JP3070861B2 - 塩基配列決定法 - Google Patents
塩基配列決定法Info
- Publication number
- JP3070861B2 JP3070861B2 JP2265229A JP26522990A JP3070861B2 JP 3070861 B2 JP3070861 B2 JP 3070861B2 JP 2265229 A JP2265229 A JP 2265229A JP 26522990 A JP26522990 A JP 26522990A JP 3070861 B2 JP3070861 B2 JP 3070861B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- fragment
- dna fragment
- group
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はDNAあるいはRNAの塩基配列決定法に関するも
のである。
のである。
従来、DNA（あるいはRNA）の塩基配列決定はDNAを放
射性元素で標識し、ゲル電気泳動により塩基長に応じて
分離したパターンをオートラジオグラフィーにより読み
取る事により行なっていた。しかし、放射性元素を用い
る煩雑さに加えて手間のかかる難点があり、そのため蛍
光標識を用いる手法が普及してきている。この手法では
DNA断片の片側の末端あるいは末端近傍に蛍光標識を着
け、ゲル電気泳動分離しながらDNA断片に光を照射し、
発する蛍光を受光して泳動時間からDNA断片長を知り塩
基配列を決定する。両者とも種々断片長のDNAの分離に
は４−８％（g/cc）のポリアクリルアミドを用いたゲル
電気泳動が用いられる。ポリアクリルアミドゲルを用い
たDNA断片の分離では、１塩基長の識別が可能なのは500
塩基程度まででありそれ以上になると分子量の差による
泳動バンドが接近し、識別が不能となり配列決定ができ
ない。従って、従来の方法では一度に配列決定が可能な
DNA断片の大きさは500塩基長までである。
射性元素で標識し、ゲル電気泳動により塩基長に応じて
分離したパターンをオートラジオグラフィーにより読み
取る事により行なっていた。しかし、放射性元素を用い
る煩雑さに加えて手間のかかる難点があり、そのため蛍
光標識を用いる手法が普及してきている。この手法では
DNA断片の片側の末端あるいは末端近傍に蛍光標識を着
け、ゲル電気泳動分離しながらDNA断片に光を照射し、
発する蛍光を受光して泳動時間からDNA断片長を知り塩
基配列を決定する。両者とも種々断片長のDNAの分離に
は４−８％（g/cc）のポリアクリルアミドを用いたゲル
電気泳動が用いられる。ポリアクリルアミドゲルを用い
たDNA断片の分離では、１塩基長の識別が可能なのは500
塩基程度まででありそれ以上になると分子量の差による
泳動バンドが接近し、識別が不能となり配列決定ができ
ない。従って、従来の方法では一度に配列決定が可能な
DNA断片の大きさは500塩基長までである。
しかし、最近のライフサイエンス分野の発展はより簡
単に長いDNAの塩基配列を迅速に決定する方法の開発を
要求している。特に人遺伝子の全塩基配列決定などのプ
ロジェクトではできる限り長いDNAを一度に決める事が
重要となっている。これは人遺伝子の中には100〜200塩
基長のくりかえし配列が多く現われるため、小断片の配
列を決定してもこれらをつなぎ合わせて長いDNA配列を
決める事は困難なためである。
単に長いDNAの塩基配列を迅速に決定する方法の開発を
要求している。特に人遺伝子の全塩基配列決定などのプ
ロジェクトではできる限り長いDNAを一度に決める事が
重要となっている。これは人遺伝子の中には100〜200塩
基長のくりかえし配列が多く現われるため、小断片の配
列を決定してもこれらをつなぎ合わせて長いDNA配列を
決める事は困難なためである。
そこで、一度に配列決定できる塩基長を大きくする試
みがなされているが未だ成功していない。本発明の目的
は長いDNAの配列を一度に決定するための優れた方法を
提供することにある。
みがなされているが未だ成功していない。本発明の目的
は長いDNAの配列を一度に決定するための優れた方法を
提供することにある。
上記目的を達成するために本発明ではDNA断片を作製
する相補鎖合成反応において、プライマーおよびターミ
ネーターを異なる蛍光体で標識し、合成した相補鎖断片
の両末端側に発光波長の異なる蛍光標識を導入し、次い
で相補鎖合成で生成した二本鎖状態の試料を制限酵素切
断し、ある長さ以上の断片を一定長さに短かくした後、
塩基配列決定を行なうものである。また、上記制限酵素
切断部位には異なる蛍光体で標識されたターミネーター
を入れたり、標識オリゴマーを結合させても良い。
する相補鎖合成反応において、プライマーおよびターミ
ネーターを異なる蛍光体で標識し、合成した相補鎖断片
の両末端側に発光波長の異なる蛍光標識を導入し、次い
で相補鎖合成で生成した二本鎖状態の試料を制限酵素切
断し、ある長さ以上の断片を一定長さに短かくした後、
塩基配列決定を行なうものである。また、上記制限酵素
切断部位には異なる蛍光体で標識されたターミネーター
を入れたり、標識オリゴマーを結合させても良い。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、蛍光標識を用いたDNAあるいはRNAの塩基配
列決定法において、蛍光標識したDNA断片を特定の箇所
で制限酵素により切断した後、断片を泳動分離して配列
を決定する手法にある。即ち、この方法は相補鎖合成に
より生成した蛍光標識した断片を電気泳動分離を行い塩
基配列を決定する従来方法に対し前記DNA断片の特定部
位を制限酵素により切断し、ある長さ以上のDNA断片を
一定長さ短くし、その短くしたDNA断片を前記と同様に
電気泳動分離を行い塩基配列の決定を行うものである。
この方法により従来、電気泳動パターンが接近し検出が
困難乃至不可能な400〜500塩基長以上の長鎖のDNAの配
列を一度に決定することができる。
列決定法において、蛍光標識したDNA断片を特定の箇所
で制限酵素により切断した後、断片を泳動分離して配列
を決定する手法にある。即ち、この方法は相補鎖合成に
より生成した蛍光標識した断片を電気泳動分離を行い塩
基配列を決定する従来方法に対し前記DNA断片の特定部
位を制限酵素により切断し、ある長さ以上のDNA断片を
一定長さ短くし、その短くしたDNA断片を前記と同様に
電気泳動分離を行い塩基配列の決定を行うものである。
この方法により従来、電気泳動パターンが接近し検出が
困難乃至不可能な400〜500塩基長以上の長鎖のDNAの配
列を一度に決定することができる。
蛍光標識したDNA断片の制限酵素による切断部位は特
に限定されるものではないが、本発明の目的からして従
来法による検出限界である400〜500塩基長に近い部位が
好ましい。
に限定されるものではないが、本発明の目的からして従
来法による検出限界である400〜500塩基長に近い部位が
好ましい。
使用する制限酵素としては、試料DNAの塩基配列に対
応して決定されるものであり、いずれの制限酵素も試料
DNAの対応関係において使用されるものである。しか
し、その制限酵素はその塩基配列を決定すべき試料DNA
断片の１〜400又は500塩基長の間で切断部位の少ないも
のから選択することが好ましい。
応して決定されるものであり、いずれの制限酵素も試料
DNAの対応関係において使用されるものである。しか
し、その制限酵素はその塩基配列を決定すべき試料DNA
断片の１〜400又は500塩基長の間で切断部位の少ないも
のから選択することが好ましい。
上記DNA断片は５′末端又は５′末端から20mer近傍に
第一の蛍光体の蛍光標識をもつものである。そして、こ
の蛍光標識はDNA断片を作成する相補鎖合成において第
一の蛍光体で標識したプライマーを用いることによりDN
A断片に導入される。
第一の蛍光体の蛍光標識をもつものである。そして、こ
の蛍光標識はDNA断片を作成する相補鎖合成において第
一の蛍光体で標識したプライマーを用いることによりDN
A断片に導入される。
また、DNA断片の３′末端側には第一の蛍光体と異な
る蛍光波長を持つ第二の蛍光体の蛍光標識をもつもので
ある。そして、この蛍光標識はDNA断片を作成する相補
鎖合成において第二の蛍光体で標識したタ−ミネ−タ−
であるddNTPを用いることによりDNA断片に導入される。
る蛍光波長を持つ第二の蛍光体の蛍光標識をもつもので
ある。そして、この蛍光標識はDNA断片を作成する相補
鎖合成において第二の蛍光体で標識したタ−ミネ−タ−
であるddNTPを用いることによりDNA断片に導入される。
上記第一および第二の蛍光体としてはテトラメチルロ
−ダミンイソチオシアネ−ト（TRITC）、テキサスレッ
ド、SF505（サクシニルフルオレセイン505）、SF512、S
F526、SF532、AL−PC（フタロシアニンAI錯体）スルフ
ォン酸塩同族体等が用いられる。
−ダミンイソチオシアネ−ト（TRITC）、テキサスレッ
ド、SF505（サクシニルフルオレセイン505）、SF512、S
F526、SF532、AL−PC（フタロシアニンAI錯体）スルフ
ォン酸塩同族体等が用いられる。
本発明のDNA断片においては、３′末端側を無標識と
し、それに代えてDNA断片の制限酵素断片部位を第二の
蛍光体で蛍光標識することにより行うこともできる。こ
の蛍光標識はDNA断片を制限酵素で切断した後、切断部
位に第二の蛍光体の蛍光標識を有するddNTP又はオリゴ
ヌクレオチドをライゲ−ション等により接合することに
より作成される。
し、それに代えてDNA断片の制限酵素断片部位を第二の
蛍光体で蛍光標識することにより行うこともできる。こ
の蛍光標識はDNA断片を制限酵素で切断した後、切断部
位に第二の蛍光体の蛍光標識を有するddNTP又はオリゴ
ヌクレオチドをライゲ−ション等により接合することに
より作成される。
次に本発明の方法による試料DNAの全塩基配列の決定
の手順を示す。
の手順を示す。
塩基配列を決定すべき試料DNAを組み込んだベクタ−
を４分割し、それぞれに第一の蛍光体で蛍光標識したプ
ライマ−と前記第一の蛍光体と異なる第二の蛍光体で蛍
光標識したタ−ミネ−タ−を加え、対応するベクタ−と
プライマーをハイブリダイズせしめた後、それぞれ末端
塩基配列がアデニン、シトシン、グアニン及びチミンと
なるように相補鎖合成を行って、それぞれDNA断片の末
端塩基配列種が前記４種のいずれかであるDNA断片群、
すなわちDNA断片の末端塩基配列種がアデニンである
群、DNA断片の末端塩基配列種がシトシンである群、DNA
断片の末端塩基配列種がグアニンである群、及び、DNA
断片の末端塩基配列種がチミンである群を作成し、次い
で各群を２分割し、それぞれの半分をそれぞれ別々の泳
動路を用いてゲル電気泳動分離を行い、レ−ザ−照射に
より塩基長400〜500までの塩基配列を検出し、次いで前
記２分割した他の半分のそれぞれに制限酵素を加えそれ
ぞれのDNA断片を切断した後、前記と同様にゲル電気泳
動分離を行い、レ−ザ−照射により塩基配列を検出し、
次いで第一および第二の両者の蛍光体で標識されたDNA
断片の情報及び第二の蛍光体のみで蛍光標識されたDNA
断片の情報をデ−タ−処理して試料DNAの塩基配列を決
定する。
を４分割し、それぞれに第一の蛍光体で蛍光標識したプ
ライマ−と前記第一の蛍光体と異なる第二の蛍光体で蛍
光標識したタ−ミネ−タ−を加え、対応するベクタ−と
プライマーをハイブリダイズせしめた後、それぞれ末端
塩基配列がアデニン、シトシン、グアニン及びチミンと
なるように相補鎖合成を行って、それぞれDNA断片の末
端塩基配列種が前記４種のいずれかであるDNA断片群、
すなわちDNA断片の末端塩基配列種がアデニンである
群、DNA断片の末端塩基配列種がシトシンである群、DNA
断片の末端塩基配列種がグアニンである群、及び、DNA
断片の末端塩基配列種がチミンである群を作成し、次い
で各群を２分割し、それぞれの半分をそれぞれ別々の泳
動路を用いてゲル電気泳動分離を行い、レ−ザ−照射に
より塩基長400〜500までの塩基配列を検出し、次いで前
記２分割した他の半分のそれぞれに制限酵素を加えそれ
ぞれのDNA断片を切断した後、前記と同様にゲル電気泳
動分離を行い、レ−ザ−照射により塩基配列を検出し、
次いで第一および第二の両者の蛍光体で標識されたDNA
断片の情報及び第二の蛍光体のみで蛍光標識されたDNA
断片の情報をデ−タ−処理して試料DNAの塩基配列を決
定する。
更に、DNA断片の制限酵素切断部位を第二の蛍光体で
蛍光標識する場合の塩基配列決定法の手順は次の通りで
ある。
蛍光標識する場合の塩基配列決定法の手順は次の通りで
ある。
塩基配列を決定すべき試料DNAを組み込んだベクタ−
を４分割し、それぞれに第一の蛍光体で蛍光標識したプ
ライマ−と無標識のタ−ミネ−タ−を加え、対応するベ
クタ−とプライマーをハイブリダイズせしめた後、それ
ぞれ末端塩基配列がアデニン、シトシン、グアニン及び
チミンとなるように相補鎖合成を行って、それぞれDNA
断片の末端塩基配列種が前記４種のいずれかであるDNA
断片群、すなわちDNA断片の末端塩基配列種がアデニン
である群、DNA断片の末端塩基配列種がシトシンである
群、DNA断片の末端塩基配列種がグアニンである群、及
び、DNA断片の末端塩基配列種がチミンである群を作成
し、次いで各群を２分割し、それぞれの半分をそれぞれ
別々の泳動路を用いてゲル電気泳動分離を行い、レ−ザ
−照射により塩基長400〜500までの塩基配列を検出し、
次いで前記２分割した他の半分のそれぞれに制限酵素を
加えそれぞれのDNA断片を切断し、その切断部位に第一
の蛍光体と異なる第二の蛍光体で蛍光標識したオリゴマ
ーをライゲションにより接着せしめた後、前記と同様に
ゲル電気泳動分離を行い、レ−ザ−照射により塩基配列
を検出し、次いで第一の蛍光体で標識されたDNA断片の
情報及び第二の蛍光体で蛍光標識されたDNA断片の情報
をデ−タ−処理して試料DNAの塩基配列を決定する。
を４分割し、それぞれに第一の蛍光体で蛍光標識したプ
ライマ−と無標識のタ−ミネ−タ−を加え、対応するベ
クタ−とプライマーをハイブリダイズせしめた後、それ
ぞれ末端塩基配列がアデニン、シトシン、グアニン及び
チミンとなるように相補鎖合成を行って、それぞれDNA
断片の末端塩基配列種が前記４種のいずれかであるDNA
断片群、すなわちDNA断片の末端塩基配列種がアデニン
である群、DNA断片の末端塩基配列種がシトシンである
群、DNA断片の末端塩基配列種がグアニンである群、及
び、DNA断片の末端塩基配列種がチミンである群を作成
し、次いで各群を２分割し、それぞれの半分をそれぞれ
別々の泳動路を用いてゲル電気泳動分離を行い、レ−ザ
−照射により塩基長400〜500までの塩基配列を検出し、
次いで前記２分割した他の半分のそれぞれに制限酵素を
加えそれぞれのDNA断片を切断し、その切断部位に第一
の蛍光体と異なる第二の蛍光体で蛍光標識したオリゴマ
ーをライゲションにより接着せしめた後、前記と同様に
ゲル電気泳動分離を行い、レ−ザ−照射により塩基配列
を検出し、次いで第一の蛍光体で標識されたDNA断片の
情報及び第二の蛍光体で蛍光標識されたDNA断片の情報
をデ−タ−処理して試料DNAの塩基配列を決定する。
制限酵素切断を受けないDNA断片はプライマーに標識
した蛍光体とターミネーターに導入した蛍光体の二種を
持つが、切断を受けた断片は片方しか持たないので区別
して塩基配列決定することができる。
した蛍光体とターミネーターに導入した蛍光体の二種を
持つが、切断を受けた断片は片方しか持たないので区別
して塩基配列決定することができる。
また、切断部位に蛍光標識オリゴヌクレオチドを導入
した場合には、DNA断片が新しく導入された蛍光体を持
つか否かで制限酵素切断を受けたDNA断片か否かを区別
し、塩基配列決定できる。
した場合には、DNA断片が新しく導入された蛍光体を持
つか否かで制限酵素切断を受けたDNA断片か否かを区別
し、塩基配列決定できる。
以下、本発明の実施例を第１〜３図により説明する。
但し、本発明はこれらの実施例により限定されるもので
はない。
但し、本発明はこれらの実施例により限定されるもので
はない。
なお、以下の実施例において第一の蛍光体（以下、蛍
光体F1という）としてはテトラメチルロ−ダミンイソチ
アシアネ−トが、第二の蛍光体（以下、蛍光体F2とい
う）としてはテキサスレッドがそれぞれ用いられる。
光体F1という）としてはテトラメチルロ−ダミンイソチ
アシアネ−トが、第二の蛍光体（以下、蛍光体F2とい
う）としてはテキサスレッドがそれぞれ用いられる。
実施例１ 第１図は試料調製の方法を示した。配列を決定しよう
とするDNAを組み込んだベクター１を用意する。これを
４分割し、蛍光体F1で標識されたプライマー２と蛍光体
F2で標識されたddNTPを加えて相補鎖を合成する。アデ
ニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ）およびチ
ミン（Ｔ）のターミネーター（ddNTP）に対応して４つ
の断片群を作成する。即ち、これら４種の断片群は、DN
A断片の末端塩基配列種がアデニンである群、DNA断片の
末端塩基配列種がシトシンである群、DNA断片の末端塩
基配列種がグアニンである群、及び、DNA断片の末端塩
基配列種がチミンである群からなる。生成したそれぞれ
と断片はプライマー部に蛍光体F1を持ち、終末端に蛍光
体F2を持ちそれぞれ蛍光標識された断片群である。得ら
れた４種の断片群をそれぞれ２分割し、その半分を用い
て塩基配列決定を行なう。配列決定は光学的に行ない、
その原理は第２図に示す通りである。末端がA,C,Gおよ
びＴとなる断片群をそれぞれ別の泳動路を用いて泳動分
離する。泳動始点から25cm内外の所をレーザーで照射
し、そこを通過していくDNA断片の発する蛍光を受光
し、DNA断片の通過時間から断片長を検出し、蛍光を発
する泳動路位置の違いから末端塩基種を識別して塩基配
列を決定する。これにより400〜500塩基までの塩基配列
決定ができる。次いで400〜500塩基長の所に切断部位の
ある４塩基認識制限酵素を選択し、これらのうち１〜40
0塩基長の所に切断部位が無いか、少ない制限酵素を選
ぶ。先に２分割した試料のうちの残りの半分に制限酵素
を作用させ、切断する。この結果第１図に示したような
断片群が生成する。蛍光体F1およびF2を保持した断片群
は制限酵素切断を受けてない断片群である。一方、蛍光
体F1だけを保持した断片プライマーを含み制限酵素切断
部位までの長さを持つもので、非連続的で制限酵素切断
部位の数だけ種々長さの断片群が存在する。また、蛍光
体F2だけを保持した断片は制限酵素切断部位からターミ
ネーター部までの断片群で、一塩基刻みで連続的に変化
する断片長を含む。
とするDNAを組み込んだベクター１を用意する。これを
４分割し、蛍光体F1で標識されたプライマー２と蛍光体
F2で標識されたddNTPを加えて相補鎖を合成する。アデ
ニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ）およびチ
ミン（Ｔ）のターミネーター（ddNTP）に対応して４つ
の断片群を作成する。即ち、これら４種の断片群は、DN
A断片の末端塩基配列種がアデニンである群、DNA断片の
末端塩基配列種がシトシンである群、DNA断片の末端塩
基配列種がグアニンである群、及び、DNA断片の末端塩
基配列種がチミンである群からなる。生成したそれぞれ
と断片はプライマー部に蛍光体F1を持ち、終末端に蛍光
体F2を持ちそれぞれ蛍光標識された断片群である。得ら
れた４種の断片群をそれぞれ２分割し、その半分を用い
て塩基配列決定を行なう。配列決定は光学的に行ない、
その原理は第２図に示す通りである。末端がA,C,Gおよ
びＴとなる断片群をそれぞれ別の泳動路を用いて泳動分
離する。泳動始点から25cm内外の所をレーザーで照射
し、そこを通過していくDNA断片の発する蛍光を受光
し、DNA断片の通過時間から断片長を検出し、蛍光を発
する泳動路位置の違いから末端塩基種を識別して塩基配
列を決定する。これにより400〜500塩基までの塩基配列
決定ができる。次いで400〜500塩基長の所に切断部位の
ある４塩基認識制限酵素を選択し、これらのうち１〜40
0塩基長の所に切断部位が無いか、少ない制限酵素を選
ぶ。先に２分割した試料のうちの残りの半分に制限酵素
を作用させ、切断する。この結果第１図に示したような
断片群が生成する。蛍光体F1およびF2を保持した断片群
は制限酵素切断を受けてない断片群である。一方、蛍光
体F1だけを保持した断片プライマーを含み制限酵素切断
部位までの長さを持つもので、非連続的で制限酵素切断
部位の数だけ種々長さの断片群が存在する。また、蛍光
体F2だけを保持した断片は制限酵素切断部位からターミ
ネーター部までの断片群で、一塩基刻みで連続的に変化
する断片長を含む。
これら断片をゲル電気泳動により分離しながら、一定
距離泳動した所でレーザー照射し、発する蛍光を波長選
別して蛍光体F1およびF2起因の蛍光を区別して受光す
る。受光される蛍光体F1およびF2の蛍光強度は標識され
たDNAの数，フィルター透過率，使用レーザーによる励
起効率etc.に依存する。しかし、１つのDNA断片に２つ
の蛍光体が含まれる場合には、観測される蛍光体F1およ
びF2の蛍光強度比は一定なので蛍光体F2の蛍光スペクト
ルからこれら断片の寄与を差引くことができる。すなわ
ち、蛍光体F2のDNA断片スペクトルからF1のDNA断片スペ
クトルに受光効率などによるスケール因子をかけたもの
をデ−タ−処理により引くことによってプライマー部を
含まないDNA断片群のスペクトルを得ることができる。
第３−ｂ図は蛍光体F2のDNA断片スペクトルでプライマ
ーを含む断片と含まない断片の混在スペクトルである。
第３−ａ図は蛍光体F1のDNA断片スペクトルでプライマ
ーを含むDNA断片のスペクトルである。第３−ｃ図は差
スペクトルで制限酵素切断部とターミネーター標識末端
を持つDNA断片のスペクトルである。この第３図から制
限酵素切断部以降の塩基配列決定が可能てあることがわ
かる。
距離泳動した所でレーザー照射し、発する蛍光を波長選
別して蛍光体F1およびF2起因の蛍光を区別して受光す
る。受光される蛍光体F1およびF2の蛍光強度は標識され
たDNAの数，フィルター透過率，使用レーザーによる励
起効率etc.に依存する。しかし、１つのDNA断片に２つ
の蛍光体が含まれる場合には、観測される蛍光体F1およ
びF2の蛍光強度比は一定なので蛍光体F2の蛍光スペクト
ルからこれら断片の寄与を差引くことができる。すなわ
ち、蛍光体F2のDNA断片スペクトルからF1のDNA断片スペ
クトルに受光効率などによるスケール因子をかけたもの
をデ−タ−処理により引くことによってプライマー部を
含まないDNA断片群のスペクトルを得ることができる。
第３−ｂ図は蛍光体F2のDNA断片スペクトルでプライマ
ーを含む断片と含まない断片の混在スペクトルである。
第３−ａ図は蛍光体F1のDNA断片スペクトルでプライマ
ーを含むDNA断片のスペクトルである。第３−ｃ図は差
スペクトルで制限酵素切断部とターミネーター標識末端
を持つDNA断片のスペクトルである。この第３図から制
限酵素切断部以降の塩基配列決定が可能てあることがわ
かる。
実施例２ 蛍光体F1プライマーと無標識ddNTPを用いて実施例１
と同様に相補鎖合成をする。生成物を制限酵素切断した
後、切断部位にF2蛍光標識オリゴマーをライゲーション
等により接合する。この時、標識蛍光体の種類（F2）す
なわち発光波長を違えておき、蛍光体F1標識プライマー
を含む断片群と区別して計測する。計測は実施例１と同
様である。
と同様に相補鎖合成をする。生成物を制限酵素切断した
後、切断部位にF2蛍光標識オリゴマーをライゲーション
等により接合する。この時、標識蛍光体の種類（F2）す
なわち発光波長を違えておき、蛍光体F1標識プライマー
を含む断片群と区別して計測する。計測は実施例１と同
様である。
相補鎖合成に各DNA断片強度が同じになるような酵素
（Proc.Natl.Acad.Sci.86,4076（1989））を用いれば、
DNA断片スペクトルの強度は断片長と共にほぼ単調に減
少する。制限酵素切断箇所が複数個ある場合、蛍光体F2
をモニターして得たDNA断片スペクトルは複雑になる
が、強度が単調に減少することを利用して識別すること
ができる。制限酵素の切断箇所がプライマーから離れる
に従がって、DNA断片スペクトル中の強度は小さくなる
のでその強度の大小からどの切断グループに所属するDN
A断片か判別できる。ピークが重なった時には判別がむ
づかしくなるが、逆配列のデータと総合すると精度良く
配列を決定できる。
（Proc.Natl.Acad.Sci.86,4076（1989））を用いれば、
DNA断片スペクトルの強度は断片長と共にほぼ単調に減
少する。制限酵素切断箇所が複数個ある場合、蛍光体F2
をモニターして得たDNA断片スペクトルは複雑になる
が、強度が単調に減少することを利用して識別すること
ができる。制限酵素の切断箇所がプライマーから離れる
に従がって、DNA断片スペクトル中の強度は小さくなる
のでその強度の大小からどの切断グループに所属するDN
A断片か判別できる。ピークが重なった時には判別がむ
づかしくなるが、逆配列のデータと総合すると精度良く
配列を決定できる。
本発明によれば、長いDNA断片群でも制限酵素切断を
利用してプライマーに近い部分を取り除き、短い断片群
として塩基配列決定できる。この結果、分離限界が500
塩基長程度の現有手法を用いて全体で１〜2K塩基長のDN
A塩基配列を一度に決定することができる。
利用してプライマーに近い部分を取り除き、短い断片群
として塩基配列決定できる。この結果、分離限界が500
塩基長程度の現有手法を用いて全体で１〜2K塩基長のDN
A塩基配列を一度に決定することができる。
第１図は試料調整プロセスを示した図である。第２図は
蛍光検出型DNAシーケンサーの原理図である。第３図は
二色標識を用いたDNA断片スペクトルの測定結果であ
る。 図において １……配列を決定しようとする二本鎖DNA、２……ベク
ターDNA、３……鋳型DNAを含む溶液、４〜７……蛍光体
F1標識プライマーと蛍光体F2で標識されたターミネータ
ーを加えた相補鎖合成用溶液、４〜７はA,C,GおよびＴ
に標識が入ったものに対応する。８〜11……蛍光体F1標
識プライマーと蛍光体F2標識ターミネーターを含んだ断
片群、二本鎖の状態、12……蛍光体F1標識からの蛍光を
受光して得たDNA断片スペクトルの一部（プライマーを
保持したDNA断片スペクトル）、13……蛍光体F2標識か
らの蛍光を受光して得たDNA断片スペクトルの一部（タ
ーミネーター標識を含む断片のスペクトル）、14……12
と13の差スペクトル。
蛍光検出型DNAシーケンサーの原理図である。第３図は
二色標識を用いたDNA断片スペクトルの測定結果であ
る。 図において １……配列を決定しようとする二本鎖DNA、２……ベク
ターDNA、３……鋳型DNAを含む溶液、４〜７……蛍光体
F1標識プライマーと蛍光体F2で標識されたターミネータ
ーを加えた相補鎖合成用溶液、４〜７はA,C,GおよびＴ
に標識が入ったものに対応する。８〜11……蛍光体F1標
識プライマーと蛍光体F2標識ターミネーターを含んだ断
片群、二本鎖の状態、12……蛍光体F1標識からの蛍光を
受光して得たDNA断片スペクトルの一部（プライマーを
保持したDNA断片スペクトル）、13……蛍光体F2標識か
らの蛍光を受光して得たDNA断片スペクトルの一部（タ
ーミネーター標識を含む断片のスペクトル）、14……12
と13の差スペクトル。
フロントページの続き (72)発明者 西川 哲夫 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所基礎研究所内 (72)発明者 川本 和子 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所基礎研究所内 (72)発明者 早坂 聖子 東京都千代田区大手町２丁目６番２号 日立電子エンジニアリング株式会社内 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．86，Ｎｏ．22, ｐ．8902−8906（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 G01N 27/447 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】蛍光標識を用いた試料DNAの塩基配列決定
法において、前記試料DNA、第１の蛍光体で標識された
プライマー及び前記第１の蛍光体とは異なる第２の蛍光
体で標識されたターミネーターを用いた相補鎖合成方法
により、両末端側に異なる蛍光標識を有するDNA断片を
生成して、前記DNA断片を制限酵素により特定の箇所で
切断した後に、電気泳動分離して得たDNA断片スペクト
ルに基づいて、前記試料DNAの塩基配列を決定すること
を特徴とする塩基配列決定法。 - 【請求項２】前記特定の箇所が、前記DNA断片の５′末
端から400〜500番目に近い部位であることを特徴とする
請求項１記載の塩基配列決定法。 - 【請求項３】前記制限酵素が、前記試料DNAの１〜400又
は500塩基長の間における切断部位の少ないものから選
択されることを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定
法。 - 【請求項４】前記DNA断片が、５′末端又は５′末端か
ら20mer近傍に前記第１の蛍光体の蛍光標識を有するこ
とを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定法。 - 【請求項５】前記DNA断片が、３′末端に前記第２の蛍
光体の蛍光標識を有することを特徴とする請求項１又は
４記載の塩基配列決定法。 - 【請求項６】蛍光標識を用いた試料DNAの塩基配列決定
法において、前記試料DNA、第１の蛍光体で標識された
プライマー及び無標識のターミネーターを用いた相補鎖
合成反応により、５′末端側に前記第１の蛍光体の蛍光
標識を有するDNA断片を生成して、前記DNA断片を制限酵
素により特定の箇所で切断した後、前記制限酵素により
切断された部位に前記第１の蛍光体とは異なる第２の蛍
光体で標識されたターミネーター又はオリゴヌクレオチ
ドを結合して、電気泳動分離して得たDNA断片スペクト
ルに基づいて、前記試料DNAの塩基配列を決定すること
を特徴とする塩基配列決定法。 - 【請求項７】鋳型DNA、第１の蛍光体で標識されたプラ
イマー及び前記第１の蛍光体とは異なる第２の蛍光体で
標識されたターミネーターを用いた相補鎖合成反応によ
り生成されたDNA断片試料であって、５′末端及び３′
末端において前記第１及び第２の蛍光体のそれぞれによ
り標識されたDNA断片試料を第１及び第２の群に分け
て、前記第１の群を電気泳動分離して得た第１のDNA断
片スペクトルと、前記第２の群を制限酵素で切断して電
気泳動分離して得た第２のDNA断片スペクトルとに基づ
いて、前記鋳型DNAの塩基配列を決定することを特徴と
する塩基配列決定法。 - 【請求項８】前記第１の蛍光体からの蛍光を受光して得
たDNA断片スペクトルと前記第２の蛍光体からの蛍光を
受光して得たDNA断片スペクトルとの差スペクトルを求
めることを特徴とする、請求項７記載の塩基配列決定
法。 - 【請求項９】前記DNA断片試料が、末端塩基配列がアデ
ニンである断片群、シトシンである断片群、グアニンで
ある断片群及びチミンである断片群からなることを特徴
とする、請求項７記載の塩基配列決定法。 - 【請求項１０】鋳型DNA、第１の蛍光体で標識されたプ
ライマー及び無標識のターミネーターを用いた相補鎖合
成反応により生成されるDNA断片試料を、第１及び第２
の群に分けて、前記第１の群を電気泳動分離して得た第
１のDNA断片スペクトルと、前記第２の群を制限酵素で
切断した後、該切断部位に前記第１の蛍光体とは異なる
第２の蛍光体で標識されたターミネーター又はオリゴヌ
クレオチドを結合して、電気泳動して得た第２のDNA断
片スペクトルとに基づいて、前記鋳型DNAの塩基配列を
決定することを特徴とする塩基配列決定法。 - 【請求項１１】前記第１の蛍光体からの蛍光を受光して
得たDNA断片スペクトルと前記第２の蛍光体からの蛍光
を受光して得たDNA断片スペクトルとの差スペクトルを
求めることを特徴とする、請求項10記載の塩基配列決定
法。 - 【請求項１２】前記DNA断片試料が、末端塩基配列がア
デニンである断片群、シトシンである断片群、グアニン
である断片群及びチミンである断片群からなることを特
徴とする、請求項10記載の塩基配列決定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2265229A JP3070861B2 (ja) | 1990-10-04 | 1990-10-04 | 塩基配列決定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2265229A JP3070861B2 (ja) | 1990-10-04 | 1990-10-04 | 塩基配列決定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04144699A JPH04144699A (ja) | 1992-05-19 |
| JP3070861B2 true JP3070861B2 (ja) | 2000-07-31 |
Family
ID=17414318
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2265229A Expired - Lifetime JP3070861B2 (ja) | 1990-10-04 | 1990-10-04 | 塩基配列決定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3070861B2 (ja) |
-
1990
- 1990-10-04 JP JP2265229A patent/JP3070861B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，Ｎｏ．２２，ｐ．８９０２−８９０６（１９８９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04144699A (ja) | 1992-05-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5821058A (en) | Automated DNA sequencing technique | |
| US5728529A (en) | Alternative dye-labeled ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and dideoxyribonucleotides for automated DNA analysis | |
| CA1258611A (en) | Method of dna sequencing | |
| US9938573B2 (en) | Methods and kits for nucleic acid sequencing | |
| US5171534A (en) | Automated DNA sequencing technique | |
| JP4602956B2 (ja) | エネルギー転移連結の色素によりラベルされたプローブ | |
| US6544744B1 (en) | Probes labeled with energy transfer coupled dyes | |
| JP2001509025A (ja) | 固相捕獲可能なターミネーターによる核酸配列方法 | |
| JPS60242368A (ja) | 核酸塩基配列決定方法 | |
| JP2628571B2 (ja) | オリゴヌクレオチドの分析装置 | |
| JP3097205B2 (ja) | 電気泳動分離検出方法 | |
| US6436641B1 (en) | Method and apparatus for DNA sequencing | |
| JP3070861B2 (ja) | 塩基配列決定法 | |
| CA2088260A1 (en) | Method for determining dna sequences | |
| JPH0734005B2 (ja) | 核酸の塩基配列決定装置 | |
| EP0535587A1 (en) | Process for optimizing nucleotide sequence determination | |
| JP3255169B2 (ja) | 電気泳動分離検出方法 | |
| JP3264276B2 (ja) | 核酸断片分子量分離パターンの検出方法 | |
| JP3289347B2 (ja) | 核酸塩基配列の変異検出方法 | |
| JP3186753B2 (ja) | 核酸断片試料及び一本鎖ｄｎａオリゴマー | |
| JPH1084999A (ja) | 多型解析方法 | |
| JP2536105B2 (ja) | 標識された核酸フラグメント | |
| JP2649794C (ja) | ||
| WO1996027023A2 (en) | Method of using mobile priming sites for dna sequencing | |
| JPH078299A (ja) | Ｄｎａの二重蛍光標識による塩基配列決定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080526 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090526 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100526 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110526 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110526 Year of fee payment: 11 |