JPH078299A - Ｄｎａの二重蛍光標識による塩基配列決定法 - Google Patents
Ｄｎａの二重蛍光標識による塩基配列決定法Info
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- JPH078299A JPH078299A JP15012993A JP15012993A JPH078299A JP H078299 A JPH078299 A JP H078299A JP 15012993 A JP15012993 A JP 15012993A JP 15012993 A JP15012993 A JP 15012993A JP H078299 A JPH078299 A JP H078299A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】一つのＤＮＡ断片のプライマとターミネータの
両方に蛍光体を標識する。プライマには試料種に対応さ
せて二種類の蛍光体を標識する。ターミネータには末端
塩基種に対応させて四種類の蛍光体を標識する。六種類
の蛍光体は発光波長が互いに異なったものを選択する。
八種類のＤＮＡ断片群を、単一の泳動路でゲル電気泳動
分離した後レーザで励起し、発光される六種類の蛍光を
分離検出する。検出される蛍光体種を試料種及び末端塩
基種に対応させ、その時間経過を調べることによって二
種類の試料の塩基配列を同時に決定する。 【効果】塩基配列決定のスループットの向上を実現する
と同時に、試料調製に費やす労力を大幅に削減すること
が可能である。
両方に蛍光体を標識する。プライマには試料種に対応さ
せて二種類の蛍光体を標識する。ターミネータには末端
塩基種に対応させて四種類の蛍光体を標識する。六種類
の蛍光体は発光波長が互いに異なったものを選択する。
八種類のＤＮＡ断片群を、単一の泳動路でゲル電気泳動
分離した後レーザで励起し、発光される六種類の蛍光を
分離検出する。検出される蛍光体種を試料種及び末端塩
基種に対応させ、その時間経過を調べることによって二
種類の試料の塩基配列を同時に決定する。 【効果】塩基配列決定のスループットの向上を実現する
と同時に、試料調製に費やす労力を大幅に削減すること
が可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡの塩基配列決定法
に関する。
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの塩基配列決定は、ＤＮＡ断片を
放射性同位元素で標識してオートラジオグラフィで検出
する方式に変わり、ＤＮＡ断片を蛍光体で標識して蛍光
検出する方式が発展してきた。
放射性同位元素で標識してオートラジオグラフィで検出
する方式に変わり、ＤＮＡ断片を蛍光体で標識して蛍光
検出する方式が発展してきた。
【０００３】ＤＮＡ断片をゲル電気泳動分離した後、標
識された蛍光体をレーザによって励起し、発する蛍光を
検出する。蛍光体の標識法と塩基配列決定法にはいくつ
かある。プライマ標識法ではＤＮＡ断片のプライマに末
端塩基種に対応させて四つの蛍光体を標識する（エル・
エム・スミス他；ネイチャー ３２１巻，６７４頁（１
９８６年）（L.M.Smith et.al.：Nature 321，674(198
6)）)。これに対して、ターミネータ標識法ではＤＮＡ
断片のターミネータとなるダイデオキシヌクレオチドに
末端塩基種に対応させて四つの蛍光体を標識する（ジェ
ー・エム・プローバー他；サイエンス ２３８巻，３３
６頁(１９８７年)(J.M.Prober et.al.；Science 238，3
36(1987)））。
識された蛍光体をレーザによって励起し、発する蛍光を
検出する。蛍光体の標識法と塩基配列決定法にはいくつ
かある。プライマ標識法ではＤＮＡ断片のプライマに末
端塩基種に対応させて四つの蛍光体を標識する（エル・
エム・スミス他；ネイチャー ３２１巻，６７４頁（１
９８６年）（L.M.Smith et.al.：Nature 321，674(198
6)）)。これに対して、ターミネータ標識法ではＤＮＡ
断片のターミネータとなるダイデオキシヌクレオチドに
末端塩基種に対応させて四つの蛍光体を標識する（ジェ
ー・エム・プローバー他；サイエンス ２３８巻，３３
６頁(１９８７年)(J.M.Prober et.al.；Science 238，3
36(1987)））。
【０００４】これらはいずれの場合もＤＮＡ断片を単一
の泳動路で電気泳動分離した後、レーザで励起すること
で発する複数の蛍光を、発光波長の違いから分離して検
出し、検出された蛍光種に対応する末端塩基種と検出時
間から塩基配列を決定する。
の泳動路で電気泳動分離した後、レーザで励起すること
で発する複数の蛍光を、発光波長の違いから分離して検
出し、検出された蛍光種に対応する末端塩基種と検出時
間から塩基配列を決定する。
【０００５】また両標識法において、末端塩基種に対応
する四つのＤＮＡ断片群を単一の蛍光体で標識し、それ
らを異なる四つの泳動路で電気泳動分離した後、レーザ
で励起することで発する蛍光を検出し、蛍光検出の位置
と時間からＤＮＡ断片の末端塩基種を知り、塩基配列を
決定する方法もある（エイチ・カンバラ他；バイオテク
ノロジィ ６巻，８１６頁（１９８８年）(H.Kambara e
t.al.;Biotechnology6，816(1988)）)。
する四つのＤＮＡ断片群を単一の蛍光体で標識し、それ
らを異なる四つの泳動路で電気泳動分離した後、レーザ
で励起することで発する蛍光を検出し、蛍光検出の位置
と時間からＤＮＡ断片の末端塩基種を知り、塩基配列を
決定する方法もある（エイチ・カンバラ他；バイオテク
ノロジィ ６巻，８１６頁（１９８８年）(H.Kambara e
t.al.;Biotechnology6，816(1988)）)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】大規模なＤＮＡ解析で
は、ＤＮＡの塩基配列決定において、単位時間に決定し
得る塩基配列数の増大、すなわち高スループット化は重
要な課題である。従来の技術において、四つの蛍光体を
標識する方法では、一つの泳動路で一つの試料の塩基配
列を決定し、一つの蛍光体を標識する方法では、四つの
泳動路で一つの試料の塩基配列を決定することができ
る。すなわち、一つの泳動路あたりの塩基配列が決定し
得る試料数は高々一つであった。
は、ＤＮＡの塩基配列決定において、単位時間に決定し
得る塩基配列数の増大、すなわち高スループット化は重
要な課題である。従来の技術において、四つの蛍光体を
標識する方法では、一つの泳動路で一つの試料の塩基配
列を決定し、一つの蛍光体を標識する方法では、四つの
泳動路で一つの試料の塩基配列を決定することができ
る。すなわち、一つの泳動路あたりの塩基配列が決定し
得る試料数は高々一つであった。
【０００７】本発明の目的は、塩基配列決定のスループ
ットを増大させる手段の一つとして、一つの泳動路で二
つの試料の塩基配列を決定する手法を提供することであ
る。本発明の他の目的は、二つの試料の調製を１度に行
うことによって、試料調製に費やす労力を大幅に削減す
ることである。
ットを増大させる手段の一つとして、一つの泳動路で二
つの試料の塩基配列を決定する手法を提供することであ
る。本発明の他の目的は、二つの試料の調製を１度に行
うことによって、試料調製に費やす労力を大幅に削減す
ることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】従来の技術では、一つの
ＤＮＡ断片のプライマあるいはターミネータに対して一
つの蛍光体を標識し、これを蛍光検出していた。これに
対して本発明では、二種類の試料の塩基配列を同時に決
定するために、一つのＤＮＡ断片のプライマとターミネ
ータの両方に蛍光体を標識し、蛍光信号の情報量を増大
させている。プライマには、試料種に対応させて、発光
波長の異なる二種類の蛍光体を標識する。ターミネータ
（ダイデオキシヌクレオチド）には、末端塩基種に対応
させて、プライマ標識蛍光体と異なり、発光波長の異な
る四種類の蛍光体を標識する。これらが混合状態にある
ＤＮＡ断片を、単一の泳動路でゲル電気泳動分離した後
レーザで励起し、発光される六種類の蛍光を発光波長の
差を利用して分離検出する。検出される蛍光体種を試料
種及び末端塩基種に対応させ、その時間経過を調べるこ
とによって二種類の試料の塩基配列を同時に決定する。
ＤＮＡ断片のプライマあるいはターミネータに対して一
つの蛍光体を標識し、これを蛍光検出していた。これに
対して本発明では、二種類の試料の塩基配列を同時に決
定するために、一つのＤＮＡ断片のプライマとターミネ
ータの両方に蛍光体を標識し、蛍光信号の情報量を増大
させている。プライマには、試料種に対応させて、発光
波長の異なる二種類の蛍光体を標識する。ターミネータ
（ダイデオキシヌクレオチド）には、末端塩基種に対応
させて、プライマ標識蛍光体と異なり、発光波長の異な
る四種類の蛍光体を標識する。これらが混合状態にある
ＤＮＡ断片を、単一の泳動路でゲル電気泳動分離した後
レーザで励起し、発光される六種類の蛍光を発光波長の
差を利用して分離検出する。検出される蛍光体種を試料
種及び末端塩基種に対応させ、その時間経過を調べるこ
とによって二種類の試料の塩基配列を同時に決定する。
【０００９】
【作用】図１に示したように、塩基配列を決定しようと
する二種のＤＮＡ，ＤＮＡ１とＤＮＡ２がそれぞれ異な
るベクタ、ベクタ３とベクタ４に組み込まれたもの、試
料５と試料６を用意する。また、異なる発光波長の蛍光
体、蛍光体αと蛍光体βが、ベクタ３とベクタ４にハイ
ブリダイズし得る塩基配列を持つ異なるオリゴヌクレオ
チドに標識されたプライマ７とプライマ８を用意する。
そこで試料５，試料６，プライマ７，プライマ８を一緒
に混合し、試料５＋プライマ７及び試料６＋プライマ８
のハイブリダイズ反応を行う。つぎに、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ
の四つのダイデオキシヌクレオチド（ターミネータ）に
それぞれ発光波長の異なる蛍光体、蛍光体ａ，蛍光体
ｃ，蛍光体ｇ，蛍光体ｔが標識されたものと、無標識の
Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの四つのデオキシヌクレオチドを、ハイ
ブリダイズ反応物に適当な濃度比で混合し、酵素反応に
より混合状態で相補鎖合成を行う。この結果、図２に示
すような八種類の断片群が生成される。例えば、断片群
１はプライマが蛍光体αで標識され、ターミネータが蛍
光体ａで標識された、試料５の末端がＡである断片群で
ある。
する二種のＤＮＡ，ＤＮＡ１とＤＮＡ２がそれぞれ異な
るベクタ、ベクタ３とベクタ４に組み込まれたもの、試
料５と試料６を用意する。また、異なる発光波長の蛍光
体、蛍光体αと蛍光体βが、ベクタ３とベクタ４にハイ
ブリダイズし得る塩基配列を持つ異なるオリゴヌクレオ
チドに標識されたプライマ７とプライマ８を用意する。
そこで試料５，試料６，プライマ７，プライマ８を一緒
に混合し、試料５＋プライマ７及び試料６＋プライマ８
のハイブリダイズ反応を行う。つぎに、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ
の四つのダイデオキシヌクレオチド（ターミネータ）に
それぞれ発光波長の異なる蛍光体、蛍光体ａ，蛍光体
ｃ，蛍光体ｇ，蛍光体ｔが標識されたものと、無標識の
Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの四つのデオキシヌクレオチドを、ハイ
ブリダイズ反応物に適当な濃度比で混合し、酵素反応に
より混合状態で相補鎖合成を行う。この結果、図２に示
すような八種類の断片群が生成される。例えば、断片群
１はプライマが蛍光体αで標識され、ターミネータが蛍
光体ａで標識された、試料５の末端がＡである断片群で
ある。
【００１０】六種類の蛍光体α，β，ａ，ｃ，ｇ，ｔ
は、互いにスペクトル分離可能であり、発光波長の違い
を利用して分離検出が可能である。ただし、標識された
蛍光体の違いによって、断片群の電気泳動速度の差がで
きないように各蛍光体は修飾されている。複数蛍光の分
離検出（多色分離検出）する方法はいくつかある。六種
の蛍光体の発光波長に対応する六種のバンドパスフィル
タを時分割して検出器の前に配置することによって分光
する回転フィルタ法（シー・コーネル他；バイオテクニ
クス ５巻、６４８頁（１９８７年）（C.Connell et.a
l.;BioTechniques5，342(1987)））、像を六つに分割す
るプリズムと分割直後に先の六種類のバンドパスフィル
タを配置することによって分光する像分割プリズム法
（エイチ・カンバラ他；バイオテクノロジ ９巻、６４
８頁（１９９１年）（H.Kambara et.al.;Biotechnology
9,648(1991)）)、プリズムの波長分散を利用して分光
するプリズム波長分散法などがある。
は、互いにスペクトル分離可能であり、発光波長の違い
を利用して分離検出が可能である。ただし、標識された
蛍光体の違いによって、断片群の電気泳動速度の差がで
きないように各蛍光体は修飾されている。複数蛍光の分
離検出（多色分離検出）する方法はいくつかある。六種
の蛍光体の発光波長に対応する六種のバンドパスフィル
タを時分割して検出器の前に配置することによって分光
する回転フィルタ法（シー・コーネル他；バイオテクニ
クス ５巻、６４８頁（１９８７年）（C.Connell et.a
l.;BioTechniques5，342(1987)））、像を六つに分割す
るプリズムと分割直後に先の六種類のバンドパスフィル
タを配置することによって分光する像分割プリズム法
（エイチ・カンバラ他；バイオテクノロジ ９巻、６４
８頁（１９９１年）（H.Kambara et.al.;Biotechnology
9,648(1991)）)、プリズムの波長分散を利用して分光
するプリズム波長分散法などがある。
【００１１】八種類の断片群を多色分離型電気泳動装置
の単一の泳動路で電気泳動分離する。励起レーザをゲル
板の側面より入射させ、泳動距離の等しい位置を照射す
る。六種類の蛍光体は混合状態でレーザ照射位置で励起
されるが、多色分離検出によって各蛍光体の蛍光量は独
立に計測できる。ここで計測される、蛍光体α，β，
ａ，ｃ，ｇ，ｔの単独の蛍光量をそれぞれ、Ｉα，
Ｉβ，Ｉa，Ｉc，Ｉg，Ｉtとする。
の単一の泳動路で電気泳動分離する。励起レーザをゲル
板の側面より入射させ、泳動距離の等しい位置を照射す
る。六種類の蛍光体は混合状態でレーザ照射位置で励起
されるが、多色分離検出によって各蛍光体の蛍光量は独
立に計測できる。ここで計測される、蛍光体α，β，
ａ，ｃ，ｇ，ｔの単独の蛍光量をそれぞれ、Ｉα，
Ｉβ，Ｉa，Ｉc，Ｉg，Ｉtとする。
【００１２】図２において、断片群ｎ（ただしｎは１〜
８の整数）のプライマ標識蛍光体の蛍光量をＩn、ター
ミネータ標識蛍光体の蛍光量をｉnとする。ここで、プ
ライマ標識蛍光体とターミネータ標識蛍光体の量比は断
片群ｎのあらゆる断片に関して１対１であるから、それ
らの蛍光量比(ｉn／Ｉn）は一定値で、これをｋnとお
く。すると、これらの蛍光量と先の計測される蛍光量と
の関係は次式のようになる。
８の整数）のプライマ標識蛍光体の蛍光量をＩn、ター
ミネータ標識蛍光体の蛍光量をｉnとする。ここで、プ
ライマ標識蛍光体とターミネータ標識蛍光体の量比は断
片群ｎのあらゆる断片に関して１対１であるから、それ
らの蛍光量比(ｉn／Ｉn）は一定値で、これをｋnとお
く。すると、これらの蛍光量と先の計測される蛍光量と
の関係は次式のようになる。
【００１３】
【数１】 Ｉα＝Ｉ1＋Ｉ2＋Ｉ3＋Ｉ4 …（数１）
【００１４】
【数２】 Ｉβ＝Ｉ5＋Ｉ6＋Ｉ7＋Ｉ8 …（数２）
【００１５】
【数３】 Ｉa＝ｉ1＋ｉ5＝ｋ1Ｉ1＋ｋ5Ｉ5 …（数３）
【００１６】
【数４】 Ｉc＝ｉ2＋ｉ6＝ｋ2Ｉ2＋ｋ6Ｉ6 …（数４）
【００１７】
【数５】 Ｉg＝ｉ3＋ｉ7＝ｋ3Ｉ3＋ｋ7Ｉ7 …（数５）
【００１８】
【数６】 Ｉt＝ｉ4＋ｉ8＝ｋ4Ｉ4＋ｋ8Ｉ8 …（数６） 左辺は計測可能な量であり、右辺のｋ1〜ｋ8は既知量で
あるの対して、右辺のＩ1〜Ｉ8は未知量である。このＩ
1〜Ｉ8を知ることができれば、二種類の試料、試料５と
試料６の塩基配列を決定できるが、このままでは未知量
８つに対して式が六つしかないので解くことはできな
い。そこで、以下の方法により、二種類の試料の塩基配
列を決定する。
あるの対して、右辺のＩ1〜Ｉ8は未知量である。このＩ
1〜Ｉ8を知ることができれば、二種類の試料、試料５と
試料６の塩基配列を決定できるが、このままでは未知量
８つに対して式が六つしかないので解くことはできな
い。そこで、以下の方法により、二種類の試料の塩基配
列を決定する。
【００１９】図３のＩα，Ｉβ，Ｉa、図４のＩc，
Ｉg，Ｉtはそれぞれの蛍光量の同一時間帯の時間経過を
表している。試料５と試料６の同じ塩基長のＤＮＡ断片
は、標識される蛍光体によって泳動速度に差がでないよ
うにされているため、Ｉα，Ｉβの時間経過は同じ時刻
にピークを持つ。そこで図３のＩα，Ｉβに示されてい
る五つのピークの表れる時刻を、早い順にｔ1，ｔ2，ｔ
3，ｔ4，ｔ5 とおいた。これらの時刻は図３のすべてに
ついて共通である。
Ｉg，Ｉtはそれぞれの蛍光量の同一時間帯の時間経過を
表している。試料５と試料６の同じ塩基長のＤＮＡ断片
は、標識される蛍光体によって泳動速度に差がでないよ
うにされているため、Ｉα，Ｉβの時間経過は同じ時刻
にピークを持つ。そこで図３のＩα，Ｉβに示されてい
る五つのピークの表れる時刻を、早い順にｔ1，ｔ2，ｔ
3，ｔ4，ｔ5 とおいた。これらの時刻は図３のすべてに
ついて共通である。
【００２０】まず、時刻ｔ1 に表れた二つの試料のＤＮ
Ａ断片の末端塩基種がＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔのいずれであるか
を考える。図３のＩa，Ｉc、図４のＩg，Ｉtの時刻ｔ1
における値を比較すると、Ｉa，Ｉgはピーク強度を示
し、Ｉc，Ｉtは信号がないことがわかる。したがって、
試料５と試料６の末端塩基種は、一方がＡで他方がＧで
あることがわかる。これを決定するために、数４，数６
においてＩc＝Ｉt＝０、すなわちＩ2＝Ｉ4＝Ｉ6＝Ｉ8＝
０とおく。一般には、時刻ｔにおけるＩa，Ｉc，Ｉg，
Ｉtを比較し、１番小さいものと２番目に小さいものを
０とおけば良い。このとき数１，数２は
Ａ断片の末端塩基種がＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔのいずれであるか
を考える。図３のＩa，Ｉc、図４のＩg，Ｉtの時刻ｔ1
における値を比較すると、Ｉa，Ｉgはピーク強度を示
し、Ｉc，Ｉtは信号がないことがわかる。したがって、
試料５と試料６の末端塩基種は、一方がＡで他方がＧで
あることがわかる。これを決定するために、数４，数６
においてＩc＝Ｉt＝０、すなわちＩ2＝Ｉ4＝Ｉ6＝Ｉ8＝
０とおく。一般には、時刻ｔにおけるＩa，Ｉc，Ｉg，
Ｉtを比較し、１番小さいものと２番目に小さいものを
０とおけば良い。このとき数１，数２は
【００２１】
【数７】 Ｉα＝Ｉ1＋Ｉ3 …（数７）
【００２２】
【数８】 Ｉβ＝Ｉ5＋Ｉ7 …（数８） となり、数３，数５と組み合わせて解けば、Ｉ1，Ｉ3，
Ｉ5，Ｉ7を求めることができる。この結果は、Ｉ1≫Ｉ3
かつＩ5≪Ｉ7、またはＩ1≪Ｉ3かつＩ5≫Ｉ7となるはず
で、前者ならば試料５がＡ、試料６がＧであり、後者な
らば試料５がＧ、試料６がＡであると決定できる。一般
には、Ｉ1≫Ｉ3かつＩ5≫Ｉ7、またはＩ1≪Ｉ3 かつＩ5
≪Ｉ7となる場合も考えられ、前者は試料５と試料６が
共にＡ、後者は試料５と試料６が共にＧであると決定で
きる。
Ｉ5，Ｉ7を求めることができる。この結果は、Ｉ1≫Ｉ3
かつＩ5≪Ｉ7、またはＩ1≪Ｉ3かつＩ5≫Ｉ7となるはず
で、前者ならば試料５がＡ、試料６がＧであり、後者な
らば試料５がＧ、試料６がＡであると決定できる。一般
には、Ｉ1≫Ｉ3かつＩ5≫Ｉ7、またはＩ1≪Ｉ3 かつＩ5
≪Ｉ7となる場合も考えられ、前者は試料５と試料６が
共にＡ、後者は試料５と試料６が共にＧであると決定で
きる。
【００２３】以上と同様の操作を時刻ｔ2，ｔ3，ｔ4，
ｔ5についても順次行えば、二つの試料の各時刻の末端
塩基種を決定することができる。実際にこれらの操作を
行えば、時刻ｔ1，ｔ2，ｔ3，ｔ4，ｔ5 に対応する末端
塩基種は、試料５はＡＣＡＴＧ、試料６はＧＣＴＧＴで
あると決定できる。他の時刻についても同様の操作を行
うことにより、二つの試料の塩基配列を、単一の電気泳
動路を用いて同時に決定することができる。
ｔ5についても順次行えば、二つの試料の各時刻の末端
塩基種を決定することができる。実際にこれらの操作を
行えば、時刻ｔ1，ｔ2，ｔ3，ｔ4，ｔ5 に対応する末端
塩基種は、試料５はＡＣＡＴＧ、試料６はＧＣＴＧＴで
あると決定できる。他の時刻についても同様の操作を行
うことにより、二つの試料の塩基配列を、単一の電気泳
動路を用いて同時に決定することができる。
【００２４】
【実施例】本発明の実施例を図５，図６により説明す
る。本実施例は、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖とアンチセン
ス鎖の同一泳動路での同時塩基配列決定を実現したもの
である。
る。本実施例は、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖とアンチセン
ス鎖の同一泳動路での同時塩基配列決定を実現したもの
である。
【００２５】塩基配列を決定しようとする二本鎖ＤＮＡ
１０がプラスミドＰＵＣ１０に組み込まれたものを試料
１１とする。正方向プライマ１２及び逆方向プライマ１
３は以下のような塩基配列のオリゴヌクレオチド（１８
ｍｅｒ）である。
１０がプラスミドＰＵＣ１０に組み込まれたものを試料
１１とする。正方向プライマ１２及び逆方向プライマ１
３は以下のような塩基配列のオリゴヌクレオチド（１８
ｍｅｒ）である。
【００２６】正方向プライマ： ５′ＴＧＴＡＡＡＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ ３′ 逆方向プライマ： ５′ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡ
ＴＧＡＣＣ ３′ 正方向プライマには６８５ｎｍに発光ピークを持つ蛍光
体AlPc680 、逆方向プライマには７１０ｎｍに発光ピー
クを持つ蛍光体AlPc720 を標識した。いづれの蛍光体も
アルミニウムフタロシアニンの誘導体であり、ウルトラ
ダイアグノスティックス社(Ultra Diagnostics社）によ
り作製された。オリゴヌクレオチドの５′末端のリン酸
基を官能基を有するスルホン酸基に置き換え、この官能
基と蛍光体を結合させることにより蛍光体標識を実現し
た。これらの蛍光体は波長633ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザ
１４によって励起した。
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ ３′ 逆方向プライマ： ５′ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡ
ＴＧＡＣＣ ３′ 正方向プライマには６８５ｎｍに発光ピークを持つ蛍光
体AlPc680 、逆方向プライマには７１０ｎｍに発光ピー
クを持つ蛍光体AlPc720 を標識した。いづれの蛍光体も
アルミニウムフタロシアニンの誘導体であり、ウルトラ
ダイアグノスティックス社(Ultra Diagnostics社）によ
り作製された。オリゴヌクレオチドの５′末端のリン酸
基を官能基を有するスルホン酸基に置き換え、この官能
基と蛍光体を結合させることにより蛍光体標識を実現し
た。これらの蛍光体は波長633ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザ
１４によって励起した。
【００２７】ターミネータとなる四種の蛍光体標識ダイ
デオキシヌクレオチド（ｄｄＡ，ｄｄＣ，ｄｄＧ，ｄｄ
Ｔ）はＡＢＩ社より製品化されているキットを使用し
た。各ダイデオキシヌクレオチドに標識されている蛍光
体は、ｄｄＡには５５０ｎｍに発光ピークを持つＪＯ
Ｅ，ｄｄＣには６００ｎｍに発光ピークを持つＲＯＸ，
ｄｄＧには５２０ｎｍに発光ピークを持つＦＡＭ，ｄｄ
Ｔには５８０ｎｍに発光ピークを持つＴＡＭＲＡであ
る。四種の蛍光体は波長５１５ｎｍのＡｒイオンレーザ
１５により励起した。
デオキシヌクレオチド（ｄｄＡ，ｄｄＣ，ｄｄＧ，ｄｄ
Ｔ）はＡＢＩ社より製品化されているキットを使用し
た。各ダイデオキシヌクレオチドに標識されている蛍光
体は、ｄｄＡには５５０ｎｍに発光ピークを持つＪＯ
Ｅ，ｄｄＣには６００ｎｍに発光ピークを持つＲＯＸ，
ｄｄＧには５２０ｎｍに発光ピークを持つＦＡＭ，ｄｄ
Ｔには５８０ｎｍに発光ピークを持つＴＡＭＲＡであ
る。四種の蛍光体は波長５１５ｎｍのＡｒイオンレーザ
１５により励起した。
【００２８】シーケンス反応は通常のプロトコールに従
って行った。ＰＵＣに二種類の蛍光プライマを混合して
それぞれハイブリダイズさせた後、四種のデオキシヌク
レオチド及び蛍光体標識ダイデオキシヌクレオチドを適
当な濃度で混合し、ポリメラーゼ酵素シーケネースによ
り伸長反応を行った。生成物は、蛍光体種がプライマに
二種類、ターミネータに四種類存在するため、合計八種
類の蛍光体の組合せのＤＮＡ断片群よりなる。
って行った。ＰＵＣに二種類の蛍光プライマを混合して
それぞれハイブリダイズさせた後、四種のデオキシヌク
レオチド及び蛍光体標識ダイデオキシヌクレオチドを適
当な濃度で混合し、ポリメラーゼ酵素シーケネースによ
り伸長反応を行った。生成物は、蛍光体種がプライマに
二種類、ターミネータに四種類存在するため、合計八種
類の蛍光体の組合せのＤＮＡ断片群よりなる。
【００２９】反応生成物は、濃度６％のポリアクリルア
ミドゲルの単一泳動路上で、３０ｖ／cmの電圧を印加す
ることにより、電気泳動分離した。泳動距離が３０cmの
位置をＨｅ−Ｎｅレーザ１４とＡｒイオンレーザ１５で
照射し、この位置を通過するＤＮＡ断片に標識された蛍
光体を励起した。二つのレーザのビームは、図６のよう
に同軸にしてからゲル泳動板１６の側面より泳動路と垂
直に入射させた。
ミドゲルの単一泳動路上で、３０ｖ／cmの電圧を印加す
ることにより、電気泳動分離した。泳動距離が３０cmの
位置をＨｅ−Ｎｅレーザ１４とＡｒイオンレーザ１５で
照射し、この位置を通過するＤＮＡ断片に標識された蛍
光体を励起した。二つのレーザのビームは、図６のよう
に同軸にしてからゲル泳動板１６の側面より泳動路と垂
直に入射させた。
【００３０】レーザ照射位置で励起される六種類の蛍光
体の発光は、像分割プリズム法によって分離検出した。
発光点１９より出射された光は、像分割プリズム１７に
よって６分割された後、透過波長を各蛍光体の発光波長
に対応させた六種類のバンドパスフィルタ１８をそれぞ
れ通過させることにより波長選別を行い、レンズ２０に
よって二次元検出器２１の結像面上に異なる６個の点に
結像させる。
体の発光は、像分割プリズム法によって分離検出した。
発光点１９より出射された光は、像分割プリズム１７に
よって６分割された後、透過波長を各蛍光体の発光波長
に対応させた六種類のバンドパスフィルタ１８をそれぞ
れ通過させることにより波長選別を行い、レンズ２０に
よって二次元検出器２１の結像面上に異なる６個の点に
結像させる。
【００３１】六種類の蛍光体の蛍光量を独立に測定し、
作用に示した手法に従うことにより、レーザ照射位置を
通過する二つの試料のＤＮＡ断片の蛍光体種をそれぞれ
特定することができ、各試料の末端塩基種を知ることが
できる。この時間経過を調べることによって、二つの試
料の塩基配列を同時に決定できる。
作用に示した手法に従うことにより、レーザ照射位置を
通過する二つの試料のＤＮＡ断片の蛍光体種をそれぞれ
特定することができ、各試料の末端塩基種を知ることが
できる。この時間経過を調べることによって、二つの試
料の塩基配列を同時に決定できる。
【００３２】本発明の他の実施例として、ＰＣＲにより
増幅された二本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖とアンチセンス
鎖の同時塩基配列決定を行うことも可能である。また、
異なる二つの一本鎖ＤＮＡを異なるベクタに組み込み、
それぞれのベクタにハイブリダイズする異なる配列のプ
ライマを用いて同時に反応させ、以下同様の操作を行う
ことにより、二つの試料の塩基配列を同時に決定するこ
ともできる。
増幅された二本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖とアンチセンス
鎖の同時塩基配列決定を行うことも可能である。また、
異なる二つの一本鎖ＤＮＡを異なるベクタに組み込み、
それぞれのベクタにハイブリダイズする異なる配列のプ
ライマを用いて同時に反応させ、以下同様の操作を行う
ことにより、二つの試料の塩基配列を同時に決定するこ
ともできる。
【００３３】
【発明の効果】本発明によれば、六種類の蛍光体を用い
て、一つの電気泳動路で二種類の試料の同時塩基配列決
定が可能となり、スループットの向上が実現できる。ま
た、二種類の試料の調製を一度に行うことができるた
め、試料調製に費やす労力を大幅に削減することが可能
である。
て、一つの電気泳動路で二種類の試料の同時塩基配列決
定が可能となり、スループットの向上が実現できる。ま
た、二種類の試料の調製を一度に行うことができるた
め、試料調製に費やす労力を大幅に削減することが可能
である。
【図１】本発明の試料調製を示す説明図。
【図２】本発明の試料調製により生成される八種類の断
片群を示す説明図。
片群を示す説明図。
【図３】六種類の蛍光体の発光強度の時間経過を示す説
明図。
明図。
【図４】六種類の蛍光体の発光強度の時間経過を示す説
明図。
明図。
【図５】本発明の一実施例の試料調製を示す説明図。
【図６】本発明の一実施例の光学検出系の説明図。
１，２…塩基配列を決定しようとする異なる塩基配列の
ＤＮＡ、３，４…異なる塩基配列のベクタ、５…ＤＮＡ
１がベクタ３に組み込まれた試料、６…ＤＮＡ２がベク
タ４に組み込まれた試料、７…蛍光体αで標識されたベ
クタ３のプライマ、８…蛍光体βで標識されたベクタ４
のプライマ、９…ベクタ、１０…塩基配列を決定しよう
とするＤＮＡ。
ＤＮＡ、３，４…異なる塩基配列のベクタ、５…ＤＮＡ
１がベクタ３に組み込まれた試料、６…ＤＮＡ２がベク
タ４に組み込まれた試料、７…蛍光体αで標識されたベ
クタ３のプライマ、８…蛍光体βで標識されたベクタ４
のプライマ、９…ベクタ、１０…塩基配列を決定しよう
とするＤＮＡ。
Claims (1)
- 【請求項１】同一あるいは異なるベクタに組み込まれた
二つの異なる試料の相補鎖合成の際、プライマに試料種
に対応させて異なる二つの蛍光体を標識し、ターミネー
タに塩基種に対応させて異なる四つの蛍光体を標識した
ものを用いてＤＮＡ断片を調製し、これらを混合状態で
単一の泳動路で電気泳動分離した後レーザで励起し、発
する六種類の蛍光を波長の違いを利用して分離検出し、
検出される蛍光体種を試料種及び塩基種に対応させ、そ
の時間経過を調べることにより二種類の試料の塩基配列
を同時に決定することを特徴とするＤＮＡの塩基配列決
定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15012993A JPH078299A (ja) | 1993-06-22 | 1993-06-22 | Ｄｎａの二重蛍光標識による塩基配列決定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15012993A JPH078299A (ja) | 1993-06-22 | 1993-06-22 | Ｄｎａの二重蛍光標識による塩基配列決定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078299A true JPH078299A (ja) | 1995-01-13 |
Family
ID=15490119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15012993A Pending JPH078299A (ja) | 1993-06-22 | 1993-06-22 | Ｄｎａの二重蛍光標識による塩基配列決定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH078299A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111272715A (zh) * | 2018-12-04 | 2020-06-12 | 长光华大基因测序设备（长春）有限公司 | 一种基因测序仪的荧光成像系统 |
-
1993
- 1993-06-22 JP JP15012993A patent/JPH078299A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111272715A (zh) * | 2018-12-04 | 2020-06-12 | 长光华大基因测序设备（长春）有限公司 | 一种基因测序仪的荧光成像系统 |
| CN111272715B (zh) * | 2018-12-04 | 2023-03-14 | 长春长光华大智造测序设备有限公司 | 一种基因测序仪的荧光成像系统 |
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