JP3400650B2 - 電気泳動分離検出方法及び装置 - Google Patents
電気泳動分離検出方法及び装置Info
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- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
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- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
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- G01N27/44782—Apparatus specially adapted therefor of a plurality of samples
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＤＮＡ等の生体関連
物質の電気泳動分離検出方法及び装置に関する。
物質の電気泳動分離検出方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】ゲノム解析計画の進展、及びＤＮＡ診断
の進展と共に、複数種類のＤＮＡの塩基配列を迅速に決
定したり、多種ＤＮＡプローブを用いて検査するニーズ
が高まってきている。これらＤＮＡの塩基配列決定、Ｄ
ＮＡ診断のための計測では、蛍光標識したＤＮＡ（ＤＮ
Ａの外、糖やペプチドを対象とする場合も同様である）
をゲル電気泳動分離し、泳動中のＤＮＡを実時間計測す
る技術が使用されてきている。一度に計測できる試料数
を増やすには、（１）泳動路数を多くする、（２）泳動
速度を早くしてスループットを上げる、（３）標識蛍光
体の種類（色、即ち蛍光発光波長）を多くする等の課題
が、挙げられる。多数の泳動路を確保するため、従来用
いていた平板ゲル（スラブゲル）に代わって、内径０．
１ｍｍ前後のキャピラリーを多数本並べるキャピラリー
アレー電気泳動装置が進展してきている（特開平０５−
０７２１７７号公報）。キャピラリーアレー電気泳動法
は、上記の課題（１）、及び（２）を解決するのに適し
た方法である。
の進展と共に、複数種類のＤＮＡの塩基配列を迅速に決
定したり、多種ＤＮＡプローブを用いて検査するニーズ
が高まってきている。これらＤＮＡの塩基配列決定、Ｄ
ＮＡ診断のための計測では、蛍光標識したＤＮＡ（ＤＮ
Ａの外、糖やペプチドを対象とする場合も同様である）
をゲル電気泳動分離し、泳動中のＤＮＡを実時間計測す
る技術が使用されてきている。一度に計測できる試料数
を増やすには、（１）泳動路数を多くする、（２）泳動
速度を早くしてスループットを上げる、（３）標識蛍光
体の種類（色、即ち蛍光発光波長）を多くする等の課題
が、挙げられる。多数の泳動路を確保するため、従来用
いていた平板ゲル（スラブゲル）に代わって、内径０．
１ｍｍ前後のキャピラリーを多数本並べるキャピラリー
アレー電気泳動装置が進展してきている（特開平０５−
０７２１７７号公報）。キャピラリーアレー電気泳動法
は、上記の課題（１）、及び（２）を解決するのに適し
た方法である。
【０００３】一方、多種類の蛍光体を用いて複数種類の
ＤＮＡを標識する方法では、ＤＮＡシーケンサーに関連
して、４種類の蛍光体が広く使用されている。蛍光体の
励起光として、Ａｒイオンレーザ（４８８ｎｍ、あるい
は５１５ｎｍ）、ＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ）等が使用
されている。例えば、蛍光体としてパーキンエルマー社
ＡＢＤ部門から入手できるＦＡＭ（発光波長〜５２０ｎ
ｍ）、ＪＯＥ（発光波長〜５４９ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ
（発光波長〜５７５ｎｍ）、ＲＯＸ（発光波長〜６００
ｎｍ）を用いる事が多いが、ＦＩＴＣ（発光波長〜５２
０ｎｍ）、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄｏｍｉｎｅ １０１（発
光波長〜６１５ｎｍ）、あるいはＣｙ５（発光波長〜６
７０ｎｍ）等も用いられる。これら蛍光体からの蛍光の
分光検出手段としては、回転フィルターによる時分割計
測、像分割プリズム（特開平０２−２６９９３６号公
報）の使用、プリズム（特開平０１−１１６４４１号公
報）、あるいは回折格子による波長分散の活用等があ
る。
ＤＮＡを標識する方法では、ＤＮＡシーケンサーに関連
して、４種類の蛍光体が広く使用されている。蛍光体の
励起光として、Ａｒイオンレーザ（４８８ｎｍ、あるい
は５１５ｎｍ）、ＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ）等が使用
されている。例えば、蛍光体としてパーキンエルマー社
ＡＢＤ部門から入手できるＦＡＭ（発光波長〜５２０ｎ
ｍ）、ＪＯＥ（発光波長〜５４９ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ
（発光波長〜５７５ｎｍ）、ＲＯＸ（発光波長〜６００
ｎｍ）を用いる事が多いが、ＦＩＴＣ（発光波長〜５２
０ｎｍ）、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄｏｍｉｎｅ １０１（発
光波長〜６１５ｎｍ）、あるいはＣｙ５（発光波長〜６
７０ｎｍ）等も用いられる。これら蛍光体からの蛍光の
分光検出手段としては、回転フィルターによる時分割計
測、像分割プリズム（特開平０２−２６９９３６号公
報）の使用、プリズム（特開平０１−１１６４４１号公
報）、あるいは回折格子による波長分散の活用等があ
る。
【０００４】蛍光体からの蛍光をお互いに識別して検出
するためには、蛍光体の発光極大波長は相互に約３０ｎ
ｍ離れていることが必要である。観測する波長領域は５
００ｎｍ〜７００ｎｍであり、７〜８種類の発光波長の
異なる蛍光体を使用するのが限度である。また、１つの
波長の励起光により、効率良く励起できる蛍光体の種類
の数は２〜３であり、より多種類の蛍光体を使用する場
合には、複数種類の蛍光体を励起するために、複数の波
長のレーザを励起のために用いる必要がある。この場
合、励起光が光検出器で受光されることを防ぐため、励
起光の近くに発光極大をもつ蛍光体は使用できない。こ
のため、実際に使用できる蛍光体の種類の数は６種程度
が限度である。
するためには、蛍光体の発光極大波長は相互に約３０ｎ
ｍ離れていることが必要である。観測する波長領域は５
００ｎｍ〜７００ｎｍであり、７〜８種類の発光波長の
異なる蛍光体を使用するのが限度である。また、１つの
波長の励起光により、効率良く励起できる蛍光体の種類
の数は２〜３であり、より多種類の蛍光体を使用する場
合には、複数種類の蛍光体を励起するために、複数の波
長のレーザを励起のために用いる必要がある。この場
合、励起光が光検出器で受光されることを防ぐため、励
起光の近くに発光極大をもつ蛍光体は使用できない。こ
のため、実際に使用できる蛍光体の種類の数は６種程度
が限度である。
【０００５】また、本願発明の発明者の一人である神
原、永井らは、波長の異なる複数の励起光をゲル電気泳
動板の所定間隔離れた異なる箇所を照射して得る蛍光像
を光検出器の異なる位置に結像させ、複数試料を同時に
計測する試みを行なっている（特開平０３−２９３５５
７号公報）しかし、あまり蛍光体の種類が多くなると、
回転フィルターや像分割では全ての種類の蛍光体からの
蛍光を検出するのが大変になり、５〜６種類の蛍光体の
使用が限度となっている。
原、永井らは、波長の異なる複数の励起光をゲル電気泳
動板の所定間隔離れた異なる箇所を照射して得る蛍光像
を光検出器の異なる位置に結像させ、複数試料を同時に
計測する試みを行なっている（特開平０３−２９３５５
７号公報）しかし、あまり蛍光体の種類が多くなると、
回転フィルターや像分割では全ての種類の蛍光体からの
蛍光を検出するのが大変になり、５〜６種類の蛍光体の
使用が限度となっている。
【０００６】また、最近、２種類の蛍光体の間での励起
エネルギー移動を利用して効率良く蛍光体を励起する方
法が提案されている（特開平０５−６０６９８号公
報）、及びＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１、１３１
−１４０（１９９５））。さらに、エネルギー供与体と
エネルギー受容体となる２種類の蛍光体間のエネルギー
移動の効率につていは、フェルスター（Ｖｏｎ Ｔｈ．
Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）による式が知られている（アンナ
ーレン デア フュジーク シリーズ６、２巻（１９４
８年）５５−７５頁（Ａｎｎａｌｅｎ ｄｅｒ Ｐｈｙ
ｓｉｋ、６．Ｆｏｌｇｅ．Ｂａｎｄ２．（１９４８）ｐ
ｐ．５５−７５））。この文献によれば、エネルギー移
動速度は、エネルギー供与体とエネルギー受容体との間
の距離の６乗に反比例し、エネルギー供与体の発光スペ
クトルとエネルギー受容体の吸収スペクトルの重なりに
比例する。また、エネルギー供与体、エネルギー受容体
間の配向によっても影響を受ける。
エネルギー移動を利用して効率良く蛍光体を励起する方
法が提案されている（特開平０５−６０６９８号公
報）、及びＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１、１３１
−１４０（１９９５））。さらに、エネルギー供与体と
エネルギー受容体となる２種類の蛍光体間のエネルギー
移動の効率につていは、フェルスター（Ｖｏｎ Ｔｈ．
Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）による式が知られている（アンナ
ーレン デア フュジーク シリーズ６、２巻（１９４
８年）５５−７５頁（Ａｎｎａｌｅｎ ｄｅｒ Ｐｈｙ
ｓｉｋ、６．Ｆｏｌｇｅ．Ｂａｎｄ２．（１９４８）ｐ
ｐ．５５−７５））。この文献によれば、エネルギー移
動速度は、エネルギー供与体とエネルギー受容体との間
の距離の６乗に反比例し、エネルギー供与体の発光スペ
クトルとエネルギー受容体の吸収スペクトルの重なりに
比例する。また、エネルギー供与体、エネルギー受容体
間の配向によっても影響を受ける。
【０００７】エネルギー移動の、エネルギー供与体とエ
ネルギー受容体との間の距離依存性の実験的研究が、ス
トライヤー（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ）とホーグランド（Ｐ．
Ｈ．Ｈａｕｇｌａｎｄ）によって報告されており（プロ
シーディングス オブ ザナショナル アカデミー オ
ブ サイエンシズ オブ ユー エス エー ５８巻
（１９６７年）７１９−７２６頁（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５８（１９６７）ｐ
ｐ．７１９−７２６））、ポリペプチドオリゴマーのペ
プチドの個数を変えることにより、その両端にあるエネ
ルギー供与体とエネルギー受容体との距離を変化させ、
エネルギー移動の距離依存性がフェルスターの式と良く
一致していることを示している。また、エネルギー移動
の効率として、エネルギー供与体とエネルギー受容体と
の間の距離が１．２ｎｍのとき１００％、４．６ｎｍの
とき１６％という値を得ている。
ネルギー受容体との間の距離依存性の実験的研究が、ス
トライヤー（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ）とホーグランド（Ｐ．
Ｈ．Ｈａｕｇｌａｎｄ）によって報告されており（プロ
シーディングス オブ ザナショナル アカデミー オ
ブ サイエンシズ オブ ユー エス エー ５８巻
（１９６７年）７１９−７２６頁（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５８（１９６７）ｐ
ｐ．７１９−７２６））、ポリペプチドオリゴマーのペ
プチドの個数を変えることにより、その両端にあるエネ
ルギー供与体とエネルギー受容体との距離を変化させ、
エネルギー移動の距離依存性がフェルスターの式と良く
一致していることを示している。また、エネルギー移動
の効率として、エネルギー供与体とエネルギー受容体と
の間の距離が１．２ｎｍのとき１００％、４．６ｎｍの
とき１６％という値を得ている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】分析、特にＤＮＡ診断
やＤＮＡ分析の分野では、できるだけ多くの異なる試料
を同時に分析できれば労力、経費の節約の点から都合が
良い。従来技術では、できるだけ多くの種類の蛍光体を
標識体とすることが好ましいが、上記で説明したよう
に、区別できる試料の数は使用可能な蛍光体の種類の数
に依存しており、６〜８種が限度であるという問題があ
る。本発明の目的は、この問題を解決して、１０〜２０
種類の試料を個別に標識し、同時に同一レーンで分析す
る電気泳動分離検出方法、及び装置を提供することにあ
る。
やＤＮＡ分析の分野では、できるだけ多くの異なる試料
を同時に分析できれば労力、経費の節約の点から都合が
良い。従来技術では、できるだけ多くの種類の蛍光体を
標識体とすることが好ましいが、上記で説明したよう
に、区別できる試料の数は使用可能な蛍光体の種類の数
に依存しており、６〜８種が限度であるという問題があ
る。本発明の目的は、この問題を解決して、１０〜２０
種類の試料を個別に標識し、同時に同一レーンで分析す
る電気泳動分離検出方法、及び装置を提供することにあ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明では励起用標識物
と発光用標識物を１組として標識物を構成し、この間の
エネルギー移動を利用して、励起光から離れた波長域に
蛍光を発するようにすると共に、励起用標識物の種類を
変えると共に、励起用標識物の種類に対応した異なる波
長のレーザを励起光として用い、空間的あるいは時間的
に励起光をそれぞれ区別可能な形で照射した。
と発光用標識物を１組として標識物を構成し、この間の
エネルギー移動を利用して、励起光から離れた波長域に
蛍光を発するようにすると共に、励起用標識物の種類を
変えると共に、励起用標識物の種類に対応した異なる波
長のレーザを励起光として用い、空間的あるいは時間的
に励起光をそれぞれ区別可能な形で照射した。
【００１０】本発明の電気泳動分離検出方法をより詳細
に説明すると、本発明の方法は、蛍光標識された試料を
泳動レーンで電気泳動して分離検出する電気泳動分離検
出方法において、試料を蛍光標識の複数種類で標識する
標識工程と、蛍光標識された試料を電気泳動分離する泳
動分離工程と、蛍光標識された試料に複数波長の励起光
を照射して、電気泳動分離された試料を検出する検出工
程とを有し、蛍光標識が、励起光により励起される励起
用物質と、励起用物質からのエネルギー移動により発光
する発光用物質とから構成され、励起用物質と発光用物
質として複数種の物質を用い、複数種の物質の組み合わ
せの違いに基づいて、蛍光標識物の複数のそれぞれを識
別して試料を検出することに特徴がある。
に説明すると、本発明の方法は、蛍光標識された試料を
泳動レーンで電気泳動して分離検出する電気泳動分離検
出方法において、試料を蛍光標識の複数種類で標識する
標識工程と、蛍光標識された試料を電気泳動分離する泳
動分離工程と、蛍光標識された試料に複数波長の励起光
を照射して、電気泳動分離された試料を検出する検出工
程とを有し、蛍光標識が、励起光により励起される励起
用物質と、励起用物質からのエネルギー移動により発光
する発光用物質とから構成され、励起用物質と発光用物
質として複数種の物質を用い、複数種の物質の組み合わ
せの違いに基づいて、蛍光標識物の複数のそれぞれを識
別して試料を検出することに特徴がある。
【００１１】上記の電気泳動分離検出方法において、波
長の異なる複数の励起光を、空間的あるいは時間的にず
らして泳動レーンを照射する工程と、検出工程におい
て、励起光の照射により蛍光標識から発する蛍光を波長
選別して検出し、励起光の波長と波長選別された蛍光波
長を識別して、蛍光標識物を識別して試料を検出するこ
と、検出工程において、試料の泳動速度がほぼ一定であ
る溶液媒体中で、試料を検出すること、励起光の波長と
蛍光を受光するチャンネルの組み合わせにより蛍光標識
を識別して、試料を検出すること、蛍光標識された試料
が同一の泳動レーンで電気泳動分離されることにも特徴
がある。
長の異なる複数の励起光を、空間的あるいは時間的にず
らして泳動レーンを照射する工程と、検出工程におい
て、励起光の照射により蛍光標識から発する蛍光を波長
選別して検出し、励起光の波長と波長選別された蛍光波
長を識別して、蛍光標識物を識別して試料を検出するこ
と、検出工程において、試料の泳動速度がほぼ一定であ
る溶液媒体中で、試料を検出すること、励起光の波長と
蛍光を受光するチャンネルの組み合わせにより蛍光標識
を識別して、試料を検出すること、蛍光標識された試料
が同一の泳動レーンで電気泳動分離されることにも特徴
がある。
【００１２】本発明の電気泳動分離検出装置を詳細に説
明すると、本発明の装置は、蛍光標識された試料を泳動
レーンで電気泳動して分離検出する電気泳動分離検出装
置において、蛍光標識の複数種類で標識された試料を電
気泳動分離する泳動分離部と、全ての泳動レーンもしく
は全ての泳動レーンの延長上の複数箇所に実質的に同時
に複数波長の励起光を照射する照射手段と、励起光が照
射された部位で、電気泳動分離された試料を検出する検
出手段とを有し、蛍光標識のそれぞれが、励起光により
励起される励起用物質と、励起用物質からのエネルギー
移動により発光する発光用物質とから構成され、励起用
物質と発光用物質として複数種の物質を用い、検出手段
は、複数種の物質の組み合わせの違いに基づいて、蛍光
標識物の複数のそれぞれを識別して試料を検出すること
に特徴がある。
明すると、本発明の装置は、蛍光標識された試料を泳動
レーンで電気泳動して分離検出する電気泳動分離検出装
置において、蛍光標識の複数種類で標識された試料を電
気泳動分離する泳動分離部と、全ての泳動レーンもしく
は全ての泳動レーンの延長上の複数箇所に実質的に同時
に複数波長の励起光を照射する照射手段と、励起光が照
射された部位で、電気泳動分離された試料を検出する検
出手段とを有し、蛍光標識のそれぞれが、励起光により
励起される励起用物質と、励起用物質からのエネルギー
移動により発光する発光用物質とから構成され、励起用
物質と発光用物質として複数種の物質を用い、検出手段
は、複数種の物質の組み合わせの違いに基づいて、蛍光
標識物の複数のそれぞれを識別して試料を検出すること
に特徴がある。
【００１３】上記の電気泳動分離検出装置において、照
射手段は、波長の異なる複数の励起光を、空間的あるい
は時間的にずらして泳動レーンを照射し、検出手段は、
励起光の照射により蛍光標識から発する蛍光を波長選別
して検出し、励起光の波長と波長選別された蛍光波長を
識別して、蛍光標識物を識別して試料を検出すること、
検出手段は、試料の泳動速度がほぼ一定である溶液媒体
中で、試料を検出すること、検出手段は、励起光の波長
と蛍光を受光するチャンネルの組み合わせにより蛍光標
識を識別して、試料を検出すること、蛍光標識された試
料が同一の前記泳動レーンで電気泳動分離されることに
も特徴がある。
射手段は、波長の異なる複数の励起光を、空間的あるい
は時間的にずらして泳動レーンを照射し、検出手段は、
励起光の照射により蛍光標識から発する蛍光を波長選別
して検出し、励起光の波長と波長選別された蛍光波長を
識別して、蛍光標識物を識別して試料を検出すること、
検出手段は、試料の泳動速度がほぼ一定である溶液媒体
中で、試料を検出すること、検出手段は、励起光の波長
と蛍光を受光するチャンネルの組み合わせにより蛍光標
識を識別して、試料を検出すること、蛍光標識された試
料が同一の前記泳動レーンで電気泳動分離されることに
も特徴がある。
【００１４】本願発明では、フェルスター（Ｖｏｎ Ｔ
ｈ． Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）（アンナーレン デア フュ
ジーク シリーズ６、２巻（１９４８年）５５−７５頁
（Ａｎｎａｌｅｎ ｄｅｒ Ｐｈｙｓｉｋ、６．Ｆｏｌ
ｇｅ．Ｂａｎｄ２．（１９４８）ｐｐ．５５−７
５））、及びストライヤー（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ）とホー
グランド（Ｐ．Ｈ．Ｈａｕｇｌａｎｄ）（プロシーディ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンシズ オブ ユー エス エー ５８巻（１９６
７年）７１９−７２６頁（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５８（１９６７）ｐｐ．７１９−７
２６））の結果に基づいて、ＤＮＡ断片に標識されたエ
ネルギー供与体とエネルギー受容体となる２種類の蛍光
体間の距離が、数ｎｍ以下で、前者の発光スペクトルと
後者の吸収スペクトルの重なりが大きければ、両者の間
でエネルギー移動が生ずることとなり、しかも１００％
ないしそれに近い効率のエネルギー移動が期待できる。
ｈ． Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）（アンナーレン デア フュ
ジーク シリーズ６、２巻（１９４８年）５５−７５頁
（Ａｎｎａｌｅｎ ｄｅｒ Ｐｈｙｓｉｋ、６．Ｆｏｌ
ｇｅ．Ｂａｎｄ２．（１９４８）ｐｐ．５５−７
５））、及びストライヤー（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ）とホー
グランド（Ｐ．Ｈ．Ｈａｕｇｌａｎｄ）（プロシーディ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンシズ オブ ユー エス エー ５８巻（１９６
７年）７１９−７２６頁（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５８（１９６７）ｐｐ．７１９−７
２６））の結果に基づいて、ＤＮＡ断片に標識されたエ
ネルギー供与体とエネルギー受容体となる２種類の蛍光
体間の距離が、数ｎｍ以下で、前者の発光スペクトルと
後者の吸収スペクトルの重なりが大きければ、両者の間
でエネルギー移動が生ずることとなり、しかも１００％
ないしそれに近い効率のエネルギー移動が期待できる。
【００１５】即ち、エネルギー供与体となる蛍光体を励
起するとエネルギー受容体である蛍光体から蛍光発光が
高効率で観測できる。また、エネルギー供与体となる蛍
光体だけが標識されている場合と比較して、発光波長が
長波長側にシフトするため、励起光の波長と発光の波長
が離れるので、蛍光発光の計測に際して、励起光による
い散乱等の影響を受けにくくなり、高感度な蛍光計測が
実現できる。
起するとエネルギー受容体である蛍光体から蛍光発光が
高効率で観測できる。また、エネルギー供与体となる蛍
光体だけが標識されている場合と比較して、発光波長が
長波長側にシフトするため、励起光の波長と発光の波長
が離れるので、蛍光発光の計測に際して、励起光による
い散乱等の影響を受けにくくなり、高感度な蛍光計測が
実現できる。
【００１６】また、同一の波長で励起できる複数の発光
体を選択する場合に、エネルギー移動による発光を利用
すれば、同一のエネルギー供与体と高い効率でエネルギ
ー移動を受ける複数の受容体との組み合わせ、あるい
は、同一、又は異なる波長で高効率で励起できる複数種
類の蛍光体と、複数種類の蛍光体のそれぞれから高い効
率でエネルギー移動を受ける受容体との組み合わせ等が
可能となり、最終的に蛍光を検出する蛍光体を高効率に
励起できる、即ち、高感度に検出できる蛍光体の選択の
幅が広がる。従って、標識されたＤＮＡの識別可能な種
類は、エネルギー供与体である励起用標識物とエネルギ
ー受容体である発光用標識物の組み合わせの数によって
決まることになる。
体を選択する場合に、エネルギー移動による発光を利用
すれば、同一のエネルギー供与体と高い効率でエネルギ
ー移動を受ける複数の受容体との組み合わせ、あるい
は、同一、又は異なる波長で高効率で励起できる複数種
類の蛍光体と、複数種類の蛍光体のそれぞれから高い効
率でエネルギー移動を受ける受容体との組み合わせ等が
可能となり、最終的に蛍光を検出する蛍光体を高効率に
励起できる、即ち、高感度に検出できる蛍光体の選択の
幅が広がる。従って、標識されたＤＮＡの識別可能な種
類は、エネルギー供与体である励起用標識物とエネルギ
ー受容体である発光用標識物の組み合わせの数によって
決まることになる。
【００１７】そこで、異なる最適励起波長と発光波長を
持つ蛍光体を、異なる波長のレーザで励起し、発光用標
識物となる蛍光体を、例えば、４種類用意し、その４種
類の発光波長に対応した４つの受光チャンネルを持つ光
検出系を用意する。２種類の波長の励起光を用い、それ
ぞれの励起光で効率良く励起できる蛍光体からのエネル
ギー移動で発光用蛍光体を励起し蛍光を得るが、２種類
の励起光を時間的に交互に照射することで両者（２種類
の励起光）を区別したり、２種類の励起光の照射位置を
ずらして両者（２種類の励起光）を区別するようにすれ
ば、発光がどちらの波長の励起光によるかがわかり、励
起光の波長の種類あるいは励起用標識物の種類数と発光
用標識物の種類数との積だけのＤＮＡの種類（試料ＤＮ
Ａの種類）を区別して同時に計測できる。このため非常
に多くの種類のＤＮＡを区別して計測できる。
持つ蛍光体を、異なる波長のレーザで励起し、発光用標
識物となる蛍光体を、例えば、４種類用意し、その４種
類の発光波長に対応した４つの受光チャンネルを持つ光
検出系を用意する。２種類の波長の励起光を用い、それ
ぞれの励起光で効率良く励起できる蛍光体からのエネル
ギー移動で発光用蛍光体を励起し蛍光を得るが、２種類
の励起光を時間的に交互に照射することで両者（２種類
の励起光）を区別したり、２種類の励起光の照射位置を
ずらして両者（２種類の励起光）を区別するようにすれ
ば、発光がどちらの波長の励起光によるかがわかり、励
起光の波長の種類あるいは励起用標識物の種類数と発光
用標識物の種類数との積だけのＤＮＡの種類（試料ＤＮ
Ａの種類）を区別して同時に計測できる。このため非常
に多くの種類のＤＮＡを区別して計測できる。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を、図面を
参照して詳細に説明する。以下の例では、試料としてＤ
ＮＡを用いたが、他の物質（糖、蛋白等）でも同様であ
る。
参照して詳細に説明する。以下の例では、試料としてＤ
ＮＡを用いたが、他の物質（糖、蛋白等）でも同様であ
る。
【００１９】（実施例１）まず、励起用蛍光体と発光用
蛍光体を１個ずつ標識したプライマー（あるいはＤＮＡ
プローブ）の作成について説明する。２種類の励起用蛍
光体として、Ｓｕｃｃｉｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ
（ＳＦ）の異性体である ＳＦ５０５（励起極大波長４８６ｎｍ、発光極大波長５
０５ｎｍ）、及びＳＦ５２６（励起極大波長５０８ｎ
ｍ、発光極大波長５２６ｎｍ）を用いた。
蛍光体を１個ずつ標識したプライマー（あるいはＤＮＡ
プローブ）の作成について説明する。２種類の励起用蛍
光体として、Ｓｕｃｃｉｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ
（ＳＦ）の異性体である ＳＦ５０５（励起極大波長４８６ｎｍ、発光極大波長５
０５ｎｍ）、及びＳＦ５２６（励起極大波長５０８ｎ
ｍ、発光極大波長５２６ｎｍ）を用いた。
【００２０】ＳＦ５０５、及びＳＦ５２６は、サイエン
ス、２３８巻、３３６−３４１頁（１９８７）（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２３８、３３６−３４１（１９８７））に報
告されている化合物であり、図１に示した励起スペクト
ル、及び発光スペクトルを持つ。４種類の発光用蛍光体
として、ＴＲＩＴＣ（励起極大波長５５５ｎｍ、発光極
大波長５８５ｎｍ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（励起極大波
長５９４ｎｍ、発光極大波長６１５ｎｍ）、Ｃｙ５（励
起極大波長６５０ｎｍ、発光極大波長６６７ｎｍ）、及
びＳＦ５０５、ＳＦ５２６を用いた。発光用蛍光体の一
つは励起用蛍光体と同一でよい。励起用蛍光体と発光用
蛍光体は、プライマー（あるいはＤＮＡプローブ）の４
塩基離れた位置に結合している。このような励起用蛍光
体と発光用蛍光体とが一個づつ標識されたプライマーあ
るいはＤＮＡプローブを８種類用意する。
ス、２３８巻、３３６−３４１頁（１９８７）（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２３８、３３６−３４１（１９８７））に報
告されている化合物であり、図１に示した励起スペクト
ル、及び発光スペクトルを持つ。４種類の発光用蛍光体
として、ＴＲＩＴＣ（励起極大波長５５５ｎｍ、発光極
大波長５８５ｎｍ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（励起極大波
長５９４ｎｍ、発光極大波長６１５ｎｍ）、Ｃｙ５（励
起極大波長６５０ｎｍ、発光極大波長６６７ｎｍ）、及
びＳＦ５０５、ＳＦ５２６を用いた。発光用蛍光体の一
つは励起用蛍光体と同一でよい。励起用蛍光体と発光用
蛍光体は、プライマー（あるいはＤＮＡプローブ）の４
塩基離れた位置に結合している。このような励起用蛍光
体と発光用蛍光体とが一個づつ標識されたプライマーあ
るいはＤＮＡプローブを８種類用意する。
【００２１】励起用蛍光体、及び発光用蛍光体のプライ
マー（あるいはＤＮＡプローブ）への標識には、特開昭
６１−４４３５３号公報に開示された方法を用いた。こ
の方法は、蛍光体標識を導入するポリヌクレオチドの部
位のリン酸結合を、官能基を有するホスホン酸結合に置
き換え、この官能基と蛍光体を結合させてポリヌクレオ
チドに蛍光体標識を行なう方法であり、ポリヌクレオチ
ドの任意の位置に標識物を導入できる。励起用標識物、
及び発光用標識物をプライマー（あるいはＤＮＡプロー
ブ）に一個ずつ標識するために、以下の標識法を用い
た。上記の標識を導入する部位にホスホン酸を導入した
プライマー（あるいはＤＮＡプローブ）に、まずＳＦ５
０５あるいはＳＦ５２６を標識する反応を行なう。
マー（あるいはＤＮＡプローブ）への標識には、特開昭
６１−４４３５３号公報に開示された方法を用いた。こ
の方法は、蛍光体標識を導入するポリヌクレオチドの部
位のリン酸結合を、官能基を有するホスホン酸結合に置
き換え、この官能基と蛍光体を結合させてポリヌクレオ
チドに蛍光体標識を行なう方法であり、ポリヌクレオチ
ドの任意の位置に標識物を導入できる。励起用標識物、
及び発光用標識物をプライマー（あるいはＤＮＡプロー
ブ）に一個ずつ標識するために、以下の標識法を用い
た。上記の標識を導入する部位にホスホン酸を導入した
プライマー（あるいはＤＮＡプローブ）に、まずＳＦ５
０５あるいはＳＦ５２６を標識する反応を行なう。
【００２２】この時、反応生成物を液体クロマトグラフ
ィーで随時モニターし、ＤＮＡ由来の２６０ｎｍの吸収
度と、ＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６由来の５００ｎｍ
近傍の吸光度とを比較することにより、ＤＮＡ断片へ
の、ＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６の導入反応の進行具
合を評価した。この反応生成物をアクリルアミド中で電
気泳動し、無標識のプライマー（あるいはＤＮＡプロー
ブ）と、ＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６が１個あるいは
２個導入されたプライマー（あるいはＤＮＡプローブ）
とを分離し、ＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６が１個導入
されたプライマー（あるいはＤＮＡプローブ）を含む部
分を含むゲルを切り出し、その中に含まれるプライマー
（あるいはＤＮＡプローブ）を精製する。こうして精製
したＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６が標識されたプライ
マー（あるいはＤＮＡプローブ）に発光用蛍光体の標識
反応を行なう。以上の反応プロセスにより励起用蛍光体
と発光用蛍光体を１個ずつ標識したプライマー（あるい
はＤＮＡプローブ）が得られる。図２に、励起用蛍光体
としてＳＦ５０５（１００）、及びＳＦ５２６（１１
０）を用い、発光用蛍光体としてＴＲＩＴＣ（１２
０）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１２２）、Ｃｙ５（１２
４）、ＳＦ５０５（１２６）、ＳＦ５２６（１２６’）
が標識されたプライマー（あるいはＤＮＡプローブ）
（１３０、１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、
１４４、１４６）を示す。
ィーで随時モニターし、ＤＮＡ由来の２６０ｎｍの吸収
度と、ＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６由来の５００ｎｍ
近傍の吸光度とを比較することにより、ＤＮＡ断片へ
の、ＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６の導入反応の進行具
合を評価した。この反応生成物をアクリルアミド中で電
気泳動し、無標識のプライマー（あるいはＤＮＡプロー
ブ）と、ＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６が１個あるいは
２個導入されたプライマー（あるいはＤＮＡプローブ）
とを分離し、ＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６が１個導入
されたプライマー（あるいはＤＮＡプローブ）を含む部
分を含むゲルを切り出し、その中に含まれるプライマー
（あるいはＤＮＡプローブ）を精製する。こうして精製
したＳＦ５０５あるいはＳＦ５２６が標識されたプライ
マー（あるいはＤＮＡプローブ）に発光用蛍光体の標識
反応を行なう。以上の反応プロセスにより励起用蛍光体
と発光用蛍光体を１個ずつ標識したプライマー（あるい
はＤＮＡプローブ）が得られる。図２に、励起用蛍光体
としてＳＦ５０５（１００）、及びＳＦ５２６（１１
０）を用い、発光用蛍光体としてＴＲＩＴＣ（１２
０）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１２２）、Ｃｙ５（１２
４）、ＳＦ５０５（１２６）、ＳＦ５２６（１２６’）
が標識されたプライマー（あるいはＤＮＡプローブ）
（１３０、１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、
１４４、１４６）を示す。
【００２３】以上では、蛍光標識をポリヌクレオチド骨
格のリン（Ｐ）原子に結合する方法を説明したが、サイ
エンス、２３８巻、３３６−３４１頁（１９８７）（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２３８、３３６−３４１（１９８７））
に記載の方法により塩基に標識を付加することも可能で
ある。
格のリン（Ｐ）原子に結合する方法を説明したが、サイ
エンス、２３８巻、３３６−３４１頁（１９８７）（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２３８、３３６−３４１（１９８７））
に記載の方法により塩基に標識を付加することも可能で
ある。
【００２４】次ぎに、図２に示す８種類のプライマー
（１３０、１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、
１４４、１４６）を使用して、２種類の異なる試料ＤＮ
Ａ（ａ、ｂ）の塩基配列決定を行なう例について説明す
る。ＤＮＡのシーケンス反応は周知のサンガー法に準じ
て行なう。試料ＤＮＡ（ａ）については、塩基Ａで終端
するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１３０を、塩
基Ｔで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１
３２を、塩基Ｇで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプ
ライマー１３４を、塩基Ｃで終端するＤＮＡ断片を得る
反応ではプライマー１３６を、それぞれ用いて行なう。
また、試料ＤＮＡ（ｂ）については、塩基Ａで終端する
ＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１４０を、塩基Ｔ
で終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１４２
を、塩基Ｇで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライ
マー１４４を、塩基Ｃで終端するＤＮＡ断片を得る反応
ではプライマー１４６を、それぞれ用いて行なう。各Ｄ
ＮＡ試料（ａ、ｂ）について、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各塩基
毎の反応生成物を混合して、塩基配列決定用の試料を得
る。各ＤＮＡ試料（ａ、ｂ）に関する塩基配列決定用の
試料を、さらに混合して電気泳動装置の１つの泳動レー
ン（泳動路、チャンネル）に供給し、所定の電圧を印加
してゲル中でＤＮＡ断片の電気泳動分離を行なう（もち
ろん、各ＤＮＡ試料（ａ、ｂ）に関する塩基配列決定用
の試料を、電気泳動装置の異なる泳動レーン（泳動路、
チャンネル）に供給し、ＤＮＡ断片の電気泳動分離を行
なってもよいことはいうまでもない）。
（１３０、１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、
１４４、１４６）を使用して、２種類の異なる試料ＤＮ
Ａ（ａ、ｂ）の塩基配列決定を行なう例について説明す
る。ＤＮＡのシーケンス反応は周知のサンガー法に準じ
て行なう。試料ＤＮＡ（ａ）については、塩基Ａで終端
するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１３０を、塩
基Ｔで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１
３２を、塩基Ｇで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプ
ライマー１３４を、塩基Ｃで終端するＤＮＡ断片を得る
反応ではプライマー１３６を、それぞれ用いて行なう。
また、試料ＤＮＡ（ｂ）については、塩基Ａで終端する
ＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１４０を、塩基Ｔ
で終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１４２
を、塩基Ｇで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライ
マー１４４を、塩基Ｃで終端するＤＮＡ断片を得る反応
ではプライマー１４６を、それぞれ用いて行なう。各Ｄ
ＮＡ試料（ａ、ｂ）について、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各塩基
毎の反応生成物を混合して、塩基配列決定用の試料を得
る。各ＤＮＡ試料（ａ、ｂ）に関する塩基配列決定用の
試料を、さらに混合して電気泳動装置の１つの泳動レー
ン（泳動路、チャンネル）に供給し、所定の電圧を印加
してゲル中でＤＮＡ断片の電気泳動分離を行なう（もち
ろん、各ＤＮＡ試料（ａ、ｂ）に関する塩基配列決定用
の試料を、電気泳動装置の異なる泳動レーン（泳動路、
チャンネル）に供給し、ＤＮＡ断片の電気泳動分離を行
なってもよいことはいうまでもない）。
【００２５】電気泳動装置としては、波長の異なるレー
ザでそれぞれ異なる位置を照射し、泳動分離されたＤＮ
Ａ断片に標識された蛍光体から発する蛍光を検出する装
置が用いられる。この種の装置については、特開平３−
２９３５５７号公報に開示されているが、本実施例で
は、波長の異なるレーザをそれぞれ異なる泳動路上の部
位を、全ての泳動路とほぼ直交して実質的に全ての泳動
路を同時に照射し、レーザが照射された２つの線状の照
射領域から発する蛍光を二次元検出器で受光する装置を
用いた。
ザでそれぞれ異なる位置を照射し、泳動分離されたＤＮ
Ａ断片に標識された蛍光体から発する蛍光を検出する装
置が用いられる。この種の装置については、特開平３−
２９３５５７号公報に開示されているが、本実施例で
は、波長の異なるレーザをそれぞれ異なる泳動路上の部
位を、全ての泳動路とほぼ直交して実質的に全ての泳動
路を同時に照射し、レーザが照射された２つの線状の照
射領域から発する蛍光を二次元検出器で受光する装置を
用いた。
【００２６】なお、ＤＮＡ断片が泳動するゲル電気泳動
部として、板状（スラブ）ゲルを用いる場合と、キャピ
ラリーゲルを用いる場合とがあるが、本実施例ではキャ
ピラリーゲル分離部もち、シースフロー中でＤＮＡ断片
を検出するキャピラリーアレー装置を使用した。この種
のキャピラリーアレー装置については、特開平５−０７
２１７７号公報、特開平５−２９６９７８号公報、特開
平０６−１３８０３７号公報、及び米国特許ＵＳＰ５１
９２４１２に開示されている。
部として、板状（スラブ）ゲルを用いる場合と、キャピ
ラリーゲルを用いる場合とがあるが、本実施例ではキャ
ピラリーゲル分離部もち、シースフロー中でＤＮＡ断片
を検出するキャピラリーアレー装置を使用した。この種
のキャピラリーアレー装置については、特開平５−０７
２１７７号公報、特開平５−２９６９７８号公報、特開
平０６−１３８０３７号公報、及び米国特許ＵＳＰ５１
９２４１２に開示されている。
【００２７】本実施例で使用した電気泳動装置の概要を
図３に示す。上記で得た各ＤＮＡ試料（ａ、ｂ）に関す
る塩基配列決定用の試料は混合されて、複数のゲルキャ
ピラリー１の１つのゲルキャピラリーの泳動開始点に供
給され、バッファー液槽１３−１、１３−２の中の図示
しない電極により電圧が印加され、ＤＮＡ断片が電気泳
動分離される。複数のゲルキャピラリー１のそれぞれと
所定の間隙をもって対向する複数のキャピラリー４が、
シースフローセル３の内部に配置されている。シースフ
ローセル３の内部には、シース溶液２が注入されシース
フロー（図示せず）が形成される。各ゲルキャピラリー
１で電気泳動分離されたＤＮＡ断片はゲルキャピラリー
から溶出して、各ゲルキャピラリー１、２の対の間の上
記間隙内を、他のゲルキャピラリーから溶出したＤＮＡ
断片とは独立して流れる。
図３に示す。上記で得た各ＤＮＡ試料（ａ、ｂ）に関す
る塩基配列決定用の試料は混合されて、複数のゲルキャ
ピラリー１の１つのゲルキャピラリーの泳動開始点に供
給され、バッファー液槽１３−１、１３−２の中の図示
しない電極により電圧が印加され、ＤＮＡ断片が電気泳
動分離される。複数のゲルキャピラリー１のそれぞれと
所定の間隙をもって対向する複数のキャピラリー４が、
シースフローセル３の内部に配置されている。シースフ
ローセル３の内部には、シース溶液２が注入されシース
フロー（図示せず）が形成される。各ゲルキャピラリー
１で電気泳動分離されたＤＮＡ断片はゲルキャピラリー
から溶出して、各ゲルキャピラリー１、２の対の間の上
記間隙内を、他のゲルキャピラリーから溶出したＤＮＡ
断片とは独立して流れる。
【００２８】レーザ光源５”−１、５”−２としてＡｒ
イオンレーザ光源を使用して、レーザ（４８８ｎｍ、５
１５ｎｍ）５’−１、５’−２を、シースフローセル３
の内部に照射する。レーザ５’−１（４８８ｎｍ）、レ
ーザ５’−２（５１５ｎｍ）の波長のレーザはそれぞ
れ、ダイクロイックミラー６、ミラー７により、ＤＮＡ
断片の泳動方向において約０．５ｍｍだけ分離して、全
ての泳動路とほぼ直交して実質的に全ての泳動路を同時
に照射される。即ち、シースフローセル３の内部での光
照射部は２つの線状の照射領域からなり、レーザ５’−
１、５’−２は、全ての泳動路が形成する平面に沿って
横方向から、泳動方向の上流側、下流側で入射し、全て
の泳動路を実質的に同時に照射する。上記各間隙におい
て、２本のレーザと各キャピラリー１の延長との交差点
近傍を通過する蛍光標識されたＤＮＡ断片から蛍光が発
するので、一直線に並んだ点状蛍光像（蛍光線像）が２
本観測される。
イオンレーザ光源を使用して、レーザ（４８８ｎｍ、５
１５ｎｍ）５’−１、５’−２を、シースフローセル３
の内部に照射する。レーザ５’−１（４８８ｎｍ）、レ
ーザ５’−２（５１５ｎｍ）の波長のレーザはそれぞ
れ、ダイクロイックミラー６、ミラー７により、ＤＮＡ
断片の泳動方向において約０．５ｍｍだけ分離して、全
ての泳動路とほぼ直交して実質的に全ての泳動路を同時
に照射される。即ち、シースフローセル３の内部での光
照射部は２つの線状の照射領域からなり、レーザ５’−
１、５’−２は、全ての泳動路が形成する平面に沿って
横方向から、泳動方向の上流側、下流側で入射し、全て
の泳動路を実質的に同時に照射する。上記各間隙におい
て、２本のレーザと各キャピラリー１の延長との交差点
近傍を通過する蛍光標識されたＤＮＡ断片から蛍光が発
するので、一直線に並んだ点状蛍光像（蛍光線像）が２
本観測される。
【００２９】蛍光線像は、レンズ１１−１により集光さ
れ、色フィルター（第１、第２、第３、第４のフイルタ
ー（９−１、９−２、９−３、９−４）から構成される
分割フイルター）９、及び分割プリズム１０（特開平０
２−２６９９３６号公報）で４分割され、波長選別され
た蛍光線像として、レンズ１１−２により２次元検出器
８に結像され検出される。検出された信号の所定の処理
が実行されて、最終的に塩基配列情報が得られる。な
お、レーザ５’−１、５’−２を、上記のようにＤＮＡ
断片の泳動方向において約０．５ｍｍだけ分離し、さら
に時分割して交互に照射してもよい。また、レーザ５’
−１、５’−２を、上記のようにＤＮＡ断片の泳動方向
において約０．５ｍｍだけ分離するのではなく、時分割
して同一位置に交互に照射してもよい。
れ、色フィルター（第１、第２、第３、第４のフイルタ
ー（９−１、９−２、９−３、９−４）から構成される
分割フイルター）９、及び分割プリズム１０（特開平０
２−２６９９３６号公報）で４分割され、波長選別され
た蛍光線像として、レンズ１１−２により２次元検出器
８に結像され検出される。検出された信号の所定の処理
が実行されて、最終的に塩基配列情報が得られる。な
お、レーザ５’−１、５’−２を、上記のようにＤＮＡ
断片の泳動方向において約０．５ｍｍだけ分離し、さら
に時分割して交互に照射してもよい。また、レーザ５’
−１、５’−２を、上記のようにＤＮＡ断片の泳動方向
において約０．５ｍｍだけ分離するのではなく、時分割
して同一位置に交互に照射してもよい。
【００３０】図４に模試的に示すように、２次元検出器
８の検出面３０では、分割フイルター９、分割プリズム
１０により分離された、合計８個の点状蛍光像３２−
１、３２−２、３４−１、３４−２、３６−１、３６−
２、３８−１、３８−２が得られ、点状蛍光像３２−
１、３４−１、３６−１、３８−１はそれぞれ、Ａｒイ
オンレーザ（４８８ｎｍ）の照射による蛍光が、第１、
第２、第３、第４フィルター（９−１、９−２、９−
３、９−４）を通過して検出された光像、点状蛍光像３
２−２、３４−２、３６−２、３８−２はそれぞれ、Ａ
ｒイオンレーザ（５１５ｎｍ）の照射による蛍光が、第
１、第２、第３、第４フィルター（９−１、９−２、９
−３、９−４）を通過しして検出された光像である。本
実施例の方法により、複数の泳動レーンを使用して電気
泳動する場合には、図４に示す模試的なパターンが複数
得られることになる。なお、図４は、図３に示す蛍光検
出系によって像分割され得られる蛍光像を模試的に示し
ている。
８の検出面３０では、分割フイルター９、分割プリズム
１０により分離された、合計８個の点状蛍光像３２−
１、３２−２、３４−１、３４−２、３６−１、３６−
２、３８−１、３８−２が得られ、点状蛍光像３２−
１、３４−１、３６−１、３８−１はそれぞれ、Ａｒイ
オンレーザ（４８８ｎｍ）の照射による蛍光が、第１、
第２、第３、第４フィルター（９−１、９−２、９−
３、９−４）を通過して検出された光像、点状蛍光像３
２−２、３４−２、３６−２、３８−２はそれぞれ、Ａ
ｒイオンレーザ（５１５ｎｍ）の照射による蛍光が、第
１、第２、第３、第４フィルター（９−１、９−２、９
−３、９−４）を通過しして検出された光像である。本
実施例の方法により、複数の泳動レーンを使用して電気
泳動する場合には、図４に示す模試的なパターンが複数
得られることになる。なお、図４は、図３に示す蛍光検
出系によって像分割され得られる蛍光像を模試的に示し
ている。
【００３１】光照射部に５１５ｎｍの励起光が照射され
ると、ＳＦ５２６だけが励起され、ＳＦ５２６からのエ
ネルギー移動により４種類の発光用蛍光体（ＴＲＩＴＣ
（１２０）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１２２）、Ｃｙ５
（１２４）、及びＡＦ５２６（１２６’））が蛍光を発
する。ＤＮＡ断片を標識している蛍光体の種類に応じて
異なる波長の蛍光が分割プリズムを用いた色分離検出系
により区別して検出される。一方、光照射部に４８８ｎ
ｍの励起光が照射されると、４８８ｎｍの励起光の照射
位置と、５１５ｎｍの励起光の照射位置とは、約０．５
ｍｍだけ分離しているので、４８８ｎｍ、及び５１５ｎ
ｍの励起光の照射に基づき、ＤＮＡ断片から発する蛍光
は、お互いに分離して区別して検出できる。
ると、ＳＦ５２６だけが励起され、ＳＦ５２６からのエ
ネルギー移動により４種類の発光用蛍光体（ＴＲＩＴＣ
（１２０）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１２２）、Ｃｙ５
（１２４）、及びＡＦ５２６（１２６’））が蛍光を発
する。ＤＮＡ断片を標識している蛍光体の種類に応じて
異なる波長の蛍光が分割プリズムを用いた色分離検出系
により区別して検出される。一方、光照射部に４８８ｎ
ｍの励起光が照射されると、４８８ｎｍの励起光の照射
位置と、５１５ｎｍの励起光の照射位置とは、約０．５
ｍｍだけ分離しているので、４８８ｎｍ、及び５１５ｎ
ｍの励起光の照射に基づき、ＤＮＡ断片から発する蛍光
は、お互いに分離して区別して検出できる。
【００３２】４８８ｎｍの励起光は、ＳＦ５０５とＳＦ
５２６の両方を励起するが、ＳＦ５２６の方が励起効率
が悪い。ＳＦ５２６からのエネルギー移動により励起さ
れ得られる上記４種類の蛍光体による蛍光強度は、ＳＦ
５０５からのエネルギー移動により励起され得られる上
記４種類の蛍光体による蛍光強度より弱い。また、４８
８ｎｍの励起光、及び５１５ｎｍの励起光により、ＳＦ
５０５が励起されＳＦ５０５からのエネルギー移動によ
り励起され得られる蛍光強度の間には、励起光の差によ
る一定の強度関係が成り立つ。４８８ｎｍの励起光と５
１５ｎｍの励起光は、それぞれ異なる位置に照射される
ので、いずれの波長の励起光により発した蛍光であるか
は、空間的に区別して計測できる。
５２６の両方を励起するが、ＳＦ５２６の方が励起効率
が悪い。ＳＦ５２６からのエネルギー移動により励起さ
れ得られる上記４種類の蛍光体による蛍光強度は、ＳＦ
５０５からのエネルギー移動により励起され得られる上
記４種類の蛍光体による蛍光強度より弱い。また、４８
８ｎｍの励起光、及び５１５ｎｍの励起光により、ＳＦ
５０５が励起されＳＦ５０５からのエネルギー移動によ
り励起され得られる蛍光強度の間には、励起光の差によ
る一定の強度関係が成り立つ。４８８ｎｍの励起光と５
１５ｎｍの励起光は、それぞれ異なる位置に照射される
ので、いずれの波長の励起光により発した蛍光であるか
は、空間的に区別して計測できる。
【００３３】従って、５１５ｎｍの励起光により得られ
る蛍光を測定することにより、４８８ｎｍの励起光によ
り得られる蛍光強度のうちの、ＳＦ５２６励起によるエ
ネルギー移動により励起され得られる蛍光強度の寄与分
を推定し、この推定値を４８８ｎｍの励起光により得ら
れる蛍光強度から除去して、ＳＦ５０５励起によるエネ
ルギー移動により励起され得られる蛍光強度だけを取り
出せる。ＳＦ５０５励起によるエネルギー移動により励
起され得られる蛍光強度だけを求める方法の一例を次ぎ
に説明する。
る蛍光を測定することにより、４８８ｎｍの励起光によ
り得られる蛍光強度のうちの、ＳＦ５２６励起によるエ
ネルギー移動により励起され得られる蛍光強度の寄与分
を推定し、この推定値を４８８ｎｍの励起光により得ら
れる蛍光強度から除去して、ＳＦ５０５励起によるエネ
ルギー移動により励起され得られる蛍光強度だけを取り
出せる。ＳＦ５０５励起によるエネルギー移動により励
起され得られる蛍光強度だけを求める方法の一例を次ぎ
に説明する。
【００３４】４８８ｎｍの励起光強度Ｉ0（４８８）と
５１５ｎｍの励起光強度Ｉ0（５１５）との比をα、４
８８ｎｍの励起光によるＳＦ５２６の励起効率をβ（Ｓ
Ｆ５２６／４８８）と、５１５ｎｍの励起光によるＳＦ
５２６の励起効率をβ（ＳＦ５２６／５１５）との比を
γ（γ＜１）、４８８ｎｍの励起光によるＳＦ５２６の
励起効率をβ（ＳＦ５０５／４８８）とする。添字ｆ
は、上記４種類の蛍光体のいずれかを示すものとし、４
８８ｎｍに励起光によりＳＦ５２６からのエネルギー移
動による蛍光体ｆの励起効率δf（ＳＦ５２６／４８
８）と、５１５ｎｍに励起光によりＳＦ５２６からのエ
ネルギー移動による蛍光体ｆの励起効率δf（ＳＦ５２
６／５１５）との比をε、４８８ｎｍに励起光によりＳ
Ｆ５０５からのエネルギー移動による蛍光体ｆの励起効
率をδf（ＳＦ５２６／５１５）とする。
５１５ｎｍの励起光強度Ｉ0（５１５）との比をα、４
８８ｎｍの励起光によるＳＦ５２６の励起効率をβ（Ｓ
Ｆ５２６／４８８）と、５１５ｎｍの励起光によるＳＦ
５２６の励起効率をβ（ＳＦ５２６／５１５）との比を
γ（γ＜１）、４８８ｎｍの励起光によるＳＦ５２６の
励起効率をβ（ＳＦ５０５／４８８）とする。添字ｆ
は、上記４種類の蛍光体のいずれかを示すものとし、４
８８ｎｍに励起光によりＳＦ５２６からのエネルギー移
動による蛍光体ｆの励起効率δf（ＳＦ５２６／４８
８）と、５１５ｎｍに励起光によりＳＦ５２６からのエ
ネルギー移動による蛍光体ｆの励起効率δf（ＳＦ５２
６／５１５）との比をε、４８８ｎｍに励起光によりＳ
Ｆ５０５からのエネルギー移動による蛍光体ｆの励起効
率をδf（ＳＦ５２６／５１５）とする。
【００３５】
【数１】
α＝Ｉ0（４８８）÷Ｉ0（５１５） …（数１）
【００３６】
【数２】
γ＝β（ＳＦ５２６／４８８）÷β（ＳＦ５２６／５１５） …（数２）
【００３７】
【数３】
ε＝δf（ＳＦ５２６／４８８）÷δf（ＳＦ５２６／５１５） …（数３）
５１５ｎｍに励起光によりＳＦ５２６からのエネルギー
移動により励起され得られる蛍光強度（実測）Ｉf（Ｓ
Ｆ５２６／５１５）は、（数４）となる。
移動により励起され得られる蛍光強度（実測）Ｉf（Ｓ
Ｆ５２６／５１５）は、（数４）となる。
【００３８】
【数４】
Ｉf（ＳＦ５２６／５１５）
＝Ｉ0（５１５）×β（ＳＦ５２６／５１５）×δf（ＳＦ５２６／５１５）
…（数４）
４８８ｎｍに励起光によりＳＦ５２６からのエネルギー
移動により励起される蛍光強度をＩf（ＳＦ５２６／４
８８）、４８８ｎｍに励起光によりＳＦ５０５からのエ
ネルギー移動により励起される蛍光強度をＩf（ＳＦ５
０５／４８８）とすると、４８８ｎｍに励起光によりＳ
Ｆ５２６、ＳＦ５０５からのエネルギー移動により励起
され得られる蛍光強度（実測）Ｉf（（ＳＦ５２６＋Ｓ
Ｆ５０５）／４８８）は、（数５）となる。
移動により励起される蛍光強度をＩf（ＳＦ５２６／４
８８）、４８８ｎｍに励起光によりＳＦ５０５からのエ
ネルギー移動により励起される蛍光強度をＩf（ＳＦ５
０５／４８８）とすると、４８８ｎｍに励起光によりＳ
Ｆ５２６、ＳＦ５０５からのエネルギー移動により励起
され得られる蛍光強度（実測）Ｉf（（ＳＦ５２６＋Ｓ
Ｆ５０５）／４８８）は、（数５）となる。
【００３９】
【数５】
Ｉf（（ＳＦ５２６＋ＳＦ５０５）／４８８）
＝Ｉf（ＳＦ５０５／４８８）＋Ｉf（ＳＦ５２６／４８８）
＝Ｉ0（４８８）×β（ＳＦ５０５／４８８）×δf（ＳＦ５０５／４８８）
＋Ｉ0（４８８）×β（ＳＦ５２６／４８８）×δf（ＳＦ５２６／４８８）
…（数５）
従って、蛍光強度Ｉf（ＳＦ５０５／４８８）は、（数
７）から、以下のようにして求められる。
７）から、以下のようにして求められる。
【００４０】
【数６】
Ｉf（ＳＦ５０５／４８８）
＝Ｉf（（ＳＦ５２６＋ＳＦ５０５）／４８８）
−Ｉ0（４８８）×β（ＳＦ５２６／４８８）×δf（ＳＦ５２６／４８８）
…（数６）
（数６）において、（数２）より、
β（ＳＦ５２６／４８８）＝γ×β（ＳＦ５２６／５１
５） （数３）より、 δf（ＳＦ５２６／４８８）＝ε×δf（ＳＦ５２６／５
１５） であり、 β（ＳＦ５２６／４８８）×δf（ＳＦ５２６／４８
８）＝γ×ε×β（ＳＦ５２６／５１５）×δf（ＳＦ
５２６／５１５） となるが、さらに（数１）、（数４）より、 β（ＳＦ５２６／５１５）×δf（ＳＦ５２６／５１
５） ＝Ｉf（ＳＦ５２６／５１５）÷Ｉ0（５１５） ＝Ｉf（ＳＦ５２６／５１５）×α÷Ｉ0（４８８） であるから、 β（ＳＦ５２６／４８８）×δf（ＳＦ５２６／４８
８）＝γ×ε×Ｉf（ＳＦ５２６／５１５）×α÷Ｉ
0（４８８） となり、（数６）は（数７）と変形される。
５） （数３）より、 δf（ＳＦ５２６／４８８）＝ε×δf（ＳＦ５２６／５
１５） であり、 β（ＳＦ５２６／４８８）×δf（ＳＦ５２６／４８
８）＝γ×ε×β（ＳＦ５２６／５１５）×δf（ＳＦ
５２６／５１５） となるが、さらに（数１）、（数４）より、 β（ＳＦ５２６／５１５）×δf（ＳＦ５２６／５１
５） ＝Ｉf（ＳＦ５２６／５１５）÷Ｉ0（５１５） ＝Ｉf（ＳＦ５２６／５１５）×α÷Ｉ0（４８８） であるから、 β（ＳＦ５２６／４８８）×δf（ＳＦ５２６／４８
８）＝γ×ε×Ｉf（ＳＦ５２６／５１５）×α÷Ｉ
0（４８８） となり、（数６）は（数７）と変形される。
【００４１】
Ｉf（ＳＦ５０５／４８８）
＝Ｉf（（ＳＦ５２６＋ＳＦ５０５）／４８８）
−α×γ×ε×Ｉf（ＳＦ５２６／５１５） …（数７）
以上の説明では、２種類の励起用蛍光体と、４種類の発
光用蛍光体を用い、２種類の波長のレーザを励起光とし
て使用して、同一泳動路で２種類の試料ＤＮＡの塩基配
列決定する例を説明したが、一般に、ｍ種類の励起用蛍
光体と、ｎ種類の発光用蛍光体を用い、ｋ種類（ｋ≦
ｍ）の波長のレーザを励起光として使用して、同一泳動
路でｍ×ｎ種類の試料ＤＮＡの塩基配列決定ができる。
このように発光用蛍光体を複数種類用意し、これに対応
して発光用蛍光体から発する異なる波長の蛍光を区別し
て検出できる多色検出能力のある検出器を使用すること
で、励起光の波長の種類あるいは励起用蛍光体の数と発
光用蛍光体の数の積で決まる数の試料ＤＮＡを光学的に
識別して計測できる。
光用蛍光体を用い、２種類の波長のレーザを励起光とし
て使用して、同一泳動路で２種類の試料ＤＮＡの塩基配
列決定する例を説明したが、一般に、ｍ種類の励起用蛍
光体と、ｎ種類の発光用蛍光体を用い、ｋ種類（ｋ≦
ｍ）の波長のレーザを励起光として使用して、同一泳動
路でｍ×ｎ種類の試料ＤＮＡの塩基配列決定ができる。
このように発光用蛍光体を複数種類用意し、これに対応
して発光用蛍光体から発する異なる波長の蛍光を区別し
て検出できる多色検出能力のある検出器を使用すること
で、励起光の波長の種類あるいは励起用蛍光体の数と発
光用蛍光体の数の積で決まる数の試料ＤＮＡを光学的に
識別して計測できる。
【００４２】（実施例２）実施例１では、２つの異なる
波長のレーザと４種類の発光用蛍光体を用いて２種類の
試料ＤＮＡ（塩基配列決定用の末端塩基種の異なる試料
でいうと８種類）を区別したが、より多くの種類のレー
ザ、及び蛍光体を用いた計測にも適用できる。例えば、
Ａｒイオンレーザ（４８８ｎｍ、及び５１５ｎｍ）、及
びＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ）を用い、３種類の励起用
蛍光体、ＳＦ５０５（励起極大波長４８６ｎｍ、発光極
大波長５０５ｎｍ）、ＳＦ５２６（励起極大波長５０８
ｎｍ、発光極大波長５２６ｎｍ）、及びｃａｅｌｏｘｙ
ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（励起
極大波長５４０ｎｍ、発光極大波長５６６ｎｍ、以下簡
単のため、ＣＡＴＲＨと略記する）を用い、発光用蛍光
体として、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎ
ｅ ｉｓｏｔｈｉｏ ｃｉａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ；励
起極大波長５５５ｎｍ、発光極大波長５８５ｎｍ）、Ｘ
ＲＩＴＣ（励起極大波長５８０ｎｍ、発光極大波長６０
５ｎｍ）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（励起極大波長５５１ｎ
ｍ、発光極大波長６３６ｎｍ）、及びＣｙ５（励起極大
波長６５０ｎｍ、発光極大波長６６７ｎｍ）を使用でき
る。励起用蛍光体と発光用蛍光体を１個ずつ標識したプ
ライマーの作成は実施例１と同様の方法にして行ない、
以下の蛍光体が４塩基の距離だけ隔てて標識されたプラ
イマーを得る。
波長のレーザと４種類の発光用蛍光体を用いて２種類の
試料ＤＮＡ（塩基配列決定用の末端塩基種の異なる試料
でいうと８種類）を区別したが、より多くの種類のレー
ザ、及び蛍光体を用いた計測にも適用できる。例えば、
Ａｒイオンレーザ（４８８ｎｍ、及び５１５ｎｍ）、及
びＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ）を用い、３種類の励起用
蛍光体、ＳＦ５０５（励起極大波長４８６ｎｍ、発光極
大波長５０５ｎｍ）、ＳＦ５２６（励起極大波長５０８
ｎｍ、発光極大波長５２６ｎｍ）、及びｃａｅｌｏｘｙ
ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（励起
極大波長５４０ｎｍ、発光極大波長５６６ｎｍ、以下簡
単のため、ＣＡＴＲＨと略記する）を用い、発光用蛍光
体として、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎ
ｅ ｉｓｏｔｈｉｏ ｃｉａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ；励
起極大波長５５５ｎｍ、発光極大波長５８５ｎｍ）、Ｘ
ＲＩＴＣ（励起極大波長５８０ｎｍ、発光極大波長６０
５ｎｍ）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（励起極大波長５５１ｎ
ｍ、発光極大波長６３６ｎｍ）、及びＣｙ５（励起極大
波長６５０ｎｍ、発光極大波長６６７ｎｍ）を使用でき
る。励起用蛍光体と発光用蛍光体を１個ずつ標識したプ
ライマーの作成は実施例１と同様の方法にして行ない、
以下の蛍光体が４塩基の距離だけ隔てて標識されたプラ
イマーを得る。
【００４３】プライマー（１５０、図示せず）：ＳＦ５
０５＋ＴＲＩＴＣ プライマー（１５２、図示せず）：ＳＦ５０５＋ＸＲＩ
ＴＣ プライマー（１５４、図示せず）：ＳＦ５０５＋Ｎｉｌ
ｅ Ｒｅｄ プライマー（１５６、図示せず）：ＳＦ５０５＋Ｃｙ５ プライマー（１６０、図示せず）：ＳＦ５２６＋ＴＲＩ
ＴＣ プライマー（１６２、図示せず）：ＳＦ５２６＋ＸＲＩ
ＴＣ プライマー（１６４、図示せず）：ＳＦ５２６＋Ｎｉｌ
ｅ Ｒｅｄ プライマー（１６６、図示せず）：ＳＦ５２６＋Ｃｙ５ プライマー（１７０、図示せず）：ＣＡＴＲＨ＋ＴＲＩ
ＴＣ プライマー（１７２、図示せず）：ＣＡＴＲＨ＋ＸＲＩ
ＴＣ プライマー（１７４、図示せず）：ＣＡＴＲＨ＋Ｎｉｌ
ｅ Ｒｅｄ プライマー（１７６、図示せず）：ＣＡＴＲＨ＋Ｃｙ５ 上記１２種類のプライマーを用いて、３種類の異なる試
料ＤＮＡ（ｃ、ｄ、ｅ）の塩基配列決定を行なう例につ
いて、以下説明する。ＤＮＡのシーケンス反応は周知の
サンガー法に準じて行なう。試料ＤＮＡ（ｃ）について
は、塩基Ａで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライ
マー１５０を、塩基Ｔで終端するＤＮＡ断片を得る反応
ではプライマー１５２を、塩基Ｇで終端するＤＮＡ断片
を得る反応ではプライマー１５４を、塩基Ｃで終端する
ＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１５６を、それぞ
れ用いて行なう。試料ＤＮＡ（ｄ）については、塩基Ａ
で終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１６０
を、塩基Ｔで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライ
マー１６２を、塩基Ｇで終端するＤＮＡ断片を得る反応
ではプライマー１６４を、塩基Ｃで終端するＤＮＡ断片
を得る反応ではプライマー１６６を、試料ＤＮＡ（ｅ）
については、塩基Ａで終端するＤＮＡ断片を得る反応で
はプライマー１７０を、塩基Ｔで終端するＤＮＡ断片を
得る反応ではプライマー１７２を、塩基Ｇで終端するＤ
ＮＡ断片を得る反応ではプライマー１７４を、塩基Ｃで
終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１７６
を、それぞれ用いて行なう。各ＤＮＡ試料（ｃ、ｄ、
ｅ）について、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各塩基毎の反応生成物
を混合して、塩基配列決定用の試料を得る。各ＤＮＡ試
料（ｃ、ｄ、ｅ）に関する塩基配列決定用の試料を、さ
らに混合して電気泳動装置の１つの泳動レーン（泳動
路、チャンネル）に供給して、ＤＮＡ断片の電気泳動分
離を行なう（もちろん、各ＤＮＡ試料（ｃ、ｄ、ｅ）に
関する塩基配列決定用の試料を、電気泳動装置の異なる
泳動レーン（泳動路、チャンネル）に供給し、ＤＮＡ断
片の電気泳動分離を行なってもよいことはいうまでもな
い）。
０５＋ＴＲＩＴＣ プライマー（１５２、図示せず）：ＳＦ５０５＋ＸＲＩ
ＴＣ プライマー（１５４、図示せず）：ＳＦ５０５＋Ｎｉｌ
ｅ Ｒｅｄ プライマー（１５６、図示せず）：ＳＦ５０５＋Ｃｙ５ プライマー（１６０、図示せず）：ＳＦ５２６＋ＴＲＩ
ＴＣ プライマー（１６２、図示せず）：ＳＦ５２６＋ＸＲＩ
ＴＣ プライマー（１６４、図示せず）：ＳＦ５２６＋Ｎｉｌ
ｅ Ｒｅｄ プライマー（１６６、図示せず）：ＳＦ５２６＋Ｃｙ５ プライマー（１７０、図示せず）：ＣＡＴＲＨ＋ＴＲＩ
ＴＣ プライマー（１７２、図示せず）：ＣＡＴＲＨ＋ＸＲＩ
ＴＣ プライマー（１７４、図示せず）：ＣＡＴＲＨ＋Ｎｉｌ
ｅ Ｒｅｄ プライマー（１７６、図示せず）：ＣＡＴＲＨ＋Ｃｙ５ 上記１２種類のプライマーを用いて、３種類の異なる試
料ＤＮＡ（ｃ、ｄ、ｅ）の塩基配列決定を行なう例につ
いて、以下説明する。ＤＮＡのシーケンス反応は周知の
サンガー法に準じて行なう。試料ＤＮＡ（ｃ）について
は、塩基Ａで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライ
マー１５０を、塩基Ｔで終端するＤＮＡ断片を得る反応
ではプライマー１５２を、塩基Ｇで終端するＤＮＡ断片
を得る反応ではプライマー１５４を、塩基Ｃで終端する
ＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１５６を、それぞ
れ用いて行なう。試料ＤＮＡ（ｄ）については、塩基Ａ
で終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１６０
を、塩基Ｔで終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライ
マー１６２を、塩基Ｇで終端するＤＮＡ断片を得る反応
ではプライマー１６４を、塩基Ｃで終端するＤＮＡ断片
を得る反応ではプライマー１６６を、試料ＤＮＡ（ｅ）
については、塩基Ａで終端するＤＮＡ断片を得る反応で
はプライマー１７０を、塩基Ｔで終端するＤＮＡ断片を
得る反応ではプライマー１７２を、塩基Ｇで終端するＤ
ＮＡ断片を得る反応ではプライマー１７４を、塩基Ｃで
終端するＤＮＡ断片を得る反応ではプライマー１７６
を、それぞれ用いて行なう。各ＤＮＡ試料（ｃ、ｄ、
ｅ）について、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各塩基毎の反応生成物
を混合して、塩基配列決定用の試料を得る。各ＤＮＡ試
料（ｃ、ｄ、ｅ）に関する塩基配列決定用の試料を、さ
らに混合して電気泳動装置の１つの泳動レーン（泳動
路、チャンネル）に供給して、ＤＮＡ断片の電気泳動分
離を行なう（もちろん、各ＤＮＡ試料（ｃ、ｄ、ｅ）に
関する塩基配列決定用の試料を、電気泳動装置の異なる
泳動レーン（泳動路、チャンネル）に供給し、ＤＮＡ断
片の電気泳動分離を行なってもよいことはいうまでもな
い）。
【００４４】本実施例で使用した電気泳動装置として
は、実施例１と同様のキャピラリーアレー型ゲル電気泳
動装置を用いた。上記で得た各ＤＮＡ試料（ｃ、ｄ、
ｅ）（塩基配列決定用の末端塩基種の異なる試料でいう
と１２種類）に関する塩基配列決定用の試料は混合され
て、複数のゲルキャピラリー１の１つのゲルキャピラリ
ーの泳動開始点に供給される。
は、実施例１と同様のキャピラリーアレー型ゲル電気泳
動装置を用いた。上記で得た各ＤＮＡ試料（ｃ、ｄ、
ｅ）（塩基配列決定用の末端塩基種の異なる試料でいう
と１２種類）に関する塩基配列決定用の試料は混合され
て、複数のゲルキャピラリー１の１つのゲルキャピラリ
ーの泳動開始点に供給される。
【００４５】図５（ａ）に示すように、ゲルキャピラリ
ー１とキャピラリー４との間の各間隙で、ゲルキャピラ
リー１の泳動末端のゲル下端から０．５ｍｍ、０．８ｍ
ｍ、及び１．１ｍｍの位置のシースフロー中を、ＹＡＧ
レーザ光源５”−３、Ａｒイオンレーザ５”−４、Ａｒ
イオンレーザ５”−５からそれぞれ得る、波長５３２ｎ
ｍ（５’−３）、５１５ｎｍ（５’−４）、４８８ｎｍ
（５’−５）の励起光で照射する。レーザ５’−３（５
３２ｎｍ）、レーザ５’−４（５１５ｎｍ）、レーザ
５’−５（４８８ｎｍ）の波長のレーザはそれぞれ、図
５（ａ）に示すように、ミラー７’、ダイクロイックミ
ラー６’、６”により、ＤＮＡ断片の泳動方向において
０．３ｍｍだけ互いに分離して、全ての泳動路とほぼ直
交して実質的に全ての泳動路を同時に照射される。蛍光
の検出方法は図２と同じである。
ー１とキャピラリー４との間の各間隙で、ゲルキャピラ
リー１の泳動末端のゲル下端から０．５ｍｍ、０．８ｍ
ｍ、及び１．１ｍｍの位置のシースフロー中を、ＹＡＧ
レーザ光源５”−３、Ａｒイオンレーザ５”−４、Ａｒ
イオンレーザ５”−５からそれぞれ得る、波長５３２ｎ
ｍ（５’−３）、５１５ｎｍ（５’−４）、４８８ｎｍ
（５’−５）の励起光で照射する。レーザ５’−３（５
３２ｎｍ）、レーザ５’−４（５１５ｎｍ）、レーザ
５’−５（４８８ｎｍ）の波長のレーザはそれぞれ、図
５（ａ）に示すように、ミラー７’、ダイクロイックミ
ラー６’、６”により、ＤＮＡ断片の泳動方向において
０．３ｍｍだけ互いに分離して、全ての泳動路とほぼ直
交して実質的に全ての泳動路を同時に照射される。蛍光
の検出方法は図２と同じである。
【００４６】各ゲルキャピラリー１で電気泳動分離され
たＤＮＡ断片はゲルキャピラリーから溶出して、各ゲル
キャピラリー１、２の対の間の上記間隙内を、他のゲル
キャピラリーから溶出したＤＮＡ断片とは独立して流れ
る。シースフローセル３の内部での光照射部は３つの線
状の照射領域からなり、レーザ５’−３、５’−４、
５’−５は、全ての泳動路が形成する平面に沿って横方
向から入射し、全ての泳動路を実質的に同時に照射す
る。上記各間隙において、３本のレーザと各キャピラリ
ー１の延長との交差点近傍を通過する蛍光標識されたＤ
ＮＡ断片から蛍光が発するので、一直線に並んだ点状蛍
光像（蛍光線像）が３本観測される。
たＤＮＡ断片はゲルキャピラリーから溶出して、各ゲル
キャピラリー１、２の対の間の上記間隙内を、他のゲル
キャピラリーから溶出したＤＮＡ断片とは独立して流れ
る。シースフローセル３の内部での光照射部は３つの線
状の照射領域からなり、レーザ５’−３、５’−４、
５’−５は、全ての泳動路が形成する平面に沿って横方
向から入射し、全ての泳動路を実質的に同時に照射す
る。上記各間隙において、３本のレーザと各キャピラリ
ー１の延長との交差点近傍を通過する蛍光標識されたＤ
ＮＡ断片から蛍光が発するので、一直線に並んだ点状蛍
光像（蛍光線像）が３本観測される。
【００４７】なお、レーザ５’−３、５’−４、５’−
５を、上記のようにＤＮＡ断片の泳動方向において約
０．３ｍｍだけ分離し、さらに時分割して交互に照射し
てもよい。また、レーザ５’−３、５’−４、５’−５
を、図５（ｂ）に示すように、上記のようにＤＮＡ断片
の泳動方向において約０．３ｍｍだけ分離するのではな
く、時分割して同一位置に交互に照射してもよい。
５を、上記のようにＤＮＡ断片の泳動方向において約
０．３ｍｍだけ分離し、さらに時分割して交互に照射し
てもよい。また、レーザ５’−３、５’−４、５’−５
を、図５（ｂ）に示すように、上記のようにＤＮＡ断片
の泳動方向において約０．３ｍｍだけ分離するのではな
く、時分割して同一位置に交互に照射してもよい。
【００４８】レーザ照射路上に現われる３個の点状蛍光
像（蛍光線像）のそれぞれを、４つの蛍光体から発する
蛍光を区別して検出する、実施例１で使用したのと同様
の色分離検出系で検出する。検出器としては、実施例１
で説明した色分割プリズムをフィルター、及び１個の二
次元検出器の組み合わせを用いたが、２個あるいは４個
の二次元検出器を用いても良い。
像（蛍光線像）のそれぞれを、４つの蛍光体から発する
蛍光を区別して検出する、実施例１で使用したのと同様
の色分離検出系で検出する。検出器としては、実施例１
で説明した色分割プリズムをフィルター、及び１個の二
次元検出器の組み合わせを用いたが、２個あるいは４個
の二次元検出器を用いても良い。
【００４９】さらに、レーザをスキャンさせて時分割的
に各泳動路（平板ゲル、キャピラリーアレーの泳動レー
ン）を照射して、レーザスキャンによる照射のタイミン
グから、照射中の泳動路を知り、その泳動路か得られる
蛍光を、分光手段付きあるいは多色フィルター付きの、
一次元あるいは二次元検出器で受光することも可能であ
る。スキャンさせるレーザの波長は、複数の泳動レーン
毎あるいは泳動レーン毎に変化させてもよい。
に各泳動路（平板ゲル、キャピラリーアレーの泳動レー
ン）を照射して、レーザスキャンによる照射のタイミン
グから、照射中の泳動路を知り、その泳動路か得られる
蛍光を、分光手段付きあるいは多色フィルター付きの、
一次元あるいは二次元検出器で受光することも可能であ
る。スキャンさせるレーザの波長は、複数の泳動レーン
毎あるいは泳動レーン毎に変化させてもよい。
【００５０】３個の点状蛍光像（蛍光線像）は、ぞれぞ
れ４分割されフィルターを通して合計１２本の蛍光線像
として検出器上に結像する。図６は受光された蛍光像を
模試的に示す。励起光の波長の数に対応して、３本１組
の蛍光線像が４組観測される。各波長の励起光の照射位
置が異なるため、同一ＤＮＡ断片が各照射部位で観測さ
れることもあるが、励起光の３箇所の照射位置の間の移
動に時間がかかるため、この移動時間を考慮してＤＮＡ
断片の泳動時間のズレを補正し、以下の色分離を行なう
必要がある。図６に模試的に示すように、図２の２次元
検出器８の検出面３０では、分割フイルター９、分割プ
リズム１０により分離された、合計１２個の点状蛍光像
６０−１〜６０−３、７０−１〜７０−３、８０−１〜
８０−３、９０−１〜９０−３が得られる。
れ４分割されフィルターを通して合計１２本の蛍光線像
として検出器上に結像する。図６は受光された蛍光像を
模試的に示す。励起光の波長の数に対応して、３本１組
の蛍光線像が４組観測される。各波長の励起光の照射位
置が異なるため、同一ＤＮＡ断片が各照射部位で観測さ
れることもあるが、励起光の３箇所の照射位置の間の移
動に時間がかかるため、この移動時間を考慮してＤＮＡ
断片の泳動時間のズレを補正し、以下の色分離を行なう
必要がある。図６に模試的に示すように、図２の２次元
検出器８の検出面３０では、分割フイルター９、分割プ
リズム１０により分離された、合計１２個の点状蛍光像
６０−１〜６０−３、７０−１〜７０−３、８０−１〜
８０−３、９０−１〜９０−３が得られる。
【００５１】本実施例では、泳動レーン５０−１にＤＮ
Ａ断片試料を泳動しているので、点状蛍光像６０−１、
７０−１、８０−１、９０−１はそれぞれ、レーザ５’
−３（５３２ｎｍ）の照射による蛍光が、第１、第２、
第３、第４フィルター（９−１、９−２、９−３、９−
４）を通過して検出された光像、点状蛍光像６０−２、
７０−２、８０−２、９０−２はそれぞれ、レーザ５’
−３（５１５ｎｍ）の照射による蛍光が、第１、第２、
第３、第４フィルター（９−１、９−２、９−３、９−
４）を通過して検出された光像、点状蛍光像６０−３、
７０−３、８０−３、９０−３はそれぞれ、レーザ５’
−３（４８８ｎｍ）の照射による蛍光が、第１、第２、
第３、第４フィルター（９−１、９−２、９−３、９−
４）を通過して検出された光像である。本実施例の方法
により、複数の泳動レーン５０−２、…、５０−ｉ、
…、５０−Ｎを使用して電気泳動する場合には、図６に
示すように、泳動レーン５０−１の模試的なパターンと
同様なパターンが複数得られることになる。
Ａ断片試料を泳動しているので、点状蛍光像６０−１、
７０−１、８０−１、９０−１はそれぞれ、レーザ５’
−３（５３２ｎｍ）の照射による蛍光が、第１、第２、
第３、第４フィルター（９−１、９−２、９−３、９−
４）を通過して検出された光像、点状蛍光像６０−２、
７０−２、８０−２、９０−２はそれぞれ、レーザ５’
−３（５１５ｎｍ）の照射による蛍光が、第１、第２、
第３、第４フィルター（９−１、９−２、９−３、９−
４）を通過して検出された光像、点状蛍光像６０−３、
７０−３、８０−３、９０−３はそれぞれ、レーザ５’
−３（４８８ｎｍ）の照射による蛍光が、第１、第２、
第３、第４フィルター（９−１、９−２、９−３、９−
４）を通過して検出された光像である。本実施例の方法
により、複数の泳動レーン５０−２、…、５０−ｉ、
…、５０−Ｎを使用して電気泳動する場合には、図６に
示すように、泳動レーン５０−１の模試的なパターンと
同様なパターンが複数得られることになる。
【００５２】一般に、ゲル中のＤＮＡ断片の泳動では、
ＤＮＡ断片の長さにより泳動速度が異なるので、ＤＮＡ
断片の泳動時間の補正はやりにくいが、シースフローを
用いる方法では、上記励起光の照射位置の間のＤＮＡ断
片の移動は、ＤＮＡ断片の長さによらずシースフロー速
度にだけ依存するので、補正が容易であるという利点が
ある。観測された蛍光強度と各色素で標識されたＤＮＡ
断片の量との間には（数８）に示す関係がある。
ＤＮＡ断片の長さにより泳動速度が異なるので、ＤＮＡ
断片の泳動時間の補正はやりにくいが、シースフローを
用いる方法では、上記励起光の照射位置の間のＤＮＡ断
片の移動は、ＤＮＡ断片の長さによらずシースフロー速
度にだけ依存するので、補正が容易であるという利点が
ある。観測された蛍光強度と各色素で標識されたＤＮＡ
断片の量との間には（数８）に示す関係がある。
【００５３】
【数８】
Ｉ＝ＡＣ
Ｉj＝ＡijＣj …（数８）
（数８）において、Ｉj（ｊ＝１、２、…、（発光用蛍
光体標識の数＝ｊmax））は検出器で検出される各蛍光
チャンネル（ｉ＝１、２、…、ｊmax）の蛍光強度、Ａ
ijは変換行列、Ｃjは各標識ＤＮＡ断片の濃度である。
行列要素Ａijは、既知濃度の各発光用蛍光体標識ＤＮＡ
からの蛍光を、３種類の波長のレーザでそれぞれ励起し
た時に得られる蛍光をそれぞれ求めて得られる。行列Ａ
の逆行列Ａ~1を作ることで観測された各チャンネル（各
レーザ照射に対応し、かつ色分離され検出された信号）
の信号から、それぞれの蛍光体は標識されたＤＮＡ断片
の量を求められる。
光体標識の数＝ｊmax））は検出器で検出される各蛍光
チャンネル（ｉ＝１、２、…、ｊmax）の蛍光強度、Ａ
ijは変換行列、Ｃjは各標識ＤＮＡ断片の濃度である。
行列要素Ａijは、既知濃度の各発光用蛍光体標識ＤＮＡ
からの蛍光を、３種類の波長のレーザでそれぞれ励起し
た時に得られる蛍光をそれぞれ求めて得られる。行列Ａ
の逆行列Ａ~1を作ることで観測された各チャンネル（各
レーザ照射に対応し、かつ色分離され検出された信号）
の信号から、それぞれの蛍光体は標識されたＤＮＡ断片
の量を求められる。
【００５４】以上の説明では、レーザ照射位置をずら
せ、照射位置から発する蛍光の空間的位置の違いによ
り、各波長のレーザで有効に励起できる励起用蛍光体の
種類を区別したが、レーザの波長毎に、レーザ照射を時
間的にずらして交互に照射して励起用蛍光体の種類を区
別することもでき、特にシースフローを用いずゲル泳動
路中を泳動するＤＮＡ断片を照射する時に都合が良い。
レーザの波長毎のレーザ照射のタイミングに合わせて検
出器の信号読み取りを同時に行なって蛍光計測して、励
起用蛍光体の種類を区別して、レーザ照射部位からの蛍
光を検出する。
せ、照射位置から発する蛍光の空間的位置の違いによ
り、各波長のレーザで有効に励起できる励起用蛍光体の
種類を区別したが、レーザの波長毎に、レーザ照射を時
間的にずらして交互に照射して励起用蛍光体の種類を区
別することもでき、特にシースフローを用いずゲル泳動
路中を泳動するＤＮＡ断片を照射する時に都合が良い。
レーザの波長毎のレーザ照射のタイミングに合わせて検
出器の信号読み取りを同時に行なって蛍光計測して、励
起用蛍光体の種類を区別して、レーザ照射部位からの蛍
光を検出する。
【００５５】また、同じ照射線上をレーザスキャンによ
り照射する方式を用い、複数レーザの照射位置をずらし
て位置検出可能な検出器を用いて、それぞれの発光点か
らの蛍光を色分解しながら検出する方式も使用ができ
る。
り照射する方式を用い、複数レーザの照射位置をずらし
て位置検出可能な検出器を用いて、それぞれの発光点か
らの蛍光を色分解しながら検出する方式も使用ができ
る。
【００５６】本実施例では、３種類の試料ＤＮＡを同一
泳動レーンで、電気泳動して塩基配列決定を行なった
が、本実施例で使用した各種の蛍光体を使用して、複数
の泳動レーン、例えば、１００泳動レーンを使用すれ
ば、３００種類の試料ＤＮＡを１回の電気泳動で塩基配
列決定できることになる。本実施例においてさらに、レ
ーザを照射する箇所を３箇所から４、５、…と増加させ
れば、同一泳動レーンで、４、５、…種類の試料ＤＮＡ
の塩基配列決定ができ、１００泳動レーンを使用すれ
ば、４００、５００種類の試料ＤＮＡを１回の電気泳動
で塩基配列決定できることになる。
泳動レーンで、電気泳動して塩基配列決定を行なった
が、本実施例で使用した各種の蛍光体を使用して、複数
の泳動レーン、例えば、１００泳動レーンを使用すれ
ば、３００種類の試料ＤＮＡを１回の電気泳動で塩基配
列決定できることになる。本実施例においてさらに、レ
ーザを照射する箇所を３箇所から４、５、…と増加させ
れば、同一泳動レーンで、４、５、…種類の試料ＤＮＡ
の塩基配列決定ができ、１００泳動レーンを使用すれ
ば、４００、５００種類の試料ＤＮＡを１回の電気泳動
で塩基配列決定できることになる。
【００５７】（実施例３）実施例１、２では、試料ＤＮ
Ａの塩基配列決定について説明したが、ＤＮＡの制限酵
素切断による断片長さの多様性（ＲＦＬＰ）の検査分析
も、図２に示したＤＮＡプローブを使用して、上記実施
例と同様にして、複数試料に関する検査分析を、同一泳
動路で同時にできる。実施例２で使用した各種の蛍光体
を使用して、複数の泳動レーン、例えば、１００泳動レ
ーンを使用すれば、３００種類の試料ＤＮＡに関するＲ
ＦＬＰの検査分析を、１回の電気泳動で塩基配列決定で
きることになる。
Ａの塩基配列決定について説明したが、ＤＮＡの制限酵
素切断による断片長さの多様性（ＲＦＬＰ）の検査分析
も、図２に示したＤＮＡプローブを使用して、上記実施
例と同様にして、複数試料に関する検査分析を、同一泳
動路で同時にできる。実施例２で使用した各種の蛍光体
を使用して、複数の泳動レーン、例えば、１００泳動レ
ーンを使用すれば、３００種類の試料ＤＮＡに関するＲ
ＦＬＰの検査分析を、１回の電気泳動で塩基配列決定で
きることになる。
【００５８】（実施例４）２本ＤＮＡ鎖の試料を、ＰＣ
Ｒで増幅した後に１本鎖にして電気泳動すると、＋鎖と
−鎖とは異なったねじれの構造をもつので、電気泳動速
度が異なる。このような、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを１
本鎖にして＋鎖と−鎖を電気泳動して、１本鎖ＤＮＡの
形態変化を検出する、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法にも本発明は
適用できる。実施例１、２で説明した複数のプライマー
を使用して、正常な塩基配列をもつ２本ＤＮＡ鎖の正常
試料、及び２本ＤＮＡ鎖の複数の一般試料をＰＣＲで増
幅し、各試料の増幅された２本鎖ＤＮＡを１本鎖にし
て、各試料に関する＋鎖と−鎖を混合して同一泳動レー
ンで電気泳動する。
Ｒで増幅した後に１本鎖にして電気泳動すると、＋鎖と
−鎖とは異なったねじれの構造をもつので、電気泳動速
度が異なる。このような、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを１
本鎖にして＋鎖と−鎖を電気泳動して、１本鎖ＤＮＡの
形態変化を検出する、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法にも本発明は
適用できる。実施例１、２で説明した複数のプライマー
を使用して、正常な塩基配列をもつ２本ＤＮＡ鎖の正常
試料、及び２本ＤＮＡ鎖の複数の一般試料をＰＣＲで増
幅し、各試料の増幅された２本鎖ＤＮＡを１本鎖にし
て、各試料に関する＋鎖と−鎖を混合して同一泳動レー
ンで電気泳動する。
【００５９】例えば、実施例１で説明した複数のプライ
マーを使用する場合には、合計試料（１種類の正常試料
と７種類の一般試料）を混合し、実施例２で説明した複
数のプライマーを使用する場合には、合計３試料（１種
類の正常試料と１１種類の一般試料）を混合して、それ
ぞれ実施例１、２で説明した励起光を使用して電気泳動
を行ない、電気泳動パターンを求める。得られた正常試
料と一般試料によるい電気泳動パターンの比較から、２
本ＤＮＡ鎖の変異の検出を効率よく実行できる。このよ
うに同一泳動レーンで、例えば、上記のように多数（７
種類、１１種類）の一般試料を、常に１種類の正常試料
を基準として比較できるので、２本ＤＮＡ鎖の変異の検
出を効率よく正確に実行できる。ｎ泳動路を使用すれ
ば、非常に多数の（７×ｎ種類、１１×ｎ種類）の一般
試料を、１回の電気泳動で検査でき、遺伝子の変異検出
が実行できる。
マーを使用する場合には、合計試料（１種類の正常試料
と７種類の一般試料）を混合し、実施例２で説明した複
数のプライマーを使用する場合には、合計３試料（１種
類の正常試料と１１種類の一般試料）を混合して、それ
ぞれ実施例１、２で説明した励起光を使用して電気泳動
を行ない、電気泳動パターンを求める。得られた正常試
料と一般試料によるい電気泳動パターンの比較から、２
本ＤＮＡ鎖の変異の検出を効率よく実行できる。このよ
うに同一泳動レーンで、例えば、上記のように多数（７
種類、１１種類）の一般試料を、常に１種類の正常試料
を基準として比較できるので、２本ＤＮＡ鎖の変異の検
出を効率よく正確に実行できる。ｎ泳動路を使用すれ
ば、非常に多数の（７×ｎ種類、１１×ｎ種類）の一般
試料を、１回の電気泳動で検査でき、遺伝子の変異検出
が実行できる。
【００６０】（実施例５）糖、蛋白等の分析にも本発明
は適用できる。糖、蛋白等の反応の定量的分析を行なう
際に、実施例１、２で説明したような各種蛍光体で反応
に関与する糖、蛋白等を標識しておき、反応生成物の分
析を電気泳動して、複数種類の波長のレーザを使用して
蛍光標識を、実施例１、２と同様な方法により検出し
て、効率よく糖、蛋白等の解析を定量的に実行できる。
は適用できる。糖、蛋白等の反応の定量的分析を行なう
際に、実施例１、２で説明したような各種蛍光体で反応
に関与する糖、蛋白等を標識しておき、反応生成物の分
析を電気泳動して、複数種類の波長のレーザを使用して
蛍光標識を、実施例１、２と同様な方法により検出し
て、効率よく糖、蛋白等の解析を定量的に実行できる。
【００６１】以上各種の実施例を説明したが、本発明に
よれば、例えば実施例２においては１２種類の一般試料
を同一泳動レーンで分析できるので、１００泳動レーン
を使用すれば、１２００種類の一般試料を同一泳動レー
ンで分析できることになる。さらに、励起光であるレー
ザの照射箇所を、さらに、３箇所から４、５、…と増加
させれば、同一泳動レーンで、１６、２０、…種類の一
般試料の分析ができ、１００泳動レーンを使用すれば、
１６００、２０００種類の一般試料を１回の電気泳動で
分析できることになる。塩基配列決定を行なう場合に
は、４００、５００種類の試料ＤＮＡを１回の電気泳動
で塩基配列決定できることになる。
よれば、例えば実施例２においては１２種類の一般試料
を同一泳動レーンで分析できるので、１００泳動レーン
を使用すれば、１２００種類の一般試料を同一泳動レー
ンで分析できることになる。さらに、励起光であるレー
ザの照射箇所を、さらに、３箇所から４、５、…と増加
させれば、同一泳動レーンで、１６、２０、…種類の一
般試料の分析ができ、１００泳動レーンを使用すれば、
１６００、２０００種類の一般試料を１回の電気泳動で
分析できることになる。塩基配列決定を行なう場合に
は、４００、５００種類の試料ＤＮＡを１回の電気泳動
で塩基配列決定できることになる。
【００６２】
【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、光を
吸収するエネルギ−供与体分子の種類数と、それからエ
ネルギーを得て蛍光を発するエネルギ−受容体分子の種
類数との積だけの数の標識を使用して、複数の試料を同
時に分析対象とできる。受光系における識別波長帯の数
をあまり多く取れなくても、エネルギ−供与体分子の種
類を変化させ、多くの異なる種類の標識を使用して複数
の試料を同時に区別して検出できる。本発明は、ＤＮＡ
シーケンシングの大容量化、多数の種類の試料ＤＮＡの
同時分析等の多くの分析分野に寄与するものである。
吸収するエネルギ−供与体分子の種類数と、それからエ
ネルギーを得て蛍光を発するエネルギ−受容体分子の種
類数との積だけの数の標識を使用して、複数の試料を同
時に分析対象とできる。受光系における識別波長帯の数
をあまり多く取れなくても、エネルギ−供与体分子の種
類を変化させ、多くの異なる種類の標識を使用して複数
の試料を同時に区別して検出できる。本発明は、ＤＮＡ
シーケンシングの大容量化、多数の種類の試料ＤＮＡの
同時分析等の多くの分析分野に寄与するものである。
【図１】本発明の実施例で使用するエネルギ−供与体分
子（サクシニルフルオレセイン）の励起スペクトル、及
び蛍光スペクトル。
子（サクシニルフルオレセイン）の励起スペクトル、及
び蛍光スペクトル。
【図２】本発明の実施例１で使用するプライマを示す
図。
図。
【図３】本発明の実施例１で使用する電気泳動装置の構
成を示す図。
成を示す図。
【図４】本発明の実施例１の電気泳動装置において像分
割により得られる蛍光像を模試的に示す図。
割により得られる蛍光像を模試的に示す図。
【図５】本発明の実施例２で使用する電気泳動装置の励
起光照射の構成を示す図。
起光照射の構成を示す図。
【図６】本発明の実施例２の電気泳動装置において像分
割により得られる蛍光像を模試的に示す図。
割により得られる蛍光像を模試的に示す図。
１…ゲルキャピラリー、２…シース溶液、３…シースフ
ローセル（光照射部）、４…キャピラリー、５’−１、
５’−２、５’−３、５’−４、５’−５…レーザ、
５”−１、５”−２、５”−３、５”−４、５”−５…
レーザ光源、６、６’、６”…ダイクロイックミラー、
７、７’…ミラー、８…２次元検出器、９…分割フィル
ター、９−１、９−２、９−３、９−４…第１、第２、
第３、第４のフイルター、１０…像分割プリズム、１１
−１、１１−２…レンズ、１２…データ処理装置、３０
…検出面、５０−１、５０−２、〜、５０−ｉ、〜、５
０−Ｎ…泳動レーンの番号、３２−１、３１−２、３４
−１、３４−２、３６−１、３６−２、３８−１、３８
−２、６０−１〜６０−３、７０−１〜７０−３、８０
−１〜８０−３、９０−１〜９０−３…点状蛍光像、１
００…ＳＦ５０５、１１０…ＳＦ５２６、１２０…ＴＲ
ＩＴＣ、１２２…Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、１２４…Ｃｙ
５、１２６…ＳＦ５０５、１２６’…ＳＦ５２６、１３
０、１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、１４
４、１４６…プライマー（あるいはＤＮＡプローブ）。
ローセル（光照射部）、４…キャピラリー、５’−１、
５’−２、５’−３、５’−４、５’−５…レーザ、
５”−１、５”−２、５”−３、５”−４、５”−５…
レーザ光源、６、６’、６”…ダイクロイックミラー、
７、７’…ミラー、８…２次元検出器、９…分割フィル
ター、９−１、９−２、９−３、９−４…第１、第２、
第３、第４のフイルター、１０…像分割プリズム、１１
−１、１１−２…レンズ、１２…データ処理装置、３０
…検出面、５０−１、５０−２、〜、５０−ｉ、〜、５
０−Ｎ…泳動レーンの番号、３２−１、３１−２、３４
−１、３４−２、３６−１、３６−２、３８−１、３８
−２、６０−１〜６０−３、７０−１〜７０−３、８０
−１〜８０−３、９０−１〜９０−３…点状蛍光像、１
００…ＳＦ５０５、１１０…ＳＦ５２６、１２０…ＴＲ
ＩＴＣ、１２２…Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、１２４…Ｃｙ
５、１２６…ＳＦ５０５、１２６’…ＳＦ５２６、１３
０、１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、１４
４、１４６…プライマー（あるいはＤＮＡプローブ）。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 町田 浩昭
東京都渋谷区東３丁目16番３号 日立電
子エンジニアリング株式会社内
(56)参考文献 特開 平５−60698（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−293557（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−94617（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−138037（ＪＰ，Ａ)
特開 平７−229835（ＪＰ，Ａ)
特表 平８−505776（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 27/447
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (10)
- 【請求項１】蛍光標識された試料を泳動レーンで電気泳
動して分離検出する電気泳動分離検出方法において、前
記試料を前記蛍光標識の複数種類で標識する標識工程
と、前記蛍光標識された前記試料を電気泳動分離する泳
動分離工程と、前記蛍光標識された前記試料に複数波長
の励起光を照射して、電気泳動分離された前記試料を検
出する検出工程とを有し、前記蛍光標識が、エネルギー
供与体と、該エネルギー供与体からのエネルギー移動に
より蛍光を発するエネルギー受容体とから構成され、前
記エネルギー供与体と前記エネルギー受容体として複数
種の物質を用い、該複数種の物質の組み合わせの違いに
基づいて、前記蛍光標識の複数のそれぞれを識別して前
記試料を検出することを特徴とする電気泳動分離検出方
法。 - 【請求項２】請求項１に記載の電気泳動分離検出方法に
おいて、波長の異なる複数の前記励起光を、空間的ある
いは時間的にずらして前記泳動レーンに照射する工程
と、前記検出工程において、前記励起光の照射により前
記蛍光標識から発する蛍光を波長選別して検出し、前記
励起光の波長と前記波長選別された蛍光波長を識別し
て、前記蛍光標識を識別して前記試料を検出することを
特徴とする蛍光を用いた電気泳動分離検出方法。 - 【請求項３】請求項２に記載の電気泳動分離検出方法に
おいて、前記検出工程において、前記試料の泳動速度が
ほぼ一定である溶液媒体中で、前記試料を検出すること
を特徴とする蛍光を用いた電気泳動分離検出方法。 - 【請求項４】請求項２に記載の電気泳動分離検出方法に
おいて、前記励起光の波長と前記蛍光を受光するチャン
ネルの組み合わせにより前記蛍光標識を識別して、前記
試料を検出することを特徴とする蛍光を用いた電気泳動
分離検出方法。 - 【請求項５】請求項２に記載の電気泳動分離検出方法に
おいて、前記蛍光標識された前記試料の複数種類が同一
の前記泳動レーンで電気泳動分離されることを特徴とす
る蛍光を用いた電気泳動分離検出方法。 - 【請求項６】蛍光標識された試料を泳動レーンで電気泳
動して分離検出する電気泳動分離検出装置において、前
記蛍光標識の複数種類で標識された前記試料を電気泳動
分離する泳動分離部と、全ての前記泳動レーンもしくは
全ての前記泳動レーンの延長上の複数箇所に実質的に同
時に複数波長の励起光を照射する照射手段と、前記励起
光が照射された部位で、電気泳動分離された前記試料を
検出する検出手段とを有し、前記蛍光標識のそれぞれ
が、エネルギー供与体と、該エネルギー供与体からのエ
ネルギー移動により蛍光を発するエネルギー受容体とか
ら構成され、前記エネルギー供与体と前記エネルギー受
容体として複数種の物質を用い、前記検出手段は、前記
複数種の物質の組み合わせの違いに基づいて、前記蛍光
標識の複数のそれぞれを識別して前記試料を検出するこ
とを特徴とする電気泳動分離検出装置。 - 【請求項７】請求項６に記載の電気泳動分離検出装置に
おいて、前記照射手段は、波長の異なる複数の前記励起
光を、空間的あるいは時間的にずらして前記泳動レーン
を照射し、前記検出手段は、前記励起光の照射により前
記蛍光標識から発する蛍光を波長選別して検出し、前記
励起光の波長と前記波長選別された蛍光波長を識別し
て、前記蛍光標識を識別して前記試料を検出することを
特徴とする蛍光を用いた電気泳動分離検出装置。 - 【請求項８】請求項７に記載の電気泳動分離検出装置に
おいて、前記検出手段は、前記試料の泳動速度がほぼ一
定である溶液媒体中で、前記試料を検出することを特徴
とする蛍光を用いた電気泳動分離検出装置。 - 【請求項９】請求項７に記載の電気泳動分離検出装置に
おいて、前記検出手段は、前記励起光の波長と前記蛍光
を受光するチャンネルの組み合わせにより前記蛍光標識
を識別して、前記試料を検出することを特徴とする蛍光
を用いた電気泳動分離検出装置。 - 【請求項１０】請求項７に記載の電気泳動分離検出装置
において、前記蛍光標識された前記試料の複数種類が同
一の前記泳動レーンで電気泳動分離されることを特徴と
する蛍光を用いた電気泳動分離検出装置。
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