ1 およびＴ2 は、そ
れぞれ９〜１２ｎｓおよび２１〜２７ｎｓに設定した。
【００７５】まず、蛍光分子Ｄで標識されたストレプト
アビジン（１μＭ）と蛍光分子Ａで標識されたストレプ
トアビジン（１μＭ）とを水溶液中で混合した試料の蛍
光量（ＩD1，ＩD2，ＩA1，ＩA2）を測定した（実験
１）。また、この蛍光量の測定においては、蛍光分子Ｄ
から蛍光分子Ａへのエネルギー移動は生じない。
【００７６】蛍光量の測定の結果、 ＩD2／ＩD1＝０．８２０ ＩA2／ＩA1＝０．７８０ が得られた。
【００７７】次に、蛍光分子Ｄで標識されたストレプト
アビジン（１μＭ）、蛍光分子Ａで標識されたストレプ
トアビジン（１μＭ）および蛍光分子Ｄおよび蛍光分子
Ａで２重標識されたストレプトアビジン（０．０５μ
Ｍ）を水溶液中で混合した試料からの蛍光量（ＩD1，Ｉ
D2，ＩA1，ＩA2）を測定した（実験２）。この試料は、
エネルギー移動を起こす分子（蛍光分子Ｄおよび蛍光分
子Ａで２重標識されたストレプトアビジン）が全体の５
％、エネルギー移動を起こさない分子（蛍光分子Ｄで標
識されたストレプトアビジン（１μＭ）、蛍光分子Ａで
標識されたストレプトアビジン）が全体の９５％を構成
している（すなわち、Ｆ／Ｂ＝２０）。
【００７８】蛍光量の測定の結果、 ＩD2／ＩD1＝０．７４１ ＩA2／ＩA1＝０．６０１ が得られた。
【００７９】実験１および２の結果から演算装置により
算出されるパラメータＺの値は、それぞれ、 Ｚ＝０．０４９ …実験１ Ｚ＝０．１８９ …実験２ であった。
【００８０】以上の結果から、本実施例ではエネルギー
移動検出方法およびその装置を用いてパラメータＺに基
づいて判定することにより（図１２〜１４参照）、実験
１ではエネルギー移動を起こしている分子は存在せず、
また、実験２ではエネルギー移動を起こしている分子が
存在していることが判定できた。なお、閾値ｚ0 は０．
０４９である。また、これらの実験結果から、ｚ0 が
０．１１６以上の場合には、エネルギー移動効率Ｅ* が
０．３以上で０．７以下の分子が存在していると判定す
ることができる。すなわち、実験２でのこのような条件
（ｚ0 が０．１１６以上）が適合し、エネルギー移動効
率Ｅ* をある程度同定することができる。前述のよう
に、エネルギー移動効率Ｅ* はドナーとアクセプターと
の距離ｒの６乗に反比例するので、距離ｒを同定するこ
とができる。
【００８１】本発明は前述の実施例に限らず様々な変形
が可能である。
【００８２】すなわち、図３に示したエネルギー移動検
出装置では、波長の選別を行うフィルタを用いて波長を
分離し、Ｉ・Ｉ管で増幅される蛍光の時間域を設定した
が、これは、プリズムや回折格子を用いて波長を選別
し、ストリーク管を用いて増幅される蛍光の時間域を設
定する構成としてもよい。
【００８３】図１５は、このような構成としたエネルギ
ー移動検出装置の構成を説明するための説明図である。
このエネルギー移動検出装置では、レーザ光源４０ａを
パルスレーザ駆動回路４０ｂを用いてパルス駆動し、光
の照射と同時に試料ＳＭから蛍光が発生する。この照射
により試料ＳＭから発生した蛍光は、顕微鏡ＭＳ、で集
束されてスリット５０１、励起光カットフィルタ５０２
および回折格子（プリズム）５００を介してストリーク
管ＳＲに入射される。励起光カットフィルタ５０２は、
このフィルタを透過する蛍光の微弱光の検出の際のノイ
ズとなる励起光（窒素レーザからのコヒーレント光）成
分をカットし、回折格子５００は、これを透過する蛍光
を波長域ΓD ，ΓA に分離する。
【００８４】従って、ストリーク管ＳＲには２次元的に
波長の広がりを有した蛍光が入射されることとなる。ス
トリーク管ＳＲは、ピコ〜フェムトセカント秒の時間域
を設定できる超高速光現象の測定装置であり、出願人の
製造する浜松ホトニクス社製Ｎ３３７３シリーズはこの
ような時間域の設定に特に優れたものである。ストリー
ク管ＳＲは、蛍光の入射する面には光電面を備え、光電
変換された電子を電子軌道上に設置された偏向電極で偏
向し、さらに出力側にこの電子を蛍光に変換する蛍光面
を備えている。時間域の設定は電子の軌道を走査する偏
向電極に印加する掃引電圧により設定する。掃引電圧
は、掃引電圧発生回路５０３から偏向電極に供給され
る。ストリーク管ＳＲから出力された蛍光は、図３と同
様のＣＣＤカメラ１０２ａで撮像される。
【００８５】図１６は、このＣＣＤカメラ１０２ａの受
光領域に入射する蛍光像を示したものである。この蛍光
像は、横方向に回折格子５００により波長ごとに分離さ
れ、縦方向にストリーク管ＳＲで掃引されることにより
時間分割されている。そしてこの受光領域のＲ１〜４に
対応する領域の蛍光量を演算装置５０ｃで積算すること
により、蛍光量（ＩD1，ＩD2，ＩA1，ＩA2）を求めるこ
とができる。このエネルギー移動検出装置の他の構成は
図３に示したものと同様である。演算装置５０ｃで蛍光
量（ＩD1，ＩD2，ＩA1，ＩA2）を演算することによりエ
ネルギー移動に係る情報を得ることができる。このよう
な蛍光量およびエネルギー移動の情報は、制御装置６０
ｂに伝送され、ＣＲＴ７０上に出力することができる。
【００８６】以上の通り、本実施例によれば、ストリー
ク管ＳＲを用いることにより、高精度の時間域の設定を
行うことができた。また、波長の分離に回折格子５００
を用いることとしたので、光検出器として１つのＣＣＤ
カメラ１０２ａでドナーおよびアクセプターからの蛍光
の分離を行うことができ、従って、ドナーおよびアクセ
プターの時間域の設定に時間の遅延が生じることがな
い。
【００８７】なお、上記実施例では、パラメータＺを用
いてエネルギー移動の判定を行ったが、これは各種のケ
ースに対応した判定関数を蛍光試薬ごとに作成してお
き、実験者が自分の必要とする情報を判定するための数
値（Ｚ＞ｚ0 ）を参照できるようにしておくと便利であ
る。
【００８８】また、上記実施例では、ドナー／アクセプ
ターの組み合わせとしてＩＡＥＤＡＮＳ／テトラメチル
ローダミンを用いたが、これらの蛍光分子（発光分子）
の組み合わせはドナーの蛍光寿命がアクセプターの蛍光
寿命よりも長く、アクセプターが発光し、これらドナー
の発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとが
重なりを有するものであればよく、例えば、フルオロエ
ッセン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）／テトラメチルロー
ダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎ）の
組み合わせ（蛍光寿命の比＝４）を用いることとしても
よい。
【００８９】以上のように、上記実施例ではエネルギー
移動を起こしていない分子が多数存在する条件において
も、エネルギー移動を起こしている少数の分子が存在す
ることを検出することが可能となる。このようなエネル
ギー移動の現象を生体内における微量物質の検出および
定量に利用する方法は非常に有効である。
【００９０】すなわち、微量物質の検出および定量にお
いて最も汎用性のある方法は、目的の物質に特異的に結
合する分子（検出する分子がタンパク質ならば抗体、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡならば相補的オリゴヌクレオチド、以下プ
ローブという）を加えて、その結合量を定量する方法が
あるが、この手法を生細胞を対象として行うときには、
目的の分子に結合しないフリーのプローブの存在が問題
となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出であれば、フリーの
プローブを洗い流すことができるが、ｉｎ ｖｉｖｏで
は一般的には洗い流すことはできない。すなわち、エネ
ルギー移動を起こしえない分子が多数存在することにな
る。
【００９１】また、対象となる分子が少量になってくる
と、プローブの非特異的な吸着も問題となる。すなわ
ち、目的の分子に結合したプローブからのシグナルが、
フリーのプローブのシグナルや非特異的吸着をした状態
のプローブから出るシグナルと、目的の分子に特異的に
結合したプローブから出るシグナルとが異なる。本発明
のエネルギー移動をこのプローブに利用すれば、プロー
ブが目的の分子に特異的に結合するとこれから発するシ
グナルが変化するように設計することができる。
【００９２】例えば、ある塩基配列を有するＤＮＡまた
はＲＮＡを検出するときには、それぞれの端末をそれぞ
れ異なる蛍光試薬で標識した２種類のオリゴヌクレオチ
ドプローブを用意し、これらをＤＮＡまたはＲＮＡ上の
特定の領域に２〜７塩基離れてハイブリダイズさせるこ
とにより、２種類の蛍光試薬間のエネルギー移動を測定
することによって、目的のＤＮＡ／ＲＮＡを検出するこ
とができる（Ｈｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ ｅｔ ａｌ．，１
９８３，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ ０７０６８５、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ
ａｎｄ Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ，Ｅ．Ｊ．，１９８７，Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ ２２９９４３）。
【００９３】しかし、ｉｎ ｖｉｖｏなどの結合しない
プローブを洗い流すことはできない条件下では、エネル
ギー移動を起こしえない分子が多数存在し、従来、この
ようなエネルギー移動をＤＮＡシ−クエンシングに利用
するこたができなかった。本発明のエネルギー移動検出
方法およびその装置は、これらの問題を解決して生細胞
内における測定のように、結合しないプローブを洗い流
すことはできない条件下においてもエネルギー移動を検
出することができる。
【００９４】
【発明の効果】本発明のエネルギー移動検出法によれ
ば、励起光の照射により発生した発光（蛍光）を波長選
別器を用いる等して少なくとも２つの異なる波長域で測
定するとともに相異なる波長域で測定される発光（蛍
光）の経時的な変化を少なくとも２つの時間域で評価
（測定）することとしたので、エネルギー移動を起こし
ていない分子が多数存在する条件においても、エネルギ
ー移動を起こしている少数の分子が存在することを検出
することが可能となる。また、本発明のエネルギー移動
検出装置によれば、エネルギー移動の有無や種々の微量
物質の量や性質を判定するパラメータの同定を行うこと
ができる。エネルギー移動は、特に、これらの発光（蛍
光）分子間の距離に依存するので、ＤＮＡやＲＮＡの１
次構造上の変化や遺伝子の発現の有無等の遺伝子情報の
解析において、これらにハイブリダイゼーションする相
補的な核酸に標識された発光（蛍光）分子のエネルギー
移動の情報を検出することにより、核酸塩基配列の決定
精度を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例に係るエネルギー移動検出装
置の構成図である。
【図２】本発明の一実施例に係るエネルギー移動検出装
置の構成図である。
【図３】本発明の一実施例に係るエネルギー移動検出装
置の構成図である。
【図４】波長域の設定の方法を説明するための説明図で
ある。
【図５】時間域の設定の方法を説明するための説明図で
ある。
【図６】時間域の設定の方法を説明するための説明図で
ある。
【図７】時間域および波長域の設定の方法を説明するた
めの説明図である。
【図８】時間域および波長域の設定の方法を説明するた
めの説明図である。
【図９】本発明の一実施例に係るエネルギー移動の演算
装置内でパラメータＺを演算するための回路構成図であ
る。
【図１０】パラメータＺと判定の方法を説明するための
蛍光強度の時間的な変化を示したグラフである。
【図１１】パラメータＺと判定の方法を説明するための
蛍光強度の時間的な変化を示したグラフである。
【図１２】パラメータＺの（Ｆ／Ｂ）、Ｅ* および時間
域の依存性を示すグラフである。
【図１３】パラメータＺの（Ｆ／Ｂ）、Ｅ* および時間
域の依存性を示すグラフである。
【図１４】パラメータＺのＥ* 依存性を示すグラフであ
る。
【図１５】本発明の一実施例に係るエネルギー移動検出
装置の構成図である。
【図１６】ＣＣＤカメラの受光領域に入射する蛍光像を
示した図である。
【符号の説明】
１０…ゲート付光検出器、２０…波長選別器、３０…試
料ホルダ、４０…励起光源、５０…データ処理部、６０
…処理装置。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 発光寿命の異なる２以上の発光分子へ励
    起光を照射するとともに、この照射により生じた前記発
    光分子からの発光を光検出器で測定することにより、前
    記発光分子間で生じるエネルギー移動を検出するエネル
    ギー移動検出法において、 前記発光を少なくとも２つの異なる波長域で測定すると
    ともに、各波長域で経時的に変化する発光を少なくとも
    ２つの時間域で評価し、得られた各波長域における各時
    間域の発光を評価することにより前記発光分子間のエネ
    ルギー移動を検出することを特徴とするエネルギー移動
    検出法。
  2. 【請求項２】 蛍光寿命の異なる２以上の蛍光分子へ励
    起光を照射するとともに、この照射により生じた前記蛍
    光分子からの蛍光を光検出器で測定することにより、前
    記蛍光分子間で生じるエネルギー移動を検出するエネル
    ギー移動検出法において、 前記蛍光を少なくとも２つの異なる波長域で測定すると
    ともに、各波長域で経時的に変化する蛍光を少なくとも
    ２つの時間域で測定し、得られた各波長域における各時
    間域の蛍光を評価することにより前記蛍光分子間のエネ
    ルギー移動を検出することを特徴とするエネルギー移動
    検出法。
  3. 【請求項３】 蛍光寿命の異なる２以上の蛍光分子へ励
    起光を照射するとともに、この照射により生じた前記蛍
    光分子からの蛍光を光検出器で測定することにより、前
    記蛍光分子間で生じるエネルギー移動を検出するエネル
    ギー移動検出法において、 前記蛍光を波長選別器を用いて第１および第２の波長域
    に分離した後、前記光検出器を用いて前記第１および第
    ２の波長域に分離された蛍光の時間的な変化が第１およ
    び第２の時間域に分割されるように測定して、得られた
    各波長域における各時間域の蛍光を評価することにより
    前記蛍光分子間のエネルギー移動を検出することを特徴
    とするエネルギー移動検出法。
  4. 【請求項４】 前記第１の時間域を前記蛍光分子の一方
    の蛍光強度の減衰が実質的に終了する時間と前記蛍光分
    子がエネルギー移動を起こした場合の蛍光強度の減衰が
    実質的に終了する時間との間に設定し、前記第２の時間
    域を前記蛍光分子がエネルギー移動を起こした場合の蛍
    光強度の減衰が実質的に終了する時間と前記蛍光分子の
    他方の蛍光強度の減衰が実質的に終了する時間との間に
    設定することを特徴とする請求項３に記載のエネルギー
    移動検出法。
  5. 【請求項５】 各時間域の蛍光を評価を、前記第１の波
    長域で得られた前記第１の時間域の蛍光と前記第２の時
    間域の蛍光との割合と、前記第２の波長域で得られた前
    記第１の時間域の蛍光と前記第２の時間域の蛍光との割
    合との差が、前記第１の波長域で得られた前記第１の時
    間域の蛍光と前記第２の時間域の蛍光との割合に占める
    比率に基づいて行うことを特徴とする請求項４に記載の
    エネルギー移動検出法。
  6. 【請求項６】 蛍光寿命の異なる２以上の蛍光分子へ励
    起光を照射する光源と、 前記照射により生じた前記蛍光分子からの前記蛍光を第
    １および第２の波長域に分離する波長選別器と、 前記第１および第２の波長域の蛍光をそれぞれ検出する
    光検出器と、 前記光検出器で検出された前記第１および第２の波長域
    の蛍光の経時的な変化を第１および第２の時間域に分割
    する処理装置と、を備え、 前記光検出器で検出した前記第１および第２の波長域の
    蛍光の前記第１および第２の時間域における蛍光量に基
    づいて、前記蛍光分子間で生じるエネルギー移動を検出
    するエネルギー移動検出装置。
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