JP3608312B2 - 試料調製方法及びこれに用いる試薬キット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素によるＤＮＡ相補鎖合成を利用したＤＮＡ分析方法、ＤＮＡ塩基配列決定方法に用いられるＤＮＡ試料の調製方法及びこれに用いる試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム解析を中心にＤＮＡ塩基配列決定の高効率化のニーズが高まっている。放射性同位元素を用いてＤＮＡ断片を標識し、ゲル電気泳動によりＤＮＡの長さを計測して、人手によって行なう従来の塩基配列決定法に代わり、ＤＮＡを蛍光体で標識し、ゲル電気泳動しながら光を当てて自動的にＤＮＡ断片を光学検出する装置（ＤＮＡシーケンサー）が普及してきている。この装置は、目的とするＤＮＡにプライマーと呼ばれるＤＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせ、酵素を用いた相補鎖合成で塩基配列決定に用いる種々の長さのＤＮＡ断片を作製し、ゲル電気泳動でＤＮＡ断片の長さを調べて塩基配列決定するものでサンガー法あるいはダイデオキシ法と呼ばれている。ここで一度に塩基配列決定できる長さは、ゲルによる長さ分離能で決められており、４００〜７００塩基長である。これより長い数Ｋ塩基から数十Ｋ塩基のＤＮＡ塩基配列決定は手間と時間のかかる作業である。
【０００３】
従来、長いＤＮＡ（数Ｋ〜数十Ｋ塩基）の塩基配列決定にはショットガン法が用いられてきた。ショットガン法では試料ＤＮＡを超音波などを用いてランダムに切断し、ＤＮＡ断片をクローニングして大腸菌等に埋め込み、コロニー培養した後、各コロニー中の大腸菌を培養してＤＮＡのコピーを増やす。次いで試料ＤＮＡを抽出して解析する。この方法では、取り出したコロニーに含まれるＤＮＡには断片化した試料ＤＮＡが含まれるが、ＤＮＡ断片が試料ＤＮＡのどの部分であるのか、塩基配列決定するまで分からないため、決定しようとするＤＮＡ鎖長の１０〜２０倍ものＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を取り解析しなくてはならない。このため、時間と手間が大いにかかり大きな障害となっている。
【０００４】
一方、塩基配列決定しようとするＤＮＡ断片を端から順に決めていく方法（プライマーウォーキング；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６、６９１７−６９２１（１９８９））も提案されている。この方法では、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したら、その中から次のプライマー領域を選びダイデオキシ法により塩基配列を再び決定する。このため無駄が少なく効率の良い塩基配列決定ができるが、時系列的に塩基配列を決めていくので時間がかかる点と、解析の都度プライマーを用意する手間がかかる点に欠点がある。
【０００５】
従来技術ではないが、上記欠点を克服する方法（フラグメントウォーキング法）が発明者により提案されている（特願平７−２３８１４１号）。このフラグメントウォーキング法では、塩基配列決定しようとする試料ＤＮＡを４塩基認識酵素などの制限酵素で完全に切断し、重複のない断片群を作製する。生成したＤＮＡ断片では制限酵素が認識して切断する部分の塩基配列を除くと塩基配列は未知である。こられＤＮＡ断片は既知の塩基配列を持ったプライマーがハイブリダイズし相補鎖合成の起点となるプライミングサイトを特に持ってない。そこで生成したＤＮＡ断片の３’末端側に既知の塩基配列のオリゴマーを結合してプライミングサイトとする。プライマーをＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ相補鎖合成でＤＮＡ伸長鎖を作る時、プライマーの３’末端の２塩基（選別配列と呼ぶ）がＤＮＡ断片と完全に相補的でピッタリとハイブリダイズしている時には反応が進行するが、そうでない時には反応が遅いか全く進まないことが知られている。そこで蛍光標識プライマーの３’末端（相補鎖伸長側）に任意の２塩基（１６通りの塩基配列がある）をつけておき、ＤＮＡ断片の中から蛍光標識プライマーと完全に相補な配列を持つ特定の断片を選び相補鎖合成したり、塩基配列決定できる（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １、２３１−２３７（１９９４））。
【０００６】
ＤＮＡ断片群中に含まれるＤＮＡ断片の種類が少なく、１種のプライマーと完全に相補的なＤＮＡ断片が１個の時には各断片の塩基配列を上記プライマーを用いて、それぞれ決定できる。１種のプライマーが２つ以上のＤＮＡ断片とハイブリダイズする場合には、予め長さ分離するなどしてから上述の操作を行なう。このようにして、フラグメントウォーキング法では、混合状態にあるＤＮＡ断片の塩基配列を、１６種のプライマーを用いてクローニングなどせずに、重複なく簡単に並列して決定できる。ＤＮＡ断片相互のつながりを決定し、試料ＤＮＡ全体の塩基配列を決めるには次の様に行なう。前述した１６種の蛍光標識プライマーは末端にプライミングサイトを持つ断片ＤＮＡにだけハイブリダイズし、元の切断されていない試料ＤＮＡにはハイブリダイズしない。しかし、断片ＤＮＡにハイブリダイズした上記プライマーを相補鎖伸長すると、伸長した部分は元の試料ＤＮＡと相補的であり、元の試料ＤＮＡにハイブリダイズする。そこで、上記プライマーを用いて各ＤＮＡ断片の塩基配列決定用の相補鎖合成反応を行なう時、反応温度を昇降するサイクルシーケンス条件下で行ない、反応液中に未切断の試料ＤＮＡを加えると、ＤＮＡ断片の塩基配列に加えて、切断部に続く元の試料ＤＮＡの塩基配列をも決定できる。この方法では異なる１６種のプライマーを用いて各ＤＮＡ断片とそれに続く塩基配列を並列して決定でき非常に効率が良い。この方法は、ＤＮＡ断片から次のＤＮＡ断片へ塩基配列をつなげて歩いて行くのに似ているのでフラグメントウォーキング法と呼んでいる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
フラグメントウォーキング法は非常に効率の良い方法であるが、プライマーとして、３’末端の２塩基すべての組み合わせの１６種のプライマーを用意する必要がある。蛍光式ＤＮＡシーケンサーには、現在、１色方式（ＤＮＡ断片の末端塩基種を１種の蛍光体で識別し、末端塩基種が異なるＤＮＡ断片を異なる泳動路で泳動させる）、及び４色方式（ＤＮＡ断片の末端塩基種に対応して４種の蛍光体で識別し、ＤＮＡ断片を同一の泳動路で泳動させる）があるが、高スループットを達成するには４色方式が都合が良い。しかし、上記のフラグメントウォーキング法を４色方式に適用しようとすると、１６×４＝６４もの蛍光標識プライマーを最低でも用意する必要があり、フラグメントウォーキング法の実用面での課題の１つとなっている。
【０００８】
本発明の目的は、この課題を解決し、市販のユニバーサルプライマーあるいは手持ちの少数のプライマーを用いて、フラグメントウォーキング法を容易に実行するための、ＤＮＡ分析方法、ＤＮＡ塩基配列決定方法に用いられるＤＮＡ試料の調製方法、及びこれに用いる試薬キットを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明では、３’末端に２塩基からなる選別配列を持つプライマーにアンカーをつけたアンカー付の選別プライマー（以下、簡単のためにアンカープライマーと呼ぶ）を用いて、鋳型となるＤＮＡ断片のコピー数をＰＣＲで増やす。アンカー部分の相補鎖がＤＮＡ断片の末端に導入されるが、アンカー部分に蛍光標識プライマーをハイブリダイズさせ塩基配列決定反応を行なう。アンカープライマー（合計１６種）は蛍光標識されている必要はなく、塩基配列決定用に使用する蛍光標識プライマーには、通常のシーケンシングに用いている４種の蛍光体でそれぞれ標識されたユニバーサルプライマーを用いる。
【００１０】
１６種のアンカープライマーは、混合ＤＮＡ断片の中の特定のＤＮＡ断片にハイブリダイズして相補鎖伸長し、特定のＤＮＡ断片のコピー数を増やすのに用いられる。この結果、ＤＮＡ断片の混合物の中から、アンカープライマーが完全にハイブリダイズするＤＮＡ断片だけを増やし、特定のＤＮＡ断片を実質的に抜き出すことができる。抜き出されたＤＮＡ断片には、蛍光標識プライマーがハイブリダイズする部分が導入されており、シーケンシング反応を行なうことができるようになっている。即ち、通常のポリメラーゼ反応のプライマーとなり得る塩基配列をもつユニバーサルな蛍光標識プライマーを用い、蛍光標識プライマーの種類を増やすことなくフラグメントウォーキング法を容易に実行できる。
【００１１】
このような蛍光標識プライマーの例としては、Ｍ１３系ベクターに用いる、塩基配列（配列番号１）
５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
をもつプライマー、Ｔ７系ベクターに用いる、塩基配列（配列番号２）
５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’
をもつプライマー等の、一般にユニバーサルプライマーと呼ばれるプライマーの他に、任意の配列をもつ蛍光標識プライマーが利用できる。もちろん、蛍光標識として周知の蛍光体が利用できる。
【００１２】
本発明の構成の特徴を以下に詳細に説明すると、本発明の構成（ａ）では、
（１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記制限酵素により認識される配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる選択配列とを有し、５’末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列を有するアンカープライマーを用いて相補鎖合成しＤＮＡ鎖を得る工程と、
（４）少なくとも上記アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしないプライマーを用いて、工程（３）で得た上記ＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行なう工程とを有する試料調製方法に特徴がある。
【００１３】
本発明の構成（ｂ）では、
（１）試料ＤＮＡを切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成す工程と、
（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチドと実質的に相補な塩基配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる上記ＤＮＡ断片を選別するための配列とを有し、５’末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列を有するアンカープライマーと、上記アンカー配列と実質的に同じ塩基配列を有し、単独では上記ＤＮＡ断片に安定にハイブリダイズしないプライマーを用いて、上記ＤＮＡ断片をその末端塩基配列毎に区分けしてＰＣＲ増幅する工程とを有する試料調製方法に特徴がある。
【００１４】
本発明の構成（ｃ）では、
（１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる選択配列とを有し、５’末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換され、上記制限酵素で切断できない塩基配列部分を有するアンカープライマーと、上記制限酵素で切断を受ける塩基配列を有するプライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
（４）増幅された上記特定のＤＮＡ断片の片方の末端を切断したＤＮＡ鎖を得る工程と、
（５）少なくとも上記アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない蛍光標識プライマーを用いて、工程（４）で得た上記ＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない相補鎖合成ＤＮＡ断片を得る工程と、（６）上記蛍光標識プライマーと上記相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用い、工程（４）で得た上記ＤＮＡ鎖、上記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、上記ＤＮＡ鎖の塩基配列と上記ＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の上記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する塩基配列方法に特徴があり、上記蛍光標識プライマーは、少なくとも上記アンカー配列と実質同じ配列を持つことにも特徴がある。
【００１５】
本発明の構成（ｄ）では、
（１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、
（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知であり、第２の制限酵素による認識部配列をもつオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記第１の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第１の選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第１のアンカー配列を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換され、上記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープライマーと、上記オリゴヌクレオチド、及び上記第１の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第２の選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第２のアンカー配列を有し、上記オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、上記第２の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
（４）増幅された上記特定のＤＮＡ断片の第１の末端を上記第２の制限酵素により切断して第１のＤＮＡ鎖を、増幅された上記特定のＤＮＡ断片の第２の末端を上記第１の制限酵素により切断して第２のＤＮＡ鎖をそれぞれ得る工程と、
（５）少なくとも上記第１のアンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない第１の蛍光標識プライマーと、少なくとも上記第２のアンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない第２の蛍光標識プライマーとを用いて、工程（４）で得た上記第１、第２のＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片を得る工程と、
（６）上記第１、第２の蛍光標識プライマーと上記第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用い、工程（４）で得た上記第１、第２のＤＮＡ鎖、上記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、上記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列と、上記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の上記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する塩基配列方法に特徴があり、上記第１の蛍光標識プライマーは、少なくとも上記第１のアンカー配列と実質同じ配列を、上記第２の蛍光標識プライマーは、少なくとも上記第２のアンカー配列と実質同じ配列を、それぞれ持つことにも特徴がある。
【００１６】
本発明の構成（ｅ）では、ライゲーション用オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列と、制限酵素が認識する認識部配列と、ユニバーサルプライマーと同じ配列とを有し、３’末端側に１塩基〜４塩基からなる選択配列を有し、ＤＡＮ断片の末端の塩基配列を選択を可能とする複数のアンカープライマーからなる試薬キットに特徴があり、上記アンカープライマーは、上記ＤＡＮ断片の末端の２塩基の配列を選択する選択配列が、２塩基からなるすべての組み合わせの塩基配列を含むことにも特徴がある。
【００１７】
本発明の構成（ｆ）では、少なくともライゲーション用オリゴヌクレオチド、相補鎖合成用プライマーからなる試薬キットにおいて、上記相補鎖合成用プライマーが、上記オリゴヌクレオチドと実質的に相補な配列、制限酵素が認識する認識部配列と、この認識部配列の３’末端側に２塩基からなる選択配列とを有する１６種のプライマーからなる第１のプライマーセットと、この第１のプライマーセットの各プライマーの５’末端側にアンカー配列を付加し、上記各プライマーの上記認識部配列の一部の塩基を置換した１６種のプライマーからなる第２のプライマーを含む試薬キットに特徴がある。
【００１８】
本発明の構成（ｇ）では、少なくともライゲーション用オリゴヌクレオチド、相補鎖合成用プライマーからなる試薬キットにおいて、上記相補鎖合成用プライマーが、上記オリゴヌクレオチド、及び第１の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第１の選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第１のアンカー配列を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換され、上記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープライマーセットと、上記オリゴヌクレオチド、及び上記第１の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第２の選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第２のアンカー配列を有し、上記オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、上記第２の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーセットを含む試薬キットに特徴があり、上記第１、第２の選択配列の塩基が２塩基からなり、２塩基からなるすべての組み合わせの塩基配列を含むことにも特徴がある。
【００１９】
本発明の構成（ｈ）では、構成（ａ）、（ｂ）の試料調製方法により調製された試料を分析する分析方法に特徴がある。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、図を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２１】
（第１の実施例）
図１は、本発明の試料調製法を用いるＤＮＡ解析プロセスを説明する図である。解析しようとする試料ＤＮＡ３０１（数Ｋｂ〜１０Ｋｂの長を持つ）を含む溶液３０２を２分割して、それぞれ第１のチューブ３０２−１、第２のチューブ３０２−２に分取する。第１のチューブ３０２−１に含まれる試料ＤＮＡを制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩで切断し、ＤＮＡ断片群３０３を得る。Ｎｌａ ＩＩＩは塩基配列−ＣＡＴＧ−を認識し、３’末端に−ＣＡＴＧ（３’）の塩基配列を持つＤＮＡ断片を生成する。使用する制限酵素は、Ｓａｕ ３Ａｌ、Ｈｈａ Ｉ、Ｍａｅ Ｉの他何でも良いが、切断部位が頻度高く現われる４塩基認識酵素が良い。ＤＮＡ断片群３０３を含む液３２０にＤＮＡオリゴマー３０４を添加して、制限酵素による切断部の少なくとも３’末端に既知の塩基配列を持つＤＮＡオリゴマー３０４を結合する。ＤＮＡオリゴマー３０４を結合する方法には、ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによるポリＡ鎖の付加とライゲーションを用いた方法があるが、ここではライゲーションを用いた例で説明する。ライゲーション反応生成物を含む液３２１は、２分割してチューブ３２２、３２３に分取しておく。
【００２２】
図２は、ＤＮＡオリゴマー３０４をライゲーション結合したＤＮＡ断片を示す図である。図２において、Ｎ、及びｎは塩基配列を決定しようとするＤＮＡ断片を構成するヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかである）であり、Ｎｌａ ＩＩＩにより認識される認識配列３０５は５’−ＣＡＴＧ−３’である。ＤＮＡオリゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖の３’末端側は相補鎖合成しないようにｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅで置換するなどして相補鎖がこれ以上伸びないようにする。もちろん、ＤＮＡオリゴマーの段階で３’−ＯＨをアミノ基やビオチン等の残基で修飾し、３’伸長を妨げる型としておいて良い。ＤＮＡオリゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖の３’末端側は相補鎖合成しないようにするのは、使用するアンカープライマーによる相補鎖合成でアンカープライマーの３’末端（ＤＮＡ断片の選別を行なうための塩基配列を持つ部分）がＤＮＡ断片と完全に相補的でない場合には、アンカー部分と相補的な鎖ができないようにするためである。アンカープライマーの３’末端がＤＮＡ断片と完全にマッチした鎖では、反対側の末端（合成鎖の３’末端）にアンカープライマーの一部がハイブリダイズし、更に、伸長してアンカー部分と相補的な塩基配列を３’末端側に持つＤＮＡ断片が合成される。
【００２３】
図３（ａ）は、ＤＮＡオリゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするアンカープライマーセット（アンカープライマーセット▲１▼）の概念図、図３（ｂ）は、ＤＮＡオリゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするプライマーセット▲２▼の概念図である。ＤＮＡ断片に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４に相補的な部分３１５と、その５’末端側にアンカー配列３１１とを持ち、３’末端側のＸＸで示す２塩基（１〜４塩基で良い）からなる選別配列３１２を持つ１６種（１〜４塩基に対応して４〜２５６種）のアンカープライマーセット３０６を用意する。選別配列３１２は特定のＤＮＡ断片をＤＮＡ断片の混合物の中から選択するための塩基配列である。このアンカープライマーセット３０６のアンカー部分３１１あるいはアンカー部分３１１を含む部分の塩基配列は実質ユニバーサル配列としておく。この時、図３（ａ）の３１３に示す様に、アンカープライマーセット３０６の３’末端から６塩基目の塩基（制限酵素の認識配列内の１つ、ここではＣである）を、別の塩基、例えばＴに変えたアンカープライマー（アンカープライマーセット▲１▼）１６種と、変化させずＣのままのプライマーセット３０７（プライマーセット▲２▼）とを用意する。この例では、図３（ｂ）に示す様に、プライマーセット▲２▼にはアンカーをつける必要はないが、後のチェックに都合のよいように、Ｔｅｘａｓ
ＲｅｄあるいはＦＩＴＣで蛍光標識３１４をつけておく。
【００２４】
１種の蛍光体で蛍光標識されたプライマーセット▲２▼とＤＮＡ断片混合物とを用いてプライマーの伸長反応を行なう。即ち、図１に示す様に、ライゲーション反応生成物を含む液を含むチューブ３２２から、液を１６本のチューブ３２２−１、３２２−２、…、３２２−１６に分注し、ぞれぞれ異なるプライマーを入れて相補鎖合成をする。即ち、各チューブにはそれぞれ異なった選別配列３１２を有するプライマーが加えられる。相補鎖合成の産物はゲル電気泳動される。図４は、相補鎖合成の産物のゲル電気泳動スペクトルの例である。電気泳動パターンには、選別配列３１２を有するプライマーと、ＤＮＡ鎖（２本鎖）のうちの＋鎖、及び−鎖のそれぞれとから相補鎖合成された産物が、泳動開始点から等距離Ｌに対を成して出現する。プライマーの３’末端の２塩基が完全にＤＮＡ断片とマッチする時には相補鎖合成がおこり、そのＤＮＡ断片と同じ長さの蛍光標識ＤＮＡ断片が生成する。そこで図４のスペクトルを得ることでＤＮＡ断片群中にいかなる長さの断片があり、その末端の塩基配列は何であるかがわかる。図５は、検出されたＤＮＡ断片の構造例を示す図である。例えば、選別配列（プライマー選択配列）ＡＧを持つプライマー、及び選別配列（プライマー選択配列）ＴＣを持つプライマーで得たｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍには、ＤＮＡ鎖長約４００塩基のＤＮＡ断片が現われる。
【００２５】
これらから、元の試料ＤＮＡを制限酵素により切断した２本鎖ＤＮＡ断片の中には、長さが約４００ｂｐであり、それぞれの鎖の３’末端側の塩基配列がそれぞれ３’□ＧＴＡＣＴＣ…５’、及び３’□ＧＴＡＣＡＧ…５’であるＤＮＡ断片が含まれることがわかる。ここで「□」はライゲーションでＤＮＡ断片中に導入したオリゴマーの塩基配列であり、「…」はＤＮＡ断片に固有の塩基配列である。制限酵素認識部の塩基配列３’ＧＴＡＣ５’に続く５’末端側の塩基配列は、それぞれＡＧ、及びＴＣに相補的な塩基配列となる。即ち、図５に示したＤＮＡ断片がＤＮＡ断片混合物中にあることがわかる。このＤＮＡ断片だけを取り出すには末端塩基配列がＡＧ、及びＴＣをそれぞれ持つアンカープライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行ない、そのＤＮＡ断片のコピー数を他より数桁大きくすればよい。
【００２６】
このようにして得たＤＮＡ断片の塩基配列、及びそれらに連なる元の試料ＤＮＡの塩基配列を、４種の蛍光体でそれぞれ標識されたプライマーを用いて決定する。既存の４種の蛍光標識プライマーを用いてシーケンシングをするために、ＰＣＲ用のプライマーとして５’末端側にアンカーの入ったアンカープライマーセット３０６▲１▼を用いる。即ち、このアンカープライマーは、図３（ａ）にす様に既存のプライマーと共通なアンカー配列３１１、ライゲーションでＤＮＡ断片の３’末端側に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４と実質相補であり、アンカープライマーセット３０６に共通する共通プライマー配列３１５、制限酵素が認識する塩基配列の１部あるいは全部と共通な塩基配列、及び３’末端側に２塩基からなる選別配列３１２を持つプライマーである。アンカー配列３１１と共通プライマー配列３１５は、一部が共通でも良いが、共通部分の長さは８マー以下であり、４種の蛍光体でそれぞれ標識された既存のプライマー単独では、ＤＮＡ断片に導入したＤＮＡオリゴマー３０４の塩基配列に安定にハイブリダイズし相補鎖合成を行なうことはできないことが必要である。共通プライマー配列３１５はＤＮＡオリゴマー３０４と実質相補な塩基配列を持つ。また、アンカー部分３１１の塩基配列は１０マー以上、望ましくは１５マー以上が安定なハイブリダイズを得る上で必要である。
【００２７】
ここでプライマー配列に工夫をする。即ち、これらアンカープライマー▲１▼は、ＤＮＡ断片に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４と相補な塩基配列と、３’末端に２塩基の選択配列（ＸＸ）３１２を持つが、制限酵素が認識する塩基配列−ＣＡＴＧ−の５’末端側の１塩基の種類を変化させておく。図３（ａ）の例では、塩基配列−ＣＡＴＧ−のうちＣをＴに変化させてあり（Ｔの代わりにＡ、Ｇとしてもよい）、このアンカープライマーは、３’末端から６塩基目の塩基Ｔ３１３がミスマッチを起こすが、ＤＮＡ断片の末端に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４に安定にハイブリダイズし、相補鎖を形成する。この結果、形成されたＤＮＡ鎖は本実施例で用いた制限酵素で切断できない型となる。なお、塩基配列−ＣＡＴＧ−のうちＡを、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかに変化させても、このアンカープライマーは、３’末端から５塩基目の塩基がミスマッチを起こすが、ＤＮＡ断片の末端に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４に安定にハイブリダイズし、相補鎖を形成する。この結果同様に、形成されたＤＮＡ鎖は本実施例で用いた制限酵素で切断できない型となる。また、１６種のプライマー（プライマーセット▲２▼）を用意する。これらプライマーは図３（ｂ）に示すように、アンカー配列を持たないが、選択配列（ＸＸ）３１２を持ったプライマーであり、３’末端から２塩基目から６塩基目の塩基配列は塩基配列−ＣＡＴＧ−に相補であり、５’末端の蛍光標識３１４をつけてもよく、つけなくてもよい。
【００２８】
図４の結果を用いて、１３０塩基より長いＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するのに必要なＰＣＲ用選別プライマーを決定する。図１に示すように、チューブ３２３に分取された液を、ＰＣＲの組み合わせの数（ｋ）（電気泳動パターンにおいて、相補鎖合成された産物が、泳動開始点から等距離に出現する対の数以下であり、決定されたＰＣＲ用選別プライマーの種類の数に等しい）の容器３２３−１、３２３−２、…、３２３−ｋに分割し、容器にそれぞれ異なるＰＣＲ用選別プライマーを添加して、選別プライマーを用いたＰＣＲ増幅を行なう。このＰＣＲ増幅には、アンカープライマーセット▲１▼、及びプライマーセット▲２▼のプライマーの組合せを用いる。ここで１３０塩基（通常１５０塩基）以下のＤＮＡ断片は解析しなくても、次に述べるように各ＤＮＡ断片の接続操作で全体塩基配列を決定できるのでＰＣＲ増幅は行なわない。
【００２９】
ＰＣＲ増幅で得たＤＮＡ断片を透析などで精製し、塩基配列決定用の鋳型とする。図６は、アンカープライマー▲１▼を用いた相補鎖合成（ＰＣＲ増幅）により得られる産物の一例を示す図である。図６において、３０４’の部分はＤＮＡオリゴマー３０４の伸長部分である。ここで得たＤＮＡ断片は、アンカープライマーセット３０６（アンカープライマーセット▲１▼）のアンカープライマー、及びプライマーセット３０７（プライマーセット▲２▼）のプライマーをそれぞれ末端に持つＤＮＡ断片である。プライマーセット３０７のプライマーが結合した部分３０５の−ＣＡＴＧ−は先に用いた制限酵素を用いると、切断部位４００で切断されるが、アンカープライマーセット３０６のアンカープライマーの結合した側の部分３５１の−ＣＡＴＡ−は−ＣＡＴＧ−と異なるため先に用いた制限酵素により切断されない。
【００３０】
この結果、先の制限酵素でＰＣＲ増幅産物を切断後１本鎖として、アンカー配列３１１と同じ塩基配列を持つ蛍光標識プライマー３３０（＊は蛍光標識を示す）を用いて相補合成すると、３’末端側に元の試料ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持ち、元の試料ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして更に相補鎖伸長可能なＤＮＡ断片（相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０２）が生成する。次いで、先に第２のチューブ３０２−２に分取した断片化前の元の試料ＤＮＡ３０１と、塩基配列決定用の試薬（ｄｄＮＴＰ：ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む試薬）とを加えてシーケンシング反応を行なう。蛍光標識プライマー３３０を用いたシーケンシング反応からＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の塩基配列がわかり、予め用意した上記の相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０２を用いたシーケンシング反応からこのＤＮＡ断片がつながるべき塩基配列（つなぎの塩基配列）がわかる。即ち、ＤＮＡ断片の塩基配列と、この塩基配列に隣接する塩基配列を決定できる。
【００３１】
図６に示すＤＮＡ断片は、アンカープライマーセット３０６のアンカープライマーとプライマーセット３０７（プライマーセット▲２▼）のプライマーをそれぞれ末端に持つＤＮＡ断片である。異なるＰＣＲ選別プライマー（図３（ａ）、図３（ｂ）において、異なる選別配列を持つプライマーセット３０７、３０６のプライマー）を用いた反応から、試料ＤＮＡ３０１の塩基配列を読むことができる。上記シーケンス反応では、異なる発光波長を持つ４種の蛍光体でそれぞれ標識されたプライマーを用いて、いわゆるＡ反応、Ｃ反応、Ｇ反応、及びＴ反応を行なうもので、蛍光標識プライマー３３０として通常の４色プライマーを用いることができるので、取り扱いが簡単で便利である。即ち、３’末端に選択配列を持つ１６種の蛍光標識プライマー（４色なので合計６４種のプライマーとなる）を作る必要がない利点がある。
【００３２】
（第２の実施例）
本実施例は２本鎖ＤＮＡの塩基配列を３’末端、５’末端の両側から同時に決定する例である。図７は、選択配列を持つアンカープライマー、標識プライマーとＤＮＡ断片の関係を示す図である。蛍光標識されたフォワードプライマー（＋鎖を相補鎖伸長合成するために使用されるプライマー）１７１、及びプライマー（−鎖を相補鎖伸長合成するために使用されるプライマー）３７１を用いるが、標識蛍光体はそれぞれＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（３１４、発光波長６１５ｎｍ）、及びＣｙ−５（１４１、発光波長６５４ｎｍ）を用いた。以後、これらプライマーを、プライマー−ａ（１７１、フォワードプライマー）、プライマー−ｂ（３７１）と呼ぶ。プライマー−ａ（１７１）、−ｂ（３７１）、アンカープライマー（３６１、３６２）とＤＮＡオリゴマー３０４を末端に付けたＤＮＡ断片の関係を図７に示した。プライマー−ａ（１７１）とアンカープライマー−ａ（３６１）のアンカー配列は実質共通の塩基配列を持ち、プライマー−ｂ（３７１）とアンカープライマー−ｂ（３６２）のアンカー配列は実質共通の塩基配列を持つ。プライマー−ａ、−ｂは、部分的にＤＮＡ断片にハイブリダイズすることはあっても安定ではなくアンカープライマーの存在なしでは相補鎖合成は起こさない塩基配列としてある。即ち、アンカープライマーが伸長してできたＤＮＡ鎖３１６の部分にだけ安定にハイブリダイズし、シーケンシング産物を作る。
【００３３】
ＤＮＡ断片に結合させるＤＮＡオリゴマーの塩基配列の中にｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素Ｆｏｋ Ｉによる制限酵素認識部（−ＧＧＡＴＧ−）３１８を入れておく。この制限酵素Ｆｏｋ Ｉは制限酵素認識部３１８より３’末端側の９塩基の部位３１７を切断する制限酵素で、後で述べるように、ＤＮＡ断片に結合したＤＮＡオリゴマーを除去するのに用いることができる。アンカープライマー−ａ（３６１）は制限酵素認識部（但し、塩基が置換された制限酵素認識部である）３５１（ここではＮｌａ ＩＩＩによる制限酵素認識部）の塩基配列−ＣＡＴＧ−を一部変化させ３１３のようにＣ→Ｔとし−ＴＡＴＧ−と変化させて、制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩで切断できなくしたものとするが、ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素切断の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）３１８は持つので、Ｆｏｋ Ｉでは切断される。一方、アンカープライマー−ｂ（３６２）は制限酵素認識配列部−ＣＡＴＧ−３０５は保存するが、ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）の一部３１９を変化させ−ＧＴＡＴＧ−とし、Ｆｏｋ Ｉでは切断されないようにしてある。即ち、アンカープライマー−ａと−ｂを用いて、ＰＣＲ増幅した産物は制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩで片側を、ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素で反対側を切断でき、それぞれＤＮＡ断片の末端に導入したＤＮＡオリゴマーを除去できるよう工夫してある。もちろん、アンカープライマー−ａ、及び−ｂは、３’末端に２塩基からなる選別配列３１２（図７の例では、ＡＧ、ＴＣ）を持っており、それぞれ１６種のプライマーからなるアンカープライマーセットである。
【００３４】
以下、手順に従って説明する。第１の実施例と同様に解析しようとする試料ＤＮＡ（数Ｋｂ〜１０Ｋｂ）を含む液が２分割される。分割された一方の液は、試料ＤＮＡを制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩ（他の４塩基認識酵素でもよい）で切断する。制限酵素による切断部には既知の塩基配列を持ったＤＮＡオリゴマーをライゲーションにより結合する。ここで用いたＤＮＡオリゴマーは、塩基配列（配列番号３）、
５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧ−３’
をもつヘルパーオリゴマー１０１と、塩基配列（配列番号４）、
３’−ＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣ−５’
の３’端にビオチン（Ｂｉｏ）が導入され、５’端にリン酸基（Ｐ）を有する
３’ Ｂｉｏ−ＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣ Ｐ−５’
の構造を持つリンカーオリゴマー１０２である。ヘルパーオリゴマー１０１は、Ｎｌａ ＩＩＩにより生じる突出端であるＣＡＴＧ−３’を除いた塩基配列はリンカーオリゴマー１０２の塩基配列と相補的な関係にあり、ビオチン（Ｂｉｏ）は伸長反応をブロックするために導入されたものであり、３’端のＯＨ基をビオチン（Ｂｉｏ）以外の物質で修飾してもよい。ＤＮＡオリゴマーを導入したＤＮＡ鎖には、一方の末端近傍にＮｌａ ＩＩＩ、他方の末端の近傍にＦｏｋ Ｉにより認識される切断部が存在する。導入されたリンカーオリゴマー１０２の３’末端は、これ以上鎖伸長しないようにビオチンでロックされている。ライゲーションの収率が悪い場合は、５’−Ｐを持たないリンカーを用いて、ヘルパオリゴマー１０１のみをライゲーションした後、ポリメラーゼ反応で相補鎖を合成する。
【００３５】
この場合、３’末端はターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼでジデオキシヌクレオチドを３’末端に導入してロックする。この手法を用いれば、プライマー同士がライゲーションでダイマーとなることを防げれるので、高効率でヘルパオリゴマー１０１とリンカーオリゴマー１０２の塩基配列をＤＮＡ鎖に導入できる。ＤＮＡ断片のセルフライゲーションは大過剰（１００倍）のオリゴマーを用いることで防止できる。アンカープライマー−ａ（アンカープライマーセットａ）、及びアンカープラマイマー−ｂ（アンカープライマーセットｂ）は、導入されたＤＮＡオリゴマー、及びＮｌａ ＩＩＩによる認識部に共通してハイブリダイズするが、アンカープライマー−ａは、Ｎｌａ ＩＩＩによる認識部の塩基配列が−ＣＡＴＧＮＮ３’から−ＴＡＴＧＮＮ３’へと変化している。一方、アンカープライマー−ｂは、Ｆｏｋ Ｉによる認識部の塩基配列が−ＧＧＡＴＧＣＡＴＧＮＮから−ＧＴＡＴＧＣＡＴＧＮＮへと変化している。これらの変化は、いずれも相補鎖合成には支障のない点置換である。
【００３６】
図８は、選択配列を持つアンカープイライマーを用いてＤＮＡ断片を選別してＰＣＲを行なうに先立ち少量のＤＮＡ断片でプライマーの対を決定する方法を説明する図である。ＤＮＡ断片の混合物をＰＣＲ増幅するためのプライマーの対を決定するために、第１の実施例と同様の電気泳動スペクトルを作る。即ち、先に２分割された一方の試料溶液（制限酵素により切断されたＤＮＡ断片群を含む）を、さらに、図８に示すように１６分割しそれぞれ容器に収納し、それぞれにアンカープライマーセットｂに属する１６種のプライマー１１０を１種づつ加え、更に蛍光標識（＊）されたフォワードプライマー１１１を加え、サイクルシーケンシングの条件下で相補鎖伸長して、フォワードプライマー１１１から伸長した相補鎖１０６を形成する。ここではアンカープライマー−ｂを用いたが、アンカープライマー−ａ、あるいはまったく点置換を持たないプライマーセットでも同様に使用できる。反応ではまずアンカープライマー−ｂ（１１０）がＤＮＡ断片１００にハイブリダイズし、３’末端が完全にマッチしたものについて相補鎖伸長１０３がおこる。ここでマッチしない側の鎖は伸長しない。相補鎖は導入オリゴマー（ヘルパーオリゴマー１０１）部分まで行なわれ、結果として伸長鎖の３’末端にヘルパオリゴマー１０１にハイブリダイズする塩基配列１０４ができる。熱サイクル反応により、この相補鎖伸長１０３は、更に続いて、プライマー１１０のアンカー配列と相補な塩基配列１０５を３’末端にもつＤＮＡ断片を形成する。即ち、フォワードプライマー１１１のハイブリダイズする塩基配列１０５部分が形成される。この塩基配列１０５部分にフォワードプライマー１１１がハイブリダイズし、伸長した相補鎖１０６を形成する。以後は、通常のＰＣＲと同様に反応が進み、アンカープライマー−ａの末端塩基配列が完全にハイブリダイズする、ＤＮＡ断片と実質同じ長さ（両端のアンカープライマーの長さだけ長い）の蛍光標識ＤＮＡ断片を得る。
【００３７】
ここではＤＮＡ断片混合物の長さを、ＤＮＡ断片の末端の２塩基種毎に求めるのに用いたが、ＤＮＡ断片混合物をその末端の２塩基配列毎にＰＣＲ増幅する手法としても有効である。選別配列を２塩基から３あるいは４塩基に増やすと１塩基ミスマッチしていてもプライマーとして機能することがある。これを防ぐため、例えば３塩基の選択配列を持つ場合、アンカープライマーの３’末端から４塩基目（選択配列の手前の塩基）にイノシンを入れ、末端の結合力を弱める。この場合、更に選択配列にミスマッチがあると相補鎖合成は非常に困難になり選別特性を上げるのに都合が良い。
【００３８】
各１６種のアンカープライマー−ｂ毎に得られた蛍光標識ＤＮＡ鎖をゲル電気泳動分離して、混合物中に含まれるＤＮＡ鎖の末端塩基配列と長さを知ることができる。このようにして得られた末端塩基配列と長さを用いて、ＰＣＲ用プライマーを決めるが、２つのプライマーはそれぞれアンカープライマー−ａ、及び−ｂから１種づつ選ぶ。この２つのプライマー（例えば、アンカープライマー−ａ（３６１）、及び−ｂ（３６２））を用いてＰＣＲ増幅することにより、図７に示すような、一方の末端近傍にＮｌａ ＩＩＩ、他方の末端希望にＦｏｋ Ｉによる切断部を持つＤＮＡ断片を得る。得られた種々のＤＮＡ断片をエタノール沈殿により精製した後、バッファー液に溶かしてそれぞれ２分割し、各ＤＮＡ断片について（ａ）、及び（ｂ）の溶液を得る。（ａ）の溶液にはＮｌａ ＩＩＩを入れ、（ｂ）の溶液にはＦｏｋ Ｉを入れ、ＤＮＡ断片を切断する。Ｎｌａ ＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片を１本鎖化し、蛍光標識プライマー１７１（フォワードプライマー）を用いてサイクル反応下で相補合成すると、３’末端側に元の試料ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持ち、元の試料ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして更に相補鎖伸長可能なＤＮＡ断片（相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０４）が生成する。同様にして、Ｆｏｋ Ｉにより切断されたＤＮＡ断片を１本鎖化し、蛍光標識プライマー３７１を用いてサイクル反応下で相補合成すると、３’末端側に元の試料ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持ち、元の試料ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして更に相補鎖伸長可能なＤＮＡ断片（相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０６）が生成する。このようにして、元の試料ＤＮＡ鎖３０１にハイブリダイズしてさらに相補鎖伸長可能なＤＮＡ断片４０４、４０６を予め用意する。
【００３９】
次いで、両者を混合し（最後まで別々でも良い）、制限酵素による切断前の全長をもつ試料ＤＮＡ３０１を加え、更に、塩基配列決定用の試薬（ｄｄＮＴＰ：ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む試薬）とを加えてサイクルシーケンシング反応を行なう。この反応により、ＤＮＡ鎖の前後の塩基配列決定に必要な情報を得ることができる。即ち、蛍光標識プライマー１７１、３７１を用いたシーケンシング反応からＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の塩基配列がわかり、上記の相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０４、４０６を用いたシーケンシング反応からこのＤＮＡ断片がつながるべき塩基配列（つなぎの塩基配列）がわかる。即ち、第１の実施例と同様にＤＮＡ断片の塩基配列と、この塩基配列に隣接する塩基配列を決定できる。
【００４０】
ここではプライマーはＤＮＡ２本鎖（＋、−鎖）に対応して２色（２種の蛍光標識されたプライマー）であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの識別は、異なる電気泳動路で行なう、即ち、末端塩基種毎に異なる電気泳動路で泳動させる（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、６４８−６５１（１９９１））。
【００４１】
一方、４色蛍光体プライマー（４種の蛍光体のそれぞれで標識されたプライマー）を用いる時には、（ａ）の溶液と（ｂ）の溶液を混合せずに、第１の実施例と同様にして行なう。このようにＤＮＡ鎖の両端に異なる切断部を持つプライマーでＰＣＲを行なうことで、２本鎖の両側から同時に塩基配列決定をできるので効率が良い。また、両末端の続きの塩基配列を同時に知ることができるので、塩基配列決定するＤＮＡ断片の数を最小にできる利点がある。
【００４２】
以上の各実施例での試料ＤＮＡの長さは数Ｋｂ〜１０Ｋｂであればよく、検査対象から抽出されたＤＮＡから断片化されたＤＮＡ断片試料であってもよいことはいうまでもない。
【００４３】
【発明の効果】
プライマーセットを用いて塩基配列決定する方法は多色計測を用いるシステムでは準備するプライマーの数が多く大変であったが、本発明ではアンカープライマーにＤＮＡ断片の選別機能を持たせることにより、少数の既存プライマーを用いて簡単に長い試料ＤＮＡの塩基配列決定ができる。さらに、ＤＮＡ鎖の両端に制限酵素により切断可能な異なる切断部を持つプライマーでＰＣＲを行ない、２本鎖の両側から同時に塩基配列決定できるので効率が良い。
【００４４】
（配列表）
配列番号：１
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
配列
ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
配列番号：２
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
配列
ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
配列番号：３
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
配列
ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧ
配列番号：４
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
配列
ＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の試料調製法を用いるＤＮＡ解析プロセスを説明する図。
【図２】ＤＮＡオリゴマーをライゲーション結合したＤＮＡ断片を示す図。
【図３】（ａ）は、ＤＮＡオリゴマーを結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするアンカープライマーセットの概念図、（ｂ）は、ＤＮＡオリゴマーを結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするプライマーセットの概念図。
【図４】１６種の選択プライマーを用いて得たＤＮＡ断片の相補鎖合成の産物のゲル電気泳動スペクトルの例を示す図。
【図５】検出されたＤＮＡ断片の構造例を示す図。
【図６】アンカープライマーを用いた相補鎖合成（ＰＣＲ増幅）により得られる産物の一例を示す図。
【図７】選択配列を持つアンカープライマー、標識プライマーとＤＮＡ断片の関係を示す図。
【図８】選択配列を持つアンカープイライマーを用いてＤＮＡ断片を選別してＰＣＲを行なうに先立ち少量のＤＮＡ断片でプライマーの対を決定する方法を説明する図。
【符号の説明】
３０１…切断前の試料ＤＮＡ、３０２…試料ＤＮＡを含む溶液、３０２−１…第１のチューブ、３０２−２…第２のチューブ、３０３…制限酵素切断されたＤＮＡ断片群、３０４…ＤＮＡオリゴマー、３０４’…ＤＮＡオリゴマーの伸長部分、３０５…制限酵素認識配列部−ＣＡＴＧ−、３０６…アンカープライマーセット、３０７…プライマーセット、３１１…アンカー配列、３１２…選別配列、３１３…アンカープライマーセットの３’末端から６塩基目の塩基、３１４…蛍光標識（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、１４１…蛍光標識（Ｃｙ−５）、３１５…ＤＮＡオリゴマーに相補的な部分（共通プライマー配列）、３１６…アンカープライマーが伸長してできたＤＮＡ鎖（相補鎖合成されたアンカー配列）、３１７…制限酵素Ｆｏｋ Ｉの制限酵素認識部より３’末端側の９塩基の部位、３１８…制限酵素Ｆｏｋ Ｉによる制限酵素認識部（−ＧＧＡＴＧ−）、３１９…ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）の一部、３２０…ＤＮＡ断片群を含む液、３２１…ライゲーション反応生成物を含む液、３２２、３２３…チューブ、３２２−１、３２２−２、〜、３２２−１６…チューブ、３２３−１、３２３−２、〜、３２３−ｋ…容器、３３０…蛍光標識プライマー、３５１…塩基が置換された認識配列、３６１…アンカープライマー−ａ（ＡＧ選別配列を持ったアンカープライマー）、３６２…アンカープライマー−ｂ（ＴＧ選別配列を持ったアンカープライマー）、３７１…プライマー−ｂ、１７１…プライマー−ａ（フォワードプライマー）、１００…ＤＮＡ断片、１０１…ヘルパーオリゴマー、１０２…リンカーオリゴマー、１０３…ＤＮＡ断片の合成相補（相補鎖伸長鎖）、１０４…リンカーオリゴマーにハイブリダイズする塩基配列、１０５…プライマーのアンカー配列と相補な塩基配列、１０６…プライマー１１１から伸長した相補鎖、１１０…アンカープライマーセットに属する１６種のプライマー、１１１…フォワードプライマー、４００…制限酵素切断部位、４０２、４０４、４０６…相補鎖伸長した蛍光標識プライマー。
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素によるＤＮＡ相補鎖合成を利用したＤＮＡ分析方法、ＤＮＡ塩基配列決定方法に用いられるＤＮＡ試料の調製方法及びこれに用いる試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム解析を中心にＤＮＡ塩基配列決定の高効率化のニーズが高まっている。放射性同位元素を用いてＤＮＡ断片を標識し、ゲル電気泳動によりＤＮＡの長さを計測して、人手によって行なう従来の塩基配列決定法に代わり、ＤＮＡを蛍光体で標識し、ゲル電気泳動しながら光を当てて自動的にＤＮＡ断片を光学検出する装置（ＤＮＡシーケンサー）が普及してきている。この装置は、目的とするＤＮＡにプライマーと呼ばれるＤＮＡオリゴマーをハイブリダイズさせ、酵素を用いた相補鎖合成で塩基配列決定に用いる種々の長さのＤＮＡ断片を作製し、ゲル電気泳動でＤＮＡ断片の長さを調べて塩基配列決定するものでサンガー法あるいはダイデオキシ法と呼ばれている。ここで一度に塩基配列決定できる長さは、ゲルによる長さ分離能で決められており、４００〜７００塩基長である。これより長い数Ｋ塩基から数十Ｋ塩基のＤＮＡ塩基配列決定は手間と時間のかかる作業である。
【０００３】
従来、長いＤＮＡ（数Ｋ〜数十Ｋ塩基）の塩基配列決定にはショットガン法が用いられてきた。ショットガン法では試料ＤＮＡを超音波などを用いてランダムに切断し、ＤＮＡ断片をクローニングして大腸菌等に埋め込み、コロニー培養した後、各コロニー中の大腸菌を培養してＤＮＡのコピーを増やす。次いで試料ＤＮＡを抽出して解析する。この方法では、取り出したコロニーに含まれるＤＮＡには断片化した試料ＤＮＡが含まれるが、ＤＮＡ断片が試料ＤＮＡのどの部分であるのか、塩基配列決定するまで分からないため、決定しようとするＤＮＡ鎖長の１０〜２０倍ものＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を取り解析しなくてはならない。このため、時間と手間が大いにかかり大きな障害となっている。
【０００４】
一方、塩基配列決定しようとするＤＮＡ断片を端から順に決めていく方法（プライマーウォーキング；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６、６９１７−６９２１（１９８９））も提案されている。この方法では、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定したら、その中から次のプライマー領域を選びダイデオキシ法により塩基配列を再び決定する。このため無駄が少なく効率の良い塩基配列決定ができるが、時系列的に塩基配列を決めていくので時間がかかる点と、解析の都度プライマーを用意する手間がかかる点に欠点がある。
【０００５】
従来技術ではないが、上記欠点を克服する方法（フラグメントウォーキング法）が発明者により提案されている（特願平７−２３８１４１号）。このフラグメントウォーキング法では、塩基配列決定しようとする試料ＤＮＡを４塩基認識酵素などの制限酵素で完全に切断し、重複のない断片群を作製する。生成したＤＮＡ断片では制限酵素が認識して切断する部分の塩基配列を除くと塩基配列は未知である。こられＤＮＡ断片は既知の塩基配列を持ったプライマーがハイブリダイズし相補鎖合成の起点となるプライミングサイトを特に持ってない。そこで生成したＤＮＡ断片の３’末端側に既知の塩基配列のオリゴマーを結合してプライミングサイトとする。プライマーをＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ相補鎖合成でＤＮＡ伸長鎖を作る時、プライマーの３’末端の２塩基（選別配列と呼ぶ）がＤＮＡ断片と完全に相補的でピッタリとハイブリダイズしている時には反応が進行するが、そうでない時には反応が遅いか全く進まないことが知られている。そこで蛍光標識プライマーの３’末端（相補鎖伸長側）に任意の２塩基（１６通りの塩基配列がある）をつけておき、ＤＮＡ断片の中から蛍光標識プライマーと完全に相補な配列を持つ特定の断片を選び相補鎖合成したり、塩基配列決定できる（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １、２３１−２３７（１９９４））。
【０００６】
ＤＮＡ断片群中に含まれるＤＮＡ断片の種類が少なく、１種のプライマーと完全に相補的なＤＮＡ断片が１個の時には各断片の塩基配列を上記プライマーを用いて、それぞれ決定できる。１種のプライマーが２つ以上のＤＮＡ断片とハイブリダイズする場合には、予め長さ分離するなどしてから上述の操作を行なう。このようにして、フラグメントウォーキング法では、混合状態にあるＤＮＡ断片の塩基配列を、１６種のプライマーを用いてクローニングなどせずに、重複なく簡単に並列して決定できる。ＤＮＡ断片相互のつながりを決定し、試料ＤＮＡ全体の塩基配列を決めるには次の様に行なう。前述した１６種の蛍光標識プライマーは末端にプライミングサイトを持つ断片ＤＮＡにだけハイブリダイズし、元の切断されていない試料ＤＮＡにはハイブリダイズしない。しかし、断片ＤＮＡにハイブリダイズした上記プライマーを相補鎖伸長すると、伸長した部分は元の試料ＤＮＡと相補的であり、元の試料ＤＮＡにハイブリダイズする。そこで、上記プライマーを用いて各ＤＮＡ断片の塩基配列決定用の相補鎖合成反応を行なう時、反応温度を昇降するサイクルシーケンス条件下で行ない、反応液中に未切断の試料ＤＮＡを加えると、ＤＮＡ断片の塩基配列に加えて、切断部に続く元の試料ＤＮＡの塩基配列をも決定できる。この方法では異なる１６種のプライマーを用いて各ＤＮＡ断片とそれに続く塩基配列を並列して決定でき非常に効率が良い。この方法は、ＤＮＡ断片から次のＤＮＡ断片へ塩基配列をつなげて歩いて行くのに似ているのでフラグメントウォーキング法と呼んでいる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
フラグメントウォーキング法は非常に効率の良い方法であるが、プライマーとして、３’末端の２塩基すべての組み合わせの１６種のプライマーを用意する必要がある。蛍光式ＤＮＡシーケンサーには、現在、１色方式（ＤＮＡ断片の末端塩基種を１種の蛍光体で識別し、末端塩基種が異なるＤＮＡ断片を異なる泳動路で泳動させる）、及び４色方式（ＤＮＡ断片の末端塩基種に対応して４種の蛍光体で識別し、ＤＮＡ断片を同一の泳動路で泳動させる）があるが、高スループットを達成するには４色方式が都合が良い。しかし、上記のフラグメントウォーキング法を４色方式に適用しようとすると、１６×４＝６４もの蛍光標識プライマーを最低でも用意する必要があり、フラグメントウォーキング法の実用面での課題の１つとなっている。
【０００８】
本発明の目的は、この課題を解決し、市販のユニバーサルプライマーあるいは手持ちの少数のプライマーを用いて、フラグメントウォーキング法を容易に実行するための、ＤＮＡ分析方法、ＤＮＡ塩基配列決定方法に用いられるＤＮＡ試料の調製方法、及びこれに用いる試薬キットを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明では、３’末端に２塩基からなる選別配列を持つプライマーにアンカーをつけたアンカー付の選別プライマー（以下、簡単のためにアンカープライマーと呼ぶ）を用いて、鋳型となるＤＮＡ断片のコピー数をＰＣＲで増やす。アンカー部分の相補鎖がＤＮＡ断片の末端に導入されるが、アンカー部分に蛍光標識プライマーをハイブリダイズさせ塩基配列決定反応を行なう。アンカープライマー（合計１６種）は蛍光標識されている必要はなく、塩基配列決定用に使用する蛍光標識プライマーには、通常のシーケンシングに用いている４種の蛍光体でそれぞれ標識されたユニバーサルプライマーを用いる。
【００１０】
１６種のアンカープライマーは、混合ＤＮＡ断片の中の特定のＤＮＡ断片にハイブリダイズして相補鎖伸長し、特定のＤＮＡ断片のコピー数を増やすのに用いられる。この結果、ＤＮＡ断片の混合物の中から、アンカープライマーが完全にハイブリダイズするＤＮＡ断片だけを増やし、特定のＤＮＡ断片を実質的に抜き出すことができる。抜き出されたＤＮＡ断片には、蛍光標識プライマーがハイブリダイズする部分が導入されており、シーケンシング反応を行なうことができるようになっている。即ち、通常のポリメラーゼ反応のプライマーとなり得る塩基配列をもつユニバーサルな蛍光標識プライマーを用い、蛍光標識プライマーの種類を増やすことなくフラグメントウォーキング法を容易に実行できる。
【００１１】
このような蛍光標識プライマーの例としては、Ｍ１３系ベクターに用いる、塩基配列（配列番号１）
５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
をもつプライマー、Ｔ７系ベクターに用いる、塩基配列（配列番号２）
５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’
をもつプライマー等の、一般にユニバーサルプライマーと呼ばれるプライマーの他に、任意の配列をもつ蛍光標識プライマーが利用できる。もちろん、蛍光標識として周知の蛍光体が利用できる。
【００１２】
本発明の構成の特徴を以下に詳細に説明すると、本発明の構成（ａ）では、
（１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記制限酵素により認識される配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる選択配列とを有し、５’末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列を有するアンカープライマーを用いて相補鎖合成しＤＮＡ鎖を得る工程と、
（４）少なくとも上記アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしないプライマーを用いて、工程（３）で得た上記ＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行なう工程とを有する試料調製方法に特徴がある。
【００１３】
本発明の構成（ｂ）では、
（１）試料ＤＮＡを切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成す工程と、
（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチドと実質的に相補な塩基配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる上記ＤＮＡ断片を選別するための配列とを有し、５’末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列を有するアンカープライマーと、上記アンカー配列と実質的に同じ塩基配列を有し、単独では上記ＤＮＡ断片に安定にハイブリダイズしないプライマーを用いて、上記ＤＮＡ断片をその末端塩基配列毎に区分けしてＰＣＲ増幅する工程とを有する試料調製方法に特徴がある。
【００１４】
本発明の構成（ｃ）では、
（１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知であるオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる選択配列とを有し、５’末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換され、上記制限酵素で切断できない塩基配列部分を有するアンカープライマーと、上記制限酵素で切断を受ける塩基配列を有するプライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
（４）増幅された上記特定のＤＮＡ断片の片方の末端を切断したＤＮＡ鎖を得る工程と、
（５）少なくとも上記アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない蛍光標識プライマーを用いて、工程（４）で得た上記ＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない相補鎖合成ＤＮＡ断片を得る工程と、（６）上記蛍光標識プライマーと上記相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用い、工程（４）で得た上記ＤＮＡ鎖、上記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、上記ＤＮＡ鎖の塩基配列と上記ＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の上記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する塩基配列方法に特徴があり、上記蛍光標識プライマーは、少なくとも上記アンカー配列と実質同じ配列を持つことにも特徴がある。
【００１５】
本発明の構成（ｄ）では、
（１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素で切断し、複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、
（２）上記ＤＮＡ断片の少なくとも３’末端側に塩基配列が既知であり、第２の制限酵素による認識部配列をもつオリゴヌクレオチドを付加する工程と、
（３）上記オリゴヌクレオチド、及び上記第１の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第１の選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第１のアンカー配列を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換され、上記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープライマーと、上記オリゴヌクレオチド、及び上記第１の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第２の選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第２のアンカー配列を有し、上記オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、上記第２の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、
（４）増幅された上記特定のＤＮＡ断片の第１の末端を上記第２の制限酵素により切断して第１のＤＮＡ鎖を、増幅された上記特定のＤＮＡ断片の第２の末端を上記第１の制限酵素により切断して第２のＤＮＡ鎖をそれぞれ得る工程と、
（５）少なくとも上記第１のアンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない第１の蛍光標識プライマーと、少なくとも上記第２のアンカー配列と実質的に同じ配列を有し、上記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない第２の蛍光標識プライマーとを用いて、工程（４）で得た上記第１、第２のＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片を得る工程と、
（６）上記第１、第２の蛍光標識プライマーと上記第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用い、工程（４）で得た上記第１、第２のＤＮＡ鎖、上記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、上記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列と、上記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の上記試料ＤＮＡの塩基配列を決定する塩基配列方法に特徴があり、上記第１の蛍光標識プライマーは、少なくとも上記第１のアンカー配列と実質同じ配列を、上記第２の蛍光標識プライマーは、少なくとも上記第２のアンカー配列と実質同じ配列を、それぞれ持つことにも特徴がある。
【００１６】
本発明の構成（ｅ）では、ライゲーション用オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列と、制限酵素が認識する認識部配列と、ユニバーサルプライマーと同じ配列とを有し、３’末端側に１塩基〜４塩基からなる選択配列を有し、ＤＡＮ断片の末端の塩基配列を選択を可能とする複数のアンカープライマーからなる試薬キットに特徴があり、上記アンカープライマーは、上記ＤＡＮ断片の末端の２塩基の配列を選択する選択配列が、２塩基からなるすべての組み合わせの塩基配列を含むことにも特徴がある。
【００１７】
本発明の構成（ｆ）では、少なくともライゲーション用オリゴヌクレオチド、相補鎖合成用プライマーからなる試薬キットにおいて、上記相補鎖合成用プライマーが、上記オリゴヌクレオチドと実質的に相補な配列、制限酵素が認識する認識部配列と、この認識部配列の３’末端側に２塩基からなる選択配列とを有する１６種のプライマーからなる第１のプライマーセットと、この第１のプライマーセットの各プライマーの５’末端側にアンカー配列を付加し、上記各プライマーの上記認識部配列の一部の塩基を置換した１６種のプライマーからなる第２のプライマーを含む試薬キットに特徴がある。
【００１８】
本発明の構成（ｇ）では、少なくともライゲーション用オリゴヌクレオチド、相補鎖合成用プライマーからなる試薬キットにおいて、上記相補鎖合成用プライマーが、上記オリゴヌクレオチド、及び第１の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第１の選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第１のアンカー配列を有し、上記認識部配列の一部の塩基が置換され、上記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープライマーセットと、上記オリゴヌクレオチド、及び上記第１の制限酵素により認識する認識部配列と実質的に相補な配列と、３’末端側に１〜４塩基からなる第２の選択配列を有し、５’末端側に少なくとも８マー以上の第２のアンカー配列を有し、上記オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、上記第２の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーセットを含む試薬キットに特徴があり、上記第１、第２の選択配列の塩基が２塩基からなり、２塩基からなるすべての組み合わせの塩基配列を含むことにも特徴がある。
【００１９】
本発明の構成（ｈ）では、構成（ａ）、（ｂ）の試料調製方法により調製された試料を分析する分析方法に特徴がある。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、図を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２１】
（第１の実施例）
図１は、本発明の試料調製法を用いるＤＮＡ解析プロセスを説明する図である。解析しようとする試料ＤＮＡ３０１（数Ｋｂ〜１０Ｋｂの長を持つ）を含む溶液３０２を２分割して、それぞれ第１のチューブ３０２−１、第２のチューブ３０２−２に分取する。第１のチューブ３０２−１に含まれる試料ＤＮＡを制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩで切断し、ＤＮＡ断片群３０３を得る。Ｎｌａ ＩＩＩは塩基配列−ＣＡＴＧ−を認識し、３’末端に−ＣＡＴＧ（３’）の塩基配列を持つＤＮＡ断片を生成する。使用する制限酵素は、Ｓａｕ ３Ａｌ、Ｈｈａ Ｉ、Ｍａｅ Ｉの他何でも良いが、切断部位が頻度高く現われる４塩基認識酵素が良い。ＤＮＡ断片群３０３を含む液３２０にＤＮＡオリゴマー３０４を添加して、制限酵素による切断部の少なくとも３’末端に既知の塩基配列を持つＤＮＡオリゴマー３０４を結合する。ＤＮＡオリゴマー３０４を結合する方法には、ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによるポリＡ鎖の付加とライゲーションを用いた方法があるが、ここではライゲーションを用いた例で説明する。ライゲーション反応生成物を含む液３２１は、２分割してチューブ３２２、３２３に分取しておく。
【００２２】
図２は、ＤＮＡオリゴマー３０４をライゲーション結合したＤＮＡ断片を示す図である。図２において、Ｎ、及びｎは塩基配列を決定しようとするＤＮＡ断片を構成するヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかである）であり、Ｎｌａ ＩＩＩにより認識される認識配列３０５は５’−ＣＡＴＧ−３’である。ＤＮＡオリゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖の３’末端側は相補鎖合成しないようにｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅで置換するなどして相補鎖がこれ以上伸びないようにする。もちろん、ＤＮＡオリゴマーの段階で３’−ＯＨをアミノ基やビオチン等の残基で修飾し、３’伸長を妨げる型としておいて良い。ＤＮＡオリゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖の３’末端側は相補鎖合成しないようにするのは、使用するアンカープライマーによる相補鎖合成でアンカープライマーの３’末端（ＤＮＡ断片の選別を行なうための塩基配列を持つ部分）がＤＮＡ断片と完全に相補的でない場合には、アンカー部分と相補的な鎖ができないようにするためである。アンカープライマーの３’末端がＤＮＡ断片と完全にマッチした鎖では、反対側の末端（合成鎖の３’末端）にアンカープライマーの一部がハイブリダイズし、更に、伸長してアンカー部分と相補的な塩基配列を３’末端側に持つＤＮＡ断片が合成される。
【００２３】
図３（ａ）は、ＤＮＡオリゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするアンカープライマーセット（アンカープライマーセット▲１▼）の概念図、図３（ｂ）は、ＤＮＡオリゴマー３０４を結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするプライマーセット▲２▼の概念図である。ＤＮＡ断片に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４に相補的な部分３１５と、その５’末端側にアンカー配列３１１とを持ち、３’末端側のＸＸで示す２塩基（１〜４塩基で良い）からなる選別配列３１２を持つ１６種（１〜４塩基に対応して４〜２５６種）のアンカープライマーセット３０６を用意する。選別配列３１２は特定のＤＮＡ断片をＤＮＡ断片の混合物の中から選択するための塩基配列である。このアンカープライマーセット３０６のアンカー部分３１１あるいはアンカー部分３１１を含む部分の塩基配列は実質ユニバーサル配列としておく。この時、図３（ａ）の３１３に示す様に、アンカープライマーセット３０６の３’末端から６塩基目の塩基（制限酵素の認識配列内の１つ、ここではＣである）を、別の塩基、例えばＴに変えたアンカープライマー（アンカープライマーセット▲１▼）１６種と、変化させずＣのままのプライマーセット３０７（プライマーセット▲２▼）とを用意する。この例では、図３（ｂ）に示す様に、プライマーセット▲２▼にはアンカーをつける必要はないが、後のチェックに都合のよいように、Ｔｅｘａｓ
ＲｅｄあるいはＦＩＴＣで蛍光標識３１４をつけておく。
【００２４】
１種の蛍光体で蛍光標識されたプライマーセット▲２▼とＤＮＡ断片混合物とを用いてプライマーの伸長反応を行なう。即ち、図１に示す様に、ライゲーション反応生成物を含む液を含むチューブ３２２から、液を１６本のチューブ３２２−１、３２２−２、…、３２２−１６に分注し、ぞれぞれ異なるプライマーを入れて相補鎖合成をする。即ち、各チューブにはそれぞれ異なった選別配列３１２を有するプライマーが加えられる。相補鎖合成の産物はゲル電気泳動される。図４は、相補鎖合成の産物のゲル電気泳動スペクトルの例である。電気泳動パターンには、選別配列３１２を有するプライマーと、ＤＮＡ鎖（２本鎖）のうちの＋鎖、及び−鎖のそれぞれとから相補鎖合成された産物が、泳動開始点から等距離Ｌに対を成して出現する。プライマーの３’末端の２塩基が完全にＤＮＡ断片とマッチする時には相補鎖合成がおこり、そのＤＮＡ断片と同じ長さの蛍光標識ＤＮＡ断片が生成する。そこで図４のスペクトルを得ることでＤＮＡ断片群中にいかなる長さの断片があり、その末端の塩基配列は何であるかがわかる。図５は、検出されたＤＮＡ断片の構造例を示す図である。例えば、選別配列（プライマー選択配列）ＡＧを持つプライマー、及び選別配列（プライマー選択配列）ＴＣを持つプライマーで得たｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍには、ＤＮＡ鎖長約４００塩基のＤＮＡ断片が現われる。
【００２５】
これらから、元の試料ＤＮＡを制限酵素により切断した２本鎖ＤＮＡ断片の中には、長さが約４００ｂｐであり、それぞれの鎖の３’末端側の塩基配列がそれぞれ３’□ＧＴＡＣＴＣ…５’、及び３’□ＧＴＡＣＡＧ…５’であるＤＮＡ断片が含まれることがわかる。ここで「□」はライゲーションでＤＮＡ断片中に導入したオリゴマーの塩基配列であり、「…」はＤＮＡ断片に固有の塩基配列である。制限酵素認識部の塩基配列３’ＧＴＡＣ５’に続く５’末端側の塩基配列は、それぞれＡＧ、及びＴＣに相補的な塩基配列となる。即ち、図５に示したＤＮＡ断片がＤＮＡ断片混合物中にあることがわかる。このＤＮＡ断片だけを取り出すには末端塩基配列がＡＧ、及びＴＣをそれぞれ持つアンカープライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行ない、そのＤＮＡ断片のコピー数を他より数桁大きくすればよい。
【００２６】
このようにして得たＤＮＡ断片の塩基配列、及びそれらに連なる元の試料ＤＮＡの塩基配列を、４種の蛍光体でそれぞれ標識されたプライマーを用いて決定する。既存の４種の蛍光標識プライマーを用いてシーケンシングをするために、ＰＣＲ用のプライマーとして５’末端側にアンカーの入ったアンカープライマーセット３０６▲１▼を用いる。即ち、このアンカープライマーは、図３（ａ）にす様に既存のプライマーと共通なアンカー配列３１１、ライゲーションでＤＮＡ断片の３’末端側に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４と実質相補であり、アンカープライマーセット３０６に共通する共通プライマー配列３１５、制限酵素が認識する塩基配列の１部あるいは全部と共通な塩基配列、及び３’末端側に２塩基からなる選別配列３１２を持つプライマーである。アンカー配列３１１と共通プライマー配列３１５は、一部が共通でも良いが、共通部分の長さは８マー以下であり、４種の蛍光体でそれぞれ標識された既存のプライマー単独では、ＤＮＡ断片に導入したＤＮＡオリゴマー３０４の塩基配列に安定にハイブリダイズし相補鎖合成を行なうことはできないことが必要である。共通プライマー配列３１５はＤＮＡオリゴマー３０４と実質相補な塩基配列を持つ。また、アンカー部分３１１の塩基配列は１０マー以上、望ましくは１５マー以上が安定なハイブリダイズを得る上で必要である。
【００２７】
ここでプライマー配列に工夫をする。即ち、これらアンカープライマー▲１▼は、ＤＮＡ断片に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４と相補な塩基配列と、３’末端に２塩基の選択配列（ＸＸ）３１２を持つが、制限酵素が認識する塩基配列−ＣＡＴＧ−の５’末端側の１塩基の種類を変化させておく。図３（ａ）の例では、塩基配列−ＣＡＴＧ−のうちＣをＴに変化させてあり（Ｔの代わりにＡ、Ｇとしてもよい）、このアンカープライマーは、３’末端から６塩基目の塩基Ｔ３１３がミスマッチを起こすが、ＤＮＡ断片の末端に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４に安定にハイブリダイズし、相補鎖を形成する。この結果、形成されたＤＮＡ鎖は本実施例で用いた制限酵素で切断できない型となる。なお、塩基配列−ＣＡＴＧ−のうちＡを、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかに変化させても、このアンカープライマーは、３’末端から５塩基目の塩基がミスマッチを起こすが、ＤＮＡ断片の末端に導入されたＤＮＡオリゴマー３０４に安定にハイブリダイズし、相補鎖を形成する。この結果同様に、形成されたＤＮＡ鎖は本実施例で用いた制限酵素で切断できない型となる。また、１６種のプライマー（プライマーセット▲２▼）を用意する。これらプライマーは図３（ｂ）に示すように、アンカー配列を持たないが、選択配列（ＸＸ）３１２を持ったプライマーであり、３’末端から２塩基目から６塩基目の塩基配列は塩基配列−ＣＡＴＧ−に相補であり、５’末端の蛍光標識３１４をつけてもよく、つけなくてもよい。
【００２８】
図４の結果を用いて、１３０塩基より長いＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するのに必要なＰＣＲ用選別プライマーを決定する。図１に示すように、チューブ３２３に分取された液を、ＰＣＲの組み合わせの数（ｋ）（電気泳動パターンにおいて、相補鎖合成された産物が、泳動開始点から等距離に出現する対の数以下であり、決定されたＰＣＲ用選別プライマーの種類の数に等しい）の容器３２３−１、３２３−２、…、３２３−ｋに分割し、容器にそれぞれ異なるＰＣＲ用選別プライマーを添加して、選別プライマーを用いたＰＣＲ増幅を行なう。このＰＣＲ増幅には、アンカープライマーセット▲１▼、及びプライマーセット▲２▼のプライマーの組合せを用いる。ここで１３０塩基（通常１５０塩基）以下のＤＮＡ断片は解析しなくても、次に述べるように各ＤＮＡ断片の接続操作で全体塩基配列を決定できるのでＰＣＲ増幅は行なわない。
【００２９】
ＰＣＲ増幅で得たＤＮＡ断片を透析などで精製し、塩基配列決定用の鋳型とする。図６は、アンカープライマー▲１▼を用いた相補鎖合成（ＰＣＲ増幅）により得られる産物の一例を示す図である。図６において、３０４’の部分はＤＮＡオリゴマー３０４の伸長部分である。ここで得たＤＮＡ断片は、アンカープライマーセット３０６（アンカープライマーセット▲１▼）のアンカープライマー、及びプライマーセット３０７（プライマーセット▲２▼）のプライマーをそれぞれ末端に持つＤＮＡ断片である。プライマーセット３０７のプライマーが結合した部分３０５の−ＣＡＴＧ−は先に用いた制限酵素を用いると、切断部位４００で切断されるが、アンカープライマーセット３０６のアンカープライマーの結合した側の部分３５１の−ＣＡＴＡ−は−ＣＡＴＧ−と異なるため先に用いた制限酵素により切断されない。
【００３０】
この結果、先の制限酵素でＰＣＲ増幅産物を切断後１本鎖として、アンカー配列３１１と同じ塩基配列を持つ蛍光標識プライマー３３０（＊は蛍光標識を示す）を用いて相補合成すると、３’末端側に元の試料ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持ち、元の試料ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして更に相補鎖伸長可能なＤＮＡ断片（相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０２）が生成する。次いで、先に第２のチューブ３０２−２に分取した断片化前の元の試料ＤＮＡ３０１と、塩基配列決定用の試薬（ｄｄＮＴＰ：ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む試薬）とを加えてシーケンシング反応を行なう。蛍光標識プライマー３３０を用いたシーケンシング反応からＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の塩基配列がわかり、予め用意した上記の相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０２を用いたシーケンシング反応からこのＤＮＡ断片がつながるべき塩基配列（つなぎの塩基配列）がわかる。即ち、ＤＮＡ断片の塩基配列と、この塩基配列に隣接する塩基配列を決定できる。
【００３１】
図６に示すＤＮＡ断片は、アンカープライマーセット３０６のアンカープライマーとプライマーセット３０７（プライマーセット▲２▼）のプライマーをそれぞれ末端に持つＤＮＡ断片である。異なるＰＣＲ選別プライマー（図３（ａ）、図３（ｂ）において、異なる選別配列を持つプライマーセット３０７、３０６のプライマー）を用いた反応から、試料ＤＮＡ３０１の塩基配列を読むことができる。上記シーケンス反応では、異なる発光波長を持つ４種の蛍光体でそれぞれ標識されたプライマーを用いて、いわゆるＡ反応、Ｃ反応、Ｇ反応、及びＴ反応を行なうもので、蛍光標識プライマー３３０として通常の４色プライマーを用いることができるので、取り扱いが簡単で便利である。即ち、３’末端に選択配列を持つ１６種の蛍光標識プライマー（４色なので合計６４種のプライマーとなる）を作る必要がない利点がある。
【００３２】
（第２の実施例）
本実施例は２本鎖ＤＮＡの塩基配列を３’末端、５’末端の両側から同時に決定する例である。図７は、選択配列を持つアンカープライマー、標識プライマーとＤＮＡ断片の関係を示す図である。蛍光標識されたフォワードプライマー（＋鎖を相補鎖伸長合成するために使用されるプライマー）１７１、及びプライマー（−鎖を相補鎖伸長合成するために使用されるプライマー）３７１を用いるが、標識蛍光体はそれぞれＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（３１４、発光波長６１５ｎｍ）、及びＣｙ−５（１４１、発光波長６５４ｎｍ）を用いた。以後、これらプライマーを、プライマー−ａ（１７１、フォワードプライマー）、プライマー−ｂ（３７１）と呼ぶ。プライマー−ａ（１７１）、−ｂ（３７１）、アンカープライマー（３６１、３６２）とＤＮＡオリゴマー３０４を末端に付けたＤＮＡ断片の関係を図７に示した。プライマー−ａ（１７１）とアンカープライマー−ａ（３６１）のアンカー配列は実質共通の塩基配列を持ち、プライマー−ｂ（３７１）とアンカープライマー−ｂ（３６２）のアンカー配列は実質共通の塩基配列を持つ。プライマー−ａ、−ｂは、部分的にＤＮＡ断片にハイブリダイズすることはあっても安定ではなくアンカープライマーの存在なしでは相補鎖合成は起こさない塩基配列としてある。即ち、アンカープライマーが伸長してできたＤＮＡ鎖３１６の部分にだけ安定にハイブリダイズし、シーケンシング産物を作る。
【００３３】
ＤＮＡ断片に結合させるＤＮＡオリゴマーの塩基配列の中にｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素Ｆｏｋ Ｉによる制限酵素認識部（−ＧＧＡＴＧ−）３１８を入れておく。この制限酵素Ｆｏｋ Ｉは制限酵素認識部３１８より３’末端側の９塩基の部位３１７を切断する制限酵素で、後で述べるように、ＤＮＡ断片に結合したＤＮＡオリゴマーを除去するのに用いることができる。アンカープライマー−ａ（３６１）は制限酵素認識部（但し、塩基が置換された制限酵素認識部である）３５１（ここではＮｌａ ＩＩＩによる制限酵素認識部）の塩基配列−ＣＡＴＧ−を一部変化させ３１３のようにＣ→Ｔとし−ＴＡＴＧ−と変化させて、制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩで切断できなくしたものとするが、ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素切断の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）３１８は持つので、Ｆｏｋ Ｉでは切断される。一方、アンカープライマー−ｂ（３６２）は制限酵素認識配列部−ＣＡＴＧ−３０５は保存するが、ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）の一部３１９を変化させ−ＧＴＡＴＧ−とし、Ｆｏｋ Ｉでは切断されないようにしてある。即ち、アンカープライマー−ａと−ｂを用いて、ＰＣＲ増幅した産物は制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩで片側を、ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素で反対側を切断でき、それぞれＤＮＡ断片の末端に導入したＤＮＡオリゴマーを除去できるよう工夫してある。もちろん、アンカープライマー−ａ、及び−ｂは、３’末端に２塩基からなる選別配列３１２（図７の例では、ＡＧ、ＴＣ）を持っており、それぞれ１６種のプライマーからなるアンカープライマーセットである。
【００３４】
以下、手順に従って説明する。第１の実施例と同様に解析しようとする試料ＤＮＡ（数Ｋｂ〜１０Ｋｂ）を含む液が２分割される。分割された一方の液は、試料ＤＮＡを制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩ（他の４塩基認識酵素でもよい）で切断する。制限酵素による切断部には既知の塩基配列を持ったＤＮＡオリゴマーをライゲーションにより結合する。ここで用いたＤＮＡオリゴマーは、塩基配列（配列番号３）、
５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧ−３’
をもつヘルパーオリゴマー１０１と、塩基配列（配列番号４）、
３’−ＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣ−５’
の３’端にビオチン（Ｂｉｏ）が導入され、５’端にリン酸基（Ｐ）を有する
３’ Ｂｉｏ−ＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣ Ｐ−５’
の構造を持つリンカーオリゴマー１０２である。ヘルパーオリゴマー１０１は、Ｎｌａ ＩＩＩにより生じる突出端であるＣＡＴＧ−３’を除いた塩基配列はリンカーオリゴマー１０２の塩基配列と相補的な関係にあり、ビオチン（Ｂｉｏ）は伸長反応をブロックするために導入されたものであり、３’端のＯＨ基をビオチン（Ｂｉｏ）以外の物質で修飾してもよい。ＤＮＡオリゴマーを導入したＤＮＡ鎖には、一方の末端近傍にＮｌａ ＩＩＩ、他方の末端の近傍にＦｏｋ Ｉにより認識される切断部が存在する。導入されたリンカーオリゴマー１０２の３’末端は、これ以上鎖伸長しないようにビオチンでロックされている。ライゲーションの収率が悪い場合は、５’−Ｐを持たないリンカーを用いて、ヘルパオリゴマー１０１のみをライゲーションした後、ポリメラーゼ反応で相補鎖を合成する。
【００３５】
この場合、３’末端はターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼでジデオキシヌクレオチドを３’末端に導入してロックする。この手法を用いれば、プライマー同士がライゲーションでダイマーとなることを防げれるので、高効率でヘルパオリゴマー１０１とリンカーオリゴマー１０２の塩基配列をＤＮＡ鎖に導入できる。ＤＮＡ断片のセルフライゲーションは大過剰（１００倍）のオリゴマーを用いることで防止できる。アンカープライマー−ａ（アンカープライマーセットａ）、及びアンカープラマイマー−ｂ（アンカープライマーセットｂ）は、導入されたＤＮＡオリゴマー、及びＮｌａ ＩＩＩによる認識部に共通してハイブリダイズするが、アンカープライマー−ａは、Ｎｌａ ＩＩＩによる認識部の塩基配列が−ＣＡＴＧＮＮ３’から−ＴＡＴＧＮＮ３’へと変化している。一方、アンカープライマー−ｂは、Ｆｏｋ Ｉによる認識部の塩基配列が−ＧＧＡＴＧＣＡＴＧＮＮから−ＧＴＡＴＧＣＡＴＧＮＮへと変化している。これらの変化は、いずれも相補鎖合成には支障のない点置換である。
【００３６】
図８は、選択配列を持つアンカープイライマーを用いてＤＮＡ断片を選別してＰＣＲを行なうに先立ち少量のＤＮＡ断片でプライマーの対を決定する方法を説明する図である。ＤＮＡ断片の混合物をＰＣＲ増幅するためのプライマーの対を決定するために、第１の実施例と同様の電気泳動スペクトルを作る。即ち、先に２分割された一方の試料溶液（制限酵素により切断されたＤＮＡ断片群を含む）を、さらに、図８に示すように１６分割しそれぞれ容器に収納し、それぞれにアンカープライマーセットｂに属する１６種のプライマー１１０を１種づつ加え、更に蛍光標識（＊）されたフォワードプライマー１１１を加え、サイクルシーケンシングの条件下で相補鎖伸長して、フォワードプライマー１１１から伸長した相補鎖１０６を形成する。ここではアンカープライマー−ｂを用いたが、アンカープライマー−ａ、あるいはまったく点置換を持たないプライマーセットでも同様に使用できる。反応ではまずアンカープライマー−ｂ（１１０）がＤＮＡ断片１００にハイブリダイズし、３’末端が完全にマッチしたものについて相補鎖伸長１０３がおこる。ここでマッチしない側の鎖は伸長しない。相補鎖は導入オリゴマー（ヘルパーオリゴマー１０１）部分まで行なわれ、結果として伸長鎖の３’末端にヘルパオリゴマー１０１にハイブリダイズする塩基配列１０４ができる。熱サイクル反応により、この相補鎖伸長１０３は、更に続いて、プライマー１１０のアンカー配列と相補な塩基配列１０５を３’末端にもつＤＮＡ断片を形成する。即ち、フォワードプライマー１１１のハイブリダイズする塩基配列１０５部分が形成される。この塩基配列１０５部分にフォワードプライマー１１１がハイブリダイズし、伸長した相補鎖１０６を形成する。以後は、通常のＰＣＲと同様に反応が進み、アンカープライマー−ａの末端塩基配列が完全にハイブリダイズする、ＤＮＡ断片と実質同じ長さ（両端のアンカープライマーの長さだけ長い）の蛍光標識ＤＮＡ断片を得る。
【００３７】
ここではＤＮＡ断片混合物の長さを、ＤＮＡ断片の末端の２塩基種毎に求めるのに用いたが、ＤＮＡ断片混合物をその末端の２塩基配列毎にＰＣＲ増幅する手法としても有効である。選別配列を２塩基から３あるいは４塩基に増やすと１塩基ミスマッチしていてもプライマーとして機能することがある。これを防ぐため、例えば３塩基の選択配列を持つ場合、アンカープライマーの３’末端から４塩基目（選択配列の手前の塩基）にイノシンを入れ、末端の結合力を弱める。この場合、更に選択配列にミスマッチがあると相補鎖合成は非常に困難になり選別特性を上げるのに都合が良い。
【００３８】
各１６種のアンカープライマー−ｂ毎に得られた蛍光標識ＤＮＡ鎖をゲル電気泳動分離して、混合物中に含まれるＤＮＡ鎖の末端塩基配列と長さを知ることができる。このようにして得られた末端塩基配列と長さを用いて、ＰＣＲ用プライマーを決めるが、２つのプライマーはそれぞれアンカープライマー−ａ、及び−ｂから１種づつ選ぶ。この２つのプライマー（例えば、アンカープライマー−ａ（３６１）、及び−ｂ（３６２））を用いてＰＣＲ増幅することにより、図７に示すような、一方の末端近傍にＮｌａ ＩＩＩ、他方の末端希望にＦｏｋ Ｉによる切断部を持つＤＮＡ断片を得る。得られた種々のＤＮＡ断片をエタノール沈殿により精製した後、バッファー液に溶かしてそれぞれ２分割し、各ＤＮＡ断片について（ａ）、及び（ｂ）の溶液を得る。（ａ）の溶液にはＮｌａ ＩＩＩを入れ、（ｂ）の溶液にはＦｏｋ Ｉを入れ、ＤＮＡ断片を切断する。Ｎｌａ ＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片を１本鎖化し、蛍光標識プライマー１７１（フォワードプライマー）を用いてサイクル反応下で相補合成すると、３’末端側に元の試料ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持ち、元の試料ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして更に相補鎖伸長可能なＤＮＡ断片（相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０４）が生成する。同様にして、Ｆｏｋ Ｉにより切断されたＤＮＡ断片を１本鎖化し、蛍光標識プライマー３７１を用いてサイクル反応下で相補合成すると、３’末端側に元の試料ＤＮＡ３０１と相補な塩基配列を持ち、元の試料ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして更に相補鎖伸長可能なＤＮＡ断片（相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０６）が生成する。このようにして、元の試料ＤＮＡ鎖３０１にハイブリダイズしてさらに相補鎖伸長可能なＤＮＡ断片４０４、４０６を予め用意する。
【００３９】
次いで、両者を混合し（最後まで別々でも良い）、制限酵素による切断前の全長をもつ試料ＤＮＡ３０１を加え、更に、塩基配列決定用の試薬（ｄｄＮＴＰ：ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む試薬）とを加えてサイクルシーケンシング反応を行なう。この反応により、ＤＮＡ鎖の前後の塩基配列決定に必要な情報を得ることができる。即ち、蛍光標識プライマー１７１、３７１を用いたシーケンシング反応からＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の塩基配列がわかり、上記の相補鎖伸長した蛍光標識プライマー４０４、４０６を用いたシーケンシング反応からこのＤＮＡ断片がつながるべき塩基配列（つなぎの塩基配列）がわかる。即ち、第１の実施例と同様にＤＮＡ断片の塩基配列と、この塩基配列に隣接する塩基配列を決定できる。
【００４０】
ここではプライマーはＤＮＡ２本鎖（＋、−鎖）に対応して２色（２種の蛍光標識されたプライマー）であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの識別は、異なる電気泳動路で行なう、即ち、末端塩基種毎に異なる電気泳動路で泳動させる（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、６４８−６５１（１９９１））。
【００４１】
一方、４色蛍光体プライマー（４種の蛍光体のそれぞれで標識されたプライマー）を用いる時には、（ａ）の溶液と（ｂ）の溶液を混合せずに、第１の実施例と同様にして行なう。このようにＤＮＡ鎖の両端に異なる切断部を持つプライマーでＰＣＲを行なうことで、２本鎖の両側から同時に塩基配列決定をできるので効率が良い。また、両末端の続きの塩基配列を同時に知ることができるので、塩基配列決定するＤＮＡ断片の数を最小にできる利点がある。
【００４２】
以上の各実施例での試料ＤＮＡの長さは数Ｋｂ〜１０Ｋｂであればよく、検査対象から抽出されたＤＮＡから断片化されたＤＮＡ断片試料であってもよいことはいうまでもない。
【００４３】
【発明の効果】
プライマーセットを用いて塩基配列決定する方法は多色計測を用いるシステムでは準備するプライマーの数が多く大変であったが、本発明ではアンカープライマーにＤＮＡ断片の選別機能を持たせることにより、少数の既存プライマーを用いて簡単に長い試料ＤＮＡの塩基配列決定ができる。さらに、ＤＮＡ鎖の両端に制限酵素により切断可能な異なる切断部を持つプライマーでＰＣＲを行ない、２本鎖の両側から同時に塩基配列決定できるので効率が良い。
【００４４】
（配列表）
配列番号：１
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
配列
ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
配列番号：２
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
配列
ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
配列番号：３
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
配列
ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧ
配列番号：４
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
配列
ＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の試料調製法を用いるＤＮＡ解析プロセスを説明する図。
【図２】ＤＮＡオリゴマーをライゲーション結合したＤＮＡ断片を示す図。
【図３】（ａ）は、ＤＮＡオリゴマーを結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするアンカープライマーセットの概念図、（ｂ）は、ＤＮＡオリゴマーを結合した後のＤＮＡ鎖（１本鎖）の末端にハイブリダイズするプライマーセットの概念図。
【図４】１６種の選択プライマーを用いて得たＤＮＡ断片の相補鎖合成の産物のゲル電気泳動スペクトルの例を示す図。
【図５】検出されたＤＮＡ断片の構造例を示す図。
【図６】アンカープライマーを用いた相補鎖合成（ＰＣＲ増幅）により得られる産物の一例を示す図。
【図７】選択配列を持つアンカープライマー、標識プライマーとＤＮＡ断片の関係を示す図。
【図８】選択配列を持つアンカープイライマーを用いてＤＮＡ断片を選別してＰＣＲを行なうに先立ち少量のＤＮＡ断片でプライマーの対を決定する方法を説明する図。
【符号の説明】
３０１…切断前の試料ＤＮＡ、３０２…試料ＤＮＡを含む溶液、３０２−１…第１のチューブ、３０２−２…第２のチューブ、３０３…制限酵素切断されたＤＮＡ断片群、３０４…ＤＮＡオリゴマー、３０４’…ＤＮＡオリゴマーの伸長部分、３０５…制限酵素認識配列部−ＣＡＴＧ−、３０６…アンカープライマーセット、３０７…プライマーセット、３１１…アンカー配列、３１２…選別配列、３１３…アンカープライマーセットの３’末端から６塩基目の塩基、３１４…蛍光標識（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、１４１…蛍光標識（Ｃｙ−５）、３１５…ＤＮＡオリゴマーに相補的な部分（共通プライマー配列）、３１６…アンカープライマーが伸長してできたＤＮＡ鎖（相補鎖合成されたアンカー配列）、３１７…制限酵素Ｆｏｋ Ｉの制限酵素認識部より３’末端側の９塩基の部位、３１８…制限酵素Ｆｏｋ Ｉによる制限酵素認識部（−ＧＧＡＴＧ−）、３１９…ｃｌａｓｓ２Ａの制限酵素の認識配列（−ＧＧＡＴＧ−）の一部、３２０…ＤＮＡ断片群を含む液、３２１…ライゲーション反応生成物を含む液、３２２、３２３…チューブ、３２２−１、３２２−２、〜、３２２−１６…チューブ、３２３−１、３２３−２、〜、３２３−ｋ…容器、３３０…蛍光標識プライマー、３５１…塩基が置換された認識配列、３６１…アンカープライマー−ａ（ＡＧ選別配列を持ったアンカープライマー）、３６２…アンカープライマー−ｂ（ＴＧ選別配列を持ったアンカープライマー）、３７１…プライマー−ｂ、１７１…プライマー−ａ（フォワードプライマー）、１００…ＤＮＡ断片、１０１…ヘルパーオリゴマー、１０２…リンカーオリゴマー、１０３…ＤＮＡ断片の合成相補（相補鎖伸長鎖）、１０４…リンカーオリゴマーにハイブリダイズする塩基配列、１０５…プライマーのアンカー配列と相補な塩基配列、１０６…プライマー１１１から伸長した相補鎖、１１０…アンカープライマーセットに属する１６種のプライマー、１１１…フォワードプライマー、４００…制限酵素切断部位、４０２、４０４、４０６…相補鎖伸長した蛍光標識プライマー。
Claims (11)
- （１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の少なくとも３'末端側に塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列とを有し、前記認識部配列の一部の塩基が置換され、前記制限酵素で切断できない塩基配列部分を有するアンカープライマーと、前記制限酵素で切断を受ける塩基配列を有するプライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、（４）増幅された前記特定のＤＮＡ断片の片方の末端を切断したＤＮＡ鎖を得る工程と、（５）少なくとも前記アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、前記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない蛍光標識プライマーを用いて、前記工程（４）で得た前記ＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない相補鎖合成ＤＮＡ断片を得る工程と、（６）前記蛍光標識プライマーと前記相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用い、前記工程（４）で得た前記ＤＮＡ鎖、前記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、前記ＤＮＡ鎖の塩基配列と前記ＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の前記試料ＤＮＡの塩基配列とを決定することを特徴とする塩基配列決定方法。
- （１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の少なくとも３'末端側に塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列とを有し、前記認識部配列の一部の塩基が置換され、前記制限酵素で切断できない塩基配列部分を有するアンカープライマーと、前記制限酵素で切断を受ける塩基配列を有するプライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、（４）増幅された前記特定のＤＮＡ断片の片方の末端を切断したＤＮＡ鎖を得る工程と、（５）少なくとも前記アンカー配列と実質的に同じ配列を有し、前記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない蛍光標識プライマーを用いて、前記工程（４）で得た前記ＤＮＡ鎖、前記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、前記ＤＮＡ鎖の塩基配列と前記ＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の前記試料ＤＮＡの塩基配列とを決定することを特徴とする塩基配列決定方法。
- 請求項１または請求項２に記載の方法において、前記蛍光標識プライマーは、少なくとも前記アンカー配列と実質同じ配列を持つことを特徴とする塩基配列決定方法。
- （１）試料ＤＮＡを制限酵素で切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の少なくとも３'末端側に塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上のアンカー配列と
を有し、前記認識部配列の一部の塩基が置換され、前記制限酵素で切断できない塩基配列部分を有するアンカープライマーと、前記制限酵素で切断を受ける塩基配列を有するプライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程とを有し、増幅された前記特定のＤＮＡ断片の塩基配列を決定することを特徴とする塩基配列決定方法。 - （１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素で切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の少なくとも３'末端側に塩基配列が既知であり、第２の制限酵素が認識する認識部配列をもつオリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記第１の制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる第１の選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上の第１のアンカー配列とを有し、前記認識部配列の一部の塩基が置換され、前記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープライマーと、前記第１の制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる第２の選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上の第２のアンカー配列とを有し、前記オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、前記第２の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、（４）増幅された前記特定のＤＮＡ断片の第１の末端を前記第２の制限酵素により切断して第１のＤＮＡ鎖を、増幅された前記特定のＤＮＡ断片の第２の末端を前記第１の制限酵素により切断して第２のＤＮＡ鎖を、それぞれ得る工程と、（５）少なくとも前記第１のアンカー配列と実質的に同じ配列を有し、前記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない第１の蛍光標識プライマーと、少なくとも前記第２のアンカー配列と実質的に同じ配列を有し、前記試料ＤＮＡに直接ハイブリダイズしない第２の蛍光標識プライマーとを用いて、前記工程（４）で得た前記第１、第２のＤＮＡ鎖を鋳型として相補鎖合成を行ない第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片を得る工程と、（６）前記第１、第２の蛍光標識プライマーと前記第１、第２の相補鎖合成ＤＮＡ断片とを用い、前記工程（４）で得た前記第１、第２のＤＮＡ鎖、前記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、前記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列と、前記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分の前記試料ＤＮＡの塩基配列とを決定することを特徴とする塩基配列決定方法。
- （１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素で切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の少なくとも３'末端側に塩基配列が既知であり、第２の制限酵素が認識する認識部配列をもつオリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記第１の制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる第１の選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上の第１のアンカー配列とを有し、前記認識部配列の一部の塩基が置換され、前記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープライマーと、前記第１の制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる第２の選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上の第２のアンカー配列とを有し、前記オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、前記第２の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程と、（４）増幅された前記特定のＤＮＡ断片の第１の末端を前記第２の制限酵素により切断して第１のＤＮＡ鎖を、増幅された前記特定のＤＮＡ断片の第２の末端を前記第１の制限酵素により切断して第２のＤＮＡ鎖を、それぞれ得る工程と、（５）前記第１、第２の蛍光標識プライマー用い、前記工程（４）で得た前記第１、第２のＤＮＡ鎖、前記試料ＤＮＡを鋳型としてシーケンシング反応を行なう工程とを有し、前記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列と、前記第１、第２のＤＮＡ鎖の塩基配列に隣接する部分前記試料ＤＮＡの塩基配列とを決定することを特徴とする塩基配列決定方法。
- 請求項５または請求項６に記載の方法において、前記第１の蛍光標識プライマーは、少なくとも前記第１のアンカー配列と実質同じ配列を、前記第２の蛍光標識プライマーは、少なくとも前記第２のアンカー配列と実質同じ配列を、それぞれ持つことを特徴とする塩基配列決定方法。
- （１）試料ＤＮＡを第１の制限酵素で切断して複数長さのＤＮＡ断片を生成する工程と、（２）前記ＤＮＡ断片の少なくとも３'末端側に塩基配列が既知であり、第２の制限酵素が認識する認識部配列をもつオリゴヌクレオチドを付加する工程と、（３）前記第１の制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる第１の選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上の第１のアンカー配列とを
有し、前記認識部配列の一部の塩基が置換され、前記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープライマーと、前記第１の制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる第２の選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上の第２のアンカー配列とを有し、前記オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、前記第２の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーとを用いて、ＰＣＲにより特定のＤＮＡ断片を増幅する工程とを有し、増幅された前記特定のＤＮＡ断片の塩基配列を決定することを特徴とする塩基配列決定方法。 - 少なくともライゲーション用オリゴヌクレオチド、相補鎖合成用プライマーからなる試薬キットにおいて、前記相補鎖合成用プライマーが、前記オリゴヌクレオチドと実質的に相補な配列と、制限酵素が認識する認識部配列と、該認識部配列の３'末端側に２塩基からなる選択配列とを有する１６種のプライマーからなる第１のプライマーセットと、該第１のプライマーセットの各プライマーの５'末端側にアンカー配列を付加し、前記各プライマーの前記認識部配列の一部の塩
基を置換した１６種のプライマーからなる第２のプライマーとを含むことを特徴とする試薬キット。 - 少なくともライゲーション用オリゴヌクレオチド、相補鎖合成用プライマーからなる試薬キットにおいて、前記相補鎖合成用プライマーが、第１の制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基からなる第１の選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上の第１のアンカー配列とを有し、前記認識部配列の一部の塩基が置換され、前記第１の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第１のアンカープライマーセットと、前記第１の制限酵素が認識する認識部配列と前記オリゴヌクレオチドの配列とに実質的に相補な配列と、３'末端側の１塩基〜４塩基
からなる第２の選択配列と、５'末端側に少なくとも８マー以上の第２のアンカー配列とを有し、前記オリゴヌクレオチドの一部の塩基が置換され、前記第２の制限酵素で切断できない塩基配列部分を有する第２のアンカープライマーセットを含むことを特徴とする試薬キット。 - 請求項１０に記載の試薬キットにおいて、前記第１、第２の選択配列の塩基が２塩基からなり、前記第１、第２のアンカープライマーセットは、前記２塩基からなる全ての組み合わせの塩基配列を含むことを特徴とする試薬キット。
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|---|---|---|---|
| JP27202796A JP3608312B2 (ja) | 1996-01-30 | 1996-10-15 | 試料調製方法及びこれに用いる試薬キット |
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| JP8-13634 | 1996-01-30 | ||
| JP1363496 | 1996-01-30 | ||
| JP27202796A JP3608312B2 (ja) | 1996-01-30 | 1996-10-15 | 試料調製方法及びこれに用いる試薬キット |
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-
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- 1996-10-15 JP JP27202796A patent/JP3608312B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH09266800A (ja) | 1997-10-14 |
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