JP3289347B2 - 核酸塩基配列の変異検出方法 - Google Patents
核酸塩基配列の変異検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の塩基配列の変異、
例えば、遺伝子の突然変異や多型を検出する方法に関す
る。
例えば、遺伝子の突然変異や多型を検出する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】核酸の塩基配列の変異、例えば突然変異
や挿入欠失などの遺伝子異常や、遺伝子の多型を検出す
る方法として、ピーシアール−エスエスシーピー（ＰＣ
Ｒ−ＳＳＣＰ；ポリメラーゼ チェイン リアクション
−シングル ストランド コンフォメーション ポリモ
ルフィズム(Polymerase Chain Reaction−SingleStrand
Conformation Polymorphism））法が用いられている。
この手法は、実験医学Ｖol.８ Ｎo.９（増刊)（１９９
０）第６８頁−第７３頁，第１５５頁−第１６２頁に記
載されている。この報告によると、既に塩基配列の知ら
れている特定の遺伝子部分を標識されたプライマを用い
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、得られたＤ
ＮＡ断片を変性して１本鎖ＤＮＡとしポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分離，検出を行う。１本鎖ＤＮＡは塩
基配列によって異なる高次構造をとるため電気泳動にお
ける移動度が異なる。そこで、正常遺伝子と変異のある
遺伝子を１本鎖にして電気泳動を行うと、変異の有無に
応じて異なる泳動パターンが得られ、塩基配列の変異を
検出する方法である。
や挿入欠失などの遺伝子異常や、遺伝子の多型を検出す
る方法として、ピーシアール−エスエスシーピー（ＰＣ
Ｒ−ＳＳＣＰ；ポリメラーゼ チェイン リアクション
−シングル ストランド コンフォメーション ポリモ
ルフィズム(Polymerase Chain Reaction−SingleStrand
Conformation Polymorphism））法が用いられている。
この手法は、実験医学Ｖol.８ Ｎo.９（増刊)（１９９
０）第６８頁−第７３頁，第１５５頁−第１６２頁に記
載されている。この報告によると、既に塩基配列の知ら
れている特定の遺伝子部分を標識されたプライマを用い
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、得られたＤ
ＮＡ断片を変性して１本鎖ＤＮＡとしポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分離，検出を行う。１本鎖ＤＮＡは塩
基配列によって異なる高次構造をとるため電気泳動にお
ける移動度が異なる。そこで、正常遺伝子と変異のある
遺伝子を１本鎖にして電気泳動を行うと、変異の有無に
応じて異なる泳動パターンが得られ、塩基配列の変異を
検出する方法である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法で
は、１塩基の変異に起因する１本鎖ＤＮＡの高次構造の
変化を電気泳動の移動速度の変化として検出するため、
塩基長が２００〜３００位に存在する変異は分離が十分
なので検出しやすいが、１キロ塩基長を超えると分離が
不十分なので変異の有無を検出することが困難となる。
しかし、塩基配列の変異を調べる対象となる領域、例え
ば、癌化に関与する塩基配列の変異を含むと思われる遺
伝子領域は数キロ塩基で成り立っていることが多い。ま
た、筋ジストロフィなどの場合は十数キロ塩基の遺伝子
中の変異の有無が問題となる。このような長いＤＮＡに
対して従来のＰＣＲ−ＳＳＣＰでは、その領域を互いに
一部重複する３００塩基長前後のＤＮＡ断片をＰＣＲ増
幅することで、全領域をカバーする手法を用いている
が、全領域の塩基配列が既知の場合にしか適用できず新
しい手法が望まれていた。
は、１塩基の変異に起因する１本鎖ＤＮＡの高次構造の
変化を電気泳動の移動速度の変化として検出するため、
塩基長が２００〜３００位に存在する変異は分離が十分
なので検出しやすいが、１キロ塩基長を超えると分離が
不十分なので変異の有無を検出することが困難となる。
しかし、塩基配列の変異を調べる対象となる領域、例え
ば、癌化に関与する塩基配列の変異を含むと思われる遺
伝子領域は数キロ塩基で成り立っていることが多い。ま
た、筋ジストロフィなどの場合は十数キロ塩基の遺伝子
中の変異の有無が問題となる。このような長いＤＮＡに
対して従来のＰＣＲ−ＳＳＣＰでは、その領域を互いに
一部重複する３００塩基長前後のＤＮＡ断片をＰＣＲ増
幅することで、全領域をカバーする手法を用いている
が、全領域の塩基配列が既知の場合にしか適用できず新
しい手法が望まれていた。
【０００４】本発明の目的は、調べる対象の核酸試料が
１キロ塩基長以上でも変異の有無を検出できる核酸塩基
配列の変異検出方法を提供することにある。
１キロ塩基長以上でも変異の有無を検出できる核酸塩基
配列の変異検出方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明では、調べる対象となる未知配列の変異部を
含む１キロ塩基長以上の核酸試料を制限酵素で切断する
工程と、その切断された部分に蛍光標識ＤＮＡオリゴマ
を結合する工程を有し、得られた各断片を１本鎖として
電気泳動分離し、そのパターンにより核酸領域中の変異
を検出する。
め、本発明では、調べる対象となる未知配列の変異部を
含む１キロ塩基長以上の核酸試料を制限酵素で切断する
工程と、その切断された部分に蛍光標識ＤＮＡオリゴマ
を結合する工程を有し、得られた各断片を１本鎖として
電気泳動分離し、そのパターンにより核酸領域中の変異
を検出する。
【０００６】すなわち、検査すべき核酸試料を制限酵素
で切断し、切断された核酸断片の両末端に２本鎖ＤＮＡ
オリゴマの片側鎖が第１の標識物で標識された標識リン
カを結合した第１のＤＮＡ断片群と、核酸試料と比較す
るための標準核酸試料を上記制限酵素で切断し、切断さ
れた核酸断片の両末端に２本鎖ＤＮＡオリゴマの片側鎖
が第２の標識物で標識された標識リンカを結合した第２
のＤＮＡ断片群とを調製し、第１のＤＮＡ断片群および
第２のＤＮＡ断片群を１本鎖状態としたのちゲル電気泳
動し、得られた電気泳動パターンの比較により核酸試料
の変異を判定する。検査すべき核酸試料の塩基長が１キ
ロ塩基以上であることに特徴があり、第１および第２の
標識物が同一の蛍光体である場合には、上記第１のＤＮ
Ａ断片群と上記第２のＤＮＡ断片群とを別個にゲル電気
泳動させ、上記蛍光体からの蛍光を検出する。また、上
記第１および第２の標識物が発光波長の異なる蛍光体で
ある場合には、１本鎖状態とした上記第１のＤＮＡ断片
群と第２のＤＮＡ断片群を混合して電気泳動させ、蛍光
体からの異なる波長の蛍光をそれぞれ検出する。
で切断し、切断された核酸断片の両末端に２本鎖ＤＮＡ
オリゴマの片側鎖が第１の標識物で標識された標識リン
カを結合した第１のＤＮＡ断片群と、核酸試料と比較す
るための標準核酸試料を上記制限酵素で切断し、切断さ
れた核酸断片の両末端に２本鎖ＤＮＡオリゴマの片側鎖
が第２の標識物で標識された標識リンカを結合した第２
のＤＮＡ断片群とを調製し、第１のＤＮＡ断片群および
第２のＤＮＡ断片群を１本鎖状態としたのちゲル電気泳
動し、得られた電気泳動パターンの比較により核酸試料
の変異を判定する。検査すべき核酸試料の塩基長が１キ
ロ塩基以上であることに特徴があり、第１および第２の
標識物が同一の蛍光体である場合には、上記第１のＤＮ
Ａ断片群と上記第２のＤＮＡ断片群とを別個にゲル電気
泳動させ、上記蛍光体からの蛍光を検出する。また、上
記第１および第２の標識物が発光波長の異なる蛍光体で
ある場合には、１本鎖状態とした上記第１のＤＮＡ断片
群と第２のＤＮＡ断片群を混合して電気泳動させ、蛍光
体からの異なる波長の蛍光をそれぞれ検出する。
【０００７】
【作用】本発明によれば、核酸試料を制限酵素で切断し
て２００〜３００塩基長の多数の断片を得て、その断片
に蛍光標識ＤＮＡオリゴマを結合して得られた標識断片
を全て同時に分離計測するので、高精度に変異を検出で
きる利点がある。また本発明は、調べる対象の核酸の塩
基配列にとらわれずあらゆる核酸試料に適用できる。
て２００〜３００塩基長の多数の断片を得て、その断片
に蛍光標識ＤＮＡオリゴマを結合して得られた標識断片
を全て同時に分離計測するので、高精度に変異を検出で
きる利点がある。また本発明は、調べる対象の核酸の塩
基配列にとらわれずあらゆる核酸試料に適用できる。
【０００８】
【実施例】以下の実施例において標識は蛍光体スルフォ
ローダミン１０１アシッドクロライド（モレキュラプロ
ーブ社，製品名テキサスレッド），テトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）を用いるが、こ
れに限るものではない。
ローダミン１０１アシッドクロライド（モレキュラプロ
ーブ社，製品名テキサスレッド），テトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）を用いるが、こ
れに限るものではない。
【０００９】〈実施例１〉本発明の試料調製プロセスを
図１に示す。まず、標準とする正常な塩基配列をもった
２本鎖の遺伝子１と、遺伝子１と同じ領域に変異をもっ
た検査すべき遺伝子２を用意する。遺伝子２は変異部３
を含む。調べる対象の核酸が１本鎖、例えばｍＲＮＡの
場合は、２本鎖のｃＤＮＡにしておく。２本鎖ｃＤＮＡ
の合成法は、クローニングとシークエンス（１９８９）
第７４頁−第８６頁に記載されており、周知の方法であ
る。調べようとする２本鎖ＤＮＡをベクタ４に挿入し、
クローニングによりそのコピー数を増やし検出に十分な
量をコピー入手する（核酸試料増幅反応）。目的ＤＮＡ
の長さがＰＣＲ増幅可能ならばＰＣＲによりコピー数を
増やしてもよい。この場合、目的ＤＮＡの少なくとも両
末端部の配列が既知であればそこに相補的なプライマを
用意してもよいし、あるいは配列が未知であっても、目
的ＤＮＡの両末端に既知配列のＤＮＡオリゴマを結合す
ることでそこに相補的なプライマを用意できる。
図１に示す。まず、標準とする正常な塩基配列をもった
２本鎖の遺伝子１と、遺伝子１と同じ領域に変異をもっ
た検査すべき遺伝子２を用意する。遺伝子２は変異部３
を含む。調べる対象の核酸が１本鎖、例えばｍＲＮＡの
場合は、２本鎖のｃＤＮＡにしておく。２本鎖ｃＤＮＡ
の合成法は、クローニングとシークエンス（１９８９）
第７４頁−第８６頁に記載されており、周知の方法であ
る。調べようとする２本鎖ＤＮＡをベクタ４に挿入し、
クローニングによりそのコピー数を増やし検出に十分な
量をコピー入手する（核酸試料増幅反応）。目的ＤＮＡ
の長さがＰＣＲ増幅可能ならばＰＣＲによりコピー数を
増やしてもよい。この場合、目的ＤＮＡの少なくとも両
末端部の配列が既知であればそこに相補的なプライマを
用意してもよいし、あるいは配列が未知であっても、目
的ＤＮＡの両末端に既知配列のＤＮＡオリゴマを結合す
ることでそこに相補的なプライマを用意できる。
【００１０】上記の方法で得た遺伝子１，２のコピー断
片５−１，５−２を２００〜３００塩基長ごとに切断す
る制限酵素を選択し、制限酵素認識部位６でコピー断片
を消化する（制限酵素切断反応）。制限酵素は前記条件
を満たすものであれば平滑末端，相補末端いずれを生ず
るものでもよいが、後のライゲーション反応の効率等を
考慮し、ここでは例えば４塩基の相補末端を生ずる制限
酵素Ｓａｕ３Ａ Ｉを選択する。Ｓａｕ３Ａ Ｉで消化
することでコピー断片５−１，５−２が変異検出に都合
のよい塩基長の断片群７−１，７−２になる。
片５−１，５−２を２００〜３００塩基長ごとに切断す
る制限酵素を選択し、制限酵素認識部位６でコピー断片
を消化する（制限酵素切断反応）。制限酵素は前記条件
を満たすものであれば平滑末端，相補末端いずれを生ず
るものでもよいが、後のライゲーション反応の効率等を
考慮し、ここでは例えば４塩基の相補末端を生ずる制限
酵素Ｓａｕ３Ａ Ｉを選択する。Ｓａｕ３Ａ Ｉで消化
することでコピー断片５−１，５−２が変異検出に都合
のよい塩基長の断片群７−１，７−２になる。
【００１１】断片群７−１，７−２の両末端に蛍光標識
リンカ１１を結合させる（蛍光標識リンカ結合反応）。
図２は蛍光標識リンカの構造を示した。蛍光標識リンカ
の構造は上記で選択した制限酵素による。Ｓａｕ３Ａ
Ｉ酵素で切断すると塩基配列が５′ＧＡＴＣ３′の相補
末端を生ずるので、この配列に相補な3′CTAG5′配列を
５′末端にもつ１本鎖ＤＮＡオリゴマ８と、ＤＮＡオリ
ゴマ８のＣＴＡＧ配列以外の配列部分に相補な配列をも
つ１本鎖ＤＮＡオリゴマの５′末端をアミノ化し蛍光体
テキサスレッド９を付着したＤＮＡオリゴマ１０をアニ
ールすることで制限酵素Ｓａｕ３Ａ Ｉ用の標識リンカ
１１が得られる。断片群７−１，７−２と標識リンカ１
１を酵素反応でライゲーションする。以上の操作で標識
２本鎖断片群１２−１，１２−２が調製される。
リンカ１１を結合させる（蛍光標識リンカ結合反応）。
図２は蛍光標識リンカの構造を示した。蛍光標識リンカ
の構造は上記で選択した制限酵素による。Ｓａｕ３Ａ
Ｉ酵素で切断すると塩基配列が５′ＧＡＴＣ３′の相補
末端を生ずるので、この配列に相補な3′CTAG5′配列を
５′末端にもつ１本鎖ＤＮＡオリゴマ８と、ＤＮＡオリ
ゴマ８のＣＴＡＧ配列以外の配列部分に相補な配列をも
つ１本鎖ＤＮＡオリゴマの５′末端をアミノ化し蛍光体
テキサスレッド９を付着したＤＮＡオリゴマ１０をアニ
ールすることで制限酵素Ｓａｕ３Ａ Ｉ用の標識リンカ
１１が得られる。断片群７−１，７−２と標識リンカ１
１を酵素反応でライゲーションする。以上の操作で標識
２本鎖断片群１２−１，１２−２が調製される。
【００１２】調製によって得られた標識２本鎖断片群１
２−１，１２−２をそれぞれ熱変性で１本鎖にし、４−
６％ポリアクリルアミドゲルで温度制御しながら電気泳
動分離する。断片群１２−１，１２−２はそれぞれ別個
の電気泳動路にて電気泳動分離し、断片群の検出は光学
的に行う。泳動始点から３０cm内外の所をレーザで照射
し、そこを通過していくＤＮＡ断片の発する蛍光を受光
し、ＤＮＡ断片の通過時間から移動度の違いを検出す
る。
２−１，１２−２をそれぞれ熱変性で１本鎖にし、４−
６％ポリアクリルアミドゲルで温度制御しながら電気泳
動分離する。断片群１２−１，１２−２はそれぞれ別個
の電気泳動路にて電気泳動分離し、断片群の検出は光学
的に行う。泳動始点から３０cm内外の所をレーザで照射
し、そこを通過していくＤＮＡ断片の発する蛍光を受光
し、ＤＮＡ断片の通過時間から移動度の違いを検出す
る。
【００１３】図３は上記検出結果を示す。遺伝子１由来
のＤＮＡ断片試料の電気泳動パターン１５と、遺伝子２
由来のＤＮＡ断片試料の電気泳動パターン１６の違いが
認められる。ピーク１３と１４は断片１２−１−ａ，１
２−１−ｂの信号であり、ピーク１３′と１４′は遺伝
子２上の変異部３を含む断片１２−２−ａ，１２−２−
ｂの信号であり、遺伝子２は変異があることがわかる。
のＤＮＡ断片試料の電気泳動パターン１５と、遺伝子２
由来のＤＮＡ断片試料の電気泳動パターン１６の違いが
認められる。ピーク１３と１４は断片１２−１−ａ，１
２−１−ｂの信号であり、ピーク１３′と１４′は遺伝
子２上の変異部３を含む断片１２−２−ａ，１２−２−
ｂの信号であり、遺伝子２は変異があることがわかる。
【００１４】〈実施例２〉蛍光体テトラメチルローダミ
ンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）を実施例１のテキ
サスレッド標識リンカと同様に付着する。
ンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）を実施例１のテキ
サスレッド標識リンカと同様に付着する。
【００１５】実施例１と同様に遺伝子１，２のコピーを
作り、制限酵素で切断し、断片群７−１，７−２を得
る。ここで、遺伝子１由来の断片群７−１にはテキサス
レッド標識リンカを、遺伝子２由来の断片群７−２には
ＴＲＩＴＣ標識リンカをそれぞれライゲーションする。
これにより、標識蛍光体の違う２本鎖断片群１２−１と
１２−２が得られる。この２本鎖断片群１２−１と１２
−２を混合して熱変性で１本鎖にし、一つの電気泳動路
で泳動する。テキサスレッドとＴＲＩＴＣは発光波長が
違うのでレーザで照射して発する蛍光の波長を選別する
ことで蛍光を区別して受光できる。
作り、制限酵素で切断し、断片群７−１，７−２を得
る。ここで、遺伝子１由来の断片群７−１にはテキサス
レッド標識リンカを、遺伝子２由来の断片群７−２には
ＴＲＩＴＣ標識リンカをそれぞれライゲーションする。
これにより、標識蛍光体の違う２本鎖断片群１２−１と
１２−２が得られる。この２本鎖断片群１２−１と１２
−２を混合して熱変性で１本鎖にし、一つの電気泳動路
で泳動する。テキサスレッドとＴＲＩＴＣは発光波長が
違うのでレーザで照射して発する蛍光の波長を選別する
ことで蛍光を区別して受光できる。
【００１６】図４はこのようにして得た電気泳動パター
ンを示す。テキサスレッドからの蛍光を検出して得た電
気泳動パターン１７と、ＴＲＩＴＣからの蛍光を検出し
て得た電気泳動パターン１８の違いが認められる。遺伝
子１由来のＤＮＡ断片試料の電気泳動パターン１７と、
遺伝子２由来のＤＮＡ断片試料の電気泳動パターン１８
の違いが認められる。実施例１と同様に、ピーク１３と
１４は断片１２−１−ａ，１２−１−ｂの信号であり、
ピーク１３′と１４′は遺伝子２上の変異部３を含む断
片１２−２−ａ，１２−２−ｂの信号であり、遺伝子２
は変異があることがわかる。遺伝子１，２が数十キロ塩
基長と長い場合などは２本鎖断片の数が増えるため、得
られるスペクトルが複雑になるが、一つの泳動路で泳動
すると変異のない断片部分のピークは重なって出て来る
ので比較が容易に行え、精度よく変異を検出することが
できる。
ンを示す。テキサスレッドからの蛍光を検出して得た電
気泳動パターン１７と、ＴＲＩＴＣからの蛍光を検出し
て得た電気泳動パターン１８の違いが認められる。遺伝
子１由来のＤＮＡ断片試料の電気泳動パターン１７と、
遺伝子２由来のＤＮＡ断片試料の電気泳動パターン１８
の違いが認められる。実施例１と同様に、ピーク１３と
１４は断片１２−１−ａ，１２−１−ｂの信号であり、
ピーク１３′と１４′は遺伝子２上の変異部３を含む断
片１２−２−ａ，１２−２−ｂの信号であり、遺伝子２
は変異があることがわかる。遺伝子１，２が数十キロ塩
基長と長い場合などは２本鎖断片の数が増えるため、得
られるスペクトルが複雑になるが、一つの泳動路で泳動
すると変異のない断片部分のピークは重なって出て来る
ので比較が容易に行え、精度よく変異を検出することが
できる。
【００１７】
【発明の効果】本発明によれば、調べようとする核酸の
長さが１キロ塩基以上で通常のSSCPでは変異検出が困難
な場合でも、それらを断片化して得た断片のＳＳＣＰを
同時に測定することにより１塩基の変異でも高精度に検
出することができる。
長さが１キロ塩基以上で通常のSSCPでは変異検出が困難
な場合でも、それらを断片化して得た断片のＳＳＣＰを
同時に測定することにより１塩基の変異でも高精度に検
出することができる。
【図１】本発明の試料調製プロセスを示す説明図。
【図２】蛍光標識リンカの構造を示す説明図。
【図３】本発明の実施例１によるＤＮＡ断片群の電気泳
動結果のパターンを示す説明図。
動結果のパターンを示す説明図。
【図４】本発明の実施例２によるＤＮＡ断片群の電気泳
動結果のパターンを示す説明図。
動結果のパターンを示す説明図。
１…正常な配列の遺伝子、２…変異のある遺伝子、３…
変異部、４…ベクタＤＮＡ、５−１…遺伝子１を増幅し
てできたコピー、５−２…遺伝子２を増幅してできたコ
ピー、６…制限酵素認識部位、７−１…コピー５−１を
制限酵素で切断してできた断片群、７−２…コピー５−
２を制限酵素で切断してできた断片群、１１…蛍光標識
リンカ、１２−１，１２−２…両末端が蛍光標識された
ＤＮＡ断片群、１２−１−ａ，１２−１−ｂ…正常な配
列の遺伝子由来のＤＮＡ断片、１２−２−ａ，１２−２
−ｂ…変異部のある遺伝子由来のＤＮＡ断片。
変異部、４…ベクタＤＮＡ、５−１…遺伝子１を増幅し
てできたコピー、５−２…遺伝子２を増幅してできたコ
ピー、６…制限酵素認識部位、７−１…コピー５−１を
制限酵素で切断してできた断片群、７−２…コピー５−
２を制限酵素で切断してできた断片群、１１…蛍光標識
リンカ、１２−１，１２−２…両末端が蛍光標識された
ＤＮＡ断片群、１２−１−ａ，１２−１−ｂ…正常な配
列の遺伝子由来のＤＮＡ断片、１２−２−ａ，１２−２
−ｂ…変異部のある遺伝子由来のＤＮＡ断片。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｚ (72)発明者 川本 和子 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社 日立製作所 中央研究所内 (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社 日立製作所 中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 G01N 27/447 G01N 33/58 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】核酸試料を制限酵素で切断して得られる核
酸断片の切断部位に，第１の標識物で標識された既知の
塩基配列を持つ２本鎖ＤＮＡオリゴマが結合された第１
の核酸断片群と，前記核酸試料と比較するための標準と
する塩基配列を持つ標準核酸試料を前記制限酵素で切断
して得られる核酸断片の切断部位に，第２の標識物で標
識された前記２本鎖ＤＮＡオリゴマが結合された第２の
核酸断片群とを調製し，前記第１及び第２の核酸断片群
の核酸断片を１本鎖にし電気泳動して得られる前記第１
及び第２の核酸断片群の電気泳動パターンの比較によ
り，前記核酸試料の塩基配列の変異の有無を検出するこ
とを特徴とする核酸塩基配列の変異検出方法。 - 【請求項２】請求項１に記載の核酸塩基配列の変異検出
方法に於いて，前記核酸試料の塩基長が１キロ塩基長以
上であることを特徴とする核酸塩基配列の変異検出方
法。 - 【請求項３】請求項１に記載の核酸塩基配列の変異検出
方法に於いて，前記第１及び第２の標識物が蛍光体であ
ることを特徴とする核酸塩基配列の変異検出方法。 - 【請求項４】請求項１に記載の核酸塩基配列の変異検出
方法に於いて，前記第１及び第２の標識物が，発光波長
の異なる蛍光体であり，前記第１及び第２の核酸断片群
の核酸断片を混合し１本鎖にした後に同一の電気泳動路
で電気泳動することを特徴とする核酸塩基配列の変異検
出方法。 - 【請求項５】請求項１に記載の核酸塩基配列の変異検出
方法に於いて，前記第１及び第２の標識物が，同一種類
の蛍光体であり，前記第１及び第２の核酸断片群の核酸
断片を１本鎖にした後に異なる電気泳動路で電気泳動す
ることを特徴とする核酸塩基配列の変異検出方法。 - 【請求項６】 塩基長が１キロ塩基長以上である２本鎖核
酸試料を制限酵素で切断して得られ る２本鎖核酸断片の
切断部位に，第１の蛍光体で片側の鎖が標識された既知
の塩基配列を持つ２本鎖ＤＮＡオリゴマが結合された第
１の核酸断片群と，前記２本鎖核酸試料と比較するため
の標準とする塩基配列を持つ標準２本鎖核酸試料を前記
制限酵素で切断して得られる２本鎖核酸断片の切断部位
に，前記第１の蛍光体と異なる種類の第２の蛍光体で片
側の鎖が標識された前記２本鎖ＤＮＡオリゴマが結合さ
れた第２の核酸断片群とを調製し，前記第１及び第２の
核酸断片群の２本鎖核酸断片を混合して１本鎖核酸断片
にし同一の電気泳動路で電気泳動して得られる前記第１
及び第２の核酸断片群の電気泳動パターンの比較によ
り，前記核酸試料の塩基配列の変異の有無を検出するこ
とを特徴とする核酸塩基配列の変異検出方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP33577892A JP3289347B2 (ja) | 1992-12-16 | 1992-12-16 | 核酸塩基配列の変異検出方法 |
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| JP33577892A JP3289347B2 (ja) | 1992-12-16 | 1992-12-16 | 核酸塩基配列の変異検出方法 |
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| JPH06189796A JPH06189796A (ja) | 1994-07-12 |
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| JP (1) | JP3289347B2 (ja) |
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1992
- 1992-12-16 JP JP33577892A patent/JP3289347B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH06189796A (ja) | 1994-07-12 |
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