JP2004532047A - Ｈａｐｐｉｅｒマッピング - Google Patents
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Abstract
本発明は、核酸を規定の配列の多数の断片に切断するステップと、改良型ＨＡＰＰＹマッピング技法によって、個々の断片を選択的に増幅して、マップを作成するステップとを含む、核酸を分析する方法を提供する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＡＰＰＹマッピングに基づいた、核酸分子をマッピングする改善された方法であって、任意に規定された大多数のゲノムマーカーの迅速なマッピングを可能にする方法に関する。本発明は、例えば、従来のマーカーが利用できない核酸分子に適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＰＰＹマッピングは、任意の生物のゲノムの連鎖マッピングのために開発された方法である。それは、当初、Dearらによって1989年に、ＤＮＡ源として１つの一倍体精子を使用して記載され(DearおよびCook、(1989)Nucleic Acids Res.17:6795)、後に、ＤＮＡ源として多数の二倍体細胞を使用し、次にＤＮＡ希釈し、各々が理想的には０．６９一倍体当量(0.69 haploid equivalents)を含有するマッピングパネルメンバーに分割し、評価することができるマーカー連鎖を使用するように適合された。この技法はいくつかの文献において総説され、使用されている（例えば、DearおよびCook、(1993)Nucleic Acids Res.21:13-20、Piperら、(1998)Genome Res.8:1299-130およびそこに引用されている種々の文献）。
【０００３】
基本的には、ＨＡＰＰＹマッピングは、ゲノムＤＮＡを物理的に分離された断片に切断し、試料パネルであって、各々が当該ゲノムの１一倍体当量（理想的には、バルクゲノムＤＮＡからサンプリングする場合には、０．６９一倍体当量）以下に等しい量のＤＮＡを含有するものを提供することに関する。次いで、一連のマーカーの存在について試料をスクリーニングする。ゲノム内で接近して位置するマーカーは、ゲノム内で距離をおいて位置するマーカーと比べて、より多く同時分離(cosegreagte)する。マーカーパネルを用いて得られる同時分離の表を分析することによって、ゲノム内のマーカーの順序および空間的位置を推定することができる。
【０００４】
ＨＡＰＰＹマッピングの主な用途には、ゲノムおよび遺伝子マッピング、菌株の多様性の検出、集団解析、疫学、遺伝子発現、ならびに系統発生学的および分類学的関係の証明が挙げられる。
【０００５】
ＨＡＰＰＹマップを作製する際に遭遇する大きな困難の１つは、ゲノム内の好適なマーカーの同定である。ＨＡＰＰＹマッピングの適用は、最初に、種々の技法を使用してマッピングパネルの全てのマーカーを同時に「事前増幅(pre-amplification)」し、次いで、特定のプライマーを使用して事前増幅した試料を事前に定めたマーカーについてＰＣＲによってスクリーニングすることに関係している。ＨＡＰＰＹマッピングについて記載している早期の理論的な論文(Dearら、1989)において、短鎖で任意のプライマーを用いた低いストリンジェンシーのＰＣＲ増幅で生じる多数の産物がマーカーとして働き、費用のかかるマーカー特異的プライマーの必要性がなくなることが示唆された。しかし、マッピング方法に使用するマーカーを作製する方法の必要性がある。
【０００６】
任意の配列の合成オリゴデオキシヌクレオチドプライマーによって駆動される増幅に基づいた核酸走査技法によると、匿名の(anonymous)核酸鋳型中の配列多型を検出することができる特徴的なフィンガープリントを得ることができる（生態学および進化の分子的方法(Molecular Approaches to Ecology and Evolution),DeSalle R, Schierwater B(編)、107-123ページ.Birkhauser Verlag, BaselのCaetano-Anolles G(1996)Nature Biotechnology 14:1668-1674、Caetano-Anolles G(1998)任意のオリゴヌクレオチド：核酸の増幅および直接同定のためのプライマー、遺伝子並びに生物(Arbitrary oligonucleotides:primers for amplification and direct identification of nucleic acids, genes and organisms)に考察されている）。少なくとも１つの短鎖プライマーを使用したゲノムＤＮＡの増幅により、通常、ゲノム全体に多少ランダムに分布されたアンプリコンを示す多数の増幅産物が得られる(Livak KJら、(1992)米国特許第5,126,239号、Bassam BJら(1995)米国特許第5,413,909号)。この観察により、３つの主な技法、ランダムに増幅された多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ:randomly amplified polymorphic DNA）(Williamsら、(1990)Nucleic Acids 18:6531-6535)、任意のプライマーを用いたＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ:arbitrarily primed PCR）(Welsh J,McClelland M(1990)Nucleic Acids Res 18:7213-7218)、およびＤＮＡ増幅フィンガープリント法（ＤＡＦ:DNA amplification fingerprinting）(Caetano-Anolles Gら、(1991)Bio/Technology 9:553-557)が開始された。これらの方法は、簡便性および広範な適用性のためにかなり普及した。多種多様な生物が検討され、数千の論文に研究が報告された。これらの技法のうち、ＲＡＰＤおよび同様の技法のほとんどの産物は非多型であるという事実にもかかわらず、ＲＡＰＤが最も広範に使用されており、多型産物のうち、遺伝子連鎖マッピングにおいて対象となるものは少数である。
【０００７】
さらに、非ストリンジェントな増幅反応が条件の変動に対して極めて敏感であるため、ランダムアンプリマー(random amplimer)をマーカーとして使用することができない。
【０００８】
別の形態の任意のアンプリマーも遺伝子連鎖マッピングのマーカーとして使用されている。試験対象のＤＮＡを先ず制限酵素で消化し、次いでリンカーを断片にライゲーションし、リンカー配列に相補的なプライマーを使用して産物を増幅する。プライマーが３’末端に追加塩基を有する場合には（「選択的リンカープライマー」）、ライゲーションされた断片のサブセットだけが増幅される。十分な追加塩基が使用される場合には、増幅される産物の数は少なく、ゲル電気泳動によって分解できる。このように、異なる選択的リンカープライマーを単独または併用して使用することができ、異なるサブセットのゲノム断片を増幅することができ、その各々がマーカーとして働くことができる。選択的プライマーは高ストリンジェンシーで使用されるので、この方法はＲＡＰＤ方法より再現性が良好である。
【０００９】
これまでは、この方法は、遺伝子連鎖分析であって、ゲノムの多型が少数の増幅産物の差に反映されるもののみに適用されている（「任意断片長多型」、ＡＦＬＰｓ:arbitrary fragment-length polymorphisms）。ＡＦＬＰ方法は、「ドナー」ゲノムから生じるアンプリマーを「宿主」から生じるものと識別する方法がないので、ＡＦＬＰ方法は放射線ハイブリッド(ＲＨ:radiation hybrid)またはクローンに基づいたマッピングに適用することができず、単一形マーカーをマッピングすることができない。
【発明の開示】
【００１０】
本発明者らは、今や、ランダムアンプリマーマーカーを使用し、このようなマーカーの本質的な欠点の多くを回避するＨＡＰＰＹマッピング方法を開発した。新規方法は、ＨＡＰＰＹマッピングの利点に、ライゲーションされたリンカーに基づいた特定のプライミングと選択的な内部プライミングとを使用した増幅を組み合わせており、ゲル電気泳動または他の従来の技法によってマッピングすることができる増幅断片のサブセットを作製することができる。これは、リンカーに基づいたプライミングを使用するポリメラーゼによって増幅された一倍体ゲノム当量(haploid genome equivalents, amplified by polymerase using linker-based priming)を使用しているので、本発明者らはこの方法をＨＡＰＰＩＥＲマッピングと呼んでいる。
【００１１】
従って、第１の態様において、本発明は、核酸を分析する方法であって、
ａ）マッピング対象の核酸に由来する複数の核酸試料を含むＨＡＰＰＹマッピングパネルを調製するステップであって、該パネルの各メンバーが、該マッピング対象の該核酸の０．０５〜２コピー以下に等しい量を質量として示すＤＮＡ断片のサンプリングを含有するステップと、
ｂ）該試料中の該核酸を規定の配列において完全に切断して核酸断片を作製するステップと、
ｃ）該核酸断片のどちらかの末端にリンカーをライゲーションするステップと、
ｄ）リンカー特異的プライマーを使用して該核酸を全体的に(globally)増幅するステップと、
ｅ）プローブのレパートリーを供するステップであって、各プローブが、該リンカーの配列、および存在する場合には、制限消化によって作製される断片の末端に保持されている制限部位の一部に相補的または同一の第１の配列と、該レパートリーの各プローブにおいて異なる隣接する第２の配列とを含むステップと、
ｆ）該レパートリーの１つ以上のプローブを該試料にハイブリダイゼーションして、該試料中の該１つ以上のプローブに相補的な配列の有無をスコアリングするステップと
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はシングル−ラン手法として実施しても、または望ましいマーカーを含む標的断片の逐次的選択の反復ステップを組み入れてもよい。従って、好ましい実施態様において、ステップｆ）は、
ｉ）各試料から複数の特定の核酸断片を増幅するステップと、
ii）ｉ）で増幅した断片をサブ試料に分割するステップと、
iii）ｉ）で使用したプローブより特異性が高い１つ以上のプローブを該サブ試料にハイブリダイゼーションするステップと、
iv）必要に応じて、ステップｉ）およびステップii）を繰り返し反復するステップと、
ｖ）前記試料中の前記１つ以上のプローブに相補的な配列の有無をスコアリングするステップと
を含む。
【００１３】
好ましくは、ステップｇ）における１つ以上のプローブを使用して、試料から特定の核酸断片を増幅し、例えば、以下に記載する従来の手段により増幅した核酸を検出することを可能にする。
【００１４】
各マッピングパネル試料は、一倍体ゲノム当量を含み、それは、以前に記載されているように、１種の一倍体細胞に由来しても、または体細胞（二倍体）細胞に由来するバルク核酸の希釈によってもよい。本明細書において使用する「一倍体ゲノム当量」は、マッピング対象の核酸の０．０５〜２質量当量と理解され、理想的にはそれは約０．６９ゲノム当量である。核酸は、連鎖がかなり維持されており、試料に分割してマッピングパネルを形成することができる大きい断片に切断される。この最初の切断は、ランダム性を確実にするために、通常放射線またはせん断により、比較的大きい断片に切断される（数ｋｂ〜Ｍｂ）。マップの精密さを決定するのはこの切断である（しかし、「一倍体」分割量は、断片のサイズにかかわらず、ほぼ同じ量のＤＮＡを含有するので、シグナルの複雑さではない）。
【００１５】
次いで、制限エンドヌクレアーゼを使用して、マッピングパネル試料を切断する。形成される断片のサイズは、エンドヌクレアーゼの切断頻度によって求められ、切断頻度が多いほど、デコンボリュートを必要とするシグナルの複雑性が大きくなる。有利なことに、リンカーのライゲーションを容易にするために、切断部位に粘着末端を作製する制限エンドヌクレアーゼが使用される。
【００１６】
この第２の切断は、ライゲーションおよび増幅のために小さい断片（典型的には、２ｋｂ未満）に切断される。それは、試料中のＤＮＡの全体的で、選択的な増幅を可能にするツールとなる。マーカーは、この第２の切断前にマッピングパネルメンバーに分離されているので、それは、典型的には、結果として得られるマップの精密さに影響しない。
【００１７】
核酸は、有利には、ＤＮＡである。
【００１８】
有利なことに、リンカーは、鎖長７〜４０ヌクレオチドであり、好ましくは鎖長１５〜２５ヌクレオチドである。リンカー自体および断片配列自体の１つ以上の隣接塩基は、選択されたプローブ鎖長に応じて、プローブレパートリーのプローブがハイブリダイゼーションすることができる独自の部位を形成する。リンカーの配列は任意の望ましい配列であってもよく、配列がマッピング対象のゲノムに天然に存在するリスクを最小にするために、このような配列は、有利なことに、異なる属に由来するリンカーなどの別の起源から選択されるか、またはハイブリダイゼーションが生じていないことを判定するためにスクリーニングされる。
【００１９】
リンカーに対応する一定の配列以外に、各プローブは、３’側に１つ以上の隣接塩基を含む。任意の数の隣接塩基を使用してもよく、当業者は、ハイブリダイゼーションの特異性の必要性と、非常に長いプローブを使用する費用および取り扱いの欠点のバランスを保つことが必要であることを認識している。有利なことに、プローブ内の隣接する第２の配列は２〜２０塩基からなり、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基からなる。
【００２０】
本発明は、一倍体ゲノム当量を試料に分割し、プローブレパートリーの１つ以上の特定のプローブを使用することによってランダムに作製された単形マーカーの迅速なマッピングを可能にする。各試料において、使用した特定のプローブに相補的または同一な末端を有する特定の核酸断片だけが増幅される。試料集団中の増幅された断片の同時分離の分析はマーカー連鎖および一倍体ゲノムのマップを決定する。
【００２１】
有利な実施態様において、プローブレパートリーの１つ以上のプローブの使用を、各試料の１つの断片を増幅するための十分に配列特異的なプローブの使用と代える。これにより、従来のＳＴＳ（配列標識部位:sequence-tagged-site）マーカーをスコアリングすることができる。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、マイクロタイタープレートの内容物をさらに別の手法および操作により追跡できるように、それらをコード化する方法に関する。マイクロタイタープレートの内容物を別のプレートに移したりもしくは別のプレートの試料と合わせたりまたはゲルにロードしても、本発明の方法により、マイクロタイタープレートの内容物を追跡することができる。
【００２３】
本発明のこの態様の第１の実施態様において、不活性な蛍光マイクロスフェア（例えば、Molecular Probes A3703）などの固相マーカーをプレートのウェルのいくつかに添加する。このように標識したウェルのパターンは、プレート内容物の独自の「サイン」となる。例えば、マーカーの位置は二進数でコード化することができる。
【００２４】
好ましい実施態様において、ＰＣＲを目的とするマイクロタイタープレートにマイクロスフェアを添加する。粒子は反応を妨害せず、試料をその後分析する場合には、ゲルにロードされる。マイクロタイタープレートの「コード」はゲルに移され、蛍光粒子を含有するウェルは、ゲルをＵＶ光線下で撮影すると光る。粒子は電気泳動中ゲル内に移動しない。これは、電気泳動中に試料を追跡する際の一般的な問題を克服する。すなわち、マイクロタイタープレート上のバーコード等をプリントすることは容易であるが、ゲルにコード番号を移すことは困難である。別の実施態様において、ＤＮＡをゲルの未使用のウェルのいくつかにロードして、２進コード化する。しかし、これにより、ユーザーは、マイクロタイタープレートの数を読み取り、同じ数がゲル上にコード化されるように配列しなければならない。本発明のシステムによると、ＰＣＲを開始するロボットは、蛍光粒子を添加することもでき、さらなる介入やエラーの発生を生じることなく、ロード時に「コード」はゲルに移される。
【００２５】
本発明は、さらに別の実施態様にさらに適用可能である。例えば、１つのプレートの試薬セット（例えば、ＰＣＲ鋳型セット）および別のプレートの別のセット（例えば、ＰＣＲプライマーセット）によって反応液を調製する場合には、ウェルに粒子を固定することによって各起源−プレートをコード化することができる。便利なことに、コード化は１つのプレートの最初の列のウェルを占め、他のプレートの最後の列を占めることができる。（２つの起源のプレートの内容物を含有する）反応プレートは両方のセットのコード用マーカーを保有する。ＵＶ照射下でプレートを画像化することによって、コードを見ることができ、確証することができる。または、試料をゲル電気泳動で分析するとき、コードが見られる。
【００２６】
より複雑なコードを提供するためまたは同一セットのウェル内に２つ以上のコードを重複させられるように、多数の色を使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本明細書に記載する一般的な技法は当技術上既知であるが、特に、Sambrookら、分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)(1989)およびAusubelら、分子生物学の簡単なプロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)(1999)第4版John Wiley & Sons, Inc（並びに、分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)の完全版）を参照することができる。
【００２８】
１．定義
本明細書において言及される「マッピングパネル」は、別個の試料またはメンバーに分離されている核酸断片のパネルである。パネルの各メンバーは、Dear&Cook(1989)におけるように、１つの一倍体細胞から単離された断片状ＤＮＡのいくつかの分画（典型的には、１／２または１／３）からなってもよい。さらに一般的には、各メンバーは、２つ以上の一倍体細胞または１つ以上の二倍体細胞から調製され、理想的には質量が０．６９ゲノムに等しい量のＤＮＡ（すなわち、０．６９一倍体当量）を含有する断片状ＤＮＡ試料からなってもよい。この量は、バルクＤＮＡからサンプリングされた配列のポアゾン分布とすると、全てのマーカーの約半分が各試料に提供されるが、約０．０５〜２の量のＤＮＡも許容可能な範囲内である。
【００２９】
本発明に使用するマッピングパネルは、ゲノムＤＮＡまたはマッピングすることが意図されている任意の他の起源に由来するＤＮＡ断片を含有する任意のマッピングパネルであってもよい。有利なことに、それは少なくとも２つのメンバーを含み、有利なことに約４、８、１６、３２、６４、９６、１００、１１０、１２８、２５６またはそれ以上のメンバーを含む。９６メンバーの使用が都合がよい。さらに別のメンバーは、対照試料として存在してもよい。
【００３０】
「規定された配列で切断する」は、ゲノム当量が、例えば、制限エンドヌクレアーゼなどの切断酵素による配列−特異的切断に付されて、核酸断片を作製することを示すことが意図されている。この切断により、規定された配列を有する核酸の切断された「末端」が生ずる。認識部位から離れた位置を切断するIII型制限酵素またはランダムに切断するＩ型酵素の使用は考えられていない。しかし、切断酵素は天然であってもまたは人工であってもよい。人工切断酵素は、例えば、好適に改変されているリボザイムまたはジンクフィンガーポリペプチドであってもよい（例えば、国際特許出願WO00/20622号を参照）。
【００３１】
「完全に」切断は、切断可能な配列を有する部位の実質的に全てが切断されることを示す。これにより、同一の配列を有する断片が確実に多数の試料に均一に供される。
【００３２】
「増幅」は、インビトロにおいて核酸鎖を増加させるための任意の方法をいう。好ましくは、この方法は酵素的であり、特徴は直線的であってもまたは指数関数的であってもよい。例示的な技法は、核酸分子を指数関数的に増幅するＰＣＲである。別の増幅技法は、ＲＮＡ標的を増幅するために使用される逆転写酵素ＰＣＲが挙げられる(Wangら、(1989.Proc Natl Acad Sci USA 86(24),9717-21)。この方法では、逆転写酵素は、ＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換するために使用され、相補的なＤＮＡは次いでＰＣＲを使用して増幅することができる。この方法は、ＲＮＡウィルスのゲノムなどのリボ核酸試料をマッピングすることが意図されている場合に特に有用である。
【００３３】
自己維持型配列複製(Self-sustained sequence replication)(3SRまたはNBSBA)は、酵素カクテルおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ活性の逐次的なラウンドによる核酸鋳型の等温増幅に関係する(Guatelliら、(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87 (5),1874-8)。ＲＮＡ/ＤＮＡヘテロ２本鎖のＲＮＡの酵素的な切断が、熱変性の代わりに使用される。ＲＮａｓｅ Ｈおよび全ての他の酵素が反応液に添加され、全ての段階は同じ温度で、さらに試薬を添加することなく実施される。この方法により、１０6〜１０9の増幅が４２℃において１時間で実施されている。
【００３４】
リガーゼ連鎖反応またはライゲーション増幅システムはＤＮＡリガーゼおよび４つのオリゴヌクレオチド、すなわち標的の鎖１つあたり２つを使用する(Wu,D.Y.&Wallace,R.B.(1989)Genomics 4(4),560-9)。オリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡの隣接配列にハイブリダイゼーションし、リガーゼによって接続される。反応液は熱変性され、サイクルが反復される。
【００３５】
本発明は、さらに、当業者に利用可能な任意の増幅技法の使用を含む。このような技法には、ローリングサークル型増幅(rolling circle amplification)(Lizardiら、(1998)Nat Genet 19(3),225-32)および鎖置換型増幅(strand-displacement amplification)(SDA;Walkerら、(1992).Proc Natl Acad Sci USA 89(1),392-6)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「マーカー」は、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション分析によって連鎖の検討において同定することができる核酸配列である。有利なことに、それは分析中のゲノム内では実質的に独自であるので、その同定は明白である。
【００３７】
「全体的な」増幅は、配列に関係のない核酸の増幅をいう。この手法は他の内容に関して当技術上既知であり、「全ゲノム」増幅または「全ゲノムＰＣＲ」という場合もある。有利なことに、全体的に増幅される集団内の核酸は各々、同じ程度増幅されて、各メンバーが忠実に提供されている増幅集団を作製する。しかし、全ゲノムＰＣＲが全ての配列を増幅するのではなく、規定されたサブセットを増幅する場合もある。
【００３８】
プローブの「レパートリー」は、配列が互いに異なる核酸分子セットである。本発明に関しては、プローブは、リンカーに相補的または同一の一定の核酸配列およびそれに隣接する可変領域を含む。可変領域は全体的もしくは部分的にランダム化されていてもよく、または１つ以上の特定の配列を有するように設計されていてもよい。
【００３９】
認識部位内で、制限酵素が切断する箇所に応じて、その部位の１つ以上の塩基が全ての断片の末端に残存する。この場合には、プローブの「一定」部分は、一般に、リンカー配列（またはその相補鎖）だけでなく、断片の末端の関連鎖に残存される認識部位部分を含む。
【００４０】
増幅された断片を「解像すること」は、各断片が各試料中で個別に同定可能であるように、例えば、鎖長に基づいたその解像をいう。
【００４１】
２．ＨＡＰＰＹマッピング
ＨＡＰＰＹマッピングの一般的な技法は当技術上既知であり、文献に広範に記載されている。ＨＡＰＰＹマッピングの詳細な説明を含む以下の開示内容は全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている：Konfortovら、Genome Res.2000 Nov;10(11):1737-42、WilliamsおよびFirtel,Genome Res.2000 Nov;10(11):1658-9、Piperら、Genome Res.1998 Dec;8(12):1299-307、Lynchetら、Genomics.1998 Aug 15;52(1):17-26、Dearら、Genomics.1998 Mar 1;48(2):232-41、Walterら、Nucleic Acids Res.1993 Sep 25;21(19):4524-9、Dearおよびcook、Nucleic Acids Res.1993 Jan 11;21(1):13-20、DearおよびCook、Nucleic Acids Res.1989 Sep 12;17(17):6795-807。本発明は、いくつか主要な箇所が異なったＨＡＰＰＹマッピングに基づいている。
【００４２】
第１の違いは、核酸は、放射線または他の物理的な手段によって切断され、別個の分割量に分離されてから、配列特異的な切断によって断片化されるということである。本発明に使用する上で好ましい酵素である制限エンドヌクレアーゼを選択し、使用する技法は、例えば、Sambrookら（前掲書中）により、当技術上既知である。
【００４３】
配列特異的な５’および３’末端が作製される限り、核酸切断の別の技法を使用することができる。これらには、分析対象の核酸が、増幅反応液中の１つ以上のプライマーを使用して増幅される、規定された配列のプライマーを用いるＰＣＲが挙げられる。１つのプライマーまたは複数のプライマーが、実質的に配列特異的な方法で、分析対象の核酸にハイブリダイゼーションして、プライマー鎖が酵素的鎖伸長することができるハイブリッドを形成することができる。プライマーがハイブリダイゼーションする部位の数に応じて、ゲノム配列に対応する数多くの断片が作製される。核酸は、通常、２本鎖であるので、プライマーがハイブリダイゼーションする前に変性させる必要がある。
【００４４】
本発明は、好ましくは、１つの配列の切断に関係する。しかし、例えば、２つ以上の制限酵素を使用した多数の配列の切断も可能である。切断が多数の配列において実施される場合には、リンカーは、切断によって残存された「末端」の１セットまたは両方のセットに付加されてもよい。リンカーの１つの特異性だけを使用する場合には、そのリンカー配列に相補的な同じ配列において切断された２つの末端を有する断片だけが増幅される。
【００４５】
さらに、本発明は、特定の断片増幅を可能にするための手段としてリンカーのライゲーションを使用する。また、このような方法は当業者に既知である。リンカー（または本明細書の別の箇所に規定されているプライマー）は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物である単位を含む。一般的に言うと、ヌクレオチド類似物は、鎖状のヌクレオチド残基に組み込まれることができ、塩基特異的な方法で相補的な核酸鎖の塩基にハイブリダイゼーションすることができる化合物である。本発明に有用な類似物は、さらに、鎖伸長酵素の基質である。
【００４６】
ヌクレオチド類似物は、例えば、塩基対形成特性に影響するように、塩基が改変されている、および／または例えば、ＰＮＡのアミド結合骨格におけるように、糖または骨格部分が改変されている、および／またはリン酸部分が改変されている、改変されたヌクレオチドであってもよい。
【００４７】
骨格が改変された核酸には、メチルホスホネート、非架橋酸素の両方が硫黄で置換されているホスホロジチオエートおよびホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル並びにボラノホスフェートが挙げられる。アキラルホスフェート誘導体には、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ2−５’−Ｏ−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートが挙げられる。ペプチド核酸は、ホスホジエステル骨格全体がペプチド結合で置換されている。
【００４８】
安定性および親和性を増強するために、糖改変も使用される。塩基が天然のβ−アノマーに対して逆であるデオキシリボースのα−アノマーを使用してもよい。リボース糖の２’−ＯＨを変更して、親和性を損なうことなく分解されにくい２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成してもよい。
【００４９】
複素環塩基の改変は、好ましくは、適切な塩基対形成を維持する。いくつかの有用な置換には、デオキシウリジンとデオキシチミジン、５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンとデオキシシチジンが挙げられる。５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピニル−２’−デオキシシチジンは、それぞれ、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと置換されると、親和性および生物学的活性を増加することが示されている。
【００５０】
リンカーは、好ましくは、鎖長全体が７〜４０残基である。通常、１５〜２５残基の短いリンカーが使用されるが、３０残基以下もしくは４０残基以下、または１０残基以下のプライマーも有用である。増幅後、全てのアンプリマーは両方の末端に同じ配列を有し、その配列の長さはプライマーに依存する。ゲノムＤＮＡを切断後、核酸を試料に分割し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断し、リンカーにライゲーションし、リンカー特異的なプライマーを使用して増幅する。全ての核酸断片は各末端にリンカーを組み入れるので、全ての断片が増幅される。
【００５１】
本発明によるハイブリダイゼーション手法は、有利なことに、２本鎖制限断片の各鎖の５’末端だけへのライゲーションを必要とする。しかし、特許請求の範囲内の本発明の態様は、リンカーが核酸鎖の３’末端または５’末端と３’末端の混合物に接続されている別のパターンのライゲーションを使用して実施することができる。
【００５２】
全体的な増幅ステップ後、特定のプライマーまたはプローブを使用して各試料中の核酸断片のサブセットを増幅する。このような状況下では、プライマーの３’末端のヌクレオチド残基が試料核酸のヌクレオチド残基と正確に一致している鎖伸長のみが生じる。５’末端は、プライマーの残りが分離されないように十分に強くハイブリダイゼーションされている限り、完全にハイブリダイゼーションされる必要はない。有利なことに、プライマーは、リンカー／試料核酸標的に１００％相補的である。
【００５３】
プライマーは、天然の塩基の２つまたは３つと塩基対形成する能力を有することによって、または一般的には、区別することなしに天然の塩基の各々と塩基対を形成することによって、変性結合(degenerate binding)を促進する塩基類似物を組み入れることができる。このような類似物は、プローブを製造する際に従来のランダム化技法と併用して使用することができる。しかし、プローブは結合の際に配列特異性が高く、ハイブリダイゼーションして配列を変性しないことが好ましい。
【００５４】
鎖伸長ステップにおいて付加するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物は検出を容易にするために標識されてもよい。好適な標識の例には、放射性同位体、蛍光部分、ハプテンおよび発色または化学発光酵素システムの成分が挙げられる。
【００５５】
追加の方法としてまたは別の方法として、規定の配列のプライマーを容易に同定させられる特定のタグを使用して規定の配列のプライマーを標識することができる。例として、質量分析計で分離可能な異なる質量のタグ、適当な検出装置を使用して「読む」ことができる分子バーコード、特定のサインの放射を生じる傾向タグの組み合わせ等が挙げられる。
【００５６】
標識の性質は、各試料中に存在するマーカーを検出するための最良の方法を決定する。断片が未標識である場合または全てが同様に標識されている場合には、従来のＨＡＰＰＹマッピングと同様に、増幅された断片は、有利なことに、ゲル電気泳動によって検出される。
【００５７】
しかし、特定の標識を使用することにより、ＦＡＣＳまたは質量分析計などによって断片を選別することができる。例えば、Griffinら、(1997) Nature Biotechnology 15:1368参照。標識が各プライマーに対して特異的に作製される場合には、増幅の必要なしに、特定の断片の存在について個々の分割量の試料を選別することができる。
【００５８】
３．核酸切断
配列特異的な方法での核酸の切断は、上記に記載されている制限エンドヌクレアーゼ消化を含む、任意の好適な方法によって実施することができる。別の方法には、三重らせん形成による二重らせんＤＮＡの配列特異的切断(H.E.MoserおよびP.B.Dervan(1985)Science 238,645-650参照)、放射性ヌクレオチドの使用（例えば、Karamychevら、J Nucl Med 2000;41:1093-1101）、米国特許第6,018,058号に記載されている合成制限酵素、ＣＡＰ−およびＦｏｓ−に基づいた分子(http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/projects/hastie/dsc.htm)並びに国際公開公報第00/20622号に記載されているジンクフィンガーポリペプチドの使用が挙げられる。
【００５９】
４．用途
本発明の改善されたＨＡＰＰＹマッピング技法は任意のマッピングプロジェクトに適用することができる。従って、染色体などのゲノムまたはゲノムＤＮＡのマッピングは、ＨＡＰＰＹマッピング技法の適用が可能であることがすでに示されており、本明細書に記載されている改善された方法の適用が可能である。本発明のさらに別の用途は、本発明の明細書に基づいて当業者に明らかになる。
【００６０】
本発明のＨＡＰＰＹマッピング技術または実際には任意のＨＡＰＰＹマッピング技術の好ましい適用を以下に記載する。
【００６１】
Ａ．ハプロタイプ決定
上記のように、ＨＡＰＰＹマッピング方法は、ゲノムＤＮＡのラムダム切断およびランダムサンプリングにより、（典型的には）サブ−ゲノム量のＤＮＡを含有する試料セット（パネル）を作製する。パネルの同一メンバーに見出される（すなわち、同時切断する）ことが多い配列（マーカー）は、断片の平均サイズと比較して、ゲノム内で接近して存在すると推論することができる。放射線ハイブリッドマッピングは、ＨＡＰＰＹマッピングといくつかの特徴を共有するが、切断は生きている「ドナー」細胞を照射し、次に異なる種の未照射の「宿主」細胞と融合することによって実施される。ドナーの染色体断片には結果として生ずるハイブリッドに保持されるものもあり、生ずるハイブリッドは、次いで、ドナーマーカーの内容について分析される
【００６２】
通常の用途では、どちらかの方法によって分析されるマーカーは単型であり、それらが多型である場合には、多型は無視される（マーカーの対立遺伝子は１つとしてスコアリングされる）。しかし、多型マーカーの対立遺伝子がマッピングパネル上で識別され、個別にスコアリングされる場合には、ハプロタイプ情報（すなわち、二倍体ゲノムの２つ以上のマーカーの対立遺伝子間の連鎖相）を求めることができる。
【００６３】
ハプロタイプ情報は、多型（特に、一塩基多型、ＳＮＰｓ）と、現在では広範に調査されている疾患または薬剤に対する有害作用の罹患性との関係、ＳＮＰハプロタイプと集団間の「通常の」可変的な特徴との関係、およびヒトの集団移動を追跡するためのＳＮＰハプロタイプの使用を含むが、これらに限定されない数多くの用途にＳＮＰハプロタイプ情報が有用である、特にヒトゲノムにおいてかなり興味深い。
【００６４】
ＨＡＰＰＹマッピングは、以下のように、ハプロタイプ決定に適用することができる。マッピングパネルは通常の方法で作製されるが、マーカーの検出およびスコアリングは、多型マーカーの対立遺伝子を識別するような方法で実施され（マーカーの２つの対立遺伝子は、本明細書においては大文字および小文字、例えば、Ａ、ａによって示される）、各対立遺伝子の結果は個別に記録される。２つ以上の多型マーカーがスコアリングされる場合には、各々の対立遺伝子の近さを求めることができる。例えば、親ゲノムがハプロタイプＡＢおよびａｂを含有し、マーカーＡ／ａがマーカーＢ／ｂに十分に近い位置に存在する場合には、同時分離（従って、連鎖）はＡとＢの間およびａとｂの間には観察されるが、Ａとｂの間またはａとＢの間には観察されない。従って、親ハプロタイプを決定することができる。ハプロタイプ情報を得ることができる距離は、マッピングパネルを作製する際に使用する断片のサイズによって決定される。
【００６５】
多型の性質に応じて、必要なスコアリングおよび対立遺伝子の識別のために多数の方法が存在する。これらの方法のいずれかを本発明に関連して適用することができる。
【００６６】
多くの例において、ゲノム内のマーカーの位置はすでに決定されており、連鎖相だけが必要である。これらの場合には、先験的にマーカーの順序および空間的位置を決定するのに必要であると思われるより少ない数のパネルメンバーを分析するだけでよい。また、マップ情報がすでに存在する場合には、マッピングパネルの解像はほとんど問題とされない。このように、ハプロタイプを決定することができる範囲を最大にするために、パネルはできるだけ大きいＤＮＡ断片から作製することができる。極端な例では、ゲノムＤＮＡは切断されないままで、完全な染色体ＤＮＡ分子（または染色体）はパネルメンバーに分離され、この例では、結果は染色体上のマーカーの順序または空間的位置を決定することができないが、染色体の長さ分のハプロタイプデータを生ずる。各対立遺伝子が独立マーカーと考えられるので、理想的には、ハプロタイプ決定に使用するために作製されるＨＡＰＰＹパネルは、通常のマッピングに使用されるもののほぼ２倍の量のＤＮＡを含有しなければならない。しかし、標準的なＨＡＰＰＹパネルにとって許容されうるＤＮＡの濃度範囲は、ハプロタイプ決定に対応するのに十分に広い。
【００６７】
原則として、同じ方法を使用して、放射線ハイブリッドパネルからハプロタイプデータを得ることができるが、大多数の個人のハプロタイプが必要とされる場合には、ＲＨパネルを作製する相対的な困難さによりこの方法はあまり関心を持たれない。
【００６８】
Ｂ．染色体のマッピング
上記のように、切断された核酸の代わりに染色体全体を使用してハプロタイプ情報をマッピングするまたは得ることが有利な場合がある。さらに、より大きいＤＮＡ断片を使用することにより、通常中程度から高い解像において有用なＨＡＰＰＹマッピングを、低解像度マップを提供するように拡大適用することができる。
【００６９】
ＨＡＰＰＹマッピングにおいて、ＤＮＡは、先ず従来通り、機械的または他の手段による切断の前に、比較的純粋な形態（溶液または保護用ゲルマトリックス）で単離される。しかし、長いＤＮＡ分子は不安定な性質であるので、鎖長数百万塩基対（Ｍｂ）より長い断片を操作するのが困難になる。このように、マーカー間の連鎖は、数Ｍｂまでの長さでは容易に求めることができる。
【００７０】
本発明は、「ネーキッド」ＤＮＡ断片ではなく、完全な染色体、染色体の断片またはクロマチンのサンプリングおよび分析（限界希釈において）に基づいたいくつかの用途を記載している。これらの形態のＤＮＡの天然のパッケージングにより、完全な染色体を含む、ネーキッドＤＮＡを取り扱う場合より大きい、断片を単離および操作することが可能になる。
【００７１】
ＤＮＡは、クロマチンまたは分裂中期の染色体の形態で細胞から放出される。これらの形態のどちらにおいても、ＤＮＡは安定化されており、ヒストンおよび他のタンパク質と結合することによって緻密にされている（必要に応じて、インサイチューハイブリダイゼーションまたはフロー−ソーティング用に分裂中期の染色体を調製する場合に使用される部分的な固定技法などの他の処理によってさらに安定化してもよい）。次いで、機械的な切断を使用して、クロマチン／染色体を断片に切断し、その溶液を希釈し、各々約０．０５〜２ゲノム当量のＤＮＡ（しかし、好ましくはパネルの各メンバー中ほぼ同じ量のＤＮＡ）を含有する試料パネルに分注する。約０．２〜約１．５の範囲が、一般に、有用であると考えられる。２コピーを超える使用は不利であるが、使用することができるコピー数に決まった下限はない。各マーカー配列が少なくとも１つの（好ましくは２つ以上の）メンバーにおいて確実に発現されるのに十分なパネルメンバーが分析されれば、本発明の原則は、分割量あたり任意に低い量のＤＮＡに適用することができる。次いで、ＨＡＰＰＹマッピングパネルの分析についてすでに記載されている方法で試料を分析する。ＤＮＡを確実にＰＣＲ増幅されやすくするために、プロテイナーゼ−Ｋを用いた前処理または他の方法が必要な場合もある。
【００７２】
無傷の分裂中期の染色体は通常溶液で作製されており、溶液で取り扱われているので、パネルメンバーに分離される断片は完全な染色体に至るまでの任意のサイズであってもよいことは明白である。（試料への分離が完了したら、マーカー内容が保持されている限り、ＤＮＡのさらなる断片化は重要ではないことに注目される）。ＨＡＰＰＹマッピングによって連鎖を最もよく検出することができる長さは、典型的には、使用するＤＮＡ断片の平均長さの０．５〜０．７倍以下である。このように、粗く切断された染色体断片から作製されるパネルは、マーカー間の平均距離が数Ｍｂ以上である過疎化状態のマップを作製するために使用することができる。これは、そのサイズでは従来のＨＡＰＰＹマッピングによって作製される緻密なマップを作製することが実行不可能または不経済となるようなゲノムに有用である。
【００７３】
分裂中期の染色体の断片をフローソーティングすることもできる（実際、断片状の染色体は、通常、染色体をフローソーティングする場合「バックグラウンド」と見られ、望ましい無傷の染色体の望ましくない分解または剪断により生じる）。このように、フローソーティングを、必要な数およびサイズの断片をマッピングパネルのメンバーに分離する方法として（希釈およびランダムサンプリングの代わりに）使用することができる。このような方法には、（ａ）各パネルメンバーのＤＮＡの総量を精密にコントロールすることができ、（ｂ）断片のサイズ範囲を狭く選択することができるという利点を有する。このような厳重な選択により、パネルの範囲および解像を微調整して取り扱い中のマッピング問題に対処することができ、任意のマーカー間の連鎖を反映するには小さすぎる断片、または有用なマッピング情報を含有するには大きすぎる断片を排除することによってマッピングデータの品質を改善が改善される。
【００７４】
無傷の分裂中期染色体は、このような染色体溶液の限界希釈またはフローソーティングによってマッピングパネルのメンバーに分離することができる。この場合には、パネルは１つの染色体内のマーカーの順序および空間的位置に関する情報を与えないが、マーカーをそれぞれの染色体にグループ単位で同時局在化させることができる。これは、染色体がフローサイトメトリーで識別できないような種において、マーカーを染色体上に割り付けるのに特に有用である。例えば、ヒトの第９、第１０、第１１および第１２染色体はフローサイトメトリーで識別することができない。１つまたは２つの染色体（Ｃｈｒ９〜１２クラスターからランダムにサンプリング）を各パネルメンバーにフローソーティングすることによって、マッピングパネルを作製する場合には、パネル上のマーカーをタイプ分けすることにより、マーカーを染色体連鎖グループに迅速に割り付けることができると思われる。
【００７５】
上記の方法は全てハプロタイプの決定にも適用することができる（多型遺伝子座間の連鎖相）。このような場合には、（対立遺伝子を識別するために確立されている技法を使用して）各マーカーの２つの対立遺伝子を独立にスコアリングすることだけが必要である。次いで、各対立遺伝子を独立マーカーとして処理することができ、（例えば）連鎖をＡとＢ間およびａとｂ間で観察し、ハプロタイプＡＢおよびａｂを明らかにする。マッピングパネルを作製する際にクロマチン／染色体断片または無傷の染色体を使用することにより、かなりの（または染色体の）長さにわたってハプロタイプを決定することができる。
【００７６】
本発明は、以下の実施例において、例示目的のためだけに以下にさらに記載されている。
【実施例】
【００７７】
［マッピングパネルの作製および事前増幅(pre-amplification)］
オオムギ（オオムギ(Hordeum vulgare)、変種「Ｏｐｔｉｃ」）の葉細胞から核を単離し、アガロースの帯状物(strings)に包埋する（０．５％ｗ／ｖ低融点アガロース、〜４０００核／マイクロタイター）。帯状物を溶解溶液（０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ９．０、１％ラウリルサルコシンのナトリウム塩、０．１ｍｇ ｍＬ-1プロテイナーゼ−Ｋ）に浸漬し、ゆっくり混合しながら４５℃において４８時間インキュベーションし、次いで０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ９．０中で４５℃において１時間インキュベーションし、次いで０．０５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０中で氷上で１時間インキュベーションし、必要時まで０．０５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０中で４℃において保存した。この操作中、溶解溶液はアガロース中に拡散し、核を溶解し、洗浄段階で拡散して流出するタンパク質および他の核物質を除去／分解し、実質的に純粋なＤＮＡをアガロース内に捕獲させておく。ＤＮＡの切断頻度をコントロールすることは非常に重要であるので、アガロースは、望ましくない機械的な切断からＤＮＡを保護する働きをする。
【００７８】
マグネシウムを含まないＰＣＲ緩衝液５ｍｌ［これは、ＤＮＡ変性のリスクを少なくするために、水より使用が好まれる］に６８℃において帯状物の小切片を融解し、ＤＮＡを分散させ、それを約５０〜１００ｋｂの断片に剪断するために試験管を数回転倒混和することによって切断が実施される。溶液を冷却させ、ＤＮＡがさらに機械的に剪断されないようにワイド−ボアピペットチップを使用して、マイクロタイター１つあたり約０．１一倍体ゲノム当量の濃度に水で希釈する。この溶液の５μｌの試料を９６ウェルマイクロタイタープレートの８８のウェルに分注し、５μｌの水を残りの８つのウェルの各々に分注する。蒸発を防ぐために、試料各々に１滴（〜３０μｌ）の軽油を積層する。
【００７９】
２μｌ容量あたり、０．７μlのＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液（Pharmacia、数多くの反応に好適な汎用緩衝液）、４．２単位の制限酵素ＤｐｎＩＩ(New England Biolabs)および水を含む消化マスター混合物を調製する。この混合物２μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに分注する。全ての水性成分が各ウェルの油積層物の下層になるように、このプレートを短時間（〜５００ｇ、５秒）遠心分離する。マイクロタイタープレートを３７℃において１０分間インキュベーションする。次いで、６５℃において３０分間加熱することによって、制限酵素を不活性化する。ＤｐｎＩＩは認識配列ＧＡＴＣの箇所で切断し、切断が完了まで進行するように条件を選択する。
【００８０】
６μｌ容量あたり、オリゴＬＩＢ１の１００μＭ溶液１．５μl、オリゴｄｄ−Ｓａｕ３Ａの１００μＭ溶液１．５μｌ、Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液０．８μｌ、０．２６μｌの１Ｍ ＮａＣｌおよびＮａＣｌを含むライゲーションマスター混合物を調製する。このマスター混合物の６μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、先のように短時間遠心分離する。プレートを８５℃において２０分間インキュベーションし、次いで１分あたり１℃の割合で１５℃まで冷却する。オリゴヌクレオチドは以下のようである：
ＬＩＢ１ ５’ＡＧＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＧＧ ３’
ｄｄＳａｕ３Ａ ５’ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＧＡ ＣＡＧ Ｃ* ３’
ここで、Ｃ*は、ジ−デオキシヌクレオチドを示す。
【００８１】
２μｌ容量あたり、１μlのＴ４ＤＮＡリガーゼ（５単位、Boehringer-Mannheim）および１μｌの１５ｍＭ ｒＡＴＰ（ｐＨ７．４のＴｒｉｓ−ＨＣｌで中和）を含むリガーゼマスター混合物を調製する。この溶液の２μｌを各ウェルに添加し、プレートを短時間遠心分離して、水性成分を油積層物の下層にする。次いで、プレートを１６℃において終夜（〜１６時間）インキュベーションする。
【００８２】
オリゴヌクレオチドは以下のように配列されている：
【化１】
斜字体＝ＬＩＢ１、下線＝ｄｄＳａｕ３Ａ、標準＝制限断片（Ｘ、Ｙ＝任意の塩基、鎖長は典型的には１００〜５００ｂｐ）。注記−ライゲーションはＬＩＢ１と制限断片（二重下線で示す）の間でだけ生じ、ｄｄＳａｕ３Ａと断片の間には生じない（その理由は、必要なリン酸基が存在しないからである）。同じ理由により、その後の増幅を妨害すると思われる（「リンカーダイマー」）、ｄｄＳａｕ３ＡとＬＩＢ１オリゴ単独の間のライゲーションは起こりえない。
【００８３】
３７μｌ容量あたり、５μｌの10 PCR Buffer No1(Boehringer Mannheim)、０．８μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各々２５ｍＭ）、１．４μｌのExpand Long Polymerase(Boehringer Mannheim)および水を含む全ゲノム増幅混合物を調製する。この溶液の３７μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに分注する。次いで、以下のように、熱サイクルを行うことによって、全ての制限断片の増幅を実施する［理想的には、ある断片は増幅しない場合があってもよく、その理由は、例えば、それらは大きすぎて、ＤｐｎＩＩの認識部位が広範に配置されている配列領域にあるからである］：
１）６８℃×４分［この段階で、オリゴｄｄＳａｕ３Ａは変性され、各制限断片の各鎖の３’末端の伸長が生じ、ライゲーションされたＬＩＢ１オリゴに相補的な領域を合成する。従って、この段階の後、全ての制限断片は、各末端にＬＩＢ１配列およびその相補鎖を保有する）。
２）９４℃×４０秒、５７℃×３０秒、６８℃×７５秒を１４サイクル
３）６８℃で７５秒ではなく１０５秒として、上記のように３４サイクル
４）６８℃で７５秒ではなく３００秒として、上記のように１サイクル
（段階２、３および４では、過剰のオリゴＬＩＢ１によって開始されて、接続された制限断片の指数的な増殖が生じる）。
【００８４】
次いで、水で反応液を連続的に８０００倍に希釈し、任意のマーカーまたは特定のマーカーの検出に必要になるまで（以下）−２０℃で保存する。
【００８５】
［特定のマーカーの検出］
特定のマーカー（すなわち、特定のプライマーを使用して事前に決定した配列）の検出は、上記から希釈した産物の各々５μｌを、以下を（さらに）含む反応液中で増幅する：
１×「Ｇｏｌｄ」ＰＣＲ緩衝液(Perkin Elmer)
０．２５Ｕ「Ｇｏｌｄ」ＤＮＡポリメラーゼ
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
特定の順方向および逆方向オリゴヌクレオチド各々１μＭ（例は以下参照）
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々２００μＭ
総容量１０μｌ
【００８６】
反応液を９６ウェルマイクロタイタープレートにセットし、鉱物油（１ウェルあたり±３０μｌ）を積層するか、または適当な密封フィルムを使用して密封する。以下のように、熱サイクルを実施する：
９３℃×５分
９４℃×２０秒、５５℃×３０秒、７２℃×６０秒を３８サイクル
（アニーリング温度、上記の例では５５℃は、オリゴヌクレオチドプライマーの融解温度により調節することができる）。
【００８７】
好適なロード用緩衝液（１５％ｗ／ｖ Ｆｉｃｏｌｌ ４００、０．１５ｍｇ／ｍｌ ブロモフェノールブルー、４×ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎを１×ＴＢＥ緩衝液に溶解したものを８μｌ）を産物に供給し、混合物の１０μｌ試料を電気泳動によって分析する（０．５×ＴＢＥ緩衝液に６％ポリアクリルアミドゲルを加えたもの）。
【００８８】
例えば、オオムギゲノム内の位置が既知である（およびシステムのテストとして働くと思われる）３つの特定の配列（「マーカー」）について上記の手法を連続的に実施した。特定のプライマー配列は以下のようである：
１４−４：
順方向＝ＧＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣ
逆方向＝ＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣ
１４−５：
順方向＝ＣＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＣＣＧ
逆方向＝ＣＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＧＴＴＧＧ
１−１６Ｂ：順方向＝ＣＴＧＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣ
逆方向＝ＣＴＧＴＴＴＧＡＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣ
【００８９】
各プライマー対は、既知のＤＮＡ配列の短い（数百塩基対）セグメントを増幅する。各場合において、セグメントは、それらの中に、ＤｐｎＩＩの制限部位を含有しないことが知られている。マーカー１４−４および１４−５は互いに非常に接近して（＜２ｋｂ）存在することが知られているが、１−１６Ｂは、これら２つからかなり距離をおいて（＞１００ｋｂ）存在することが知られている。
【００９０】
結果の分析は、１４−４と１４−５の間には強力な同時分離が存在したことを示しており、２つのマーカーは各々マッピングパネルの８８のメンバー（マーカーを含有しない８つの陰性対照を除く）の±６０％に存在し、パネルへのこれら２つのマーカーの分布に大きな類似性がある。これら２つのマーカー間ではＬｏｄスコア１４．２が算出され、これは連鎖を強く示している。マーカー１−１６Ｂもマッピングパネルの非陰性対照メンバーの±６０％に存在するが、その分布は、他の２つのマーカーの分布とは明らかに関連性を示さず、１−１６Ｂと１４−４および１−１６Ｂと１４−５のＬｏｄスコアは、それぞれ、０．４および０．７であり、これらはあまり有用ではない。
【００９１】
ライゲーション−媒介性ＰＣＲの希釈産物は、この方法では約８０，０００の特定のマーカーをタイプ分けするのに十分であることが明らかである。しかし、この産物は、ＬＩＢ１プライマーを使用すると、さらなる非−選択的増幅を受けやすく、本質的に無制限量の物質を提供することも明らかである。
【００９２】
［任意のマーカーの検出］
希釈した事前−増幅産物の各々から５μｌの分画を取り、（希釈産物以外に）０．２５単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(Taq Gold、Perkin Elmer)、１×ＰＣＲ「Ｇｏｌｄ」緩衝液（ポリメラーゼの供給元による推奨）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１μＭのプライマーＬＩＢＳＥＬ−Ａ （５’ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＣＧＴ ＣＣ ３’）。
【００９３】
（最初の１２塩基はＬＩＢ１の３’側の１２塩基と同一であり、次の４つは、全ての断片に共通のＤｐｎＩＩの認識配列と同一であり、最後の４つの塩基は選択的で、断片の末端の〜１／２５６番にだけ対応物を有する）。蒸発を抑えるために、混合物に鉱物油を積層し、熱サイクル（９３℃×９分、ついで９４℃×２０秒、６４℃×３０秒および７２℃×６０秒を３３サイクル）に付する。１００〜５００塩基のサイズを有する断片を解像することができる、標準的なプロトコールを使用したゲル電気泳動で各反応の産物を分析する。
【００９４】
このような反応は各々（マッピングパネルの各メンバーに対応する）数多くの産物を産生し、各場合の産物は、各末端の制限部位の内側に適当な４つの選択的なヌクレオチドを保有するゲノムの数十のＤｐｎＩＩ断片のサブセットである。解像可能な断片の各々の有無について各反応液をスコアリングし、９６の分割量においてそれらがどれくらいの頻度で同時分離しているかを調べることによって互いに対してマッピングする。従って、各断片は、サイズ（電気泳動によって決定される）、それを作製するために使用した制限酵素（ＤｐｎＩＩ）およびそれを増幅するために使用した選択的プライマー（ＬＩＢＳＥＬ−Ａ）の組み合わせによって規定されるマーカーであると考えることができる。種々の理由のいずれかのために増幅（全体的または選択的）が失敗する、またはマーカーが１本鎖コピー配列ではない（９６分割量中の陽性の数を見ることによって容易にわかる）、または別のマーカーとほぼ同じサイズであるので、電気泳動で解像することができないことにより、マッピングできないマーカーもある。しかし、大多数のマーカーは、ある割合の試料中で検出することができ、連鎖頻度の表作成および算出によってマッピングすることができる。
【００９５】
上記の明細書中に記載されている文献は全て参照として本明細書に組み入れられている。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載されている本発明の方法およびシステムに種々の改良および変更を加えることができることは、当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施態様に関連して記載されているが、主張されている本発明は、このような具体的な実施態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連の分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載されている様式の種々の改良は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【０００１】
本発明は、ＨＡＰＰＹマッピングに基づいた、核酸分子をマッピングする改善された方法であって、任意に規定された大多数のゲノムマーカーの迅速なマッピングを可能にする方法に関する。本発明は、例えば、従来のマーカーが利用できない核酸分子に適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＰＰＹマッピングは、任意の生物のゲノムの連鎖マッピングのために開発された方法である。それは、当初、Dearらによって1989年に、ＤＮＡ源として１つの一倍体精子を使用して記載され(DearおよびCook、(1989)Nucleic Acids Res.17:6795)、後に、ＤＮＡ源として多数の二倍体細胞を使用し、次にＤＮＡ希釈し、各々が理想的には０．６９一倍体当量(0.69 haploid equivalents)を含有するマッピングパネルメンバーに分割し、評価することができるマーカー連鎖を使用するように適合された。この技法はいくつかの文献において総説され、使用されている（例えば、DearおよびCook、(1993)Nucleic Acids Res.21:13-20、Piperら、(1998)Genome Res.8:1299-130およびそこに引用されている種々の文献）。
【０００３】
基本的には、ＨＡＰＰＹマッピングは、ゲノムＤＮＡを物理的に分離された断片に切断し、試料パネルであって、各々が当該ゲノムの１一倍体当量（理想的には、バルクゲノムＤＮＡからサンプリングする場合には、０．６９一倍体当量）以下に等しい量のＤＮＡを含有するものを提供することに関する。次いで、一連のマーカーの存在について試料をスクリーニングする。ゲノム内で接近して位置するマーカーは、ゲノム内で距離をおいて位置するマーカーと比べて、より多く同時分離(cosegreagte)する。マーカーパネルを用いて得られる同時分離の表を分析することによって、ゲノム内のマーカーの順序および空間的位置を推定することができる。
【０００４】
ＨＡＰＰＹマッピングの主な用途には、ゲノムおよび遺伝子マッピング、菌株の多様性の検出、集団解析、疫学、遺伝子発現、ならびに系統発生学的および分類学的関係の証明が挙げられる。
【０００５】
ＨＡＰＰＹマップを作製する際に遭遇する大きな困難の１つは、ゲノム内の好適なマーカーの同定である。ＨＡＰＰＹマッピングの適用は、最初に、種々の技法を使用してマッピングパネルの全てのマーカーを同時に「事前増幅(pre-amplification)」し、次いで、特定のプライマーを使用して事前増幅した試料を事前に定めたマーカーについてＰＣＲによってスクリーニングすることに関係している。ＨＡＰＰＹマッピングについて記載している早期の理論的な論文(Dearら、1989)において、短鎖で任意のプライマーを用いた低いストリンジェンシーのＰＣＲ増幅で生じる多数の産物がマーカーとして働き、費用のかかるマーカー特異的プライマーの必要性がなくなることが示唆された。しかし、マッピング方法に使用するマーカーを作製する方法の必要性がある。
【０００６】
任意の配列の合成オリゴデオキシヌクレオチドプライマーによって駆動される増幅に基づいた核酸走査技法によると、匿名の(anonymous)核酸鋳型中の配列多型を検出することができる特徴的なフィンガープリントを得ることができる（生態学および進化の分子的方法(Molecular Approaches to Ecology and Evolution),DeSalle R, Schierwater B(編)、107-123ページ.Birkhauser Verlag, BaselのCaetano-Anolles G(1996)Nature Biotechnology 14:1668-1674、Caetano-Anolles G(1998)任意のオリゴヌクレオチド：核酸の増幅および直接同定のためのプライマー、遺伝子並びに生物(Arbitrary oligonucleotides:primers for amplification and direct identification of nucleic acids, genes and organisms)に考察されている）。少なくとも１つの短鎖プライマーを使用したゲノムＤＮＡの増幅により、通常、ゲノム全体に多少ランダムに分布されたアンプリコンを示す多数の増幅産物が得られる(Livak KJら、(1992)米国特許第5,126,239号、Bassam BJら(1995)米国特許第5,413,909号)。この観察により、３つの主な技法、ランダムに増幅された多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ:randomly amplified polymorphic DNA）(Williamsら、(1990)Nucleic Acids 18:6531-6535)、任意のプライマーを用いたＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ:arbitrarily primed PCR）(Welsh J,McClelland M(1990)Nucleic Acids Res 18:7213-7218)、およびＤＮＡ増幅フィンガープリント法（ＤＡＦ:DNA amplification fingerprinting）(Caetano-Anolles Gら、(1991)Bio/Technology 9:553-557)が開始された。これらの方法は、簡便性および広範な適用性のためにかなり普及した。多種多様な生物が検討され、数千の論文に研究が報告された。これらの技法のうち、ＲＡＰＤおよび同様の技法のほとんどの産物は非多型であるという事実にもかかわらず、ＲＡＰＤが最も広範に使用されており、多型産物のうち、遺伝子連鎖マッピングにおいて対象となるものは少数である。
【０００７】
さらに、非ストリンジェントな増幅反応が条件の変動に対して極めて敏感であるため、ランダムアンプリマー(random amplimer)をマーカーとして使用することができない。
【０００８】
別の形態の任意のアンプリマーも遺伝子連鎖マッピングのマーカーとして使用されている。試験対象のＤＮＡを先ず制限酵素で消化し、次いでリンカーを断片にライゲーションし、リンカー配列に相補的なプライマーを使用して産物を増幅する。プライマーが３’末端に追加塩基を有する場合には（「選択的リンカープライマー」）、ライゲーションされた断片のサブセットだけが増幅される。十分な追加塩基が使用される場合には、増幅される産物の数は少なく、ゲル電気泳動によって分解できる。このように、異なる選択的リンカープライマーを単独または併用して使用することができ、異なるサブセットのゲノム断片を増幅することができ、その各々がマーカーとして働くことができる。選択的プライマーは高ストリンジェンシーで使用されるので、この方法はＲＡＰＤ方法より再現性が良好である。
【０００９】
これまでは、この方法は、遺伝子連鎖分析であって、ゲノムの多型が少数の増幅産物の差に反映されるもののみに適用されている（「任意断片長多型」、ＡＦＬＰｓ:arbitrary fragment-length polymorphisms）。ＡＦＬＰ方法は、「ドナー」ゲノムから生じるアンプリマーを「宿主」から生じるものと識別する方法がないので、ＡＦＬＰ方法は放射線ハイブリッド(ＲＨ:radiation hybrid)またはクローンに基づいたマッピングに適用することができず、単一形マーカーをマッピングすることができない。
【発明の開示】
【００１０】
本発明者らは、今や、ランダムアンプリマーマーカーを使用し、このようなマーカーの本質的な欠点の多くを回避するＨＡＰＰＹマッピング方法を開発した。新規方法は、ＨＡＰＰＹマッピングの利点に、ライゲーションされたリンカーに基づいた特定のプライミングと選択的な内部プライミングとを使用した増幅を組み合わせており、ゲル電気泳動または他の従来の技法によってマッピングすることができる増幅断片のサブセットを作製することができる。これは、リンカーに基づいたプライミングを使用するポリメラーゼによって増幅された一倍体ゲノム当量(haploid genome equivalents, amplified by polymerase using linker-based priming)を使用しているので、本発明者らはこの方法をＨＡＰＰＩＥＲマッピングと呼んでいる。
【００１１】
従って、第１の態様において、本発明は、核酸を分析する方法であって、
ａ）マッピング対象の核酸に由来する複数の核酸試料を含むＨＡＰＰＹマッピングパネルを調製するステップであって、該パネルの各メンバーが、該マッピング対象の該核酸の０．０５〜２コピー以下に等しい量を質量として示すＤＮＡ断片のサンプリングを含有するステップと、
ｂ）該試料中の該核酸を規定の配列において完全に切断して核酸断片を作製するステップと、
ｃ）該核酸断片のどちらかの末端にリンカーをライゲーションするステップと、
ｄ）リンカー特異的プライマーを使用して該核酸を全体的に(globally)増幅するステップと、
ｅ）プローブのレパートリーを供するステップであって、各プローブが、該リンカーの配列、および存在する場合には、制限消化によって作製される断片の末端に保持されている制限部位の一部に相補的または同一の第１の配列と、該レパートリーの各プローブにおいて異なる隣接する第２の配列とを含むステップと、
ｆ）該レパートリーの１つ以上のプローブを該試料にハイブリダイゼーションして、該試料中の該１つ以上のプローブに相補的な配列の有無をスコアリングするステップと
を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はシングル−ラン手法として実施しても、または望ましいマーカーを含む標的断片の逐次的選択の反復ステップを組み入れてもよい。従って、好ましい実施態様において、ステップｆ）は、
ｉ）各試料から複数の特定の核酸断片を増幅するステップと、
ii）ｉ）で増幅した断片をサブ試料に分割するステップと、
iii）ｉ）で使用したプローブより特異性が高い１つ以上のプローブを該サブ試料にハイブリダイゼーションするステップと、
iv）必要に応じて、ステップｉ）およびステップii）を繰り返し反復するステップと、
ｖ）前記試料中の前記１つ以上のプローブに相補的な配列の有無をスコアリングするステップと
を含む。
【００１３】
好ましくは、ステップｇ）における１つ以上のプローブを使用して、試料から特定の核酸断片を増幅し、例えば、以下に記載する従来の手段により増幅した核酸を検出することを可能にする。
【００１４】
各マッピングパネル試料は、一倍体ゲノム当量を含み、それは、以前に記載されているように、１種の一倍体細胞に由来しても、または体細胞（二倍体）細胞に由来するバルク核酸の希釈によってもよい。本明細書において使用する「一倍体ゲノム当量」は、マッピング対象の核酸の０．０５〜２質量当量と理解され、理想的にはそれは約０．６９ゲノム当量である。核酸は、連鎖がかなり維持されており、試料に分割してマッピングパネルを形成することができる大きい断片に切断される。この最初の切断は、ランダム性を確実にするために、通常放射線またはせん断により、比較的大きい断片に切断される（数ｋｂ〜Ｍｂ）。マップの精密さを決定するのはこの切断である（しかし、「一倍体」分割量は、断片のサイズにかかわらず、ほぼ同じ量のＤＮＡを含有するので、シグナルの複雑さではない）。
【００１５】
次いで、制限エンドヌクレアーゼを使用して、マッピングパネル試料を切断する。形成される断片のサイズは、エンドヌクレアーゼの切断頻度によって求められ、切断頻度が多いほど、デコンボリュートを必要とするシグナルの複雑性が大きくなる。有利なことに、リンカーのライゲーションを容易にするために、切断部位に粘着末端を作製する制限エンドヌクレアーゼが使用される。
【００１６】
この第２の切断は、ライゲーションおよび増幅のために小さい断片（典型的には、２ｋｂ未満）に切断される。それは、試料中のＤＮＡの全体的で、選択的な増幅を可能にするツールとなる。マーカーは、この第２の切断前にマッピングパネルメンバーに分離されているので、それは、典型的には、結果として得られるマップの精密さに影響しない。
【００１７】
核酸は、有利には、ＤＮＡである。
【００１８】
有利なことに、リンカーは、鎖長７〜４０ヌクレオチドであり、好ましくは鎖長１５〜２５ヌクレオチドである。リンカー自体および断片配列自体の１つ以上の隣接塩基は、選択されたプローブ鎖長に応じて、プローブレパートリーのプローブがハイブリダイゼーションすることができる独自の部位を形成する。リンカーの配列は任意の望ましい配列であってもよく、配列がマッピング対象のゲノムに天然に存在するリスクを最小にするために、このような配列は、有利なことに、異なる属に由来するリンカーなどの別の起源から選択されるか、またはハイブリダイゼーションが生じていないことを判定するためにスクリーニングされる。
【００１９】
リンカーに対応する一定の配列以外に、各プローブは、３’側に１つ以上の隣接塩基を含む。任意の数の隣接塩基を使用してもよく、当業者は、ハイブリダイゼーションの特異性の必要性と、非常に長いプローブを使用する費用および取り扱いの欠点のバランスを保つことが必要であることを認識している。有利なことに、プローブ内の隣接する第２の配列は２〜２０塩基からなり、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基からなる。
【００２０】
本発明は、一倍体ゲノム当量を試料に分割し、プローブレパートリーの１つ以上の特定のプローブを使用することによってランダムに作製された単形マーカーの迅速なマッピングを可能にする。各試料において、使用した特定のプローブに相補的または同一な末端を有する特定の核酸断片だけが増幅される。試料集団中の増幅された断片の同時分離の分析はマーカー連鎖および一倍体ゲノムのマップを決定する。
【００２１】
有利な実施態様において、プローブレパートリーの１つ以上のプローブの使用を、各試料の１つの断片を増幅するための十分に配列特異的なプローブの使用と代える。これにより、従来のＳＴＳ（配列標識部位:sequence-tagged-site）マーカーをスコアリングすることができる。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、マイクロタイタープレートの内容物をさらに別の手法および操作により追跡できるように、それらをコード化する方法に関する。マイクロタイタープレートの内容物を別のプレートに移したりもしくは別のプレートの試料と合わせたりまたはゲルにロードしても、本発明の方法により、マイクロタイタープレートの内容物を追跡することができる。
【００２３】
本発明のこの態様の第１の実施態様において、不活性な蛍光マイクロスフェア（例えば、Molecular Probes A3703）などの固相マーカーをプレートのウェルのいくつかに添加する。このように標識したウェルのパターンは、プレート内容物の独自の「サイン」となる。例えば、マーカーの位置は二進数でコード化することができる。
【００２４】
好ましい実施態様において、ＰＣＲを目的とするマイクロタイタープレートにマイクロスフェアを添加する。粒子は反応を妨害せず、試料をその後分析する場合には、ゲルにロードされる。マイクロタイタープレートの「コード」はゲルに移され、蛍光粒子を含有するウェルは、ゲルをＵＶ光線下で撮影すると光る。粒子は電気泳動中ゲル内に移動しない。これは、電気泳動中に試料を追跡する際の一般的な問題を克服する。すなわち、マイクロタイタープレート上のバーコード等をプリントすることは容易であるが、ゲルにコード番号を移すことは困難である。別の実施態様において、ＤＮＡをゲルの未使用のウェルのいくつかにロードして、２進コード化する。しかし、これにより、ユーザーは、マイクロタイタープレートの数を読み取り、同じ数がゲル上にコード化されるように配列しなければならない。本発明のシステムによると、ＰＣＲを開始するロボットは、蛍光粒子を添加することもでき、さらなる介入やエラーの発生を生じることなく、ロード時に「コード」はゲルに移される。
【００２５】
本発明は、さらに別の実施態様にさらに適用可能である。例えば、１つのプレートの試薬セット（例えば、ＰＣＲ鋳型セット）および別のプレートの別のセット（例えば、ＰＣＲプライマーセット）によって反応液を調製する場合には、ウェルに粒子を固定することによって各起源−プレートをコード化することができる。便利なことに、コード化は１つのプレートの最初の列のウェルを占め、他のプレートの最後の列を占めることができる。（２つの起源のプレートの内容物を含有する）反応プレートは両方のセットのコード用マーカーを保有する。ＵＶ照射下でプレートを画像化することによって、コードを見ることができ、確証することができる。または、試料をゲル電気泳動で分析するとき、コードが見られる。
【００２６】
より複雑なコードを提供するためまたは同一セットのウェル内に２つ以上のコードを重複させられるように、多数の色を使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本明細書に記載する一般的な技法は当技術上既知であるが、特に、Sambrookら、分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)(1989)およびAusubelら、分子生物学の簡単なプロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)(1999)第4版John Wiley & Sons, Inc（並びに、分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)の完全版）を参照することができる。
【００２８】
１．定義
本明細書において言及される「マッピングパネル」は、別個の試料またはメンバーに分離されている核酸断片のパネルである。パネルの各メンバーは、Dear&Cook(1989)におけるように、１つの一倍体細胞から単離された断片状ＤＮＡのいくつかの分画（典型的には、１／２または１／３）からなってもよい。さらに一般的には、各メンバーは、２つ以上の一倍体細胞または１つ以上の二倍体細胞から調製され、理想的には質量が０．６９ゲノムに等しい量のＤＮＡ（すなわち、０．６９一倍体当量）を含有する断片状ＤＮＡ試料からなってもよい。この量は、バルクＤＮＡからサンプリングされた配列のポアゾン分布とすると、全てのマーカーの約半分が各試料に提供されるが、約０．０５〜２の量のＤＮＡも許容可能な範囲内である。
【００２９】
本発明に使用するマッピングパネルは、ゲノムＤＮＡまたはマッピングすることが意図されている任意の他の起源に由来するＤＮＡ断片を含有する任意のマッピングパネルであってもよい。有利なことに、それは少なくとも２つのメンバーを含み、有利なことに約４、８、１６、３２、６４、９６、１００、１１０、１２８、２５６またはそれ以上のメンバーを含む。９６メンバーの使用が都合がよい。さらに別のメンバーは、対照試料として存在してもよい。
【００３０】
「規定された配列で切断する」は、ゲノム当量が、例えば、制限エンドヌクレアーゼなどの切断酵素による配列−特異的切断に付されて、核酸断片を作製することを示すことが意図されている。この切断により、規定された配列を有する核酸の切断された「末端」が生ずる。認識部位から離れた位置を切断するIII型制限酵素またはランダムに切断するＩ型酵素の使用は考えられていない。しかし、切断酵素は天然であってもまたは人工であってもよい。人工切断酵素は、例えば、好適に改変されているリボザイムまたはジンクフィンガーポリペプチドであってもよい（例えば、国際特許出願WO00/20622号を参照）。
【００３１】
「完全に」切断は、切断可能な配列を有する部位の実質的に全てが切断されることを示す。これにより、同一の配列を有する断片が確実に多数の試料に均一に供される。
【００３２】
「増幅」は、インビトロにおいて核酸鎖を増加させるための任意の方法をいう。好ましくは、この方法は酵素的であり、特徴は直線的であってもまたは指数関数的であってもよい。例示的な技法は、核酸分子を指数関数的に増幅するＰＣＲである。別の増幅技法は、ＲＮＡ標的を増幅するために使用される逆転写酵素ＰＣＲが挙げられる(Wangら、(1989.Proc Natl Acad Sci USA 86(24),9717-21)。この方法では、逆転写酵素は、ＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換するために使用され、相補的なＤＮＡは次いでＰＣＲを使用して増幅することができる。この方法は、ＲＮＡウィルスのゲノムなどのリボ核酸試料をマッピングすることが意図されている場合に特に有用である。
【００３３】
自己維持型配列複製(Self-sustained sequence replication)(3SRまたはNBSBA)は、酵素カクテルおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ活性の逐次的なラウンドによる核酸鋳型の等温増幅に関係する(Guatelliら、(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87 (5),1874-8)。ＲＮＡ/ＤＮＡヘテロ２本鎖のＲＮＡの酵素的な切断が、熱変性の代わりに使用される。ＲＮａｓｅ Ｈおよび全ての他の酵素が反応液に添加され、全ての段階は同じ温度で、さらに試薬を添加することなく実施される。この方法により、１０6〜１０9の増幅が４２℃において１時間で実施されている。
【００３４】
リガーゼ連鎖反応またはライゲーション増幅システムはＤＮＡリガーゼおよび４つのオリゴヌクレオチド、すなわち標的の鎖１つあたり２つを使用する(Wu,D.Y.&Wallace,R.B.(1989)Genomics 4(4),560-9)。オリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡの隣接配列にハイブリダイゼーションし、リガーゼによって接続される。反応液は熱変性され、サイクルが反復される。
【００３５】
本発明は、さらに、当業者に利用可能な任意の増幅技法の使用を含む。このような技法には、ローリングサークル型増幅(rolling circle amplification)(Lizardiら、(1998)Nat Genet 19(3),225-32)および鎖置換型増幅(strand-displacement amplification)(SDA;Walkerら、(1992).Proc Natl Acad Sci USA 89(1),392-6)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「マーカー」は、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション分析によって連鎖の検討において同定することができる核酸配列である。有利なことに、それは分析中のゲノム内では実質的に独自であるので、その同定は明白である。
【００３７】
「全体的な」増幅は、配列に関係のない核酸の増幅をいう。この手法は他の内容に関して当技術上既知であり、「全ゲノム」増幅または「全ゲノムＰＣＲ」という場合もある。有利なことに、全体的に増幅される集団内の核酸は各々、同じ程度増幅されて、各メンバーが忠実に提供されている増幅集団を作製する。しかし、全ゲノムＰＣＲが全ての配列を増幅するのではなく、規定されたサブセットを増幅する場合もある。
【００３８】
プローブの「レパートリー」は、配列が互いに異なる核酸分子セットである。本発明に関しては、プローブは、リンカーに相補的または同一の一定の核酸配列およびそれに隣接する可変領域を含む。可変領域は全体的もしくは部分的にランダム化されていてもよく、または１つ以上の特定の配列を有するように設計されていてもよい。
【００３９】
認識部位内で、制限酵素が切断する箇所に応じて、その部位の１つ以上の塩基が全ての断片の末端に残存する。この場合には、プローブの「一定」部分は、一般に、リンカー配列（またはその相補鎖）だけでなく、断片の末端の関連鎖に残存される認識部位部分を含む。
【００４０】
増幅された断片を「解像すること」は、各断片が各試料中で個別に同定可能であるように、例えば、鎖長に基づいたその解像をいう。
【００４１】
２．ＨＡＰＰＹマッピング
ＨＡＰＰＹマッピングの一般的な技法は当技術上既知であり、文献に広範に記載されている。ＨＡＰＰＹマッピングの詳細な説明を含む以下の開示内容は全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている：Konfortovら、Genome Res.2000 Nov;10(11):1737-42、WilliamsおよびFirtel,Genome Res.2000 Nov;10(11):1658-9、Piperら、Genome Res.1998 Dec;8(12):1299-307、Lynchetら、Genomics.1998 Aug 15;52(1):17-26、Dearら、Genomics.1998 Mar 1;48(2):232-41、Walterら、Nucleic Acids Res.1993 Sep 25;21(19):4524-9、Dearおよびcook、Nucleic Acids Res.1993 Jan 11;21(1):13-20、DearおよびCook、Nucleic Acids Res.1989 Sep 12;17(17):6795-807。本発明は、いくつか主要な箇所が異なったＨＡＰＰＹマッピングに基づいている。
【００４２】
第１の違いは、核酸は、放射線または他の物理的な手段によって切断され、別個の分割量に分離されてから、配列特異的な切断によって断片化されるということである。本発明に使用する上で好ましい酵素である制限エンドヌクレアーゼを選択し、使用する技法は、例えば、Sambrookら（前掲書中）により、当技術上既知である。
【００４３】
配列特異的な５’および３’末端が作製される限り、核酸切断の別の技法を使用することができる。これらには、分析対象の核酸が、増幅反応液中の１つ以上のプライマーを使用して増幅される、規定された配列のプライマーを用いるＰＣＲが挙げられる。１つのプライマーまたは複数のプライマーが、実質的に配列特異的な方法で、分析対象の核酸にハイブリダイゼーションして、プライマー鎖が酵素的鎖伸長することができるハイブリッドを形成することができる。プライマーがハイブリダイゼーションする部位の数に応じて、ゲノム配列に対応する数多くの断片が作製される。核酸は、通常、２本鎖であるので、プライマーがハイブリダイゼーションする前に変性させる必要がある。
【００４４】
本発明は、好ましくは、１つの配列の切断に関係する。しかし、例えば、２つ以上の制限酵素を使用した多数の配列の切断も可能である。切断が多数の配列において実施される場合には、リンカーは、切断によって残存された「末端」の１セットまたは両方のセットに付加されてもよい。リンカーの１つの特異性だけを使用する場合には、そのリンカー配列に相補的な同じ配列において切断された２つの末端を有する断片だけが増幅される。
【００４５】
さらに、本発明は、特定の断片増幅を可能にするための手段としてリンカーのライゲーションを使用する。また、このような方法は当業者に既知である。リンカー（または本明細書の別の箇所に規定されているプライマー）は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物である単位を含む。一般的に言うと、ヌクレオチド類似物は、鎖状のヌクレオチド残基に組み込まれることができ、塩基特異的な方法で相補的な核酸鎖の塩基にハイブリダイゼーションすることができる化合物である。本発明に有用な類似物は、さらに、鎖伸長酵素の基質である。
【００４６】
ヌクレオチド類似物は、例えば、塩基対形成特性に影響するように、塩基が改変されている、および／または例えば、ＰＮＡのアミド結合骨格におけるように、糖または骨格部分が改変されている、および／またはリン酸部分が改変されている、改変されたヌクレオチドであってもよい。
【００４７】
骨格が改変された核酸には、メチルホスホネート、非架橋酸素の両方が硫黄で置換されているホスホロジチオエートおよびホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル並びにボラノホスフェートが挙げられる。アキラルホスフェート誘導体には、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ2−５’−Ｏ−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートが挙げられる。ペプチド核酸は、ホスホジエステル骨格全体がペプチド結合で置換されている。
【００４８】
安定性および親和性を増強するために、糖改変も使用される。塩基が天然のβ−アノマーに対して逆であるデオキシリボースのα−アノマーを使用してもよい。リボース糖の２’−ＯＨを変更して、親和性を損なうことなく分解されにくい２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成してもよい。
【００４９】
複素環塩基の改変は、好ましくは、適切な塩基対形成を維持する。いくつかの有用な置換には、デオキシウリジンとデオキシチミジン、５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンとデオキシシチジンが挙げられる。５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピニル−２’−デオキシシチジンは、それぞれ、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと置換されると、親和性および生物学的活性を増加することが示されている。
【００５０】
リンカーは、好ましくは、鎖長全体が７〜４０残基である。通常、１５〜２５残基の短いリンカーが使用されるが、３０残基以下もしくは４０残基以下、または１０残基以下のプライマーも有用である。増幅後、全てのアンプリマーは両方の末端に同じ配列を有し、その配列の長さはプライマーに依存する。ゲノムＤＮＡを切断後、核酸を試料に分割し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断し、リンカーにライゲーションし、リンカー特異的なプライマーを使用して増幅する。全ての核酸断片は各末端にリンカーを組み入れるので、全ての断片が増幅される。
【００５１】
本発明によるハイブリダイゼーション手法は、有利なことに、２本鎖制限断片の各鎖の５’末端だけへのライゲーションを必要とする。しかし、特許請求の範囲内の本発明の態様は、リンカーが核酸鎖の３’末端または５’末端と３’末端の混合物に接続されている別のパターンのライゲーションを使用して実施することができる。
【００５２】
全体的な増幅ステップ後、特定のプライマーまたはプローブを使用して各試料中の核酸断片のサブセットを増幅する。このような状況下では、プライマーの３’末端のヌクレオチド残基が試料核酸のヌクレオチド残基と正確に一致している鎖伸長のみが生じる。５’末端は、プライマーの残りが分離されないように十分に強くハイブリダイゼーションされている限り、完全にハイブリダイゼーションされる必要はない。有利なことに、プライマーは、リンカー／試料核酸標的に１００％相補的である。
【００５３】
プライマーは、天然の塩基の２つまたは３つと塩基対形成する能力を有することによって、または一般的には、区別することなしに天然の塩基の各々と塩基対を形成することによって、変性結合(degenerate binding)を促進する塩基類似物を組み入れることができる。このような類似物は、プローブを製造する際に従来のランダム化技法と併用して使用することができる。しかし、プローブは結合の際に配列特異性が高く、ハイブリダイゼーションして配列を変性しないことが好ましい。
【００５４】
鎖伸長ステップにおいて付加するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物は検出を容易にするために標識されてもよい。好適な標識の例には、放射性同位体、蛍光部分、ハプテンおよび発色または化学発光酵素システムの成分が挙げられる。
【００５５】
追加の方法としてまたは別の方法として、規定の配列のプライマーを容易に同定させられる特定のタグを使用して規定の配列のプライマーを標識することができる。例として、質量分析計で分離可能な異なる質量のタグ、適当な検出装置を使用して「読む」ことができる分子バーコード、特定のサインの放射を生じる傾向タグの組み合わせ等が挙げられる。
【００５６】
標識の性質は、各試料中に存在するマーカーを検出するための最良の方法を決定する。断片が未標識である場合または全てが同様に標識されている場合には、従来のＨＡＰＰＹマッピングと同様に、増幅された断片は、有利なことに、ゲル電気泳動によって検出される。
【００５７】
しかし、特定の標識を使用することにより、ＦＡＣＳまたは質量分析計などによって断片を選別することができる。例えば、Griffinら、(1997) Nature Biotechnology 15:1368参照。標識が各プライマーに対して特異的に作製される場合には、増幅の必要なしに、特定の断片の存在について個々の分割量の試料を選別することができる。
【００５８】
３．核酸切断
配列特異的な方法での核酸の切断は、上記に記載されている制限エンドヌクレアーゼ消化を含む、任意の好適な方法によって実施することができる。別の方法には、三重らせん形成による二重らせんＤＮＡの配列特異的切断(H.E.MoserおよびP.B.Dervan(1985)Science 238,645-650参照)、放射性ヌクレオチドの使用（例えば、Karamychevら、J Nucl Med 2000;41:1093-1101）、米国特許第6,018,058号に記載されている合成制限酵素、ＣＡＰ−およびＦｏｓ−に基づいた分子(http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/projects/hastie/dsc.htm)並びに国際公開公報第00/20622号に記載されているジンクフィンガーポリペプチドの使用が挙げられる。
【００５９】
４．用途
本発明の改善されたＨＡＰＰＹマッピング技法は任意のマッピングプロジェクトに適用することができる。従って、染色体などのゲノムまたはゲノムＤＮＡのマッピングは、ＨＡＰＰＹマッピング技法の適用が可能であることがすでに示されており、本明細書に記載されている改善された方法の適用が可能である。本発明のさらに別の用途は、本発明の明細書に基づいて当業者に明らかになる。
【００６０】
本発明のＨＡＰＰＹマッピング技術または実際には任意のＨＡＰＰＹマッピング技術の好ましい適用を以下に記載する。
【００６１】
Ａ．ハプロタイプ決定
上記のように、ＨＡＰＰＹマッピング方法は、ゲノムＤＮＡのラムダム切断およびランダムサンプリングにより、（典型的には）サブ−ゲノム量のＤＮＡを含有する試料セット（パネル）を作製する。パネルの同一メンバーに見出される（すなわち、同時切断する）ことが多い配列（マーカー）は、断片の平均サイズと比較して、ゲノム内で接近して存在すると推論することができる。放射線ハイブリッドマッピングは、ＨＡＰＰＹマッピングといくつかの特徴を共有するが、切断は生きている「ドナー」細胞を照射し、次に異なる種の未照射の「宿主」細胞と融合することによって実施される。ドナーの染色体断片には結果として生ずるハイブリッドに保持されるものもあり、生ずるハイブリッドは、次いで、ドナーマーカーの内容について分析される
【００６２】
通常の用途では、どちらかの方法によって分析されるマーカーは単型であり、それらが多型である場合には、多型は無視される（マーカーの対立遺伝子は１つとしてスコアリングされる）。しかし、多型マーカーの対立遺伝子がマッピングパネル上で識別され、個別にスコアリングされる場合には、ハプロタイプ情報（すなわち、二倍体ゲノムの２つ以上のマーカーの対立遺伝子間の連鎖相）を求めることができる。
【００６３】
ハプロタイプ情報は、多型（特に、一塩基多型、ＳＮＰｓ）と、現在では広範に調査されている疾患または薬剤に対する有害作用の罹患性との関係、ＳＮＰハプロタイプと集団間の「通常の」可変的な特徴との関係、およびヒトの集団移動を追跡するためのＳＮＰハプロタイプの使用を含むが、これらに限定されない数多くの用途にＳＮＰハプロタイプ情報が有用である、特にヒトゲノムにおいてかなり興味深い。
【００６４】
ＨＡＰＰＹマッピングは、以下のように、ハプロタイプ決定に適用することができる。マッピングパネルは通常の方法で作製されるが、マーカーの検出およびスコアリングは、多型マーカーの対立遺伝子を識別するような方法で実施され（マーカーの２つの対立遺伝子は、本明細書においては大文字および小文字、例えば、Ａ、ａによって示される）、各対立遺伝子の結果は個別に記録される。２つ以上の多型マーカーがスコアリングされる場合には、各々の対立遺伝子の近さを求めることができる。例えば、親ゲノムがハプロタイプＡＢおよびａｂを含有し、マーカーＡ／ａがマーカーＢ／ｂに十分に近い位置に存在する場合には、同時分離（従って、連鎖）はＡとＢの間およびａとｂの間には観察されるが、Ａとｂの間またはａとＢの間には観察されない。従って、親ハプロタイプを決定することができる。ハプロタイプ情報を得ることができる距離は、マッピングパネルを作製する際に使用する断片のサイズによって決定される。
【００６５】
多型の性質に応じて、必要なスコアリングおよび対立遺伝子の識別のために多数の方法が存在する。これらの方法のいずれかを本発明に関連して適用することができる。
【００６６】
多くの例において、ゲノム内のマーカーの位置はすでに決定されており、連鎖相だけが必要である。これらの場合には、先験的にマーカーの順序および空間的位置を決定するのに必要であると思われるより少ない数のパネルメンバーを分析するだけでよい。また、マップ情報がすでに存在する場合には、マッピングパネルの解像はほとんど問題とされない。このように、ハプロタイプを決定することができる範囲を最大にするために、パネルはできるだけ大きいＤＮＡ断片から作製することができる。極端な例では、ゲノムＤＮＡは切断されないままで、完全な染色体ＤＮＡ分子（または染色体）はパネルメンバーに分離され、この例では、結果は染色体上のマーカーの順序または空間的位置を決定することができないが、染色体の長さ分のハプロタイプデータを生ずる。各対立遺伝子が独立マーカーと考えられるので、理想的には、ハプロタイプ決定に使用するために作製されるＨＡＰＰＹパネルは、通常のマッピングに使用されるもののほぼ２倍の量のＤＮＡを含有しなければならない。しかし、標準的なＨＡＰＰＹパネルにとって許容されうるＤＮＡの濃度範囲は、ハプロタイプ決定に対応するのに十分に広い。
【００６７】
原則として、同じ方法を使用して、放射線ハイブリッドパネルからハプロタイプデータを得ることができるが、大多数の個人のハプロタイプが必要とされる場合には、ＲＨパネルを作製する相対的な困難さによりこの方法はあまり関心を持たれない。
【００６８】
Ｂ．染色体のマッピング
上記のように、切断された核酸の代わりに染色体全体を使用してハプロタイプ情報をマッピングするまたは得ることが有利な場合がある。さらに、より大きいＤＮＡ断片を使用することにより、通常中程度から高い解像において有用なＨＡＰＰＹマッピングを、低解像度マップを提供するように拡大適用することができる。
【００６９】
ＨＡＰＰＹマッピングにおいて、ＤＮＡは、先ず従来通り、機械的または他の手段による切断の前に、比較的純粋な形態（溶液または保護用ゲルマトリックス）で単離される。しかし、長いＤＮＡ分子は不安定な性質であるので、鎖長数百万塩基対（Ｍｂ）より長い断片を操作するのが困難になる。このように、マーカー間の連鎖は、数Ｍｂまでの長さでは容易に求めることができる。
【００７０】
本発明は、「ネーキッド」ＤＮＡ断片ではなく、完全な染色体、染色体の断片またはクロマチンのサンプリングおよび分析（限界希釈において）に基づいたいくつかの用途を記載している。これらの形態のＤＮＡの天然のパッケージングにより、完全な染色体を含む、ネーキッドＤＮＡを取り扱う場合より大きい、断片を単離および操作することが可能になる。
【００７１】
ＤＮＡは、クロマチンまたは分裂中期の染色体の形態で細胞から放出される。これらの形態のどちらにおいても、ＤＮＡは安定化されており、ヒストンおよび他のタンパク質と結合することによって緻密にされている（必要に応じて、インサイチューハイブリダイゼーションまたはフロー−ソーティング用に分裂中期の染色体を調製する場合に使用される部分的な固定技法などの他の処理によってさらに安定化してもよい）。次いで、機械的な切断を使用して、クロマチン／染色体を断片に切断し、その溶液を希釈し、各々約０．０５〜２ゲノム当量のＤＮＡ（しかし、好ましくはパネルの各メンバー中ほぼ同じ量のＤＮＡ）を含有する試料パネルに分注する。約０．２〜約１．５の範囲が、一般に、有用であると考えられる。２コピーを超える使用は不利であるが、使用することができるコピー数に決まった下限はない。各マーカー配列が少なくとも１つの（好ましくは２つ以上の）メンバーにおいて確実に発現されるのに十分なパネルメンバーが分析されれば、本発明の原則は、分割量あたり任意に低い量のＤＮＡに適用することができる。次いで、ＨＡＰＰＹマッピングパネルの分析についてすでに記載されている方法で試料を分析する。ＤＮＡを確実にＰＣＲ増幅されやすくするために、プロテイナーゼ−Ｋを用いた前処理または他の方法が必要な場合もある。
【００７２】
無傷の分裂中期の染色体は通常溶液で作製されており、溶液で取り扱われているので、パネルメンバーに分離される断片は完全な染色体に至るまでの任意のサイズであってもよいことは明白である。（試料への分離が完了したら、マーカー内容が保持されている限り、ＤＮＡのさらなる断片化は重要ではないことに注目される）。ＨＡＰＰＹマッピングによって連鎖を最もよく検出することができる長さは、典型的には、使用するＤＮＡ断片の平均長さの０．５〜０．７倍以下である。このように、粗く切断された染色体断片から作製されるパネルは、マーカー間の平均距離が数Ｍｂ以上である過疎化状態のマップを作製するために使用することができる。これは、そのサイズでは従来のＨＡＰＰＹマッピングによって作製される緻密なマップを作製することが実行不可能または不経済となるようなゲノムに有用である。
【００７３】
分裂中期の染色体の断片をフローソーティングすることもできる（実際、断片状の染色体は、通常、染色体をフローソーティングする場合「バックグラウンド」と見られ、望ましい無傷の染色体の望ましくない分解または剪断により生じる）。このように、フローソーティングを、必要な数およびサイズの断片をマッピングパネルのメンバーに分離する方法として（希釈およびランダムサンプリングの代わりに）使用することができる。このような方法には、（ａ）各パネルメンバーのＤＮＡの総量を精密にコントロールすることができ、（ｂ）断片のサイズ範囲を狭く選択することができるという利点を有する。このような厳重な選択により、パネルの範囲および解像を微調整して取り扱い中のマッピング問題に対処することができ、任意のマーカー間の連鎖を反映するには小さすぎる断片、または有用なマッピング情報を含有するには大きすぎる断片を排除することによってマッピングデータの品質を改善が改善される。
【００７４】
無傷の分裂中期染色体は、このような染色体溶液の限界希釈またはフローソーティングによってマッピングパネルのメンバーに分離することができる。この場合には、パネルは１つの染色体内のマーカーの順序および空間的位置に関する情報を与えないが、マーカーをそれぞれの染色体にグループ単位で同時局在化させることができる。これは、染色体がフローサイトメトリーで識別できないような種において、マーカーを染色体上に割り付けるのに特に有用である。例えば、ヒトの第９、第１０、第１１および第１２染色体はフローサイトメトリーで識別することができない。１つまたは２つの染色体（Ｃｈｒ９〜１２クラスターからランダムにサンプリング）を各パネルメンバーにフローソーティングすることによって、マッピングパネルを作製する場合には、パネル上のマーカーをタイプ分けすることにより、マーカーを染色体連鎖グループに迅速に割り付けることができると思われる。
【００７５】
上記の方法は全てハプロタイプの決定にも適用することができる（多型遺伝子座間の連鎖相）。このような場合には、（対立遺伝子を識別するために確立されている技法を使用して）各マーカーの２つの対立遺伝子を独立にスコアリングすることだけが必要である。次いで、各対立遺伝子を独立マーカーとして処理することができ、（例えば）連鎖をＡとＢ間およびａとｂ間で観察し、ハプロタイプＡＢおよびａｂを明らかにする。マッピングパネルを作製する際にクロマチン／染色体断片または無傷の染色体を使用することにより、かなりの（または染色体の）長さにわたってハプロタイプを決定することができる。
【００７６】
本発明は、以下の実施例において、例示目的のためだけに以下にさらに記載されている。
【実施例】
【００７７】
［マッピングパネルの作製および事前増幅(pre-amplification)］
オオムギ（オオムギ(Hordeum vulgare)、変種「Ｏｐｔｉｃ」）の葉細胞から核を単離し、アガロースの帯状物(strings)に包埋する（０．５％ｗ／ｖ低融点アガロース、〜４０００核／マイクロタイター）。帯状物を溶解溶液（０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ９．０、１％ラウリルサルコシンのナトリウム塩、０．１ｍｇ ｍＬ-1プロテイナーゼ−Ｋ）に浸漬し、ゆっくり混合しながら４５℃において４８時間インキュベーションし、次いで０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ９．０中で４５℃において１時間インキュベーションし、次いで０．０５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０中で氷上で１時間インキュベーションし、必要時まで０．０５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０中で４℃において保存した。この操作中、溶解溶液はアガロース中に拡散し、核を溶解し、洗浄段階で拡散して流出するタンパク質および他の核物質を除去／分解し、実質的に純粋なＤＮＡをアガロース内に捕獲させておく。ＤＮＡの切断頻度をコントロールすることは非常に重要であるので、アガロースは、望ましくない機械的な切断からＤＮＡを保護する働きをする。
【００７８】
マグネシウムを含まないＰＣＲ緩衝液５ｍｌ［これは、ＤＮＡ変性のリスクを少なくするために、水より使用が好まれる］に６８℃において帯状物の小切片を融解し、ＤＮＡを分散させ、それを約５０〜１００ｋｂの断片に剪断するために試験管を数回転倒混和することによって切断が実施される。溶液を冷却させ、ＤＮＡがさらに機械的に剪断されないようにワイド−ボアピペットチップを使用して、マイクロタイター１つあたり約０．１一倍体ゲノム当量の濃度に水で希釈する。この溶液の５μｌの試料を９６ウェルマイクロタイタープレートの８８のウェルに分注し、５μｌの水を残りの８つのウェルの各々に分注する。蒸発を防ぐために、試料各々に１滴（〜３０μｌ）の軽油を積層する。
【００７９】
２μｌ容量あたり、０．７μlのＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液（Pharmacia、数多くの反応に好適な汎用緩衝液）、４．２単位の制限酵素ＤｐｎＩＩ(New England Biolabs)および水を含む消化マスター混合物を調製する。この混合物２μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに分注する。全ての水性成分が各ウェルの油積層物の下層になるように、このプレートを短時間（〜５００ｇ、５秒）遠心分離する。マイクロタイタープレートを３７℃において１０分間インキュベーションする。次いで、６５℃において３０分間加熱することによって、制限酵素を不活性化する。ＤｐｎＩＩは認識配列ＧＡＴＣの箇所で切断し、切断が完了まで進行するように条件を選択する。
【００８０】
６μｌ容量あたり、オリゴＬＩＢ１の１００μＭ溶液１．５μl、オリゴｄｄ−Ｓａｕ３Ａの１００μＭ溶液１．５μｌ、Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ緩衝液０．８μｌ、０．２６μｌの１Ｍ ＮａＣｌおよびＮａＣｌを含むライゲーションマスター混合物を調製する。このマスター混合物の６μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、先のように短時間遠心分離する。プレートを８５℃において２０分間インキュベーションし、次いで１分あたり１℃の割合で１５℃まで冷却する。オリゴヌクレオチドは以下のようである：
ＬＩＢ１ ５’ＡＧＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＧＧ ３’
ｄｄＳａｕ３Ａ ５’ＧＡＴ ＣＣＣ ＴＧＡ ＣＡＧ Ｃ* ３’
ここで、Ｃ*は、ジ−デオキシヌクレオチドを示す。
【００８１】
２μｌ容量あたり、１μlのＴ４ＤＮＡリガーゼ（５単位、Boehringer-Mannheim）および１μｌの１５ｍＭ ｒＡＴＰ（ｐＨ７．４のＴｒｉｓ−ＨＣｌで中和）を含むリガーゼマスター混合物を調製する。この溶液の２μｌを各ウェルに添加し、プレートを短時間遠心分離して、水性成分を油積層物の下層にする。次いで、プレートを１６℃において終夜（〜１６時間）インキュベーションする。
【００８２】
オリゴヌクレオチドは以下のように配列されている：
【化１】
【００８３】
３７μｌ容量あたり、５μｌの10 PCR Buffer No1(Boehringer Mannheim)、０．８μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各々２５ｍＭ）、１．４μｌのExpand Long Polymerase(Boehringer Mannheim)および水を含む全ゲノム増幅混合物を調製する。この溶液の３７μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに分注する。次いで、以下のように、熱サイクルを行うことによって、全ての制限断片の増幅を実施する［理想的には、ある断片は増幅しない場合があってもよく、その理由は、例えば、それらは大きすぎて、ＤｐｎＩＩの認識部位が広範に配置されている配列領域にあるからである］：
１）６８℃×４分［この段階で、オリゴｄｄＳａｕ３Ａは変性され、各制限断片の各鎖の３’末端の伸長が生じ、ライゲーションされたＬＩＢ１オリゴに相補的な領域を合成する。従って、この段階の後、全ての制限断片は、各末端にＬＩＢ１配列およびその相補鎖を保有する）。
２）９４℃×４０秒、５７℃×３０秒、６８℃×７５秒を１４サイクル
３）６８℃で７５秒ではなく１０５秒として、上記のように３４サイクル
４）６８℃で７５秒ではなく３００秒として、上記のように１サイクル
（段階２、３および４では、過剰のオリゴＬＩＢ１によって開始されて、接続された制限断片の指数的な増殖が生じる）。
【００８４】
次いで、水で反応液を連続的に８０００倍に希釈し、任意のマーカーまたは特定のマーカーの検出に必要になるまで（以下）−２０℃で保存する。
【００８５】
［特定のマーカーの検出］
特定のマーカー（すなわち、特定のプライマーを使用して事前に決定した配列）の検出は、上記から希釈した産物の各々５μｌを、以下を（さらに）含む反応液中で増幅する：
１×「Ｇｏｌｄ」ＰＣＲ緩衝液(Perkin Elmer)
０．２５Ｕ「Ｇｏｌｄ」ＤＮＡポリメラーゼ
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
特定の順方向および逆方向オリゴヌクレオチド各々１μＭ（例は以下参照）
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ各々２００μＭ
総容量１０μｌ
【００８６】
反応液を９６ウェルマイクロタイタープレートにセットし、鉱物油（１ウェルあたり±３０μｌ）を積層するか、または適当な密封フィルムを使用して密封する。以下のように、熱サイクルを実施する：
９３℃×５分
９４℃×２０秒、５５℃×３０秒、７２℃×６０秒を３８サイクル
（アニーリング温度、上記の例では５５℃は、オリゴヌクレオチドプライマーの融解温度により調節することができる）。
【００８７】
好適なロード用緩衝液（１５％ｗ／ｖ Ｆｉｃｏｌｌ ４００、０．１５ｍｇ／ｍｌ ブロモフェノールブルー、４×ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎを１×ＴＢＥ緩衝液に溶解したものを８μｌ）を産物に供給し、混合物の１０μｌ試料を電気泳動によって分析する（０．５×ＴＢＥ緩衝液に６％ポリアクリルアミドゲルを加えたもの）。
【００８８】
例えば、オオムギゲノム内の位置が既知である（およびシステムのテストとして働くと思われる）３つの特定の配列（「マーカー」）について上記の手法を連続的に実施した。特定のプライマー配列は以下のようである：
１４−４：
順方向＝ＧＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣ
逆方向＝ＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＣＣ
１４−５：
順方向＝ＣＡＡＣＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＡＡＣＣＧ
逆方向＝ＣＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＧＴＴＧＧ
１−１６Ｂ：順方向＝ＣＴＧＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣ
逆方向＝ＣＴＧＴＴＴＧＡＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＣ
【００８９】
各プライマー対は、既知のＤＮＡ配列の短い（数百塩基対）セグメントを増幅する。各場合において、セグメントは、それらの中に、ＤｐｎＩＩの制限部位を含有しないことが知られている。マーカー１４−４および１４−５は互いに非常に接近して（＜２ｋｂ）存在することが知られているが、１−１６Ｂは、これら２つからかなり距離をおいて（＞１００ｋｂ）存在することが知られている。
【００９０】
結果の分析は、１４−４と１４−５の間には強力な同時分離が存在したことを示しており、２つのマーカーは各々マッピングパネルの８８のメンバー（マーカーを含有しない８つの陰性対照を除く）の±６０％に存在し、パネルへのこれら２つのマーカーの分布に大きな類似性がある。これら２つのマーカー間ではＬｏｄスコア１４．２が算出され、これは連鎖を強く示している。マーカー１−１６Ｂもマッピングパネルの非陰性対照メンバーの±６０％に存在するが、その分布は、他の２つのマーカーの分布とは明らかに関連性を示さず、１−１６Ｂと１４−４および１−１６Ｂと１４−５のＬｏｄスコアは、それぞれ、０．４および０．７であり、これらはあまり有用ではない。
【００９１】
ライゲーション−媒介性ＰＣＲの希釈産物は、この方法では約８０，０００の特定のマーカーをタイプ分けするのに十分であることが明らかである。しかし、この産物は、ＬＩＢ１プライマーを使用すると、さらなる非−選択的増幅を受けやすく、本質的に無制限量の物質を提供することも明らかである。
【００９２】
［任意のマーカーの検出］
希釈した事前−増幅産物の各々から５μｌの分画を取り、（希釈産物以外に）０．２５単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ(Taq Gold、Perkin Elmer)、１×ＰＣＲ「Ｇｏｌｄ」緩衝液（ポリメラーゼの供給元による推奨）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１μＭのプライマーＬＩＢＳＥＬ−Ａ （５’ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＣＧＴ ＣＣ ３’）。
【００９３】
（最初の１２塩基はＬＩＢ１の３’側の１２塩基と同一であり、次の４つは、全ての断片に共通のＤｐｎＩＩの認識配列と同一であり、最後の４つの塩基は選択的で、断片の末端の〜１／２５６番にだけ対応物を有する）。蒸発を抑えるために、混合物に鉱物油を積層し、熱サイクル（９３℃×９分、ついで９４℃×２０秒、６４℃×３０秒および７２℃×６０秒を３３サイクル）に付する。１００〜５００塩基のサイズを有する断片を解像することができる、標準的なプロトコールを使用したゲル電気泳動で各反応の産物を分析する。
【００９４】
このような反応は各々（マッピングパネルの各メンバーに対応する）数多くの産物を産生し、各場合の産物は、各末端の制限部位の内側に適当な４つの選択的なヌクレオチドを保有するゲノムの数十のＤｐｎＩＩ断片のサブセットである。解像可能な断片の各々の有無について各反応液をスコアリングし、９６の分割量においてそれらがどれくらいの頻度で同時分離しているかを調べることによって互いに対してマッピングする。従って、各断片は、サイズ（電気泳動によって決定される）、それを作製するために使用した制限酵素（ＤｐｎＩＩ）およびそれを増幅するために使用した選択的プライマー（ＬＩＢＳＥＬ−Ａ）の組み合わせによって規定されるマーカーであると考えることができる。種々の理由のいずれかのために増幅（全体的または選択的）が失敗する、またはマーカーが１本鎖コピー配列ではない（９６分割量中の陽性の数を見ることによって容易にわかる）、または別のマーカーとほぼ同じサイズであるので、電気泳動で解像することができないことにより、マッピングできないマーカーもある。しかし、大多数のマーカーは、ある割合の試料中で検出することができ、連鎖頻度の表作成および算出によってマッピングすることができる。
【００９５】
上記の明細書中に記載されている文献は全て参照として本明細書に組み入れられている。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載されている本発明の方法およびシステムに種々の改良および変更を加えることができることは、当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施態様に関連して記載されているが、主張されている本発明は、このような具体的な実施態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連の分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載されている様式の種々の改良は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
Claims (16)
- 核酸を分析する方法であって、
ａ）複数の核酸試料を含むＨＡＰＰＹマッピングパネルを供するステップであって、各試料が、マッピング対象の該核酸からランダムに選択された切断されたＤＮＡの断片を含有し、質量について、マッピング対象の該核酸の１つのコピーの質量の０．０５〜２倍に達するステップと、
ｂ）該試料中の該核酸を規定の配列において完全に切断して核酸断片を作製するステップと、
ｃ）該核酸断片の５’末端および３’末端にリンカーをライゲーションするステップと、
ｄ）リンカー特異的プライマーを使用して該核酸を全体的に増幅するステップと、
ｅ）プローブのレパートリーを供するステップであって、各プローブが、該リンカーの配列に相補的または同一の第１の配列と、該レパートリーの各プローブにおいて異なる隣接する第２の配列とを含むステップと、
ｆ）該レパートリーの１つ以上のプローブを該試料にハイブリダイゼーションして、該試料中の該１つ以上のプローブに相補的な配列の有無をスコアリングするステップと
を含む方法。 - 前記ステップｄ）が、
ｉ）各試料から複数の特定の核酸断片を増幅するステップと、
ii）ｉ）で増幅した断片をサブ試料に分割するステップと、
iii）ｉ）で使用したプローブより特異性が高い１つ以上のプローブを該サブ試料にハイブリダイゼーションするステップと、
iv）必要に応じて、ステップｉ）およびステップii）を繰り返し反復するステップと、
ｖ）前記試料中の前記１つ以上のプローブに相補的な配列の有無をスコアリングするステップと
を含む請求項１に記載の方法。 - 前記ステップｅ）における前記１つ以上のプローブを使用して、前記試料から特定の核酸断片が増幅される請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記マッピングパネルの２つ以上の試料が、１の一倍体細胞に由来する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 前記マッピングパネルの前記試料が、希釈により、１以上の二倍体細胞または２以上の一倍体細胞に由来する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記マッピングパネル試料が、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して切断される請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 前記リンカーが、鎖長７〜４０ヌクレオチドである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 前記プローブレパートリーの各プローブが、前記リンカーの配列またはそれに相補的な配列と、２〜２０ヌクレオチドの別の配列とを含む請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 前記別の配列が、少なくとも部分的にランダムに作製された配列である請求項８に記載の方法。
- 各プローブが、既知の配列である請求項８に記載の方法。
- 各試料中のいずれかの核酸断片の有無が、ゲル電気泳動によってスコアリングされる請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
- ２つ以上の多型ＤＮＡ遺伝子座の対立遺伝子間の連鎖相を求める方法であって、
ａ）ゲノムＤＮＡを含むマッピングパネルを調製するステップと、
ｂ）マーカーの両対立遺伝子の存在について該ゲノムＤＮＡをサンプリングするステップと、
ｃ）ハロタイプ情報を提供するために、対立遺伝子間の同時分離頻度を求めるステップと
を含む方法。 - 前記ゲノムＤＮＡが、マーカーを検出するために核酸増幅を使用してサンプリングされる請求項１２に記載の方法。
- 前記増幅が、前記核酸を特異的に切断し、増幅プライマーがハイブリダイゼーションするリンカーをライゲーションすることによって実施される請求項１３に記載の方法。
- 前記マッピングパネルが、染色体全体または染色体断片を含む請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
- 前記マッピングパネルが、実質的に、染色体全体または染色体断片からなる請求項１５に記載の方法。
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