EA009605B1 - Способ характеристики полинуклеотидов - Google Patents

Abstract

Способ настоящего изобретения, используемый для идентификации специфичных характеристик полинуклеотидной мишени в любом образце, включает в себя следующие стадии: i) присоединение к одному концу каждой полинуклеотидной мишени в данном образце полинуклеотидной сигнальной последовательности, которая специфична в отношении исследуемой характеристики; ii) контактирование данных полинуклеотидов-мишеней с молекулой, взаимодействующей с соответствующей полинуклеотидной мишенью, в которой присутствует исследуемая характеристика; iii) присоединение полинуклеотидной адаптерной последовательности к тем полинуклеотидным мишеням, которые взаимодействуют с молекулой стадии (ii), адаптер которой присоединен к концу данной полинуклеотидной мишени в направлении, противоположном присоединению соответствующей сигнальной последовательности; iv) осуществление реакции амплификации тех полинуклеотидных мишеней, которые включают и данный адаптер, и сигнальную последовательность, повторяя, по выбору, стадии (i)-(iv) в отношении других характеристик; (v) идентификация всех сигнальных последовательностей, представленных в данных амплифицируемых продуктах, и их порядка с тем, чтобы определить соответствующие характеристики в каждой полинуклеотидной мишени.

Description

Настоящее изобретение относится к способам конвертирования полинуклеотида-мишени в считываемые информационные цепи для последующего определения последовательности полинуклеотидамишени.

Сущность изобретения

Успехи в изучении молекул привели отчасти к усовершенствованию способов, используемых для того, чтобы охарактеризовать определенные молекулы или их биологические реакции. В частности, были усовершенствованы исследования нуклеиновых кислот, ДНК и РНК, в результате развития технологий, используемых для анализа последовательностей и изучения их гибридизации.

Основной способ, обычно используемый для широкомасштабного секвенирования молекул ДНК, представляет собой способ терминирования цепи. Указанный способ впервые разработан 8аидег и Сои18ои (8алдег а1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, 1977; 74:5463-5467) и основан на использовании дидезоксипроизводных из четырех нуклеотидов, которые включаются в образующуюся в полимеразной реакции полинуклеотидную цепь. При включении указанные дидезоксипроизводные терминируют полимеразную реакцию, затем продукты реакции разделяют с помощью гель-электрофореза и анализируют с целью определения положения, в котором данное конкретное дидезоксипроизводное включается в образующуюся цепь.

Хотя данный способ широко используют и получают надежные результаты, общепризнанно, что он медленный, трудоемкий и дорогостоящий.

В И8-А-5302509 раскрыт способ секвенирования полинуклеотида, иммобилизованного на твердом носителе. Данный способ основан на встраивании в иммобилизованный полинуклеотид в присутствии ДНК-полимеразы З'-блокируемых оснований А, О, С и Т, имеющих разные флуоресцентные метки. Полимераза встраивает в полинуклеотид-мишень комплементарное основание и препятствует дальнейшему добавлению З'-блокирующей группы. Затем можно определить метку встроенного основания и удалить соответствующую блокирующую группу путем химического отщепления для продолжения процесса полимеризации. Однако необходимость удаления указанных блокирующих групп данным способом является времяемким процессом и должно осуществляться с высокой эффективностью.

В \УО-А-00/39333 описан способ секвенирования полинуклеотида путем конвертирования последовательности полинуклеотида-мишени в другой полинуклеотид, обладающий определенной последовательностью и содержащий позиционную информацию. Считается, что информация последовательности мишени усиливается во втором полинуклеотиде, существенно облегчая различение отдельных оснований в данной молекуле-мишени. Это достигается с использованием усиливающих маркеров, которые предопределяют последовательности нуклеиновых кислот. Каждое из оснований, аденин, цитозин, гуанин и тимин, находящихся в данной молекуле-мишени, представлено индивидуальным усиливающим маркером, конвертируя исходную последовательность в усиливающую последовательность. Впоследствии для определения порядка усиливающих маркеров можно использовать традиционные методики и таким образом определять специфичную последовательность в полинуклеотиде-мишени.

В предпочтительном способе секвенирования каждый усиливающий маркер содержит метку, например флуоресцентную метку, которую затем можно идентифицировать и использовать для характеристики определенного усиливающего маркера.

Хотя раскрытый в данной патентной публикации способ обладает множеством преимуществ, существует все же необходимость в усовершенствовании способов секвенирования полинуклеотидных мишеней.

Краткое изложение существа изобретения

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения способ идентификации конкретных характеристик полинуклеотидной мишени, представленной в любом образце, включает в себя следующие стадии:

ί) присоединение к одному концу каждого полинуклеотида-мишени в данном образце полинуклеотидной сигнальной последовательности, которая специфична для определенной изучаемой характеристики;

ίί) контактирование полинуклеотидов-мишеней с той или иной молекулой, взаимодействующей с определенной полинуклеотидной мишенью, характеристика которой представлена;

ϊϊΐ) отделение взаимодействующих полинуклеотидов-мишеней от невзаимодействующих полинуклеотидов-мишеней;

ίν) повторение стадий (ί)-(ίίί), по выбору;

ν) идентификация всех сигнальных последовательностей, представленных в отделенных полинуклеотидах-мишенях, и их порядка для определения характеристики каждого полинуклеотида-мишени.

Способ согласно изобретению позволяет определять многие характеристики полинуклеотидамишени простым способом, который можно легко автоматизировать. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ основан на включении двух полинуклеотидных молекул в такие мишени, которые обладают специфической характеристикой, позволяющей осуществить реакцию амплификации для увеличения числа полинуклеотидов-мишеней с требуемой характеристикой

- 1 009605 и для эффективного удаления мишеней, не имеющих такой характеристики. Данный способ, в частности, пригоден для определения указанной последовательности полинуклеотида-мишени.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения способ определения последовательности полинуклеотида-мишени включает в себя следующие стадии:

ί) обработку образца двухцепочечного полинуклеотида-мишени для создания выступающих 5'- и З'-концов с каждой из сторон, с определенным числом оснований;

ίί) разделение обработанного образца и контактирование каждого отделенного образца с двухцепочечной полинуклеотидной сигнальной последовательностью и двухцепочечным адаптерным полинуклеотидом, причем каждая сигнальная последовательность представляет собой специфическую полинуклеотидную последовательность по 5'-выступу и включает в себя выступ, который способствует гибридизации и лигированию с З'-концом данного полинуклеотида-мишени, а каждый адаптер включает в себя выступ, который представляет собой последовательность, комплементарную последовательности, представленной сигнальной последовательностью;

ϊϊΐ) осуществление полимеразной реакции образца(ов) с использованием праймеров, которые гибридизуются с данной сигнальной последовательностью и с адаптерной последовательностью, причем продукт данной полимеразной реакции включает в себя сайт рестрикции, что позволяет отщеплять данный адаптер, и та часть данного полинуклеотида-мишени, которая образована 5'-выступом, образует новый 5'-выступ, повторяя стадии (ί)-(ίίί), по выбору, с использованием ферментов рестрикции для создания выступов;

ίν) идентификацию всех сигнальных последовательностей, представленных в данных амплифицируемых продуктах, и их порядка для определения последовательности данного полинуклеотида-мишени.

Описание чертежей

Настоящее изобретение описано со ссылками на прилагаемые чертежи:

на фиг. 1 схематически представлена сигнальная последовательность, иллюстрирующая конверсию части полинуклеотида-мишени в определенную сигнальную последовательность;

на фиг. 2 схематически представлен эксперимент по секвенированию полинуклеотида, осуществляемому с использованием настоящего изобретения;

на фиг. 3 схематически представлено использование различных компартментов (ячеек) с ассоциированными специфическими сигнальными последовательностями в процессе конверсии;

на фиг. 4 представлены результаты конверсии, осуществляемой в трех циклах, с образованием ряда сигнальных последовательностей, представляющих основную последовательность полинуклеотидамишени;

на фиг. 5 схематически представлен эксперимент по секвенированию полинуклеотида, осуществляемому для определения трех последовательностей оснований за цикл;

на фиг. 6 представлены результаты конверсии, демонстрирующие включение специфических сигнальных последовательностей в полинуклеотид-мишень.

Описание изобретения

Способ согласно изобретению представляет собой адаптацию способа конверсии, раскрытого в νθ-Α-00/39333. Вкратце, настоящее изобретение дает возможность получения специфических характеристик полинуклеотидной мишени, идентифицируемой на основе включения специфических сигнальных последовательностей. Такие сигнальные последовательности встраивают во все представленные в образце полинуклеотиды-мишени, но лишь те из них, которые включают в себя определенную специфическую характеристику, отделяют и характеризуют.

Данный способ, в частности, пригоден для определения последовательности полинуклеотидамишени. Используя данный способ, определенное число последовательностей одного из концов данного полинуклеотида-мишени можно конвертировать в заданную сигнальную последовательность на другом конце данной мишени. С помощью ряда стадий секвенированный конец данной мишени расщепляют, а конец с сигнальной последовательностью достраивают, создавая определенный ряд сигнальных последовательностей, которые можно определить, осуществляя последующую стадию идентификации.

Термин полинуклеотид хорошо известен в данной области и используется для обозначения группы родственных нуклеиново-кислотных молекул, например ДНК или РНК. Нуклеиново-кислотные миметики, например ΡΝΑ, ΤΝΑ (замкнутая нуклеиновая кислота) и 2'-О-те1йКИА, все они также входят в объем настоящего изобретения.

Приведенные здесь обозначения оснований А, Т(И), С и С относятся к нуклеотидным основаниям, аденину, тимину (урацилу), гуанину и цитозину, как принято в данной области. Урацил заменяет тимин, если полинуклеотид представляет собой РНК, либо его можно ввести в ДНК с использованием ЙЛТР, известного в данной области.

Здесь упоминаются 5'- и 3'-концы полинуклеотида-мишени. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения полинуклеотид-мишень является двухцепочечным, так что каждый конец включает в себя оба конца: 5'- и 3'-. Однако упоминание 5'- и 3'-концов связано с исследуемой цепьюмишенью или с секвенируемой цепью. Очевидно также, что там, где описание относится к 5'-концу как к концу, который собираются секвенировать, можно модифицировать методику так, чтобы секвенировать

- 2 009605 пришлось З'-конец, т.е. сигнальные последовательности и адаптеры сшивают с противоположными концами последовательностей, которые указаны здесь.

В самом широком аспекте настоящее изобретение открывает возможность идентификации специфических характеристик полинуклеотида-мишени. Характеристикой может являться последовательность полинуклеотида. Альтернативно характеристикой может являться способность полинуклеотида-мишени связываться с другими молекулами, например с ДНК-связывающими белками, или гибридизоваться с комплементарными полинуклеотидами. Данный способ можно также использовать для идентификации и характеристики сайтов ферментов рестрикции, присутствующих в пределах данной полинуклеотидной мишени.

Каждую характеристику идентифицируют, осуществляя реакцию с молекулой, которая взаимодействует с полинуклеотидом-мишенью, обладающим данной характеристикой и отличающимся от полинуклеотидов-мишеней, не обладающих данной характеристикой. Те полинуклеотиды-мишени, которые взаимодействуют с данной молекулой, маркируют сигнальной последовательностью, которая специфична для данной характеристики и позволяет определить данную характеристику позднее, на стадии считывания.

Настоящее изобретение основано на включении сигнальной последовательности во все полинуклеотиды-мишени в образце, причем сигнальная последовательность представляет изучаемую специфическую характеристику. Затем эти полинуклеотиды-мишени контактируют с молекулой, и те из них, которые взаимодействуют с ней, отбирают. Таким способом представляется возможным определять характеристику (свойство) идентификации сигнальной последовательности.

Отделение молекул-мишеней, которые взаимодействуют с указанной молекулой, осуществляют различными путями. Например, молекула может содержать связывающую составляющую, что позволяет разделить комплекс полинуклеотид-мишень/молекула. Подходящие связывающие составляющие включают в себя антитела и биотин/стрептавидин. Альтернативно можно осуществить сортировку по размеру, поскольку можно отличить комплекс мишень/молекула от компонентов, не вошедших в состав комплекса.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения основан на включении полинуклеотидной сигнальной последовательности и полинуклеотидной адаптерной последовательности в полинуклеотид-мишень, что позволяет проводить реакцию амплификации таким образом, чтобы амплифицировались те нуклеотиды-мишени, которые реагируют со специфической молекулой. Впоследствии полученные продукты полимеразной реакции могут быть охарактеризованы в повторных стадиях взаимодействия мишени с молекулой путем включения дополнительной сигнальной последовательности, представляющей исследуемую характеристику.

Способ согласно изобретению предпочтительно осуществляют с использованием множества реактивных компартментов, по одному на каждую характеристику, которую предполагается изучать. Каждый реактивный компартмент ассоциирован с сигнальной последовательностью, специфичной для этого компартмента. Исследуемый образец, содержащий полинуклеотиды-мишени, разделен между реактивными компартментами и сигнальной последовательностью, которую присоединяют, например, путем лигирования к одному из концов каждого полинуклеотида-мишени. Сигнальная последовательность присоединяется ко всем полинуклеотидам-мишеням в таком компартменте безотносительно тому, обладает ли данная мишень соответствующей специфической характеристикой. На следующей стадии указанную характеристику тестируют путем реагирования каждой мишени с молекулой, которая специфически взаимодействует с теми мишенями, которые включают данную характеристику. Поэтому указанная молекула может представлять собой полинуклеотид-связывающий белок, фермент или иной полинуклеотид. Те мишени, которые взаимодействуют с данными молекулами, впоследствии отделяют. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула включает в себя адаптерную последовательность. По этой причине при взаимодействии мишени с молекулой указанная молекула (содержащая адаптер) присоединяется или лигируется с мишенью. Те мишени, которые включают в себя и сигнальную последовательность, и адаптер, впоследствии амплифицируют.

Реакцию амплификации можно осуществить с использованием любого подходящего способа. В предпочтительном способе используют традиционную полимеразную реакцию и известные в данной области условия. Следует иметь в виду, что можно осуществлять и иные реакции амплификации, в том числе изотермическую ПЦР и амплификацию в бактериальных клетках.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют способ секвенирования первичных нуклеотидных последовательностей в исследуемом полинуклеотиде-мишени. Это осуществляется путем идентификации на одном из концов полинуклеотида-мишени определенного числа оснований, например, трех или четырех оснований, после чего данную информацию конвертируют в сигнальную последовательность на противоположном конце, тем самым создавая возможность для осуществления дополнительных циклов конверсии без удаления встроенных в предыдущих циклах сигнальных последовательностей.

Способ секвенирования можно осуществлять путем получения полинуклеотида-мишени и обработки его рядом ферментов рестрикции с образованием заданных выступающих областей на каждом конце полинуклеотида-мишени, которые позволяют включать сигнальную последовательность и адаптер во время каждой стадии конверсии.

Сигнальная последовательность представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный полинуклеотид, который включает в себя разные элементы нуклеиново-кислотной последовательности. Каждая характеристика, например каждое основание А, Т(И), С и С в мишени, представлена отличающимся и заранее определенным элементом либо уникальным сочетанием элементов. Каждый элемент будет предпочтительно включать в себя два или более нуклеотидных основания, предпочтительно от 2 до 50 оснований, более предпочтительно 2-20 оснований и наиболее предпочтительно 4-10 оснований, например 6 оснований. Существует по меньшей мере два разных основания, содержащихся в каждом элементе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в каждом элементе существует три разных основания. Конструкция элементов такова, что во время стадии считывания можно отличить разные элементы, например, включением в реакцию полимеризации или в гибридизацию комплементарных олигонуклеотидов любых детектируемых меченых нуклеотидов. Например, если исследуемая характеристика представляет собой последовательность мишени, то каждое основание мишени представлено специфической совокупностью оснований в любом элементе.

В предпочтительном варианте каждая сигнальная последовательность включает в себя два элемента с разной последовательностью, которые представляют все четыре основания на мишени. В соответствии с этим вариантом указанные два элемента могут быть использованы как бинарная система, когда один элемент соответствует 0, а другой элемент соответствует 1. Каждое основание на мишени характеризуется сочетанием двух элементов. Например, как показано на фиг. 1, аденин может быть представлен с помощью 0+0, цитозин - с помощью 0+1, гуанин - с помощью 1+0, а тимин - с помощью 1+1. Необходимо различать элементы и поэтому в каждый элемент можно включить сигнал стоп. Предпочтительно также использовать разные элементы, соответствующие 1 и 0, в зависимости от того, находится ли основание в полинуклеотиде-мишени (матрице) в нечетном или в четном положении.

Это демонстрируется следующим образом.

Матричная последовательность с нечетной нумерацией:

0: АТТТТТАТ(СС)

1: СТТТТТСТ(СС)

Матричная последовательность с четной нумерацией:

0: АСССССАС(ТТ)

1: СССССССС(ТТ)

Подходящие сигнальные последовательности приведены также в ^О-А-00/39333.

Адаптер представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный полинуклеотид. Адаптер необходим для обеспечения нужной последовательности, при которой возможна амплификация. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения адаптер представляет собой двухцепочечный полинуклеотид, который включает в себя определенный выступ, способный к гибридизации и лигированию с комплементарной областью данного полинуклеотида-мишени. Эта комплементарная область, как правило, находится на конце мишени, противоположном тому, где встроена сигнальная последовательность. Адаптер создает необходимый сайт связывания праймера, нужный для реакции амплификации. В предпочтительном варианте адаптер конструируют для гибридизации с той частью полинуклеотида-мишени, которую секвенируют, а именно 5'-выступающей частью полинуклеотида. Если 5'-выступающая часть на мишени составляет 4 основания, то и комплементарный выступ в адаптере также составляет 4 основания. Это позволяет осуществлять лигирование с образованием двухцепочечного полинуклеотида. Полагая, что на мишени 5'-выступ представляет собой неизвестную последовательность, как правило, необходимо использовать сочетание адаптеров, имеющих все перестановки, например, для последовательности из 4 оснований. Адаптеры с разной последовательностью, используемые в реакциях разделения, обсуждаются ниже.

Каждый адаптер имеет, как правило, сайт, распознаваемый рестрикционным ферментом, что способствует его расщеплению на поздней стадии. Он может использоваться для создания нового 5'-выступа.

Способ секвенирования в предпочтительном варианте включает в себя следующие основные стадии.

Расщепление.

Вначале образец полинуклеотида-мишени обрабатывают одним или несколькими ферментами рестрикции, что приводит к появлению на мишени выступа с определенным числом оснований, например 3 основаниями, который позже используют в данной методике для лигирования сигнальной последовательности (создание выступа). На противоположном конце полинуклеотида-мишени также создают выступ (5'-выступ), который предназначен для идентификации (представления) с помощью сигнальной последовательности и лигирования с адаптером в процессе конверсии.

Лигирование.

Образец с полинуклеотидом-мишенью разделяют поровну на реакционные компартменты, в которых представлены все перестановки выступа, подлежащего секвенированию. Например, если секвени

- 4 009605 руемый выступ представляет собой 4 основания, тогда используют 256 реакционных компартментов. В первом компартменте полинуклеотид-мишень контактирует с сигнальной последовательностью, которая, к примеру, представляет АААА (при условии, что секвенируемый выступ составляют 4 основания) и эту сигнальную последовательность лигируют с З'-выступом во всех полинуклеотидах-мишенях. Адаптерный полинуклеотид с выступом ТТТТ также присоединяют, но его специфически сшивают с полинуклеотидами-мишенями, которые содержат выступ АААА, отставляя полинуклеотиды с отличающейся выступающей последовательностью с нелигируемым выступом. Эту же операцию осуществляют и в других компартментах, где в каждом представлено разное сочетание из 4 возможных оснований последовательности. В каждом случае адаптер будет дополнять последовательность, представленную сигнальной последовательностью.

Хотя и предпочтительно, чтобы сигнальная последовательность представляла все основания данного выступа, все же возможно, чтобы последовательность содержала меньше оснований по сравнению с выступом. Так, например, когда выступ содержит 4 основания, можно использовать сигнальную последовательность, в которой представлены З основания. Это иллюстрируется в описанных ниже примерах.

Амплификация.

После осуществления стадий лигирования образцы можно объединить и осуществить полимеразную реакцию. Полимеразную реакцию осуществляют с использованием праймеров, которые направлены на концы сигнальной последовательности и адаптера, и поэтому лишь те молекулы, которые успешно лигируют и сигнальную, и адаптерную последовательность, будут амплифицироваться экспоненциально, а молекулы, содержащие лишь сигнальную последовательность, будут удалены в результате линейной амплификации. В итоге получают совокупность конвертированных полинуклеотидных фрагментов, в которых выступ из 4 оснований, изначально образованный на одном конце полинуклеотида-мишени, замещается сигнальной последовательностью, представленной 4 основаниями на другом конце мишени.

В предпочтительном воплощении полимеразную реакцию осуществляют с использованием метил6СТР, который гарантирует, что нативные сайты ферментов рестрикции остаются неактивными. Дополнительные сайты ферментов рестрикции включаются с помощью адаптерных молекул, давая тем самым возможность для осуществления последующих циклов конверсии. Праймеры, используемые в полимеразной реакции, специфичны для последовательностей, находящихся внутри сигнальной последовательности и адаптера, гарантируя тем самым, что стадия амплификации осуществляется лишь в том случае, если и сигнальная последовательность, и адаптер лигированы в полинуклеотид-мишень.

Для сайтов, связывающих праймеры, предпочтительно также, чтобы они отличались разными наборами сигнальной последовательности и адаптера, т.е. чтобы сигнальная последовательность и адаптер, используемые в одном из циклов конверсии, включали праймер-связывающие сайты, отличные от тех, которые используются в предыдущем цикле. Это обеспечивает амплификацию правильной последовательности.

Выступы можно создать разными способами, хотя в предпочтительном варианте осуществления изобретения используют ферменты рестрикции, например, Ш-класс рестрикционных ферментов. Эти ферменты не проявляют специфичности к вырезаемой последовательности, и поэтому они могут создавать выступы, содержащие нуклеотидные основания всех типов. Сайт связывания фермента рестрикции можно разместить так, чтобы выступ образовался внутри существующего полинуклеотида-мишени. На практике предпочтительно выбирают ферменты, которые создают выступы из 3-4 пар оснований.

Рестрикционные эндонуклеазы класса ΙΙδ известны и идентифицированы в ΑΘ-Λ-00/39333.

В одном из вариантов осуществления полинуклеотид-мишень вначале обрабатывают адаптерным полинуклеотидом, который включает в себя узнающую последовательность для фермента рестрикции ВЬу1, после чего полинуклеотид обрабатывают рестрикционным ферментом для создания специфического выступа по 5'-концу. Нативные сайты распознавания для ВЬу1 инактивируют при первой обработке полинуклеотида-мишени путем метилирования. После создания первого выступа последующие выступы по 5'-концу предпочтительно создают с использованием фермента рестрикции δίαΝΙ. Это осуществляют путем лигирования специфической адаптерной последовательности по 5'-концу, которая включает узнающую последовательность для δίαΝΙ.

Изначально выступ по 3'-концу предпочтительно создают путем лигирования полинуклеотида, который включает заданный выступ. Этот заданный выступ позволяет исходной сигнальной последовательности гибридизоваться и сшиваться с 3'-концом. В другом воплощении полинуклеотид-мишень вначале обрабатывают с помощью адаптерного полинуклеотида, который включает в себя узнающую последовательность для ферментов рестрикции Мте1 и Еаг1 (или его изошизомера Еат 11041). Затем полинуклеотид обрабатывают ферментом рестрикции Мте1, чтобы отщепить 20 пар оснований от молекулы-мишени и связать ее с указанным адаптерным полинуклеотидом. Второй адаптерный полинуклеотид, содержащий узнающую последовательность для фермента рестрикции δίαΝΙ, лигируют затем с адаптерассоциированным полинуклеотидом-мишенью путем создания выступа с помощью Мте1. Осуществляют ПЦР-амплификацию для того, чтобы амплифицировать фрагменты, содержащие 20 п.н. полинуклеотида-мишени, фланкированной двумя адаптерными полинуклеотидами. Для того чтобы защитить внутренние сайты от последующей Еаг1- и δίαΝΙ -обработки, ПЦР осуществляют с метилированным 6СТР,

- 5 009605 замещающим обычный СТР в άΝΤΡ-смеси. Амплификацию полинуклеотидов-мишеней, фланкированных выступами, образованными с помощью Мте1 (т.е. побочными продуктами обработки), можно исключить путем использования нефосфорилированных вторых адаптеров. Специфичный выступ по 5'-концу создают путем обработки ПЦР-продукта ферментом рестрикции δίΟΝΙ (или его эквивалентами). Заданный выступ по З'-концу создают путем обработки ПЦР-продукта ферментом рестрикции Еаг1 (или Еат 11041). Сигнальная последовательность включает в себя сайт фермента рестрикции, который предпочтителен для фермента рестрикции Еаг1. Последующие циклы отщепления и включения осуществляют с использованием ферментов рестрикции Еаг1 и δίαΝΙ, как показано на фиг. 2.

Цикл конверсии дополнительно иллюстрирован на фиг. 3, на которой показана судьба пяти разных фрагментов в трех произвольно выбранных реакционных компартментах из 256 компартментов, используемых в данной методике. Сначала эти фрагменты равномерно распределяют между 256 компартментами. В компартмент 56, в котором надлежит идентифицировать выступ ТСТА, вводят сигнальную последовательность, имеющую указанный состав оснований, и сшивают с 3 основаниями З'-выступа на левом конце полинуклеотида-мишени. Такое лигирование происходит независимо от состава 5'-выступа из 4 оснований на правой стороне полинуклеотида. Затем вводят и лигируют специфический адаптер, который сшивают только с фрагментами 3'-ТСТА-5'-выступов. Нарушение комплементарности лигирования адаптера можно уменьшить, осуществляя лигирование в присутствии блокирующих адаптеров. Блокирующие адаптеры обладают отличающейся выступающей последовательностью по сравнению со специфическим адаптером, и поэтому лигируют с полинуклеотидом-мишенью, имеющим выступ, некомплементарный к данному специфическому адаптеру. Затем в заключительной реакции амплификации избирательно амплифицируют фрагменты, которые лигировали с указанным специфическим адаптером, и, следовательно, удаляют другие фрагменты, которые ассоциированы с некорректной сигнальной последовательностью. Такую же операцию осуществляют в компартментах 141 и 194 за тем исключением, что состав сигнальных последовательностей и адаптеров подбирают в соответствии с выступами, которые идентифицируют в указанных компартментах (3'-АТАС-5' и 3'-СААТ-5').

Полинуклеотиды-мишени из 256 компартментов предпочтительно объединяют в одну общую реакционную пробирку перед осуществлением реакции амплификации, избегая таким образом неудобства, связанного с осуществлением 256 отдельных реакций амплификации.

После осуществления последующих циклов конверсии последовательность на 5'-конце полинуклеотида-мишени уменьшается, а сигнальная последовательность, введенная по 3'-концу полинуклеотидамишени, возрастает определенным образом, корреспондируя с имеющимся секвенированным полинуклеотидом-мишенью. Определение типа и порядка указанных сигнальных последовательностей можно осуществлять с использованием способов, раскрытых в \УО-А-00/39333. или в находящейся на рассмотрении международной патентной заявке, поданной на имя ЬтдУйае, с приоритетом на основании 6В0308852.3.

Реакция амплификации может привести к нежелательным артефактам, и следует предпринять всевозможные шаги для их уменьшения или удаления. Например, предпочтительно, чтобы в разных сигнальных последовательностях (и также, по выбору, в разных адаптерах) сайт узнавания праймера отличался для уменьшения вероятности связывания праймеров с внутренними сигнальными последовательностями и амплификации фрагментов большей конвертируемой мишени.

Предпочтительно также создать сигнальные последовательности с тем, чтобы имеющиеся или последующие сигнальные последовательности включали различные последовательности оснований. Это служит гарантией того, что праймеры, вводимые для гибридизации с концевой сигнальной последовательностью, не будут гибридизоваться с внутренними сигнальными последовательностями, получаемыми для фрагментов, которые образуются в течение стадии амплификации.

Источником артефактов может быть также неполная обработка с помощью одного или нескольких ферментов рестрикции. Использование ферментов рестрикции, обладающих высокой специфичностью и активностью, уменьшит данную проблему.

Артефакты можно также удалить путем выделения очисткой в геле или путем иммобилизации полученных продуктов перед их обработкой соответствующим ферментом рестрикции; такие не полностью обработанные продукты будут оставаться иммобилизованными и могут быть отделены от продуктов полного расщепления.

Удаление избытка адаптеров и мишеней перед амплификацией также должно привести к уменьшению артефактов.

Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1. Первоначальное получение с использованием ВЬу1 и без рестрикции по массе.

Перед ДНК-фрагментацией (или после нее) полинуклеотид-мишень метилируют для инактивации нативных сайтов распознавания. Используют ВЬу1 в качестве фермента рестрикции, М.ВЬу (МедаЬаке Яекеагсй Ргобис1§) - для инактивации его нативных сайтов. Полинуклеотид-мишень фрагментируют случайным образом на куски по 500-1000 пар оснований путем механического гидродинамического сдвига с использованием Нубго8йеаг-устройства (ОепеМасЫпек). В сочетании с ультразвуком можно получить еще более короткие фрагменты. Для увеличения эффективности последующей стадии затупления концов

- 6 009605 для лигирования адаптера разорванные под действием сил сдвига полинуклеотиды для заполнения или удаления выступов факультативно обрабатывают ДНК-полимеразой, используя ее экзонуклеазную функцию. Как правило, для этой цели используют, порознь или в сочетании, Т4-ДНК-полимеразу и большой фрагмент Кленова.

Два вида полинуклеотидных адаптеров с затупленными концами сшивают с фрагментами полинуклеотида-мишени. Один из них включает в себя ВЬу1-сайт, а другой содержит выступ для последующего лигирования с сигнальной последовательностью. Каждый адаптер имеет длину 10-20 пар оснований и добавляется по отношению к данному полинуклеотиду-мишени в 10Х-молярном избытке. Используемые адаптеры фосфорилируются, за исключением одной из нитей ВЬу1-адаптера. Кроме того, антипараллельная нить несет З'-дезоксигруппу, которая препятствует образованию конкатемеров во время лигирования. Лигирование осуществляют в оптимизированных условиях для лигирования тупого конца, следуя рекомендациям производителей.

Лигированные полинуклеотидные фрагменты обрабатывают с помощью ВЬу1. После обработки осуществляют отбор по массе (например, разделением в геле или фракционированием на колонке) для удаления избытка адаптеров, очистки концевых фрагментов и полинуклеотидных фрагментов ниже и выше определенного порогового значения (например, двукратное распределение по массе).

Пример 2. Первоначальное получение с использованием Мте1 и рестрикция по массе.

Полинуклеотид-мишень разрушают случайным образом на куски по 500-1000 пар оснований путем механического гидродинамического сдвига с использованием НубгоЗйеаг-устройства (ОеиеМасЫиек). Вместе с ультразвуковой обработкой, таким образом, можно получить более короткие фрагменты. Для повышения эффективности следующей стадии лигирования адаптера по тупому концу разорванные под действием сил сдвига полинуклеотиды факультативно обрабатывают ДНК-полимеразой для заполнения или удаления выступов, как рассмотрено в примере 1.

10Х-молярный избыток адаптера размером 20-40 п.н. с тупым концом сшивают с фрагментированными полинуклеотидами-мишенями. Лигирование осуществляют в оптимизированных условиях для лигирования по тупому концу, следуя рекомендациям производителей. Фосфорилируется только антисмысловая цепь соответствующего адаптера, что обеспечивает однонаправленное лигирование (помимо включения 3'-дидезоксигруппы или блокирующей группы антисмысловой цепи для предотвращения конкатемеризации). Данный адаптер несет в себе слева именно З'-концевой рестрикционный Мте1-сайт и рестрикционный Еаг1 (или Еат 11041)-сайт. Для удаления избытка адаптеров удобно использовать колонки для эксклюзионной или колоночной хроматографии с центрифугированием (например, М1иЕ1и1е РСК. с1еап-ир от О|;щеп). а также меняя буфер.

Мте1-обработку осуществляют в оптимальных условиях для отщепления 20 пар оснований от молекулы-мишени и присоединения ее к полинуклеотиду-адаптеру. Колонку для центрифугирования используют для смены буфера (например, Βίοδρίη-б от ВюКаб). Затем второй адаптерный полинуклеотид, содержащий узнающую последовательность для фермента рестрикции 8ΓηΝΙ, лигируют с адаптерассоциированным полинуклеотидом-мишенью благодаря созданному с помощью Мте1 выступу (поскольку Мте1 образует З'-выступ с двумя основаниями, этот второй адаптер представляет собой объединение адаптеров, обладающее всеми 1б перестановками двух оснований на З'-выступе). Позиционируют 81аИ1-сайт, отрезав концевые 4 основания у последовательности-мишени. Адаптер сохраняют нефосфорилированным, чтобы исключить последующую амплификацию полинуклеотидов-мишеней, содержащих два Мте1-образованных выступа (побочный продукт обработки полинуклеотида-мишени). Осуществляют ПЦР-амплификацию, чтобы амплифицировать фрагменты, содержащие 20 п.н. полинуклеотидамишени, фланкированные двумя адаптерными полинуклеотидами. Для защиты внутренних сайтов от последующей Еаг1- и 8ГаМ-обработки осуществляют ПЦР с метилированным бСТР, замещающим стандартный бСТР в άΝΤΡ-смеси.

Центрифугируемую колонку для очистки продуктов ПЦР используют для удаления избытка праймеров, ДНК-полимеразы и сменного буфера.

ПЦР-амплифицируемый материал обрабатывают с помощью Еаг1 (или Еат 11041) и 8Γ;·ιΝΙ для создания выступов, необходимых для лигирования сигнальной последовательности и биохимической конверсии. При использовании в ПЦР биотинилированных праймеров обработанные концевые фрагменты можно удалить по сродству (например, с помощью шариков, покрытых стрептавидином).

Пример 3. Принцип циклической конверсии, в которой за цикл конвертируется четыре нуклеотида.

Продемонстрирован принцип циклической конверсии нуклеиново-кислотных оснований в считываемые сигнальные последовательности путем конверсии 12 оснований ДНК-мишени в ее соответствующую сигнальную цепь. Данная конверсия происходит на стадиях циклического способа, где 4 основания конвертируют в каждом из 3 суммарных циклов. Полученный конечный продукт представляет собой сигнальную цепь, состоящую из 12 сигнальных компонентов, соответствующих обнаруживаемой последовательности оснований в ДНК-мишени. Эксперимент схематически представлен на фиг. 2.

Фрагмент ДНК-мишени в 240 п.н., содержащий внутренние сайты для 8Γ;·ιΝΙ и Еат 11041, амплифицируют из генома бактериофага ЬатЬба (1507-1703) с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции для Еат 11041 и 8Γ;·ιΝΙ (самый верхний фрагмент на фиг. 2). Для того чтобы впоследствии

- 7 009605 исключить вырезание внутренних сайтов, реакцию ПЦР осуществляют с метилированными дезоксицитозиннуклеотидами (т5-бСТР) вместо обычного дезоксицитозина (бСТР).

Условия ПЦР (50 мкл): 10 мМ КС1, 10 мМ (ΝΗ₄)₂8Ο4, 20 мМ Трис-НС1, 0,1% Тритон-Х-100, рН 8,8 (Тйегторо1-буфер, Νο\ν Епд1апб В1о1аЬь). 2 мМ Мд²', 200 мкМ бХГР (-бСТР) и 200 мкМ т5-бСТР (Атегайат Рйагтааа Вю1есй), 20 пкмоль ЬатЬба-праймера #328 (5'-адас1ддсда1ссс1ддса1сасссс1ссадсд1дййа1-3'; 8ЕЦ ΙΌ Νο 1) и 20 пкмоль ЬатЬба-праймера #329 (5'-дсас1да1аддсд1сас1сйсдс1д1асдс1д1ссада1д1-3'; 8ЕЦ ΙΌ Νο 2) (М\УС Ью1есй), 10 нг ЬатЬба-генома, 1 ед. Уеп1-полимеразы (Νον Епд1апб Вю1аЬ§). ПЦР осуществляют на РТС-200 (МЖекеагсй).

Горячий старт: 95°С, 5 мин, 35 циклов, состоящих из 95°С, 15 с; 58°С, 20 с; 72°С, 30 с.

Стадия полного удлинения: 72°С, 5 мин.

Цикл 1.

Фрагмент вводят в цикл секвенирования (фиг. 2, А) и разрезают его с помощью Еат 11041 и δίίιΝΙ (поскольку внутренние сайты метилированы и защищены от разрезания, оно имеет место только в праймерных участках).

Условия обработки: 100 мМ №С1, 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ МдС1₂, 1 мМ ОТТ, рН 7,9 (ΝΕΒ3, №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), 1 мкг метилированного ПЦР-фрагмента, 20 ед. Еат 11041, 3 ед. δίπΝΙ и инкубация в течение 1 ч при 37°С. Ферменты рестрикции подвергают термической инактивации при 65°С в течение 20 мин. Вырезанный фрагмент очищают с использованием ПЦР-системы выделения очисткой С1ЬсоВКЬ (С1Ьсо), а затем его элюируют с помощью 10 мМ Трис-НС1. Данный вырезанный фрагмент корреспондируют с характером тех фрагментов, которые получены после первоначального получения или после первого цикла конверсии (описано в примере 1), так как он обладает выступом из 3 оснований для лигирования сигнальной цепи, а также выступом из 4 оснований для лигирования со специфическим правым адаптером.

Стадия конверсии, в которой присоединяют селективный маркер (фиг. 2, В), осуществляется путем лигирования соответствующего фрагмента с указанным специфическим адаптером и с его ассоциированной сигнальной последовательностью: 40 мМ Трис-НС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ ОТТ, 0,5 мМ АТР, рН 7,8 (Ыдаке-буфер, Еегтеп1а§), 1,6 пкмоль адптера 1 (5'-Вю1ш-ддс1адд1дс1да1даасдса1сд-3'; 8ЕЦ ΙΌ Ыо 3'-отожженная до 5'-1ддасда1дсдйса1садсасс1адсс-3'; 8ЕЦ ΙΌ Ыо 4 (М^С-Ью1есй), 1,9 пкмоль сигнальной последовательности 1 (1), 7,5 ХУеЬх-Ь Т4 ДНК-лигазы (ЕегшеШак). Инкубацию осуществляют при комнатной температуре (22°С) в течение 2,5 ч. Данную лигазу подвергают термической инактивации при 65°С в течение 10 мин.

Сигнальные последовательности, используемые в данном эксперименте, были созданы следующим образом. Сигнальные компоненты (каждый представлен одним основанием) создают путем отжига олигонуклеотидов (приблизительно 45 оснований), которые лигируют вместе для создания требуемых сигнальных последовательностей (данные сигнальные компоненты конструируют с разными выступающими концами, которые диктует лигирующая последовательность). Сигнальные последовательности амплифицируют с помощью ПЦР и режут с помощью 8ар1, с тем, чтобы образовался комплементарный выступ, необходимый для лигирования сигнальной последовательности с ДНК-мишенью. Поскольку все фрагменты ДНК-мишени обладают одним и тем же выступом для лигирования сигнальной последовательности, то и все фрагменты реакции будут сшиваться с одной и той же сигнальной последовательностью, независимо от других полученных последовательностей с выступом, образованным δίΟΝΙ. Поэтому специфичность и селективность определяются адаптером. Так как последний сшивается с концом ДНК-мишени, которая была разрезана с помощью δί6ΝΙ, лигироваться будут лишь фрагменты с комплементарным адаптеру выступом. Поэтому конверсия предполагает, что ДНК-мишень, а также ДНКмишень, которая сшита с сигнальной последовательностью, также имеет выступ, комплементарный адаптеру, для лигирования с ним, которое имеет место. Иными словами, данный адаптер обеспечивает специфическую селекцию фрагментов с выступающей последовательностью, корреспондирующей с лигируемой сигнальной последовательностью.

Стадия селекции конвертированных оснований состоит из селекции и амплификации фрагментов, которые лигируют и с сигнальной последовательностью, и со специфическим адаптером (фиг. 2, С). Это осуществляется с использованием ПЦР при следующих условиях (50 мкл): 10 мМ КС1, 10 мМ (ХН₄)₂8О₄, 20 мМ Трис-НС1, 0,1% Тритон-Х-100, рН 8,8 (Тйегторо1-буфер, Νον Епд1апб Вю1аЬ§), 2 мМ Мд²⁺, 200 мкМ ДИТР (-6СТР) и 200 мкМ т5-бСТР (Атегайат Рйагтааа Вю1есй), 20 пкмоль адаптер 1-праймера #332 (5'-Вю1т-ддс1адд1дс1да1даасдса1сд-3'; 8ЕЦ ΙΌ Но 5) и 20 пкмоль сигнальной последовательности 1-праймера #340 (5'-1аа1асдас1сас1а1адса1дас1сдадсс1сйсдсда-3'; 8ЕЦ ΙΌ Ко 5) (М^С-Ью1есй), приблизительно 3,5 фемтомоль лигируемой ДНК-мишени и 1 ед. УепГполимеразы (Хете Епд1апб Вю1аЬ§). ПЦР-амплификацию осуществляют на РТС-200 (МЖекеагсй).

Горячий старт: 95°С, 2 мин, 20 циклов, состоящих из 95°С, 15 с; 66°С, 20 с; 72°С, 30 с.

Стадия полного удлинения: 72°С, 5 мин.

Компартмент 2 на фиг. 2 демонстрирует результаты начального цикла способа секвенирования. Получают корректный фрагмент в 380 п.н.

- 8 009605

Цикл 2.

Для того чтобы конвертировать следующие 4 основания, с помощью системы выделения очисткой С1ЬсоВКЬ (С1Ьсо) очищают ПЦР-продукт и расщепляют его с помощью ΞΓαΝΙ и Еат 11041. Это возможно осуществить, поскольку сигнальная последовательность и адаптер из начального цикла содержат, соответственно, сайт для Еат 11041 и 8£αΝΙ. Так как данные сайты располагаются в праймерной области, они не блокируются при метилировании во время ПЦР. Для повышения эффективности реакции расщепления ее осуществляют последовательно в условиях, оптимальных для расщепления.

8£аЫ1-расщепление: 100 мМ ЫаС1, 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ МдС1₂, 1 мМ ΌΤΤ, рН 7,9 (ЫЕВ3, Ые\\ Епд1апй Вю1аЬ§), 1 мкг метилированного ПЦР-фрагмента, 4 ед. 8£аЫ1.

Инкубация при 37°С в течение 1 ч. Термоинактивация фермента при 65°С в течение 10 мин.

Для очистки полученного фрагмента используют колонку Мюго Βίο-8ρίη 6 (ВюВай).

Еат 11041-расщепление: 33 мМ Трис-ацетат, 10 мМ магнийацетат, 66 мМ калийацетат, 0,1 мг/мл В8Л, рН 7,9 (Тапдо Υ'. Еегтеп1а§), 8£аЫ1-обработанный ПЦР-фрагмент, 10 ед. Еат 11041.

Инкубируют при 37°С в течение 1 ч, с последующей термоинактивацией при 65°С в течение 20 мин. Обработанный таким образом продукт очищают с использованием системы выделения очисткой С1ЬсоВКЕ (С1Ьсо). Осуществляют начальную стадию конверсии, соответствующую начальному циклу, за тем исключением, что добавляют новую сигнальную последовательность и ассоциированный с ней специфический адаптер (корреспондирующие со следующими 4 основаниями последовательности). Для уменьшения потенциальных, связанных с переносом проблем сигнальную последовательность 2 конструируют с выступом, отличающимся от сигнальной последовательности 1.

Условия лигирования: 40 мМ Трис-НС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ ΌΤΤ, 0,5 мМ АТР, рН 7,8 (Ыдакебуфер, Регтеп1а8), 0,5 пкмоль адаптера 2 (5'Вюйп-сдасад1асдасддассадса1сс-3'; 8ЕО ΙΩ Ыо 6 отжигают до 5'-асдсдда1дс1дд1ссд1сд1ас1д1сд-3'; 8ЕО ΙΌ Ыо 7) (М^6-Ью1есй), 1 пкмоль сигнальной последовательности 2 (2), 1 \\ е^-Е Τ4 ДНК-лигазы (Еегтеп1а§).

Инкубацию осуществляют при комнатной температуре (22°С) в течение 1,5 ч. Лигазу термически инактивируют при 65°С в течение 10 мин. ПЦР-амплификацию осуществляют в тех же условиях, что и начальный цикл, за исключением нового набора праймеров (адаптер2-праймер #347, 5'-Вю1т-сдасад1асдасддассадса1сс-3'; 8ЕО ΙΌ Ыо 6' и сигнальная последовательность 2-праймер #343, 5'-1аа1асдас1сас1а1адса1сдаа1дассдсс1сйссас1-3'; 8ЕО ΙΌ Ыо 8). Для каждого цикла секвенирования предпочтительны разные наборы праймеров, чтобы минимизировать вред от амплификации любых остатков предыдущего цикла секвенирования. Результат ПЦР-амплификации во втором цикле представлен в компартменте 3 на фиг. 4. Получен корректный фрагмент в 523 п.н.

Цикл 3.

Конверсия следующих 4 оснований и ПЦР-амплификация следуют для того же образца, который описан для цикла 2. После последовательного разрезания с помощью ΞΓηΝΙ и Еат 11041 полученные фрагменты лигируют с сигнальной последовательностью 3 (3) и адаптером 3 (5'-Вю1ша1сдадсс1ддса1адсадса1са-3'; 8ЕО ΙΌ Ыо 9 отжигают до 5'-ааас1да1дс1а1дссаддс1сда1-3'; 8ЕО ΙΌ Ыо 10) (М\УС-Вю1ес11). ПЦР-амплификацию осуществляют со следующим набором праймеров: адаптер3праймер #353 (5'-а1сдадсс1ддса1адсадса1са-3'; 8ЕО ΙΌ Ыо 9) и сигнальная последовательность 3-праймер #345 (5'-1аа1асдас1сас1а1адсассдддсадда1адас1сйсадд1-3'; 8ЕО ΙΌ Ыо 11). Результат амплификации для цикла 3 представлен в компартменте 4 на фиг. 4. Компартмент 4 демонстрирует образование двух слабых и одной относительно интенсивной полосы. Интенсивная полоса наиболее близка к ожидаемой длине 666 п.н. Слабые полосы, не соответствующие размеру, который наблюдается в компартменте 4 (цикл 3) и в компартменте 3 (цикл 2), вероятнее всего, являются результатом переноса и ошибочного праймирования. Слабая полоса в компартменте 3 и дополнительные слабые полосы внизу, в компартменте 4, корреспондируют с массой ПЦР-фрагмента предыдущего цикла. Возможное объяснение заключается в том, что неполностью вырезанные в первом цикле фрагменты могут выполнять функцию матрицы в следующем ПЦР-цикле. Даже если новые наборы праймеров в каждом цикле отчасти уменьшают данную проблему, вред от ошибочного праймирования все еще присутствует из-за общности ферментных сайтов в праймерах. Вместе с тем, указанный тип ошибочного праймирования можно исключить путем использования более жестких условий отжига в течение ПЦР (например, Мд²⁺, температура), использования более дискриминирующих полимераз, перемещения Еат 11041-сайта из 3'-конца цепи праймерной последовательности, выбора новых последовательностей или иммобилизации данных фрагментов (например, биотин-стрептавидиновой системой на микрошариках) перед разрезанием так, чтобы гарантировать вырезание этих фрагментов при их вхождении в следующий цикл. Наилучшим решением в отношении других видов ошибочного праймирования явился бы подбор новых праймерных последовательностей и/или оптимизация ПЦР-условий. События ошибочного праймирования, обусловленные наличием избытка ДНКматериала (например, избыток адаптеров или нелигированной ДНК), можно устранить, используя метод тиозащиты недоступной цепи адаптера.

Обработка с помощью 5'-3'-экзонуклеазы (например, Т7-экзонуклеазы или ЬатЬйа-экзонуклеазы) перед ПЦР оставит интактной лишь одну цепь ДНК, сшиваемую с адаптером. В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых все последовательности-мишени обладают равной длиной, отбор

- 9 009605 по массе можно использовать для удаления фрагментов с некорректной длиной в течение процесса биохимической конверсии.

Пример 4. Принцип циклической конверсии, в которой за цикл конвертируются три нуклеотида.

Принцип циклической конверсии нуклеиново-кислотных оснований в считываемую сигнальную последовательность продемонстрирован путем конверсии последовательности из 12 оснований ДНКмишени в соответствующую сигнальную последовательность. Конверсия происходит на стадиях циклического способа, в котором 3 основания конвертируются в каждом цикле при их суммарной численности 4 цикла. Конечный продукт представляет собой сигнальную последовательность, состоящую из 12 сигнальных компонентов, представляющих характерную последовательность оснований соответствующей ДНК-мишени. Данный эксперимент схематически описан на фиг. 5.

Синтетический матричный фрагмент ДНК длиной 66 п.н. получают путем отжига следующих олигонуклеотидов :

#003 (5'-РНОСАТСТТСССТАТТССТСТСТТСССТТТТССТСТСАТТСТАСАССССААССССАСАТСАТСАТСАТ-3'; 8ЕС) ГО Νο 12) и #004 (5'-РНОСАТСАТСАТСАТСАТСТССССТТССССТСТАСААТСАСАССААААСССААСАСАССААТАСССААС-3'; 8ЕС) ГО Νο 13).

Как следует из данной последовательности, указанная молекула-мишень содержит на 3'-конце четыре последовательных АТС-триплета. Отожженная молекула соответствует характеру фрагментов, которые получены, как указано, при начальном изготовлении (описанном в примере 2), так как она обладает выступом из 3 оснований для лигирования сигнальной последовательности и выступом из 4 оснований для лигирования специфического адаптера.

Стадию конверсии, в которой присоединяют селективный маркер (фиг. 5, В), осуществляют путем лигирования 1 пкмоль определенного фрагмента со специфическим адаптером и ассоциированной с ним сигнальной последовательностью: 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ ОТТ, 1 мМ АТР, 25 мкг/мл В 8 А, рН 7,5 (лигазный буфер, Νο\ν ЕпДапй Вю1аЬ§), 1 пкмоль адаптера #005 (5'-САТСТАСАТССАСТСССССАССТС-3'; 8 ЕС) ГО Νο 14, отожженная до #006 5'-САССТСССССАСТССАТСТА-3'; 8ЕО ГО Νο 15) (М\УС-Ью1сс11). 1 пкмоль сигнальной последовательности #001 (5'-ТСТСТСССССТСССТСТТСТСАТСТТСССТТТТССТСТСТТСССТАТТССТСТ-3'; 8ЕО ГО Νο 16, отожженная до #002 5'-РНОАТСАСАССААТАСССААСАСАССААААСССААСАТСАСААСАСССАСССССАСАСА-3';

8ЕО ГО Νο 17) (МУС-Ью1есй), 100 ед. Т4-ДНК-лигазы (Νον ЕпДапй Вю1аЬ§).

Инкубацию осуществляют при 22°С в амплификаторе РТС-200 (МЖекеагсй) в течение 1 ч. Отбор и амплификацию молекул, которые успешно лигируются и с данным адаптером, и с данной сигнальной последовательностью адаптера, осуществляют с использованием ПЦР в следующих условиях (50 мкл): 10 мМ КС1, 10 мМ (ЫН₄)₂8О₄, 20 мМ Трис-НС1, 0,1% Тритон-Х-100, рН 8,8 (Тйе^тοрο1-буфер, \еи Епд1апй Вю1аЬ§), 2 мМ Мд²⁺, 200 мкМ ЙНТР5 (Атегайат Вюкаепсе), 10 пкмоль адаптерного праймера #006 (5'-САССТСССССАСТССАТСТА-3'; 8 ЕС) ГО Νο 18) (М\\'С-Вю1ес11) и 10 пкмоль цепочки сигнального праймера #007 (5'-ТСТСТСССССТСССТСТТСТ-3'; 8ЕС) ГО Νο 19) (МУС-Вю1есй), приблизительно 1 пкмоль лигируемой ДНК-мишени и 0,2 ед. Уеп1-полимеразы (№и Епд1апй Вю1аЬ§). ПЦР-амплификацию осуществляют на РТС-200 (МЖекеатсй).

Горячий старт: 95°С, 2 мин, 25 циклов, состоящих из 95°С, 15 с; 59,3°С, 20 с; 72°С, 20 с.

Стадия полного удлинения: 72°С, 60 с.

Компартмент 2 на фиг. 6 демонстрирует результаты начального цикла используемого способа секвенирования. Получен корректный фрагмент из 142 п.н.

Цикл 2.

Для того чтобы конвертировать следующие 3 основания, соответствующий ПЦР-продукт очищают с использованием МшЕ1и1е-набора для очистки ПЦР (Р1адеп), после чего его расщепляют с помощью Еат 11041 и 8ίπΝΙ. Для повышения эффективности реакции разрезания вырезание осуществляют последовательно в оптимальных условиях.

Еат 11041-разрезание: 33 мМ Трис-ацетат, 10 мМ магний-ацетат, 66 мМ калий-ацетат, 0,1 мг/мл В8А, рН 7,9 (Тап^ Υ⁺, Еегтеп1а§), 0,5 мкг ПЦР-фрагмента, 20 ед. Еат 11041 в 25 мкл реакционной смеси. Инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Для очистки данного фрагмента используют колонку Мюго Вю8рш 6 (ВюВай).

8£а№-разрезание: 100 мМ №С1, 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ М§С1₂, 1 мМ ИТТ, рН 7,9 (ИЕВ3, Хеи Епд1апй ВюкхЬО, 0,5 мкг ПЦР-фрагмента, 2,5 ед. 8ίπΝΙ. Инкубация в 50 мкл реакционной смеси при 37°С в течение 15 мин.

Обработанный продукт очищают с помощью ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле) и выделяют очисткой из данного геля с использованием способа дробления и вымачивания. Частицы геля удаляют с использованием колонки М1ш Вю8рт 6, а ДНК выделяют очисткой с использованием МтЕ1и1е-колонки (01адеп) для очистки продукта реакции.

- 10 009605

Стадию конверсии осуществляют, корреспондируясь с начальным циклом, с использованием той же сигнальной последовательности и ассоциированной со специфическим адаптером. Остальные действия осуществляют с тем же образцом, который описан в цикле 1, за исключением того, что агарозный гель и гель из набора для выделения очисткой (ΟίοχίΙΙ, О1адсп) используют для выделения очисткой данного образца после его обработки. Результат ПЦР-амплификации во втором цикле показан в компартменте 3 на фиг. 6. Получен корректный фрагмент из 172 п.н.

В циклах 3 и 4 применяют тот же образец, который описан в цикле 2. Результат ПЦР-амплификации представлен в компартментах 4 и 5, в которых получают корректные фрагменты из 202 п.н. и 232 п.н.

Claims (15)

1. Способ идентификации специфических характеристик полинуклеотидов-мишеней, представленных в образце, включающий в себя следующие стадии:

ί) присоединение к одному концу каждого полинуклеотида-мишени в образце полинуклеотидной сигнальной последовательности, которая специфична в отношении изучаемой характеристики;

ίί) контактирование полинуклеотидов-мишеней с молекулой, которая взаимодействует с полинуклеотидом-мишенью всякий раз, когда специфическая характеристика присутствует;

ϊϊΐ) отделение взаимодействующих полинуклеотидов-мишеней от невзаимодействующих полинуклеотидов-мишеней;

ίν) необязательное повторение стадий (ί)-(ίίί);

ν) идентификация того, какие сигнальные последовательности присутствуют в выделенных полинуклеотидах-мишенях и в каком порядке с тем, чтобы определить изучаемые характеристики каждого полинуклеотида-мишени.

2. Способ по п.1, в котором стадию (ш) осуществляют путем:

(a) присоединения полинуклеотидной адаптерной последовательности к тем полинуклеотидаммишеням, которые взаимодействуют с указанной молекулой;

(b) осуществления реакции полинуклеотидной амплификации тех полинуклеотидов-мишеней, которые включают в себя и сигнальную последовательность, и адаптер.

3. Способ по п.1 или 2, который осуществляют для определения последовательности нуклеиновой кислоты полинуклеотидов-мишеней.

4. Способ по п.2, где адаптерный полинуклеотид включает в себя узнающую фермент рестрикции последовательность, которая позволяет производить более позднее отщепление, после стадии амплификации.

5. Способ по п.2, в котором амплификацию осуществляют с использованием полимеразной реакции.

6. Способ по п.5, в котором указанный адаптер и сигнальная последовательность включают сайты распознавания олигонуклеотидных праймеров, используемых в данной полимеразной реакции.

7. Способ по любому предшествующему пункту, в котором используемый образец разделяют в п реакционные компартменты, где п соответствует числу разных исследуемых характеристик, а присутствующая в каждом компартменте сигнальная последовательность является специфичной.

8. Способ по п.4, в котором узнающая определенный фермент рестрикции последовательность специфична для фермента класса ΙΚ

9. Способ по п.8, в котором фермент рестрикции представляет собой δίαΝΙ или Еаг1.

10. Способ по п.5, в котором соответствующую полимеразную реакцию осуществляют с использованием метил-бСТР, который замещает 6СТР.

11. Способ по п.2, в котором используемый адаптер иммобилизуют на носителе.

12. Способ по п.6, в котором последующие сигнальные последовательности и, по выбору, последующие адаптеры включают сайты распознавания для различных олигонуклеотидных праймеров.

13. Способ определения последовательности полинуклеотидной мишени, включающий следующие стадии:

ί) обработка образца двухцепочечной полинуклеотидной мишени для создания выступа на каждом конце, один из которых секвенируют, и каждый выступ обладает определенным числом оснований;

ίί) разделение используемого образца и контактирование каждого разделенного образца с двухцепочечной полинуклеотидной сигнальной последовательностью и с двухцепочечным адаптерным полинуклеотидом, причем каждая сигнальная последовательность представляет специфичную последовательность полинуклеотида одной и той же длины, что и выступ, который секвенировали, и включает выступ, который делает возможной гибридизацию и лигирование с концом данной полинуклеотидной мишени, противоположным секвенированному концу, а каждый адаптер включает выступ, который представляет собой последовательность, комплементарную последовательности секвенированного выступа;

ϊϊΐ) осуществление соответствующей полимеразной реакции образца(ов) с использованием праймеров, которые гибридизуют по концам используемой сигнальной и адаптерной последовательностей, причем продукт данной полимеразной реакции включает сайт рестрикции, который делает возможным от

- 11 009605 щепление используемого адаптера с образованием нового выступа, который секвенируют повторяющимися, по выбору, стадиями (ί)-(ίίί) с использованием ферментов рестрикции для создания выступов;

ίν) идентификация всех сигнальных последовательностей, представленных в амплифицированных продуктах, и их порядка с тем, чтобы определить соответствующую последовательность соответствующей полинуклеотидной мишени.

14. Способ по п.13, в котором выступ, который сшивают с соответствующей сигнальной последовательностью, равен по меньшей мере 3 основаниям.

15. Способ по п.13 или 14, в котором выступ, который секвенируют, равен 4 основаниям.