JPH1189598A - 蛍光標識プローブ及びハイブリダイゼーション検出方法 - Google Patents
蛍光標識プローブ及びハイブリダイゼーション検出方法Info
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- JPH1189598A JPH1189598A JP9253463A JP25346397A JPH1189598A JP H1189598 A JPH1189598 A JP H1189598A JP 9253463 A JP9253463 A JP 9253463A JP 25346397 A JP25346397 A JP 25346397A JP H1189598 A JPH1189598 A JP H1189598A
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- fluorescent substance
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料には処理を施さずにＳ／Ｎを向上させて
高感度でハイブリダイゼーションを検出する。 【解決手段】 １つのプローブ１２を複数個の部分プロ
ーブ１２ａ，１２ｂに分割し、分割した部分プローブに
各々異なる蛍光物質１４ａ，１４ｂを標識させた分割構
成のプローブを用いる。プローブとサンプルＤＮＡ１１
がハイブリダイズすると、分割した部分プローブ１２
ａ、１２ｂが１つのプローブを構成する。蛍光励起光１
９として断続光線を用い、蛍光物質１４ａを励起したと
き蛍光物質１４ｂが発光する多段階励起蛍光１８を光照
射されていない期間に検出する。
高感度でハイブリダイゼーションを検出する。 【解決手段】 １つのプローブ１２を複数個の部分プロ
ーブ１２ａ，１２ｂに分割し、分割した部分プローブに
各々異なる蛍光物質１４ａ，１４ｂを標識させた分割構
成のプローブを用いる。プローブとサンプルＤＮＡ１１
がハイブリダイズすると、分割した部分プローブ１２
ａ、１２ｂが１つのプローブを構成する。蛍光励起光１
９として断続光線を用い、蛍光物質１４ａを励起したと
き蛍光物質１４ｂが発光する多段階励起蛍光１８を光照
射されていない期間に検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンプルＤＮＡと
プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを利用して
サンプルＤＮＡに目的とするＤＮＡ配列が存在するか否
かを分析するハイブリダイゼーション検出法に関する。
プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションを利用して
サンプルＤＮＡに目的とするＤＮＡ配列が存在するか否
かを分析するハイブリダイゼーション検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、生体内の分子を同定・分画す
るために、特に目的ＤＮＡの検出、あるいは遺伝子ＤＮ
Ａの有無検出などのために、既知の配列をもつ核酸や蛋
白質をプローブとしてハイブリダイズする方法が多く用
いられてきた。しかし、生化学実験で用いられる試料の
多くは微量なため、その分析には非常に高い検出感度が
要求される。従って、従来はプローブを放射性同位体で
標識し、試料とハイブリダイズさせた後にＸ線フィルム
などに露光してハイブリダイゼーションを検出し、試料
の同定を行っていた。
るために、特に目的ＤＮＡの検出、あるいは遺伝子ＤＮ
Ａの有無検出などのために、既知の配列をもつ核酸や蛋
白質をプローブとしてハイブリダイズする方法が多く用
いられてきた。しかし、生化学実験で用いられる試料の
多くは微量なため、その分析には非常に高い検出感度が
要求される。従って、従来はプローブを放射性同位体で
標識し、試料とハイブリダイズさせた後にＸ線フィルム
などに露光してハイブリダイゼーションを検出し、試料
の同定を行っていた。
【０００３】しかし、放射性同位体は危険であり、取り
扱いを厳重に管理しなくてはならない。そのため、近年
では、放射性同位体に代わって蛍光や化学発光を用いた
高感度検出方法が開発されている。特に蛍光法は、化学
発光法に比べて平面上の発光パターンをイメージとして
読み取りやすいため、平面上の試料の検出によく利用さ
れている。この方法では、蛍光標識した試料にレーザ光
を照射して蛍光物質を励起し、その蛍光物質から発する
蛍光の強度分布を測定することで試料の同定を行う。発
光パターンを読み取る装置の例は、特公平８−３４８１
号公報に記載されている。
扱いを厳重に管理しなくてはならない。そのため、近年
では、放射性同位体に代わって蛍光や化学発光を用いた
高感度検出方法が開発されている。特に蛍光法は、化学
発光法に比べて平面上の発光パターンをイメージとして
読み取りやすいため、平面上の試料の検出によく利用さ
れている。この方法では、蛍光標識した試料にレーザ光
を照射して蛍光物質を励起し、その蛍光物質から発する
蛍光の強度分布を測定することで試料の同定を行う。発
光パターンを読み取る装置の例は、特公平８−３４８１
号公報に記載されている。
【０００４】また、試料とプローブを異なる蛍光物質で
標識し、ハイブリダイズを行った後に多段階励起でハイ
ブリダイゼーションを検出する方法も知られている。図
２は、この方法の原理を説明する図である。図２（ａ）
に示すようにサンプルＤＮＡ１１を蛍光物質１３で標識
するとともに、図２（ｂ）に示すようにプローブＤＮＡ
１２を蛍光物質１４で標識する。蛍光物質１３と蛍光物
質１４は異なる励起波長及び異なる蛍光波長を有するも
のである。蛍光物質１３，１４で標識したこれらのサン
プルＤＮＡ１１及びプローブＤＮＡ１２を、ハイブリダ
イゼーション溶液１５中に混合する。ハイブリダイゼー
ション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, tris
odium citrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfat
e）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、
蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用する
ＤＮＡの性質により異なる。
標識し、ハイブリダイズを行った後に多段階励起でハイ
ブリダイゼーションを検出する方法も知られている。図
２は、この方法の原理を説明する図である。図２（ａ）
に示すようにサンプルＤＮＡ１１を蛍光物質１３で標識
するとともに、図２（ｂ）に示すようにプローブＤＮＡ
１２を蛍光物質１４で標識する。蛍光物質１３と蛍光物
質１４は異なる励起波長及び異なる蛍光波長を有するも
のである。蛍光物質１３，１４で標識したこれらのサン
プルＤＮＡ１１及びプローブＤＮＡ１２を、ハイブリダ
イゼーション溶液１５中に混合する。ハイブリダイゼー
ション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（NaCl, tris
odium citrate）、ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfat
e）、ＥＤＴＡ（ethylenediamidetetraacetic acid）、
蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用する
ＤＮＡの性質により異なる。
【０００５】このとき、サンプルＤＮＡ１１とプローブ
ＤＮＡ１２が相補鎖ＤＮＡであれば、図２（ｃ）に示す
ように、両者はハイブリダイゼーションして二重らせん
構造で結合する。一方、両者が相補鎖ＤＮＡでなけれ
ば、図２（ｄ）に示すように非結合のままである。サン
プルＤＮＡとプローブＤＮＡのハイブリダイゼーション
を検出するために、すなわち両ＤＮＡが結合しているか
否かを検出するために、連続光源から蛍光物質１３を発
光させるが蛍光物質１４を発光させることのできない励
起光１６を照射する。サンプルＤＮＡ１１とプローブＤ
ＮＡ１２がハイブリダイゼーションしていれば、図２
（ｅ）に示すように、蛍光物質１３の近傍に蛍光物質１
４が存在するため蛍光物質１３の励起エネルギー１７が
蛍光物質１４に移行し、蛍光物質１４から蛍光１８が発
せられる。一方、サンプルＤＮＡ１１とプローブＤＮＡ
１２がハイブリダイゼーションしていなければ、図２
（ｆ）に示すように、サンプルＤＮＡ１１に標識された
蛍光物質１３とプローブＤＮＡ１２に標識された蛍光物
質１４の間の距離が離れているため、蛍光物質１３のエ
ネルギーが蛍光物質１４に移ることができず蛍光物質１
４は蛍光を発しない。このようにして、試料から放出さ
れる蛍光波長を観察することにより、サンプルＤＮＡ１
１とプローブＤＮＡ１２のハイブリダイゼーションを検
出することができる。
ＤＮＡ１２が相補鎖ＤＮＡであれば、図２（ｃ）に示す
ように、両者はハイブリダイゼーションして二重らせん
構造で結合する。一方、両者が相補鎖ＤＮＡでなけれ
ば、図２（ｄ）に示すように非結合のままである。サン
プルＤＮＡとプローブＤＮＡのハイブリダイゼーション
を検出するために、すなわち両ＤＮＡが結合しているか
否かを検出するために、連続光源から蛍光物質１３を発
光させるが蛍光物質１４を発光させることのできない励
起光１６を照射する。サンプルＤＮＡ１１とプローブＤ
ＮＡ１２がハイブリダイゼーションしていれば、図２
（ｅ）に示すように、蛍光物質１３の近傍に蛍光物質１
４が存在するため蛍光物質１３の励起エネルギー１７が
蛍光物質１４に移行し、蛍光物質１４から蛍光１８が発
せられる。一方、サンプルＤＮＡ１１とプローブＤＮＡ
１２がハイブリダイゼーションしていなければ、図２
（ｆ）に示すように、サンプルＤＮＡ１１に標識された
蛍光物質１３とプローブＤＮＡ１２に標識された蛍光物
質１４の間の距離が離れているため、蛍光物質１３のエ
ネルギーが蛍光物質１４に移ることができず蛍光物質１
４は蛍光を発しない。このようにして、試料から放出さ
れる蛍光波長を観察することにより、サンプルＤＮＡ１
１とプローブＤＮＡ１２のハイブリダイゼーションを検
出することができる。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】蛍光プローブは、取
り扱いが簡便であるが、標識蛍光物質から発せられる蛍
光強度が微弱であり、また蛍光波長が励起波長からそれ
ほど離れていないため検出器の前に励起光遮断フィルタ
ーを配置しても励起光を完全にカットすることができ
ず、高感度な検出を行うことができなかった。
り扱いが簡便であるが、標識蛍光物質から発せられる蛍
光強度が微弱であり、また蛍光波長が励起波長からそれ
ほど離れていないため検出器の前に励起光遮断フィルタ
ーを配置しても励起光を完全にカットすることができ
ず、高感度な検出を行うことができなかった。
【０００７】多段階励起プローブを用いると励起波長と
蛍光波長の間を離すことが可能であり蛍光を励起光から
波長分離して検出する上では有利になるが、サンプルＤ
ＮＡそのものを蛍光物質で標識しなければならない。サ
ンプルＤＮＡに蛍光物質を標識するなど人的加工を施す
場合、サンプルＤＮＡの加工工程でミスが発生すると分
析の信頼性は全く失われ、それが貴重な試料の場合には
取り返しのつかないことになる。また、蛍光測定時、励
起光の一部も同時に検出器に入射するためＳ／Ｎを高め
るのが困難であった。
蛍光波長の間を離すことが可能であり蛍光を励起光から
波長分離して検出する上では有利になるが、サンプルＤ
ＮＡそのものを蛍光物質で標識しなければならない。サ
ンプルＤＮＡに蛍光物質を標識するなど人的加工を施す
場合、サンプルＤＮＡの加工工程でミスが発生すると分
析の信頼性は全く失われ、それが貴重な試料の場合には
取り返しのつかないことになる。また、蛍光測定時、励
起光の一部も同時に検出器に入射するためＳ／Ｎを高め
るのが困難であった。
【０００８】本発明は、このような従来技術の問題点に
鑑みなされたもので、試料には処理を施さずにＳ／Ｎを
向上させて高感度でハイブリダイゼーションを検出する
ことのできる方法及びその検出方法に適したプローブを
提供することを目的とする。
鑑みなされたもので、試料には処理を施さずにＳ／Ｎを
向上させて高感度でハイブリダイゼーションを検出する
ことのできる方法及びその検出方法に適したプローブを
提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、本発明では、１本のプローブを複数に分割し、それ
ぞれ異なる蛍光物質を結合させたプローブを用い、これ
らの蛍光物質を多段階励起することで従来より強い蛍光
が発せられることを利用している。また、励起光として
断続光を照射し、試料に励起光が照射されていない期間
に蛍光検出を行うことによりＳ／Ｎ比を高くしている。
め、本発明では、１本のプローブを複数に分割し、それ
ぞれ異なる蛍光物質を結合させたプローブを用い、これ
らの蛍光物質を多段階励起することで従来より強い蛍光
が発せられることを利用している。また、励起光として
断続光を照射し、試料に励起光が照射されていない期間
に蛍光検出を行うことによりＳ／Ｎ比を高くしている。
【００１０】すなわち、本発明の蛍光標識プローブは、
ＤＮＡの連続する複数の部位に各々ハイブリダイズする
複数の部分プローブからなり、各部分プローブは前記Ｄ
ＮＡの連続する複数の部位にハイブリダイズしたとき互
いに近接する位置にそれぞれ異なる蛍光物質で標識され
ていることを特徴とする。
ＤＮＡの連続する複数の部位に各々ハイブリダイズする
複数の部分プローブからなり、各部分プローブは前記Ｄ
ＮＡの連続する複数の部位にハイブリダイズしたとき互
いに近接する位置にそれぞれ異なる蛍光物質で標識され
ていることを特徴とする。
【００１１】また、本発明の蛍光標識プローブは、ＤＮ
Ａの特定の部位にハイブリダイズするプローブを複数個
の部分プローブに分割し、前記ＤＮＡの特定の部位にハ
イブリダイズしたとき互いに近接する各部分プローブの
位置にそれぞれ異なる蛍光物質で標識したことを特徴と
する。ＤＮＡの特定の部位にハイブリダイズする１本の
プローブを複数の部分プローブに分割する際には、１本
のプローブＤＮＡの中央付近で分割するのが好ましい。
Ａの特定の部位にハイブリダイズするプローブを複数個
の部分プローブに分割し、前記ＤＮＡの特定の部位にハ
イブリダイズしたとき互いに近接する各部分プローブの
位置にそれぞれ異なる蛍光物質で標識したことを特徴と
する。ＤＮＡの特定の部位にハイブリダイズする１本の
プローブを複数の部分プローブに分割する際には、１本
のプローブＤＮＡの中央付近で分割するのが好ましい。
【００１２】前記各部分プローブに標識されている蛍光
物質は、１つの部分プローブに標識されている蛍光物質
を励起したとき多段階励起によって他の部分プローブに
標識されている蛍光物質から蛍光を発生することができ
るものが選択される。
物質は、１つの部分プローブに標識されている蛍光物質
を励起したとき多段階励起によって他の部分プローブに
標識されている蛍光物質から蛍光を発生することができ
るものが選択される。
【００１３】また、本発明のハイブリダイゼーション検
出方法は、ＤＮＡの特定の部位にプローブがハイブリダ
イズしてなる複合体に含まれる複数の標識蛍光物質を断
続光線によって多段階励起し、光照射されていない期間
に多段階励起蛍光を検出することを特徴とする。
出方法は、ＤＮＡの特定の部位にプローブがハイブリダ
イズしてなる複合体に含まれる複数の標識蛍光物質を断
続光線によって多段階励起し、光照射されていない期間
に多段階励起蛍光を検出することを特徴とする。
【００１４】また、本発明のハイブリダイゼーション検
出方法は、ＤＮＡの連続する複数の部位に各々ハイブリ
ダイズする複数の蛍光標識プローブを用い、サンプルＤ
ＮＡにハイブリダイズしている１つのプローブに標識さ
れている蛍光物質を励起したとき該プローブに隣接して
サンプルＤＮＡにハイブリダイズしている他のプローブ
の蛍光物質が発光する多段階励起蛍光を検出することを
特徴とする。
出方法は、ＤＮＡの連続する複数の部位に各々ハイブリ
ダイズする複数の蛍光標識プローブを用い、サンプルＤ
ＮＡにハイブリダイズしている１つのプローブに標識さ
れている蛍光物質を励起したとき該プローブに隣接して
サンプルＤＮＡにハイブリダイズしている他のプローブ
の蛍光物質が発光する多段階励起蛍光を検出することを
特徴とする。
【００１５】また、本発明のハイブリダイゼーション検
出方法は、１つのプローブを複数個の部分プローブに分
割し、分割した各部分プローブに各々異なる蛍光物質を
標識させた分割構成のプローブとサンプルＤＮＡをハイ
ブリダイズさせ、サンプルＤＮＡと結合することで分割
した前記部分プローブが１つのプローブを構成し、１つ
の部分プローブに標識されている蛍光物質を励起したと
き他の部分プローブの蛍光物質が発光する多段階励起蛍
光を検出することを特徴とする。蛍光励起光として断続
光線を用い、光照射されていない期間に蛍光検出を行う
のがＳ／Ｎ比向上の上で有効である。
出方法は、１つのプローブを複数個の部分プローブに分
割し、分割した各部分プローブに各々異なる蛍光物質を
標識させた分割構成のプローブとサンプルＤＮＡをハイ
ブリダイズさせ、サンプルＤＮＡと結合することで分割
した前記部分プローブが１つのプローブを構成し、１つ
の部分プローブに標識されている蛍光物質を励起したと
き他の部分プローブの蛍光物質が発光する多段階励起蛍
光を検出することを特徴とする。蛍光励起光として断続
光線を用い、光照射されていない期間に蛍光検出を行う
のがＳ／Ｎ比向上の上で有効である。
【００１６】本発明によると、機器で自動的に生成でき
るプローブＤＮＡだけに蛍光標識をつけることで、検体
のサンプルＤＮＡなどに処置を施すことなく、多段階励
起蛍光によってハイブリダイゼーションの検出を行うこ
とができ、人的ミスの発生を抑制することができる。ま
た、蛍光標識はプローブＤＮＡだけにつければよいた
め、蛍光標識を付けたプローブを試薬キットとして予め
用意しておくことが可能となり、ハイブリダイゼーショ
ン検出のための処理時間を短縮することができる。
るプローブＤＮＡだけに蛍光標識をつけることで、検体
のサンプルＤＮＡなどに処置を施すことなく、多段階励
起蛍光によってハイブリダイゼーションの検出を行うこ
とができ、人的ミスの発生を抑制することができる。ま
た、蛍光標識はプローブＤＮＡだけにつければよいた
め、蛍光標識を付けたプローブを試薬キットとして予め
用意しておくことが可能となり、ハイブリダイゼーショ
ン検出のための処理時間を短縮することができる。
【００１７】また、蛍光の多段階励起に断続光源を使用
し、試料に励起光が照射されていない期間に蛍光検出を
行うことで、蛍光に比べて著しく強度の強い励起光に妨
害されることなく蛍光検出を行うことができる。従っ
て、蛍光検出のＳ／Ｎ比を向上することができ、ハイブ
リダイゼーションの検出感度が高くなる。なお、プロー
ブＤＮＡに手を加えたくないときは、サンプルＤＮＡを
分割して蛍光物質を標識し、サンプルＤＮＡとプローブ
ＤＮＡの関係を逆にして処理することも可能である。
し、試料に励起光が照射されていない期間に蛍光検出を
行うことで、蛍光に比べて著しく強度の強い励起光に妨
害されることなく蛍光検出を行うことができる。従っ
て、蛍光検出のＳ／Ｎ比を向上することができ、ハイブ
リダイゼーションの検出感度が高くなる。なお、プロー
ブＤＮＡに手を加えたくないときは、サンプルＤＮＡを
分割して蛍光物質を標識し、サンプルＤＮＡとプローブ
ＤＮＡの関係を逆にして処理することも可能である。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。図１は、本発明の原理を説明する図であ
る。図１（ａ）に示すように、血液などから抽出される
サンプルＤＮＡ１１には蛍光物質標識の処置を施さず、
合成機で作成することのできるプローブＤＮＡに処理を
施して複数に分割する。すなわち、図１（ｂ）に示すよ
うに、ＤＮＡの特定の部位にハイブリダイズすることの
できる１本のプローブＤＮＡ１２を合成機で作成し、そ
れを複数の部分プローブＤＮＡ１２ａ，１２ｂに分割
し、部分プローブＤＮＡ１２ａに蛍光物質１４ａを標識
し、部分プローブＤＮＡ１２ｂには蛍光物質１４ｂを標
識する。
て説明する。図１は、本発明の原理を説明する図であ
る。図１（ａ）に示すように、血液などから抽出される
サンプルＤＮＡ１１には蛍光物質標識の処置を施さず、
合成機で作成することのできるプローブＤＮＡに処理を
施して複数に分割する。すなわち、図１（ｂ）に示すよ
うに、ＤＮＡの特定の部位にハイブリダイズすることの
できる１本のプローブＤＮＡ１２を合成機で作成し、そ
れを複数の部分プローブＤＮＡ１２ａ，１２ｂに分割
し、部分プローブＤＮＡ１２ａに蛍光物質１４ａを標識
し、部分プローブＤＮＡ１２ｂには蛍光物質１４ｂを標
識する。
【００１９】１本のプローブＤＮＡ１２の分割は、特定
配列の部分で切断する制限酵素でＤＮＡを切断すること
によって行うことができ、分割箇所としてはプローブＤ
ＮＡ１２の中央付近を選択するのが好ましい。また、蛍
光物質１４ａ，１４ｂには多段階励起に適したものを励
起光の波長に応じて選択する。すなわち、蛍光物質１４
ａを光励起したとき、その励起エネルギーが他方の蛍光
物質１４ｂに移って蛍光物質１４ｂが発光する組み合わ
せのものを用いる。例えば励起光としてアルゴンレーザ
の４９０ｎｍを用いる場合、蛍光物質１４ａにイソチオ
シアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を用い、蛍光物質
１４ｂにテキサスレッドを用いる。このとき４９０ｎｍ
のレーザ光で励起されたＦＩＴＣは５２０ｎｍの励起光
を発する。次に、この５２０ｎｍの光によってテキサス
レッドが励起され、６１５ｎｍの蛍光を発する。
配列の部分で切断する制限酵素でＤＮＡを切断すること
によって行うことができ、分割箇所としてはプローブＤ
ＮＡ１２の中央付近を選択するのが好ましい。また、蛍
光物質１４ａ，１４ｂには多段階励起に適したものを励
起光の波長に応じて選択する。すなわち、蛍光物質１４
ａを光励起したとき、その励起エネルギーが他方の蛍光
物質１４ｂに移って蛍光物質１４ｂが発光する組み合わ
せのものを用いる。例えば励起光としてアルゴンレーザ
の４９０ｎｍを用いる場合、蛍光物質１４ａにイソチオ
シアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を用い、蛍光物質
１４ｂにテキサスレッドを用いる。このとき４９０ｎｍ
のレーザ光で励起されたＦＩＴＣは５２０ｎｍの励起光
を発する。次に、この５２０ｎｍの光によってテキサス
レッドが励起され、６１５ｎｍの蛍光を発する。
【００２０】蛍光物質１４ａ，１４ｂの標識箇所は、部
分プローブＤＮＡ１２ａと部分プローブＤＮＡ１２ｂと
がＤＮＡの特定部位に隣接して同時にハイブリダイズし
たとき蛍光物質１４ａの発光エネルギーが蛍光物質１４
ｂを励起できる距離となるようにする。蛍光物質１４
ａ，１４ｂの標識箇所は、典型的には１本のプローブ１
２を分割したその分割箇所に相当する箇所とすればよい
が、２本鎖ＤＮＡが立体構造を有することを考慮すると
必ずしも１本のプローブの分割箇所に相当する箇所とす
る必要はない。要は、２本の部分プローブ１２ａ，１２
ｂがサンプルＤＮＡの特定部位に並んでハイブリダイズ
したとき、蛍光物質１４ａと蛍光物質１４ｂの間の空間
的距離が両者間でエネルギーの授受が可能な距離になっ
ていればよい。
分プローブＤＮＡ１２ａと部分プローブＤＮＡ１２ｂと
がＤＮＡの特定部位に隣接して同時にハイブリダイズし
たとき蛍光物質１４ａの発光エネルギーが蛍光物質１４
ｂを励起できる距離となるようにする。蛍光物質１４
ａ，１４ｂの標識箇所は、典型的には１本のプローブ１
２を分割したその分割箇所に相当する箇所とすればよい
が、２本鎖ＤＮＡが立体構造を有することを考慮すると
必ずしも１本のプローブの分割箇所に相当する箇所とす
る必要はない。要は、２本の部分プローブ１２ａ，１２
ｂがサンプルＤＮＡの特定部位に並んでハイブリダイズ
したとき、蛍光物質１４ａと蛍光物質１４ｂの間の空間
的距離が両者間でエネルギーの授受が可能な距離になっ
ていればよい。
【００２１】次に、サンプルＤＮＡ１１と蛍光物質１４
ａ，１４ｂで標識した部分プローブＤＮＡ１２ａ，１２
ｂを、ハイブリダイゼーション溶液１５中に混合する。
ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、Ｓ
ＳＣ、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、蒸留水などからなる混合液で
あり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
このとき、サンプルＤＮＡ１１ともとのプローブＤＮＡ
１２が相補鎖ＤＮＡであれば、図１（ｃ）に示すよう
に、サンプルＤＮＡ１１と部分プローブＤＮＡ１２ａ，
１２ｂとはハイブリダイゼーションして二重らせん構造
で結合する。一方、サンプルＤＮＡ１１と分割する前の
プローブＤＮＡ１２が相補鎖ＤＮＡでなければ、図１
（ｄ）に示すようにサンプルＤＮＡ１１と部分プローブ
ＤＮＡ１２ａ，１２ｂとは非結合のままである。
ａ，１４ｂで標識した部分プローブＤＮＡ１２ａ，１２
ｂを、ハイブリダイゼーション溶液１５中に混合する。
ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、Ｓ
ＳＣ、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、蒸留水などからなる混合液で
あり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
このとき、サンプルＤＮＡ１１ともとのプローブＤＮＡ
１２が相補鎖ＤＮＡであれば、図１（ｃ）に示すよう
に、サンプルＤＮＡ１１と部分プローブＤＮＡ１２ａ，
１２ｂとはハイブリダイゼーションして二重らせん構造
で結合する。一方、サンプルＤＮＡ１１と分割する前の
プローブＤＮＡ１２が相補鎖ＤＮＡでなければ、図１
（ｄ）に示すようにサンプルＤＮＡ１１と部分プローブ
ＤＮＡ１２ａ，１２ｂとは非結合のままである。
【００２２】サンプルＤＮＡ１１と部分プローブＤＮＡ
１２ａ，１２ｂのハイブリダイゼーションを検出するた
めに、励起光源から蛍光物質１４ａを発光させることが
できるが蛍光物質１４ｂを発光させることのできない波
長の励起光を断続光１９として照射する。断続励起光１
９は、励起光源としてパルスレーザを用いることで、あ
るいは連続光源から発生された光線をシャッタなどの光
断続手段で断続することによって発生することができ
る。
１２ａ，１２ｂのハイブリダイゼーションを検出するた
めに、励起光源から蛍光物質１４ａを発光させることが
できるが蛍光物質１４ｂを発光させることのできない波
長の励起光を断続光１９として照射する。断続励起光１
９は、励起光源としてパルスレーザを用いることで、あ
るいは連続光源から発生された光線をシャッタなどの光
断続手段で断続することによって発生することができ
る。
【００２３】サンプルＤＮＡ１１と部分プローブＤＮＡ
１２ａ，１２ｂがハイブリダイゼーションしていれば、
図１（ｅ）に示すように、蛍光物質１４ａの近傍に蛍光
物質１４ｂが存在するため蛍光物質１４ａの励起エネル
ギー１７が蛍光物質１４ｂに移行し、蛍光物質１４ｂか
ら蛍光１８が発せられる。一方、サンプルＤＮＡ１１と
部分プローブＤＮＡ１２ａ、部分プローブ１２ｂが同時
にハイブリダイゼーションしていなければ、図１（ｆ）
に示すように、部分ＤＮＡ１２ａに標識された蛍光物質
１４ａと部分プローブＤＮＡ１２ｂに標識された蛍光物
質１４ｂの間の距離が離れているため、蛍光物質１４ａ
のエネルギーが蛍光物質１４ｂに移ることができず蛍光
物質１４ｂは蛍光を発しない。このようにして、試料か
ら放出される蛍光波長を観察することにより、サンプル
ＤＮＡ１１とプローブ１２のハイブリダイゼーションと
同等なサンプルＤＮＡ１１と部分プローブＤＮＡ１２
ａ，１２ｂのハイブリダイゼーションを検出することが
できる。
１２ａ，１２ｂがハイブリダイゼーションしていれば、
図１（ｅ）に示すように、蛍光物質１４ａの近傍に蛍光
物質１４ｂが存在するため蛍光物質１４ａの励起エネル
ギー１７が蛍光物質１４ｂに移行し、蛍光物質１４ｂか
ら蛍光１８が発せられる。一方、サンプルＤＮＡ１１と
部分プローブＤＮＡ１２ａ、部分プローブ１２ｂが同時
にハイブリダイゼーションしていなければ、図１（ｆ）
に示すように、部分ＤＮＡ１２ａに標識された蛍光物質
１４ａと部分プローブＤＮＡ１２ｂに標識された蛍光物
質１４ｂの間の距離が離れているため、蛍光物質１４ａ
のエネルギーが蛍光物質１４ｂに移ることができず蛍光
物質１４ｂは蛍光を発しない。このようにして、試料か
ら放出される蛍光波長を観察することにより、サンプル
ＤＮＡ１１とプローブ１２のハイブリダイゼーションと
同等なサンプルＤＮＡ１１と部分プローブＤＮＡ１２
ａ，１２ｂのハイブリダイゼーションを検出することが
できる。
【００２４】図３は、図１（ｅ），（ｆ）における断続
励起光１９の照射タイミングと、蛍光物質１４ａからの
発光１７及び蛍光物質１４ｂからの発光１８の関係を説
明する図である。図３には、断続励起光１９が照射され
ている状態をＯＮ、遮断されて照射されていない状態を
ＯＦＦとして表示してある。断続励起光１９が照射され
ている状態では、断続励起光１９によって蛍光物質１４
ａが励起１７される。
励起光１９の照射タイミングと、蛍光物質１４ａからの
発光１７及び蛍光物質１４ｂからの発光１８の関係を説
明する図である。図３には、断続励起光１９が照射され
ている状態をＯＮ、遮断されて照射されていない状態を
ＯＦＦとして表示してある。断続励起光１９が照射され
ている状態では、断続励起光１９によって蛍光物質１４
ａが励起１７される。
【００２５】いま、図１（ｅ）に示したようにサンプル
ＤＮＡ１１と部分プローブ１２ａ，１２ｂとがハイブリ
ダイズしていれば、蛍光物質１４ａの励起エネルギーは
蛍光物質１４ｂに移り、多段階励起によって蛍光物質１
４ｂから蛍光１８が発せられる。一方、図１（ｆ）に示
したようにサンプルＤＮＡ１１と部分プローブ１２ａ，
１２ｂとがハイブリダイズしていなければ、断続励起光
１９によって励起された蛍光物質１４ａのエネルギーは
蛍光物質１４ｂに移行することができず、蛍光物質１４
ａが蛍光１７を発生する。蛍光物質１４ｂは励起され
ず、従って蛍光１８は発せられない。このように、多段
階励起による蛍光１８が発生しているタイミングでは断
続励起光１９が遮断されているため、強度の極めて強い
励起光に妨害されることなく高Ｓ／Ｎ比にて高感度に蛍
光１８の検出を行うことができる。
ＤＮＡ１１と部分プローブ１２ａ，１２ｂとがハイブリ
ダイズしていれば、蛍光物質１４ａの励起エネルギーは
蛍光物質１４ｂに移り、多段階励起によって蛍光物質１
４ｂから蛍光１８が発せられる。一方、図１（ｆ）に示
したようにサンプルＤＮＡ１１と部分プローブ１２ａ，
１２ｂとがハイブリダイズしていなければ、断続励起光
１９によって励起された蛍光物質１４ａのエネルギーは
蛍光物質１４ｂに移行することができず、蛍光物質１４
ａが蛍光１７を発生する。蛍光物質１４ｂは励起され
ず、従って蛍光１８は発せられない。このように、多段
階励起による蛍光１８が発生しているタイミングでは断
続励起光１９が遮断されているため、強度の極めて強い
励起光に妨害されることなく高Ｓ／Ｎ比にて高感度に蛍
光１８の検出を行うことができる。
【００２６】なお、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡを
異なる蛍光物質で標識し、多段階励起によってサンプル
とプローブのハイブリダイゼーションを検出する従来の
検出方法でも、蛍光物質の励起光として断続光を使用
し、励起光が遮断されている期間に多段階励起蛍光を検
出するようにすると、連続光励起の場合に比べて検出信
号のＳ／Ｎ比を向上することができる。
異なる蛍光物質で標識し、多段階励起によってサンプル
とプローブのハイブリダイゼーションを検出する従来の
検出方法でも、蛍光物質の励起光として断続光を使用
し、励起光が遮断されている期間に多段階励起蛍光を検
出するようにすると、連続光励起の場合に比べて検出信
号のＳ／Ｎ比を向上することができる。
【００２７】選択可能な励起用レーザの発振波長が限ら
れている現状では、多段階励起を利用することによっ
て、１種類の蛍光物質を用いる蛍光プローブより蛍光物
質の励起効率を高めることが可能である。すなわち、第
１の蛍光物質として励起レーザ光の波長によって効率よ
く励起される蛍光物質を選択し、第２の蛍光物質として
第１の蛍光物質による発光波長で効率よく励起される蛍
光物質を選択することにより、全体としての蛍光励起効
率を１種類の蛍光物質を直接励起する場合より高めるこ
とができる。
れている現状では、多段階励起を利用することによっ
て、１種類の蛍光物質を用いる蛍光プローブより蛍光物
質の励起効率を高めることが可能である。すなわち、第
１の蛍光物質として励起レーザ光の波長によって効率よ
く励起される蛍光物質を選択し、第２の蛍光物質として
第１の蛍光物質による発光波長で効率よく励起される蛍
光物質を選択することにより、全体としての蛍光励起効
率を１種類の蛍光物質を直接励起する場合より高めるこ
とができる。
【００２８】また、各部分プローブを各々１種類の蛍光
物質で標識するとは限らない。図４は、１つの部分プロ
ーブを複数の蛍光物質で標識した本発明による蛍光標識
プローブの他の例の説明図である。ここでは、３種類の
蛍光物質を用いる例について説明する。
物質で標識するとは限らない。図４は、１つの部分プロ
ーブを複数の蛍光物質で標識した本発明による蛍光標識
プローブの他の例の説明図である。ここでは、３種類の
蛍光物質を用いる例について説明する。
【００２９】図４（ａ）の例では、ＤＮＡの特定の部位
にハイブリダイズすることのできる１本のプローブＤＮ
Ａ１２を複数の部分プローブＤＮＡ１２ａ，１２ｂに分
割し、部分プローブＤＮＡ１２ａに蛍光物質１４ａを標
識し、部分プローブＤＮＡ１２ｂには蛍光物質１４ｂ，
１４ｃを標識する。蛍光物質１４ｃは、蛍光物質１４ｂ
に結合されている。励起光は蛍光物質１４ａを励起でき
るが、蛍光物質１４ｂあるいは蛍光物質１４ｃを直接励
起することはできないものとする。また、蛍光物質１４
ａの蛍光波長は蛍光物質１４ｂを励起でき、蛍光物質１
４ｂの蛍光波長は蛍光物質１４ｃを励起でき、蛍光物質
１４ａの蛍光波長は蛍光物質１４ｃを励起できないもの
とする。
にハイブリダイズすることのできる１本のプローブＤＮ
Ａ１２を複数の部分プローブＤＮＡ１２ａ，１２ｂに分
割し、部分プローブＤＮＡ１２ａに蛍光物質１４ａを標
識し、部分プローブＤＮＡ１２ｂには蛍光物質１４ｂ，
１４ｃを標識する。蛍光物質１４ｃは、蛍光物質１４ｂ
に結合されている。励起光は蛍光物質１４ａを励起でき
るが、蛍光物質１４ｂあるいは蛍光物質１４ｃを直接励
起することはできないものとする。また、蛍光物質１４
ａの蛍光波長は蛍光物質１４ｂを励起でき、蛍光物質１
４ｂの蛍光波長は蛍光物質１４ｃを励起でき、蛍光物質
１４ａの蛍光波長は蛍光物質１４ｃを励起できないもの
とする。
【００３０】このような蛍光物質の例としては、波長４
９０ｎｍで励起されて波長５２０ｎｍの蛍光を発生する
ＦＩＴＣ Fluoresceinと、波長５８０ｎｍで励起されて
波長６０２ｎｍの蛍光を発生するＴｅｘａｓＲｅｄと、
波長６５０ｎｍで励起されて波長６６７ｎｍの蛍光を発
生するＣｙ５の組み合わせが挙げられる。
９０ｎｍで励起されて波長５２０ｎｍの蛍光を発生する
ＦＩＴＣ Fluoresceinと、波長５８０ｎｍで励起されて
波長６０２ｎｍの蛍光を発生するＴｅｘａｓＲｅｄと、
波長６５０ｎｍで励起されて波長６６７ｎｍの蛍光を発
生するＣｙ５の組み合わせが挙げられる。
【００３１】図４（ｂ）の例は、部分プローブＤＮＡ１
２ｂに蛍光物質１４ｂ，１４ｃを標識する点では図４
（ａ）の例と同じであるが、蛍光物質１４ｂ，１４ｃを
付ける位置がいずれも部分プローブＤＮＡ上である点で
図４（ａ）の例と異なる。
２ｂに蛍光物質１４ｂ，１４ｃを標識する点では図４
（ａ）の例と同じであるが、蛍光物質１４ｂ，１４ｃを
付ける位置がいずれも部分プローブＤＮＡ上である点で
図４（ａ）の例と異なる。
【００３２】図４に示した３種類の蛍光物質を用いるプ
ローブによるハイブリダイゼーションの検出は、蛍光物
質１４ａを励起可能な励起光を照射したとき、蛍光物質
１４ｃから多段階励起蛍光が検出されるか否かによって
行われる。すなわち、サンプルＤＮＡと部分プローブＤ
ＮＡ１２ａ，１２ｂがハイブリダイゼーションしていれ
ば、この多段階励起によって蛍光物質１４ｃからの蛍光
が検出される。しかし、サンプルＤＮＡと部分プローブ
ＤＮＡ１２ａ，１２ｂがハイブリダイゼーションしてい
なければ、蛍光物質１４ａからの蛍光が検出されるだけ
であり、蛍光物質１４ｃからの蛍光が検出されることは
ない。このように３種類以上の蛍光物質を組み合わせた
多段階励起を利用すると、２段階励起の場合と同様に蛍
光物質系全体としての蛍光励起光率を向上させることが
可能となるとともに、多段階励起蛍光の蛍光波長を励起
光の波長からずっと離れたところに設定することが可能
となり、蛍光検出の際の励起光の波長分離の点で有利に
なる。
ローブによるハイブリダイゼーションの検出は、蛍光物
質１４ａを励起可能な励起光を照射したとき、蛍光物質
１４ｃから多段階励起蛍光が検出されるか否かによって
行われる。すなわち、サンプルＤＮＡと部分プローブＤ
ＮＡ１２ａ，１２ｂがハイブリダイゼーションしていれ
ば、この多段階励起によって蛍光物質１４ｃからの蛍光
が検出される。しかし、サンプルＤＮＡと部分プローブ
ＤＮＡ１２ａ，１２ｂがハイブリダイゼーションしてい
なければ、蛍光物質１４ａからの蛍光が検出されるだけ
であり、蛍光物質１４ｃからの蛍光が検出されることは
ない。このように３種類以上の蛍光物質を組み合わせた
多段階励起を利用すると、２段階励起の場合と同様に蛍
光物質系全体としての蛍光励起光率を向上させることが
可能となるとともに、多段階励起蛍光の蛍光波長を励起
光の波長からずっと離れたところに設定することが可能
となり、蛍光検出の際の励起光の波長分離の点で有利に
なる。
【００３３】次に、本発明の具体的な適用例について説
明する。ここでは、ガン遺伝子の診断用ＤＮＡプローブ
の一つであるｖ−ｍｙｂ（０．５２ｋｂ）の場合で説明
する。このｖ−ｍｙｂプローブには、３００ｂｐ付近に
制限酵素ＦｏｋＩの認識部位が存在する。よって、この
ＦｏｋＩを用いてｖ−ｍｙｂプローブを切断すると、約
３００ｂｐと約２００ｂｐの２本の断片が得られる。次
に、３００ｂｐの断片の３′末端側及び２００ｂｐの断
片の５′末端側を別々の蛍光物質で標識する。蛍光物質
の組み合わせとしては、ＴｅｘａｓＲｅｄとＣｙ５を使
用した。次に、この２断片を含むハイブリダイゼーショ
ン溶液中にサンプルＤＮＡを入れて液中でハイブリダイ
ゼーションを行い、検出を行った。検出には５３２ｎｍ
の光を出す半導体励起固体レーザを光音響素子でパルス
化したものを光源として使用した。パルス間隔は、１０
ｎｓレーザ光ＯＮ、２０ｎｓレーザ光ＯＦＦに設定し、
レーザ光ＯＦＦ後、５〜１５ｎｓの蛍光光量を６７５ｎ
ｍの光学干渉フィルターを通して光電子増倍管で測定し
た。結果として、多段階励起による従来例に比べ、本発
明の方法では約１００倍の感度で測定を行うことができ
た。
明する。ここでは、ガン遺伝子の診断用ＤＮＡプローブ
の一つであるｖ−ｍｙｂ（０．５２ｋｂ）の場合で説明
する。このｖ−ｍｙｂプローブには、３００ｂｐ付近に
制限酵素ＦｏｋＩの認識部位が存在する。よって、この
ＦｏｋＩを用いてｖ−ｍｙｂプローブを切断すると、約
３００ｂｐと約２００ｂｐの２本の断片が得られる。次
に、３００ｂｐの断片の３′末端側及び２００ｂｐの断
片の５′末端側を別々の蛍光物質で標識する。蛍光物質
の組み合わせとしては、ＴｅｘａｓＲｅｄとＣｙ５を使
用した。次に、この２断片を含むハイブリダイゼーショ
ン溶液中にサンプルＤＮＡを入れて液中でハイブリダイ
ゼーションを行い、検出を行った。検出には５３２ｎｍ
の光を出す半導体励起固体レーザを光音響素子でパルス
化したものを光源として使用した。パルス間隔は、１０
ｎｓレーザ光ＯＮ、２０ｎｓレーザ光ＯＦＦに設定し、
レーザ光ＯＦＦ後、５〜１５ｎｓの蛍光光量を６７５ｎ
ｍの光学干渉フィルターを通して光電子増倍管で測定し
た。結果として、多段階励起による従来例に比べ、本発
明の方法では約１００倍の感度で測定を行うことができ
た。
【００３４】ここでは、サンプルＤＮＡと蛍光標識プロ
ーブとを溶液中で反応させてハイブリダイゼーションさ
せる方法について説明した。しかし、本発明の蛍光標識
プローブは、メンブレン上にブロットして行うハイブリ
ダイゼーション検出方法に適用できることはもちろんで
ある。
ーブとを溶液中で反応させてハイブリダイゼーションさ
せる方法について説明した。しかし、本発明の蛍光標識
プローブは、メンブレン上にブロットして行うハイブリ
ダイゼーション検出方法に適用できることはもちろんで
ある。
【００３５】
【発明の効果】本発明によると、サンプルＤＮＡに処理
を施すことなく、蛍光物質の多段階励起を利用してハイ
ブリダイゼーションの検出感度を向上することができ
る。
を施すことなく、蛍光物質の多段階励起を利用してハイ
ブリダイゼーションの検出感度を向上することができ
る。
【図１】本発明の原理を説明する図。
【図２】試料とプローブを蛍光物質で標識する従来の多
段階励起法の説明図。
段階励起法の説明図。
【図３】断続励起光の照射タイミングと蛍光物質からの
発光の関係を説明する図。
発光の関係を説明する図。
【図４】本発明による蛍光標識プローブの他の例の説明
図。
図。
１１…サンプルＤＮＡ、１２…プローブＤＮＡ、１２
ａ，１２ｂ…分割した部分プローブＤＮＡ、１３，１４
ａ…励起光で励起される蛍光物質、１４ｂ…蛍光物質か
ら多段階励起によって励起される蛍光物質、１５…ハイ
ブリダイゼーション溶液、１６…励起光、１７…蛍光
（エネルギー）、１８…蛍光、１９…断続励起光
ａ，１２ｂ…分割した部分プローブＤＮＡ、１３，１４
ａ…励起光で励起される蛍光物質、１４ｂ…蛍光物質か
ら多段階励起によって励起される蛍光物質、１５…ハイ
ブリダイゼーション溶液、１６…励起光、１７…蛍光
（エネルギー）、１８…蛍光、１９…断続励起光
フロントページの続き (72)発明者 藤宮 仁 神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地 日立ソフトウェアエンジニアリング株式会 社内 (72)発明者 百合野 以子 神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地 日立ソフトウェアエンジニアリング株式会 社内
Claims (7)
- 【請求項１】 ＤＮＡの連続する複数の部位に各々ハイ
ブリダイズする複数の部分プローブからなり、前記各部
分プローブは前記ＤＮＡの連続する複数の部位にハイブ
リダイズしたとき互いに近接する位置にそれぞれ異なる
蛍光物質で標識されていることを特徴とする蛍光標識プ
ローブ。 - 【請求項２】 ＤＮＡの特定の部位にハイブリダイズす
るプローブを複数個の部分プローブに分割し、前記ＤＮ
Ａの特定の部位にハイブリダイズしたとき互いに近接す
る前記各部分プローブの位置にそれぞれ異なる蛍光物質
で標識したことを特徴とする蛍光標識プローブ。 - 【請求項３】 前記各部分プローブに標識されている蛍
光物質は、１つの部分プローブに標識されている蛍光物
質を励起したとき多段階励起によって他の部分プローブ
に標識されている蛍光物質が蛍光を発生することができ
るものであることを特徴とする請求項１又は２記載の蛍
光標識プローブ。 - 【請求項４】 ＤＮＡの特定の部位にプローブがハイブ
リダイズしてなる複合体に含まれる複数の標識蛍光物質
を断続光線によって多段階励起し、光照射されていない
期間に多段階励起蛍光を検出することを特徴とするハイ
ブリダイゼーション検出方法。 - 【請求項５】 ＤＮＡの連続する複数の部位に各々ハイ
ブリダイズする複数の蛍光標識プローブを用い、サンプ
ルＤＮＡにハイブリダイズしている１つのプローブに標
識されている蛍光物質を励起したとき該プローブに隣接
してサンプルＤＮＡにハイブリダイズしている他のプロ
ーブの蛍光物質が発光する多段階励起蛍光を検出するこ
とを特徴とするハイブリダイゼーション検出方法。 - 【請求項６】 １つのプローブを複数個の部分プローブ
に分割し、分割した各部分プローブに各々異なる蛍光物
質を標識させた分割構成のプローブとサンプルＤＮＡを
ハイブリダイズさせ、サンプルＤＮＡと結合することで
分割した前記部分プローブが１つのプローブを構成し、
１つの部分プローブに標識されている蛍光物質を励起し
たとき他の部分プローブの蛍光物質が発光する多段階励
起蛍光を検出することを特徴とするハイブリダイゼーシ
ョン検出方法 - 【請求項７】 蛍光励起光として断続光線を用い、光照
射されていない期間に蛍光検出を行うことを特徴とする
請求項５又は６記載のハイブリダイゼーション検出方
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9253463A JPH1189598A (ja) | 1997-09-18 | 1997-09-18 | 蛍光標識プローブ及びハイブリダイゼーション検出方法 |
| US09/039,278 US6077670A (en) | 1997-09-18 | 1998-03-13 | Fluorescent material labeled-probe and method for detecting hybridization |
| EP98250095A EP0903411A3 (en) | 1997-09-18 | 1998-03-19 | Fluorescent material labeled-probe and method for detecting hybridization |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9253463A JPH1189598A (ja) | 1997-09-18 | 1997-09-18 | 蛍光標識プローブ及びハイブリダイゼーション検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1189598A true JPH1189598A (ja) | 1999-04-06 |
Family
ID=17251744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9253463A Pending JPH1189598A (ja) | 1997-09-18 | 1997-09-18 | 蛍光標識プローブ及びハイブリダイゼーション検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6077670A (ja) |
| EP (1) | EP0903411A3 (ja) |
| JP (1) | JPH1189598A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101545012A (zh) | 2001-05-11 | 2009-09-30 | 松下电器产业株式会社 | 生物分子基底，使用它的检验和诊断方法及装置 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1190838A (en) * | 1981-07-17 | 1985-07-23 | Cavit Akin | Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer |
| US4996143A (en) * | 1985-12-23 | 1991-02-26 | Syngene, Inc. | Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization |
| CA1273552A (en) * | 1985-12-23 | 1990-09-04 | Michael J. Heller | Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays |
| DE3785591T2 (de) * | 1986-01-10 | 1993-09-02 | Amoco Corp | Kompetitiver homogener test. |
| EP0476556A3 (en) * | 1990-09-18 | 1992-11-19 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for determination of a light sensitive substance |
| WO1992014845A1 (en) * | 1991-02-26 | 1992-09-03 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Diagnosing cystic fibrosis and other genetic diseases using fluorescence resonance energy transfer (fret) |
| EP1067134B1 (en) * | 1991-11-07 | 2004-07-28 | Nanotronics, Inc. | Hybridization of polynucleotides conjugated with chromophores and fluorophores to generate donor-to-donor energy transfer system |
| CA2167804A1 (en) * | 1993-07-20 | 1995-02-02 | Robert H. Singer | In vivo nucleic acid hybridization method |
| US5654419A (en) * | 1994-02-01 | 1997-08-05 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent labels and their use in separations |
| JP3448090B2 (ja) * | 1994-02-16 | 2003-09-16 | 浜松ホトニクス株式会社 | エネルギー移動検出法およびその装置 |
| EP0810291B1 (en) * | 1995-02-17 | 2003-10-29 | Hamamatsu Photonics K.K. | Probe for use in nucleic acid analysis and detecting method based on excimer fluorescence |
| AU694313B2 (en) * | 1995-02-17 | 1998-07-16 | Hamamatsu Photonics K.K. | Probe for use in nucleic acid analysis and detecting method |
-
1997
- 1997-09-18 JP JP9253463A patent/JPH1189598A/ja active Pending
-
1998
- 1998-03-13 US US09/039,278 patent/US6077670A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-19 EP EP98250095A patent/EP0903411A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0903411A2 (en) | 1999-03-24 |
| US6077670A (en) | 2000-06-20 |
| EP0903411A3 (en) | 2002-08-07 |
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