KR20230028450A

KR20230028450A - 앰플리콘 포괄적 풍부화

Info

Publication number: KR20230028450A
Application number: KR1020237002334A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 장; 케로우 장; 핑 송
Original assignee: 윌리엄 마쉬 라이스 유니버시티
Priority date: 2020-06-26
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2023-02-28
Also published as: AU2021294360A1; CN116075520A; EP4172169A1; WO2021263176A1; US20230250470A1; CA3183843A1

Abstract

앰플리콘 포괄적 풍부화 (ACE)라고 하는, 표적된 영역 내에서 잠재적 변이체를 포괄적으로 풍부화하기 위한 시약 및 방법이 본원에 제공된다. 풍부화된 서열 변이체는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 단일 뉴클레오티드 변이체, 또는 작은 삽입 및 결실을 포함할 수 있다. 구현예는 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 차세대 시컨싱 (NGS), 및 장기-판독 시컨싱과 통합을 위한 절차를 포함한다.

Description

앰플리콘 포괄적 풍부화

관련 출원에 대한 참조

본 출원은 2020년 6월 26일 출원된 미국 가출원 번호 63/044,634의 우선권 이익을 주장하고, 이의 전체 내용은 참고로 본원에 포함된다.

연방 후원 연구에 관한 진술

본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 R01CA203964 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 양식으로 제출되었고 이로써 이 전체가 참고로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2021년 6월 8일 창작된 상기 ASCII 카피는 RIEP0077WO_ST25.txt라고 하고 크기가 11.6 킬로바이트이다.

배경

1. 분야

본 개시내용은 일반적으로 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 앰플리콘 포괄적 풍부화 (ACE)라고 하는, 표적된 영역 내에서 잠재적 변이체를 포괄적으로 풍부화하는 시약 및 방법에 관한 것이다.

2. 관련된 기술의 설명

저 변이체 대립유전자 분획 (VAF)을 가진 DNA 서열 변이체의 검출은 암 종양 생검 및 혈장 무세포 DNA 샘플에서 종양-특이적 돌연변이의 검출을 포함하는, 다양한 연구 및 임상 적용에 중요하다. 저 VAF 돌연변이의 검출을 위한 현행 기구는 어느 한쪽 감도 (예를 들면 10% VAF에 생어 및 나노포어 시컨싱)에서 제한되거나 다중화 (예를 들면 1-플렉스에 디지털 PCR)에서 제한되거나 고가 (예를 들면 고유 분자성 식별자 (UMI) 바코드로 25,000x 이상까지 심층 시컨싱)이다. DNA 서열 변이체의 선택적 풍부화는 qPCR, 생어 시컨싱, 및 나노포어 시컨싱의 감도를 개선할 것이고 동시에 합성에 의한 시컨싱 (NGS)의 비용을 감소시킬 것이다.

변이체 풍부화를 위한, 예컨대 진동하는 전기장 (Boreal Genomics), 복잡한 램핑이 있는 PCR (ICE-COLD PCR), 핵산 유사체 차단제 (Diacarta), 및 효소적 소화 (Name-Pro)에 기반된 이전 방법은 전형적으로, 주위 온도 및 프로브 서열에 대한 이들 방법의 높은 취약성으로 인해, 다중화된 패널의 경우 제품화하기 어렵다. 차단제 변위 증폭 방법 (Nuprobe)은 온도-강한 변이체 서열 풍부화를 허용하지만, 긴 연속 엑손에서, 예컨대 TP53 및 BRCA1 같은 종양 억압인자 유전자에서 돌연변이 심문하기를 다루기 어렵게 만드는 약 20개 뉴클레오티드 (nt)의 풍부화 윈도우를 갖는다. 그래서, 긴 영역에서 돌연변이 심문하기를 허용하는 변이체 풍부화의 새로운 방법은 필요하다.

개요

이와 같이, 최대 100 nt 범위의 긴 영역에서 다중화된 변이체 대립유전자 풍부화를 허용하는 대립유전자 포괄적 풍부화 (ACE) 기술이 본원에 제공된다.

일 구현예에서, (a) 보조 올리고뉴클레오티드, (b) 억압인자 올리고뉴클레오티드가 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이고 보조 올리고뉴클레오티드의 하위서열에 역 상보적인 보호된 하위서열을 포함하는, 억압인자 올리고뉴클레오티드가 적어도 7개 뉴클레오티드 길이이고 보조 올리고뉴클레오티드에 역 상보적이지 않은 미보호된 하위서열을 포함하는, 억압인자 올리고뉴클레오티드, (c) 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 억압인자 올리고뉴클레오티드의 하위서열과 동일한 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 하위서열을 포함하는, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 (d) 템플레이트-의존적 폴리머라제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 조성물은 폴리머라제 기능에 필요한 시약 및 완충액을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 템플레이트-의존적 폴리머라제는 DNA 폴리머라제이다. 일부 양태에서, 템플레이트-의존적 폴리머라제는 역 전사효소이다. 일부 양태에서, 템플레이트-의존적 폴리머라제는 RNA 폴리머라제이다.

일부 양태에서, 조성물은 핵산 템플레이트 분자를 추가로 포함하며, 여기서 템플레이트 분자는 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 하위서열의 역 상보체와 90% 초과 상동인 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 생물학적 DNA 또는 RNA 분자이다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 세포의 샘플로부터 수득된다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 생체유체로부터 수득된다. 특정 양태에서, 생체유체는 혈액, 소변, 타액, 뇌척수액, 간질액, 또는 활액이다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 조직으로부터 수득된다. 특정 양태에서, 조직은 생검 조직 또는 외과적으로 절제된 조직이다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 RNA 분자의 역 전사를 통해서 생성된 상보적 DNA 분자이다. 일부 양태에서, RNA 분자는 인간, 동물, 식물, 또는 환경적 표본으로부터 유래된 생물학적 RNA 샘플로부터 수득된다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 단일-가닥 DNA 템플레이트에서 작용하는 DNA 폴리머라제를 통해서 생성된 앰플리콘 DNA 분자이다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 단일 세포 DNA의 다중 변위 증폭으로부터 생성된 앰플리콘 DNA 분자이다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 생물학적 DNA 분자의 물리적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 생성된 생성물이다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 단편화 과정의 생성물이다. 일부 양태에서, 단편화 과정은 초음파처리 또는 효소적 단편화이다. 일부 양태에서, 템플레이트 분자는 비술파이트 전환 반응, APOBEC 반응 (즉, 아포리포단백질 B mRNA 편집 효소, 촉매적 폴리펩티드-유사 반응), TAPS 반응 (즉, TET-보조된 피리딘 보란 시컨싱 반응), 또는 시토신 뉴클레오티드가 이의 메틸화 상태에 기반된 우라실 뉴클레오티드로 선택적으로 전환되는 다른 화학적 또는 효소적 반응의 생성물이다.

일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 개시 상보체 하위서열 및 표적-결합 상보체 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 DNA를 포함한다. 일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 DNA로 이루어진다. 일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 비-천연 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 30 내지 500nt, 50 내지 500nt, 100 내지 500nt, 30 내지 400nt, 30 내지 300nt, 30 내지 200nt, 30 내지 100nt, 30 내지 75nt, 및 30 내지 50nt의 길이를 갖는다. 일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 적어도 또는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제 확장을 방지하는 3' 화학적 변형 또는 DNA 서열을 갖는다.

일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 미보호된 하위서열 및 보호된 하위서열을 포함한다. 보호된 하위서열은 표적-결합 하위서열 및 개시 하위서열로 이루어진다. 일부 양태에서, 보호된 하위서열은 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이고 보조 올리고뉴클레오티드의 적어도 한 하위서열에 역 상보적이다. 일부 양태에서, 보호된 하위서열은 적어도 또는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 보호된 하위서열은 길이가 20-500nt, 20-400nt, 20-300nt, 20-200nt, 20-100nt, 20-80nt, 20-60nt, 30-500nt, 30-400nt, 30-300nt, 30-200nt, 30-100nt, 30-80nt, 30-60nt, 40-500nt, 40-400nt, 40-300nt, 40-200nt, 40-100nt, 40-80nt, 50-500nt, 50-400nt, 50-300nt, 50-200nt, 50-100nt, 50-80nt, 또는 100-500nt이다. 일부 양태에서, 보호된 하위서열은 보조 올리고뉴클레오티드의 전체에 역 상보적이다. 일부 양태에서, 미보호된 하위서열은 적어도 7개 뉴클레오티드 길이이고 보조 올리고뉴클레오티드의 임의의 부분에 역 상보적이지 않다. 일부 양태에서, 미보호된 하위서열은 적어도 또는 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 미보호된 하위서열은 8-30nt, 8-25nt, 8-20nt, 8-15nt, 12-30nt, 12-25nt, 12-20nt, 16-30nt, 또는 16-25nt 길이이다.

일부 양태에서, 개시 하위서열은 억압인자 올리고뉴클레오티드의 3'에서 또는 근처에서 있다. 일부 양태에서, 개시 하위서열은 4 내지 30개 뉴클레오티드 (예를 들면, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드; 또는 4-30nt, 4-25nt, 4-20nt, 4-15nt, 8-30nt, 8-25nt, 8-20nt, 8-15nt, 12-30nt, 12-25nt, 12-20nt, 16-30nt, 또는 16-25nt) 길이를 갖는다. 일부 양태에서, 개시 하위서열은 표적 하위서열의 3' 바로 옆에 있는 템플레이트 분자 하위서열의 역 상보체와 30% 미만 동일하다 (즉, 약 30%, 28%, 26%, 24%, 22%, 20%, 18%, 또는 16% 미만 동일하다). 일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 보조 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 또는 근처에서 개시 상보체 하위서열을 갖는다. 일부 양태에서, 개시 상보체 하위서열은 4 내지 35개 뉴클레오티드 (예를 들면, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드; 또는 4-30nt, 4-25nt, 4-20nt, 4-15nt, 8-30nt, 8-25nt, 8-20nt, 8-15nt, 12-30nt, 12-25nt, 12-20nt, 16-30nt, 또는 16-25nt) 길이를 갖는다. 일부 양태에서, 개시 상보체 하위서열은 억압인자 올리고뉴클레오티드의 개시 하위서열의 역 상보체와 적어도 90% 동일하다 (예를 들면, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다). 일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드는 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 역 상보체와 30% 초과 동일한 (예를 들면, 약 30%, 28%, 26%, 24%, 22%, 20%, 18%, 또는 16% 이하 동일한) 하위서열을 갖지 않는다.

일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 DNA를 포함한다. 일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 DNA로 이루어진다. 일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 비-천연 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 30 내지 500, 50 내지 500, 100 내지 500, 30 내지 400, 30 내지 300, 30 내지 200, 30 내지 100, 30 내지 75, 및 30 내지 50개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 적어도 또는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드의 미보호된 하위서열은 보조 올리고뉴클레오티드의 임의의 부분에 역 상보적이지 않다. 일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제 확장을 방지하는 3' 화학적 변형 또는 DNA 서열을 갖는다.

일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 억압인자 올리고뉴클레오티드의 하위서열과 동일한 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 DNA를 포함한다. 일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 DNA로 이루어진다. 일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 RNA를 포함한다. 일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 RNA로 이루어진다. 일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 6 내지 70개 뉴클레오티드 (예를 들면, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70개 뉴클레오티드; 또는 6-70nt, 6-30nt, 6-25nt, 6-20nt, 6-15nt, 8-70nt, 8-30nt, 8-25nt, 8-20nt, 8-15nt, 12-70nt, 12-30nt, 12-25nt, 12-20nt, 16-70nt, 16-30nt, 또는 16-25nt) 길이를 갖는다. 일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드는 서로 혼성화할 수 없다.

일부 양태에서, 조성물은 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 템플레이트 분자는 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 하위서열과 90% 초과 상동 (예를 들면, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 1090% 상동)인 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 10 내지 70개 뉴클레오티드 (예를 들면, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70개 뉴클레오티드; 또는 10-70nt, 10-30nt, 10-25nt, 10-20nt, 10-15nt, 12-70nt, 12-30nt, 12-25nt, 12-20nt, 16-70nt, 16-30nt, 또는 16-25nt) 길이를 갖는다.

일부 양태에서, 템플레이트 분자는 순방향 프라이머-결합 하위서열과 역방향 프라이머-상동 하위서열 사이 위치된 표적 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 표적 하위서열은 개시 하위서열, 즉, 표적-결합 하위서열을 포함하지 않는 억압인자 올리고뉴클레오티드 보호된 하위서열의 부분의 역 상보체와 적어도 70% 동일하다 (예를 들면, 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다).

일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드는 각각 DNA 폴리머라제 확장을 방지하는 3' 화학적 변형을 갖는다. 일부 양태에서, 변형은 디데옥시뉴클레오티드, 역전된 DNA 뉴클레오티드, 포스포노티오에이트-치환된 백본, 및 알칸 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서를 포함한다.

일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드는 각각 DNA 폴리머라제 확장을 방지하는 DNA 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 3' 단부에서 DNA 서열은 적어도 하나의 헤어핀 구조를 형성한다.

일부 양태에서, 조성물은 형광단-기능화된 DNA 프로브를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 형광단-기능화된 DNA 프로브는 Taqman 프로브 또는 분자성 비콘이다.

일부 양태에서, 조성물은 DNA 인터칼레이팅 염료를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, DNA 인터칼레이팅 염료는 SybrGreen, EvaGreen, 또는 Syto이다.

일부 양태에서, 보조 올리고뉴클레오티드 대 억압인자 올리고뉴클레오티드의 화학양론 비는 0.8 내지 100이다.

일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트 분자는 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -7.0 kcal/mol 내지 -20.0 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₁)를 갖는다. 예를 들어, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트 분자는 -7.0 내지 -20.0 kcal/mol, -7.0 내지 -18.0 kcal/mol, -7.0 내지 -16.0 kcal/mol, -7.0 내지 -14.0 kcal/mol, -7.0 내지 -12.0 kcal/mol, -7.0 내지 -10.0 kcal/mol, -10.0 내지 -20.0 kcal/mol, -10.0 내지 -18.0 kcal/mol, -10.0 내지 -16.0 kcal/mol, -10.0 내지 -14.0 kcal/mol, 또는 그안에 파생가능한 임의의 범위의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₁)를 갖는다. 일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트 분자는 적어도 또는 약 -7.0, -8.0, -9.0, -10.0, -11.0, -12.0, -13.0, -14.0, -15.0, -16.0, -17.0, -18.0, -19.0, 또는 -20.0 kcal/mol인 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₁)를 갖는다.

일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트 분자는 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -16 kcal/mol 내지 -200 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₂)를 갖는다. 예를 들어, 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트 분자는 -16 내지 -200 kcal/mol, -16 내지 -150 kcal/mol, -16 내지 -100 kcal/mol, -16 내지 -50 kcal/mol, -16 내지 -25 kcal/mol, -25 내지 -200 kcal/mol, -25 내지 -150 kcal/mol, -25 내지 -100 kcal/mol, -25 내지 -75 kcal/mol, -25 내지 -50 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₂)를 갖는다. 일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트 분자는 적어도 또는 약 -16, -18, -20, -25, -30, -35, -40, -45, -50, -55, -60, -65, -70, -75, -80, -85, -90, -95, -100, -125, -150, -175, 또는 -200 kcal/mol인 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₂)를 갖는다.

일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드는 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -15 kcal/mol 내지 -200 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₃)를 갖는다. 예를 들어, 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드는 -15 내지 -200 kcal/mol, -15 내지 -150 kcal/mol, -15 내지 -100 kcal/mol, -15 내지 -50 kcal/mol, -15 내지 -25 kcal/mol, -25 내지 -200 kcal/mol, -25 내지 -150 kcal/mol, -25 내지 -100 kcal/mol, -25 내지 -75 kcal/mol, -25 내지 -50 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₃)를 갖는다. 일부 양태에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드는 적어도 또는 약 -15, -16, -17, -18, -19, -20, -25, -30, -35, -40, -45, -50, -55, -60, -65, -70, -75, -80, -85, -90, -95, -100, -125, -150, -175, 또는 -200 kcal/mol인 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₃)를 갖는다.

일부 양태에서, (ΔG°₂ - ΔG°₃)의 값은 -5 kcal/mol 내지 +5 kcal/mol이다. 예를 들어, (ΔG°₂ - ΔG°₃)의 값은 -5 내지 +5 kcal/mol, -5 내지 +4 kcal/mol, -5 내지 +3 kcal/mol, -5 내지 +2 kcal/mol, -5 내지 +1 kcal/mol, -5 내지 0 kcal/mol, -5 내지 -1 kcal/mol, -5 내지 -2 kcal/mol, -5 내지 -3 kcal/mol, -4 내지 +5 kcal/mol, -3 내지 +5 kcal/mol, -2 내지 +5 kcal/mol, -1 내지 +5 kcal/mol, 0 내지 +5 kcal/mol, +1 내지 +5 kcal/mol, +2 내지 +5 kcal/mol, +3 내지 +5 kcal/mol, -4 내지 +4 kcal/mol, -3 내지 +3 kcal/mol, -2 내지 +2 kcal/mol, -1 내지 +1 kcal/mol, -2 내지 0 kcal/몰, -2 내지 +1 kcal/mol, 또는 -1 및 +2 kcal/mol이다. 일부 양태에서, (ΔG°₂ - ΔG°₃)의 값은 적어도 또는 약 -5, -4, -3, -2, -1, 0 +1, +2, +3, +4, 또는 +5 kcal/mol이다.

일부 양태에서, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 변이체 템플레이트 분자는 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -7 kcal/mol 내지 -20 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₄)를 갖는다. 예를 들어, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트 분자는 -7 내지 -20 kcal/mol, -7 내지 -18 kcal/mol, -7 내지 -16 kcal/mol, -7 내지 -14 kcal/mol, -7 내지 -12 kcal/mol, -7 내지 -10 kcal/mol, -10 내지 -20 kcal/mol, -10 내지 -18 kcal/mol, -10 내지 -16 kcal/mol, 또는 -10 내지 -14 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₄)를 갖는다. 일부 양태에서, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트 분자는 적어도 또는 약 -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, 또는 -20 kcal/mol인 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₄)를 갖는다.

일부 양태에서, 야생형 DNA 템플레이트 분자에 혼성화하는 억압인자 올리고뉴클레오티드는 보조 올리고뉴클레오티드에 결합하는 억압인자 올리고뉴클레오티드보다 더욱 열역학적으로 유리하며, 이는 DNA 템플레이트 분자에 결합하는 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드보다 더욱 열역학적으로 유리하며, 이는 변이체 DNA 템플레이트 분자에 결합하는 억압인자 올리고뉴클레오티드보다 더욱 열역학적으로 유리하다.

일부 양태에서, 조성물은 복수의 억압인자 올리고뉴클레오티드 종, 복수의 보조 올리고뉴클레오티드 종, 및 복수의 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 종을 포함한다. 일부 양태에서, 각 억압인자 올리고뉴클레오티드 종은 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이고 적어도 하나의 상응하는 보조 올리고뉴클레오티드 종의 하위서열에 역 상보적인 보호된 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 각 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 종은 적어도 하나의 상응하는 억압인자 올리고뉴클레오티드 종의 하위서열과 동일한 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 복수의 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 종은 각각 이의 5' 영역에 제1 범용 어댑터 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 DNA 서열 변이체를 선택적으로 증폭시키는 방법으로서, (a) 변이체 DNA 템플레이트 분자를 아마 포함하고 야생형 DNA 템플레이트 분자를 아마 포함하는 샘플을 본 구현예들 중 임의의 것의 조성물과 혼합시키는 단계, 및 (b) 혼합물을 적어도 7 라운드의 열 사이클링에 적용하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 열 사이클링은 적어도 또는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40 사이클 동안 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 각 라운드의 열 사이클링은 혼합물을 80℃ 내지 105℃ (예를 들면, 80 내지 105℃, 80 내지 100℃, 80 내지 95℃, 85 내지 105℃, 85 내지 100℃, 85 내지 95℃; 또는 적어도 또는 약 80, 85, 90, 95, 100, 또는 105℃)의 변성 온도에서 1 초 내지 1 시간 (예를 들면, 1 초-1 시간, 1 초-30 분, 10 초-30 분, 20 초-30 분, 30 초-30 분, 45 초-30 분, 1 분-30 분, 2-분-30 분, 30 초-5 분, 또는 1 분-5 분; 또는 적어도 또는 약 1 초, 5 초, 10 초, 15 초, 20 초, 30 초, 45 초, 1 분, 2 분, 5 분, 또는 10 분) 동안 유지하기 및 그 다음 혼합물을 50℃ 내지 75℃ (예를 들면, 50 내지 75℃, 50 내지 72℃, 50 내지 70℃, 50 내지 65℃, 50 내지 60℃, 55 내지 75℃, 55 내지 72℃, 55 내지 70℃, 55 내지 65℃, 60 내지 75℃, 60 내지 72℃, 60 내지 70℃, 65 내지 75℃; 또는 적어도 또는 약 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75℃)의 어닐링 온도에서 1 초 내지 2 시간 (예를 들면 1 초-2 시간, 1 초-1 시간, 1 초-30 분, 10 초-30 분, 20 초-30 분, 30 초-30 분, 45 초-30 분, 1 분-30 분, 2-분-30 분, 30 초-5 분, 또는 1 분-5 분; 또는 적어도 또는 약 1 초, 5 초, 10 초, 15 초, 20 초, 30 초, 45 초, 1 분, 2 분, 5 분, 또는 10 분) 동안 유지하기를 포함한다.

일부 양태에서, 복수의 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 억압인자 올리고뉴클레오티드, 및 보조 올리고뉴클레오티드는 샘플과 혼합되며, 여기서 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 억압인자 올리고뉴클레오티드, 및 보조 올리고뉴클레오티드의 각 세트는 상이한 변이체 템플레이트 분자 및 야생형 템플레이트 분자 서열에 상응한다. 일부 양태에서, 모든 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 5' 단부에서 또는 근처에서 범용 순방향 어댑터 하위서열을 포함하고, 여기서 모든 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 5' 단부에서 또는 근처에서 범용 역 어댑터 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 각 억압인자 올리고뉴클레오티드 종은 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이고 적어도 하나의 상응하는 보조 올리고뉴클레오티드 종의 하위서열에 역 상보적인 보호된 하위서열을 포함한다. 일부 양태에서, 각 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 종은 적어도 하나의 상응하는 억압인자 올리고뉴클레오티드 종의 하위서열과 동일한 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 하위서열을 포함한다.

일부 양태에서, 혼합물에서 각 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도는 100 pM 내지 5 μM이다. 일부 양태에서, 혼합물에서 각 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도는 100 pM 내지 5 μM이다. 일부 양태에서, 혼합물에서 각 억압인자 올리고뉴클레오티드의 농도는 100 pM 내지 5 μM이다. 일부 양태에서, 각 보조 올리고뉴클레오티드의 농도는 100 pM 내지 5 μM이다. 이들 중 임의의 경우, 농도는 100 pM-5 μM, 200 pM-5 μM, 300 pM-5 μM, 400 pM-5 μM, 500 pM-5 μM, 750 pM-5 μM, 1 nM-5 μM, 250 nM-5 μM, 500 nM-5 μM, 750 nM-5 μM, 1 μM-5 μM, 100 pM-1 μM, 200 pM-1 μM, 300 pM-1 μM, 400 pM-1 μM, 500 pM-1 μM, 750 pM-1 μM, 1 nM-1 μM, 또는 500 pM-500 nM일 수 있다. 예를 들어, 농도는 적어도 또는 약 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 750 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 750 nM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 또는 5 μM일 수 있다.

일부 양태에서, 각 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 대 이의 상응하는 억압인자 올리고뉴클레오티드의 화학양론 비는 0.8 내지 100이다. 일부 양태에서, 각 보조 올리고뉴클레오티드 대 이의 상응하는 억압인자 올리고뉴클레오티드의 화학양론 비는 0.8 내지 100이다.

일부 양태에서, 혼합물은 형광단-기능화된 DNA 프로브를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 형광단-기능화된 DNA 프로브는 Taqman 프로브 또는 분자성 비콘이다. 일부 양태에서, 혼합물은 DNA 인터칼레이팅 염료를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, DNA 인터칼레이팅 염료는 SybrGreen, EvaGreen, 또는 Syto이다.

일 구현예에서, 정량적 PCR (qPCR)을 사용하여 DNA 서열 변이체를 선택적으로 검출 및 정량화하는 방법으로서, (a) 본 구현예들 중 어느 하나의 선택적 증폭 방법에 따라 샘플의 제1 분취량으로 야생형 DNA 템플레이트보다 변이체 DNA 템플레이트의 선택적 PCR 증폭을 수행하는 단계; (b) 용액 형광의 시간-기반 측정을 수행하는 단계; (c) 용액 형광이 임계값을 초과하는 사이클에 기반된 사이클 임계 (Ct) 값을 계산하는 단계; 및 (d) Ct 값에 기반된 샘플에서 변이체 DNA 템플레이트의 존재/부재 또는 정량을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, qPCR 혼합물은 Taqman 프로브를 포함한다. 일부 양태에서, 본 방법은 (e) 억압인자 올리고뉴클레오티드의 부재 하에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여 샘플의 제2 분취량으로 제2 qPCR 반응을 수행하는 단계; (f) 이 제2 반응의 사이클 임계값 (Ct2)을 계산하는 단계; 및 (g) Ct와 Ct2 사이 값에서의 차이에 기반된 야생형 DNA 템플레이트에 대한 변이체 DNA 템플레이트의 상대 정량에 대하여 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 고-처리량 시컨싱을 사용하여 DNA 서열 변이체를 선택적으로 검출 및 정량화하는 방법으로서, (a) 본 구현예들 중 어느 하나의 선택적 증폭 방법에 따라 샘플의 제1 분취량으로 야생형 DNA 템플레이트보다 변이체 DNA 템플레이트의 선택적 PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 PCR 생성물로 고-처리량 시컨싱을 수행하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.

일부 양태에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 이의 5' 단부에 순방향 시컨싱 어댑터를 포함하고, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 이의 5' 단부에 역방향 시컨싱 어댑터를 포함한다. 특정 양태에서, 시컨싱 어댑터의 한쪽 또는 양쪽은 고유 분자성 식별자 (UMI) 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 본 방법은 PCR을 사용하여 시컨싱 어댑터 및/또는 시컨싱 지수를 첨부하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 시컨싱 어댑터는 고유 분자성 식별자 (UMI) 서열을 포함한다.

일부 양태에서, 본 방법은 고-처리량 시컨싱을 수행하기 전에 단계 (a)의 PCR 생성물에 시컨싱 어댑터를 결찰시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 결찰을 통해 첨부된 시컨싱 어댑터는 고유 분자성 식별자 (UMI) 서열을 포함한다.

일부 양태에서, UMI 서열은 UMI 서열의 모든 쌍이 UMI의 길이의 30% 이상인 최소 해밍 거리를 나타내는 사전-설계된 서열의 한 세트를 포함한다. 일부 양태에서, UMI 서열은 N (A, C, G, 및 T의 혼합물), B (C, G, 및 T의 혼합물), D (A, G, 및 T의 혼합물), H (C, A, 및 T의 혼합물), V (A, C, 및 G의 혼합물), S (C 및 G의 혼합물), W (A 및 T의 혼합물), R (A 및 G의 혼합물), Y (T 및 C의 혼합물), K (G 및 T의 혼합물), 및 M (A 및 C의 혼합물)으로부터 선택된, 축퇴 뉴클레오티드를 포함하는 서열의 한 세트를 포함한다.

일부 양태에서, 고-처리량 시컨싱은 합성에 의한 시컨싱을 통해 수행된다. 일부 양태에서, 고-처리량 시컨싱은 나노포어와 공동으로 전류 측정을 통해 수행된다.

본 발명의 다른 목적, 속성 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다. 하지만, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 동안, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 수정이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 구체적 실시예가 실례로써만 주어지는 것이 이해되어야 한다.

도면의 간단한 설명
하기 도면은 본 명세서의 부분을 형성하고 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 조합으로 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해할 수 있다.
도 1: 앰플리콘 포괄적 풍부화 (ACE) 시스템을 위한 핵심 시약 구성요소. 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 우측에서 화살표는 올리고뉴클레오티드의 3' 단부를 표시한다. 보조 올리고뉴클레오티드의 좌측에서 수직 막대 및 억압인자 올리고뉴클레오티드의 우측에서 대각선 막대는 올리고뉴클레오티드의 3' 단부를 표시하고 추가로 폴리머라제 확장을 방지하는 화학적 변형 또는 DNA 서열이 있음을 표시한다. 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드는, 2개 올리고가 서로 가까이 배치되는 영역으로서 실례되고 보호된 하위서열로서 정의된, 역 상보성의 중대한 영역을 갖는다. 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 억압인자 올리고뉴클레오티드는, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 억압인자 올리고뉴클레오티드의 수평 위치로서 실례된, 서열 유사성의 중대한 영역을 갖는다. ACE 시스템은 폴리머라제가 프라이머 확장을 수행하는데 필요한 템플레이트-의존적 폴리머라제 및 dNTP 시약을 또한 포함한다.
도 2: 변이체 대립유전자의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)-기반 풍부화에서 ACE의 적용. 억압인자 올리고뉴클레오티드는 더 길고 혼성화의 개시를 위한 추가의 부위를 갖기 때문에, 그리고 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드보다 더 높은 농도에서 존재할 수 있기 때문에 템플레이트 분자에 우선적으로 결합한다. 억압인자 올리고뉴클레오티드가 템플레이트 분자에 결합되는 동안, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 템플레이트 분자에 혼성화할 수 없고, 그래서 DNA 폴리머라제에 의해 확장될 수 없다. 억압인자 올리고뉴클레오티드 상에서 개시 하위서열은 보조 올리고뉴클레오티드 상에서 개시 상보체 하위서열에 결합할 수 있고 분지점 이동은 시작할 수 있다. 하지만, 표적 하위서열에서 억압인자 올리고뉴클레오티드에 매칭된 템플레이트 분자 상에서, 보조 올리고뉴클레오티드에 의한 억압인자 올리고뉴클레오티드의 변위는 제한된 PCR 어닐 사이클 시간이 주어지면 어느 한쪽 열역학 또는 동역학으로 인해 발생할 것 같지 않다. 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 표준 PCR 역방향 프라이머이고 다른 올리고뉴클레오티드의 임의의 것에 임의의 서열 유사성 또는 역 상보성을 반드시 갖지 않는다.
도 3: 변이체 대립유전자의 PCR-기반 풍부화에서 ACE의 적용. 서열 변이체가 있는 템플레이트 분자 상에서, 표적 하위서열에서 템플레이트 분자와 억압인자 올리고뉴클레오티드 사이 형성된 미스매치 버블은 템플레이트-억압인자 혼성화를 열역학적으로 불안정화시키고 보조 올리고뉴클레오티드에 의한 억압인자 올리고뉴클레오티드의 변위를 더욱 열역학적으로 유리하게 만든다. 게다가, 미스매치 버블은 동역학을 또한 가속화하는 변위 반응에서 운동 트랩을 나타낸다. 억압인자 올리고뉴클레오티드가 보조 올리고뉴클레오티드에 의해 변위된 후, 템플레이트 분자는 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드에 자유롭게 결합하고, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 표준 PCR에서와 같이 후속적으로 확장된다.
도 4: rs1443486 SNP 유전자좌에서 2개 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 대립유전자 중 하나를 선택적으로 PCR 증폭시키기 위해 의도된 ACE 혼합물의 상세한 예. NA18562 인간 게놈성 DNA는 A 대립유전자에 동형접합적이고, NA18537 인간 게놈성 DNA는 DNA의 (-) 가닥 상에서 C 대립유전자에 동형접합적이다. Taqman 프로브는 억압인자 올리고뉴클레오티드의 다운스트림을 결합시켜 생성된 앰플리콘에 대하여 특정 형광 신호를 생산한다. 여기에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 NA18562 A 대립유전자를 완벽하게 매칭하도록 설계된다.
도 5: 인간 게놈성 DNA를 사용하는, ACE 정량적 PCR (qPCR)에 대한 실험적 결과. qPCR 반응의 사이클 임계 (Ct) 값은 100% NA18537, 5% NA18537 / 95% NA18562, 1% NA18537 / 99% NA18562, 및 100% NA18562 사이 명확하게 구별될 수 있다. 모든 반응에서, 대략 2250개 반수체 게놈 카피에 상응하는 7.5 ng의 인간 게놈성 DNA 입력이 사용되었다. 억압인자 올리고뉴클레오티드의 더 높은 농도는 모든 DNA 샘플에 대하여 지연된 Ct 값을 초래하였다. 모든 반응은 PowerUp DNA 폴리머라제 마스터믹스를 사용하였다.
도 6: 제안된 ACE 기전을 뒷받침하는 추가 실험적 결과. qPCR 반응에서 어느 한쪽 억압인자 올리고뉴클레오티드 또는 보조 올리고뉴클레오티드 없이, NA18537 및 NA18562의 Ct 값은 거의 동일하여, 입력 정량이 유사하고 PCR 효율이 유사함을 입증한다. 억압인자 올리고뉴클레오티드가 아닌 단지 보조 올리고뉴클레오티드로, Ct 값은 보조 올리고뉴클레오티드도 억압인자 올리고뉴클레오티드도 없이 qPCR 반응과 동일하여, 보조 올리고뉴클레오티드가 홀로 템플레이트 분자의 역 상보체에 결합하는 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드를 억제시키지 않음을 시사한다. 보조 올리고뉴클레오티드가 아닌 단지 억압인자 올리고뉴클레오티드로, 관찰가능한 PCR 증폭이 없어, 억압인자 올리고뉴클레오티드가 보조 올리고뉴클레오티드에 의해 변위되지 않는 경우 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 결합 및 PCR을 완전히 억제시킴을 시사한다. 양쪽 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하는 경우, 이의 템플레이트 분자가 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대해 미스매칭되기 때문에, 우리는 NA18537의 우선적 증폭을 관찰한다.
도 7: qPCR 환경에서 ACE의 포괄성의 입증. ACE qPCR은 상이한 유전자좌에서 TP53 돌연변이에 상응하는 15개 별도 DNA 서열에 관해 검사되었다. ACE 기전의 설계에 기반하여, 모든 돌연변이는 억압인자 올리고뉴클레오티드 상에서 돌연변이의 위치에 관계없이 동일한 ACE 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드에 의해 선택적으로 풍부화된다. 실험은 돌연변이체 템플레이트로서 합성 gBlock 올리고뉴클레오티드 템플레이트 (606 nt 길이 각각)를 사용하여 그리고 야생형 템플레이트로서 NA18537을 사용하여 수행되었다. 돌연변이에 대하여 3개 삼중 반응의 중앙 Ct 값이 플롯팅되고, NA18537 gDNA의 Ct 값은 3개 수평선으로서 플롯팅된다. 모든 TP53 돌연변이의 Ct 값은 NA18537 야생형 템플레이트 단독의 것보다 상당히 더 작아, 이들 돌연변이의 모두가 풍부화됨을 시사하였다.
도 8: ACE가 긴 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드에 대하여 기능한다는 입증. 3개 별도 ACE 시스템은 동일한 rs1443486 SNP에 대하여 검사되었다. 억압인자 올리고뉴클레오티드는 가변하는 길이이도록 설계되었으며 템플레이트-결합 영역의 길이는 64 nt, 81 nt, 및 126 nt이다. SNP 위치는 템플레이트-결합 영역의 단부로부터 일관되게 13번째 뉴클레오티드이도록 설계되었다. 모두 3개 ACE 시스템은 NA18537 템플레이트와 NA18562 템플레이트 사이 상당한 Ct 차이를 보여주었다. 상당한 지연은 가장 긴 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대하여 관찰되어, 더 긴 길이가 가닥 변위를 허용하기 위해 더 긴 어닐 사이클 시간을 필요로 함, 또는 더 긴 길이가 보조 올리고뉴클레오티드 순도를 떨어트려, 변위를 덜 효율적으로 만들도록 야기시킴 어느 한쪽을 시사하였다.
도 9: 5' 범용 어댑터 서열을 가진 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하는 ACE의 적용. 어댑터 서열은 차세대 시컨싱 (NGS) 라이브러리 제조를 위하여 후속 어댑터 PCR을 허용한다.
도 10: NGS를 사용하여 고도로 다중화된 ACE의 입증. NA18537 및 NA18562가 상이한 대립유전자에 동형접합적인 18개 상이한 SNP 유전자좌를 표적하는 18-플렉스 ACE 패널은 작제되었다. 모두 18개 억압인자 올리고뉴클레오티드는 NA18562 대립유전자에 대해 완벽하게 매칭되도록 설계되었다. 18-플렉스 ACE는 1% NA18537 / 99% NA18562의 샘플 상에서 검사되었고; 각 라이브러리는 25 ng의 이 혼합물을 입력으로서 사용하였다. ACE의 부재 하에서, NGS 라이브러리는 각 유전자좌의 경우, NA18562 대립유전자에 맵핑된 판독의 수가 예상된 대로 NA18537 대립유전자의 것보다 대충 100-배 더 높음을 보여주었다. 18-플렉스 어댑터 ACE 시스템 (우)으로, 각 유전자좌에서 NA18537 대립유전자의 분획은 증가되었다 (상이한 Y-축 눈금 참조). 하단 표는 5개 상이한 라이브러리에 대하여 NGS 라이브러리 결과를 요약하고; 가장 왼쪽 및 가장 오른쪽 라이브러리는 위에 플롯팅되었다. VRF 행은, 변이체 판독 및 야생형 (NA18562) 판독의 합계로 나눗셈된 변이체 (NA18537) 판독의 수로서 계산된, 변이체 대립유전자 분획을 지칭한다.
도 11: 여러 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 더 긴 PCR 앰플리콘에 걸쳐서 타일링되는 ACE의 구현예. 이것은 매우 긴 억압인자 올리고뉴클레오티드의 합성에서 기술적 어려움을 극복하여, 단일 PCR 앰플리콘에서 많은 뉴클레오티드의 넓은 영역에서 변이체의 검출을 가능하게 할 수 있다.
도 12: 유전자 융합 변이체를 풍부화하는데 사용된 ACE의 구현예. 여기에서, 유전자 융합 템플레이트는 상이한 유전자로부터 다운스트림 서열 (지그재그선)을 보유한다는 점에서 야생형 템플레이트와 상이하다. 유전자 융합 변이체는, 예를 들어 암 세포에서 비정상 염색체 재배열로부터 아마 유래될 수 있다. 중요하게, 다운스트림 융합 유전자 및 서열은 선험적으로 알려지지 않고, 그래서 표준 PCR-기반 ACE는 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열이 다운스트림 유전자를 표적하도록 설계될 수 없기 때문에 작동하지 않을 것이다. 여기에서, 이중-가닥 DNA 어댑터는 DNA 템플레이트에 결찰되고, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 어댑터 서열을 표적하도록 설계된다. 억압인자 올리고뉴클레오티드는 야생형 템플레이트에 강하게 결합하고 고 효율로 보조 올리고뉴클레오티드에 의해 변위된다. 억압인자 올리고뉴클레오티드는 유전자 융합 템플레이트에 덜 강하게 결합하고, 보조 올리고뉴클레오티드에 의해 효과적으로 변위되어, 순방향 프라이머가 유전자 융합 템플레이트에 결합하고 템플레이트를 증폭하게 한다.
도 13: 회전 환 증폭 (RCA)에 관한 ACE의 구현예. 여기에서, 야생형 또는 돌연변이체 서열을 가진 환형 DNA 템플레이트 분자는 억압인자 올리고뉴클레오티드가 야생형 템플레이트 분자에 강하게 결합하고 보조 올리고뉴클레오티드에 의해 변위되지 않기 때문에 RCA를 통해 차별적으로 증폭된다. 억압인자 올리고뉴클레오티드와 돌연변이체 템플레이트 분자 사이 형성된 미스매치 버블은 억압인자 올리고뉴클레오티드와 돌연변이체 템플레이트 분자 사이 결합을 불안정화시키고, 보조 올리고뉴클레오티드가 억압인자 올리고뉴클레오티드를 변위하게 하여, 차례로 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 템플레이트 분자를 결합 및 증폭하게 한다. RCA에서, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 없음을 유의한다.

상세한 설명

대립유전자 포괄적 풍부화 (ACE)는 상응하는 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드에 상당한 5' 서열 유사성을 나타내는 억압인자 올리고뉴클레오티드의 설계에 기반된다 (도 1). 후자의 3' 단부에서 억압인자 올리고뉴클레오티드에 상당한 역 상보성을 나타내는 보조 올리고뉴클레오티드는 억압인자 올리고뉴클레오티드를 억제시키는데 그리고 의도된 핵산 야생형 템플레이트 분자와 상이한 서열을 갖는 핵산 변이체 템플레이트 분자의 효율적 증폭을 허용하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 템플레이트 분자는 DNA 분자이다. 다른 구현예에서, 템플레이트 분자는 RNA 분자이다.

억압인자 올리고뉴클레오티드는 보조 올리고뉴클레오티드에 하는 것보다 의도된 야생형 템플레이트 서열에 더욱 호의적으로 결합하도록 설계되는 서열을 갖는다 (도 2). 억압인자 올리고뉴클레오티드가 템플레이트 분자에 결합되는 동안, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 템플레이트 분자에 효율적으로 결합할 수 없는 것은, 억압인자 올리고뉴클레오티드에 결합하는 템플레이트 서열의 부분이 또한 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드에 결합하는 하위서열이기 때문이다. 일부 구현예에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 결합하는 템플레이트 분자의 하위서열은 억압인자 올리고뉴클레오티드가 결합하는 템플레이트 분자의 하위서열 내에서 전체적으로 포괄된다. 다른 구현예에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 결합하는 템플레이트 분자의 하위서열은, 억압인자 올리고뉴클레오티드가 결합하는 템플레이트 분자의 하위서열 내에서 포괄되지 않는, 7개 이하 뉴클레오티드 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 뉴클레오티드(들))인, 소수의 뉴클레오티드를 갖는다.

억압인자 올리고뉴클레오티드는, 템플레이트 분자에 역 상보적이지 않은, 개시 하위서열을 포함한다. 보조 올리고뉴클레오티드는, 개시 서열에 역 상보적인, 개시 상보체 하위서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 개시 하위서열은 4nt 내지 30nt (예를 들면, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드; 또는 4-30nt, 4-25nt, 4-20nt, 4-15nt, 8-30nt, 8-25nt, 8-20nt, 8-15nt, 12-30nt, 12-25nt, 12-20nt, 16-30nt, 또는 16-25nt) 길이를 갖는다.

억압인자 올리고뉴클레오티드가 결합하는, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 결합하지 않는, 템플레이트 분자의 영역은 표적 하위서열로서 알려진다. 표적 하위서열에서 서열 변동은 ACE를 통해서 우선적으로 증폭될 것이다. 일부 구현예에서, 표적 하위서열은 10nt 내지 500nt 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 표적 하위서열은 10nt 내지 200nt 길이를 갖는다. 예를 들어, 표적 하위서열은 10-500nt, 10-400nt, 10-300nt, 10-200nt, 10-100nt, 10-80nt, 10-60nt, 10-40nt, 20-500nt, 20-400nt, 20-300nt, 20-200nt, 20-100nt, 20-80nt, 20-60nt, 30-500nt, 30-400nt, 30-300nt, 30-200nt, 30-100nt, 30-80nt, 30-60nt, 40-500nt, 40-400nt, 40-300nt, 40-200nt, 40-100nt, 40-80nt, 50-500nt, 50-400nt, 50-300nt, 50-200nt, 50-100nt, 50-80nt, 또는 100-500nt 길이를 갖는다. 예를 들어, 표적 하위서열은 적어도 또는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 또는 500개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

템플레이트 서열이 심지어 단일 뉴클레오티드 서열 변이체를 갖는다면, 표적 하위서열에서 템플레이트 분자와 억압인자 올리고뉴클레오티드 사이 형성된 미스매치 버블은 템플레이트 분자보다 보조 올리고뉴클레오티드에 더욱 우호적으로 결합하는 억압인자 올리고뉴클레오티드를 초래하는 열역학적 불안정화를 야기시킨다 (도 3). 결과적으로, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 템플레이트 분자로부터 변위되고, 템플레이트 분자는 후속적으로 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드는 그 다음 템플레이트-의존적 폴리머라제에 의해 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 야생형 템플레이트 분자 및 변이체 템플레이트 분자의 혼합물은 템플레이트 샘플에서 존재하고, 샘플에 ACE의 적용은 변이체 템플레이트 분자의 선택적 증폭을 통해서 야생형 템플레이트 분자보다 변이체 템플레이트 분자의 풍부화를 초래한다. 일부 구현예에서, 템플레이트-의존적 폴리머라제는 DNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, DNA 폴리머라제는 열안정성 DNA 폴리머라제이고, 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해서 달성된다. 다른 구현예에서, DNA 폴리머라제는 파이-29 폴리머라제이고, 증폭은 회전 환 증폭을 통해서 달성된다. 다른 구현예에서, 템플레이트-의존적 폴리머라제는 역 전사효소이고, 야생형 RNA 템플레이트보다 돌연변이체 RNA 템플레이트의 풍부화는 돌연변이체 RNA 템플레이트의 선택적 역 전사를 통해서 이루어진다.

I. 정의

"증폭"은, 본원에 사용된 경우에, 뉴클레오티드 서열 또는 서열들의 카피의 수를 증가시키기 위한 임의의 시험관내 과정을 지칭한다. 핵산 증폭은 뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에의 통합을 초래한다. 본원에 사용된 경우에, 하나의 증폭 반응은 많은 라운드의 DNA 복제로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 하나의 PCR 반응은 변성 및 복제의 2-100 "사이클"로 이루어질 수 있다.

"폴리머라제 연쇄 반응", 또는 "PCR"은 DNA의 상보적 가닥의 동시 프라이머 확장에 의한 특정 DNA 서열의 시험관내 증폭을 위한 반응을 의미한다. 다시 말해서, PCR은 프라이머 결합 부위에 의해 측접된 표적 핵산의 여러 카피 또는 복제물을 만들기 위한 반응으로, 이러한 반응은 하기 단계들 중 하나 이상의 반복을 포함한다: (i) 표적 핵산을 변성시키는 단계, (ii) 프라이머 결합 부위에 프라이머를 어닐링하는 단계, 및 (iii) 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 핵산 폴리머라제에 의해 프라이머를 확장시키는 단계. 보통, 반응은 열 사이클러 기구에서 각 단계에 최적화된 상이한 온도를 통해서 사이클링된다. 일부 경우에, 어닐링 및 확장 단계는 단일 단계로 조합될 수 있다. 특정한 온도, 각 단계에 지속기간, 및 단계들 사이 변화의 비율은, 예를 들면, 참고문헌: McPherson 등, editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991 및 1995, 각각)에 의해 예시된 당업자에 잘-알려진 많은 인자에 의존한다.

"프라이머"는, 폴리뉴클레오티드 템플레이트와 듀플렉스 형성시, 핵산 합성의 개시의 지점으로서 작용할 수 있고 확장된 듀플렉스가 형성되도록 템플레이트와 함께 이의 3' 단부로부터 확장될 수 있는 천연 또는 합성 어느 한쪽인, 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 확장 과정 동안 부가된 뉴클레오티드의 서열은 템플레이트 폴리뉴클레오티드의 서열에 의해 결정된다. 보통 프라이머는 DNA 폴리머라제에 의해 확장된다. 프라이머는 일반적으로 프라이머 확장 생성물의 합성에서 이의 사용과 맞는 길이이고, 보통 길이가 6 내지 100개 뉴클레오티드의 범위, 예컨대 6 내지 70, 10 내지 50, 10 내지 75, 15 내지 60, 15 내지 40, 15 내지 45, 18 내지 30, 18 내지 40, 20 내지 30, 20 내지 40, 21 내지 25, 21 내지 50, 22 내지 45, 25 내지 40의 범위, 및 언급된 범위 사이 임의의 길이이다. 일부 구현예에서, 프라이머는 보통 길이가 약 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70개 뉴클레오티드 이하이다.

"통합하기"는, 본원에 사용된 경우에, 핵산 중합체의 부분이 되는 것을 의미한다.

용어 "외인성 조작의 부재 하에서"는 본원에 사용된 경우에 핵산 분자가 변형되고 있는 용액을 변화시킴 없이 핵산 분자의 변형이 있음을 지칭한다. 특정 구현예에서, 완충액 조건으로서 또한 지칭될 수 있는, 용액 조건을 변화시키는 기계의 부재 하에서 또는 사람의 손의 부재 하에서 발생한다. 하지만, 온도에서의 변화는 변형 동안 발생할 수 있다.

"뉴클레오시드"는 염기-당 조합, 즉, 포스페이트가 부족한 뉴클레오티드이다. 용어 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 활용에서 특정 호환가능성이 있음이 당업계에서 인식된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 데옥시우리딘 트리포스페이트, dUTP는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트이다. DNA로의 통합후, 공식적으로 데옥시우리딜레이트, 즉, dUMP 또는 데옥시우리딘 모노포스페이트인 DNA 단량체의 역할을 한다. 생성된 DNA에서 dUTP 모이어티가 없어도 dUTP를 DNA에 통합한다고 말할 수 있다. 유사하게, 기질 분자의 한 부분만 있어도 데옥시우리딘을 DNA에 통합한다고 말할 수 있다.

"뉴클레오티드"는, 본원에 사용된 경우에, 염기-당-포스페이트 조합을 지칭하는 당업계의 용어이다. 뉴클레오티드는 핵산 중합체의, 즉, DNA 및 RNA의 단량체성 단위이다. 본 용어는 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 예컨대 rATP, rCTP, rGTP, 또는 rUTP, 및 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 예컨대 dATP, dCTP, dUTP, dGTP, 또는 dTTP를 포함한다.

용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는, 적어도 하나의 핵염기, 예컨대, 예를 들어, DNA (예를 들면, 아데닌 "A," 구아닌 "G," 티민 "T" 및 시토신 "C") 또는 RNA (예를 들면 A, G, 우라실 "U" 및 C)에서 발견된 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 DNA, RNA, DNA-RNA 키메라 또는 이들의 유도체 또는 유사체의 적어도 하나의 분자 또는 가닥을 일반적으로 지칭할 것이다. 본 용어 "핵산"은 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"를 포괄한다. "올리고뉴클레오티드"는, 본원에 사용된 경우에, 집합적으로 및 교환가능하게 당업계의 2개 용어, "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드가 업계의 별개 용어이어도, 이들 사이 정확한 구분선이 없고 본원에 교환가능하게 사용됨을 유의한다. 용어 "어댑터"는 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"와 교환가능하게 또한 사용될 수 있다. 이외에도, 용어 "어댑터"는 선형 어댑터 (어느 한쪽 단일 가닥 또는 이중 가닥) 또는 스템-루프 어댑터를 나타낼 수 있다. 이들 정의는 일반적으로 적어도 하나의 단일-가닥 분자를 지칭하지만, 특정 구현예에서 적어도 하나의 단일-가닥 분자에 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전히 상보적인 적어도 하나의 추가의 가닥을 또한 포괄할 것이다. 그래서, 핵산은 분자의 한 가닥을 포함하는 특정한 서열의 하나 이상의 상보적 가닥(들) 또는 "상보체(들)"를 포함하는 적어도 하나의 이중-가닥 분자 또는 적어도 하나의 삼중-가닥 분자를 포괄할 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 단일 가닥 핵산은 접두사 "ss"에 의해, 이중-가닥 핵산은 접두사 "ds"에 의해 그리고 삼중 가닥 핵산은 접두사 "ts"에 의해 표시될 수 있다.

"핵산 분자"는 표준 정준 염기, 초변형된 염기, 비-천연 염기, 또는 이들의 염기의 임의의 조합을 포함하는 임의의 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어 및 제한 없이, 핵산 분자는 4개 정준 DNA 염기 - 아데닌, 시토신, 구아닌, 및 티민, 및/또는 4개 정준 RNA 염기 - 아데닌, 시토신, 구아닌, 및 우라실을 함유한다. 뉴클레오시드가 2'-데옥시리보스 기를 함유하는 경우 우라실은 티민에 대하여 치환될 수 있다. 핵산 분자는 RNA에서 DNA로 그리고 DNA에서 RNA로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 및 제한 없이, mRNA는 역 전사효소를 사용하여 상보적 DNA (cDNA)로 창출될 수 있고 DNA는 RNA 폴리머라제를 사용하여 RNA로 창출될 수 있다. 핵산 분자는 생물학적 또는 합성 기원일 수 있다. 핵산 분자의 예는 게놈성 DNA, cDNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 증폭된 DNA, 기존 핵산 라이브러리, 등을 포함한다. 핵산은 인간 샘플, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 뺨 찰과상, 생검, 정액, 소변, 대변, 타액, 땀, 등으로부터 수득될 수 있다. 핵산 분자는 다양한 치료, 예컨대 복구 치료 및 단편화 치료에 적용될 수 있다. 단편화 치료는 기계적, 음파, 및 유체역학적 전단을 포함한다. 복구 치료는 확장 및/또는 결찰을 통해 닉 복구, 무딘 단부를 창출하기 위한 연마, 손상된 염기, 예컨대 탈아미노화, 유도체화, 무염기성, 또는 가교결합된 뉴클레오티드, 등의 제거를 포함한다. 관심의 핵산 분자는 또한 화학적 변형 (예를 들면, 비술파이트 전환, 메틸화 / 탈메틸화), 확장, 증폭 (예를 들면, PCR, 등온, 등), 등에 적용될 수 있다.

"상보적" 또는 "상보체(들)"인 핵산(들)은 표준 왓슨-크릭, 후그스틴 또는 역 후그스틴 결합 상보성 규칙에 따라 염기-짝짓기할 수 있는 것들이다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "상보적" 또는 "상보체(들)"는, 상기 제시된 동일한 뉴클레오티드 비교에 의해 평가될 수 있는 대로, 실질적으로 상보적인 핵산(들)을 지칭할 수 있다. 용어 "실질적으로 상보적"은 하나 이상의 핵염기 모이어티가 분자에서 존재하지 않으면, 모든 핵염기보다 적은 수가 상대방 핵염기와 염기 짝짓기하지 않더라도 적어도 하나의 핵산 가닥 또는 듀플렉스에 혼성화할 수 있다면 연속 핵염기, 또는 반연속 핵염기 중 적어도 하나의 서열을 포함하는 핵산을 지칭할 수 있다. 특정 구현예에서, "실질적으로 상보적" 핵산은 핵염기 서열의 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 내지 약 100%, 및 그안에 임의의 범위가 혼성화 동안 적어도 하나의 단일 또는 이중-가닥 핵산 분자와 염기-짝짓기할 수 있는 적어도 하나의 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, 용어 "실질적으로 상보적"은 엄격한 조건에서 적어도 하나의 핵산 가닥 또는 듀플렉스에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 핵산을 지칭한다. 특정 구현예에서, "부분적으로 상보적" 핵산은 낮은 엄격성 조건에서 적어도 하나의 단일 또는 이중-가닥 핵산에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함하거나, 핵염기 서열의 약 70% 미만이 혼성화 동안 적어도 하나의 단일 또는 이중-가닥 핵산 분자와 염기-짝짓기할 수 있는 적어도 하나의 서열을 함유한다.

용어 "비-상보적"은 특정 수소 결합을 통해서 적어도 하나의 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는 능력이 부족한 핵산 서열을 지칭한다.

용어 "축퇴"는 본원에 사용된 경우에 정체성이, 정의된 서열과 대조적으로, 뉴클레오티드의 다양한 선택범위로부터 선택될 수 있는 뉴클레오티드 또는 일련의 뉴클레오티드를 지칭한다. 특정 구현예에서, 둘 이상의 상이한 뉴클레오티드로부터 선택범위가 있을 수 있다. 추가 특정 구현예에서, 하나의 특정한 위치에 뉴클레오티드의 선택은 퓨린만, 피리미딘만, 또는 비-짝짓기 퓨린 및 피리미딘으로부터 선택을 포함한다.

용어 "이차 구조"는 본원에 사용된 경우에 염기 쌍들 사이 상호작용의 세트를 지칭한다. 예를 들어, DNA 이중 나선에서, DNA의 2개 가닥은 수소 결합에 의해 함께 유지된다. 이차 구조는 핵산이 취하는 형상을 담당한다. 단일 가닥 핵산의 경우, 가장 단순한 이차 구조는 선형이다. 선형 이차 구조의 경우, 핵산 분자의 2개 하위서열은 -2 kcal/mol보다 강한 분자내 구조를 형성하지 않는다. 단일 가닥 핵산의 경우에 또다른 예로서, 핵산 분자의 하나의 부분은 동일한 핵산 분자의 제2 부분과 혼성화하여, 이에 의해 헤어핀을 스템 루프 이차 구조에 형성할 수 있다. 비-선형 이차 구조의 경우에, -2 kcal/mol보다 강한 분자내 구조로부터 핵산 분자의 적어도 2개 하위서열.

본원에 사용된 경우에, 용어 "하위서열"은 적어도 5개 연속 염기 쌍의 서열을 지칭한다.

본원에 사용된 경우에, 용어 "돌연변이체 DNA 템플레이트" 또는 "변이체 DNA 템플레이트"는 증폭, 식별, 또는 달리 단리되어야 하는 원하는 대립유전자, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성을 갖는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "야생형 서열" 또는 "배경 서열"은 원하는 대립유전자를 갖지 않는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일부 경우에, 배경 서열은 야생형 대립유전자를 갖는 반면에 변이체 서열은 돌연변이체 대립유전자를 갖는다. 그래서, 일부 경우에, 배경 서열 및 변이체 서열은 원하는 대립유전자, 뉴클레오티드 또는 그룹 또는 이 둘 사이 가변하는 뉴클레오티드를 갖는 영역을 제외하고 각각의 서열이 실질적으로 상동일 수 있도록 게놈에서 공통 유전자좌로부터 유래된다.

"샘플"은 관심의 핵산을 함유하는 신선하거나 보존된 생물학적 샘플 또는 합성적으로 창출된 공급원으로부터 수득되거나 단리된 물질을 의미한다. 샘플은 적어도 하나의 세포, 태아 세포, 세포 배양물, 조직 표본, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 눈물, 질 분비물, 땀, 림프액, 뇌척수액, 점막 분비물, 복막액, 복수액, 배설물, 신체 삼출물, 제대혈, 융모막 융모, 양수, 배아 조직, 다세포 배아, 용해물, 추출물, 용액, 또는 관심의 면역 핵산을 함유하는 것으로 의심된 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 샘플은 비-인간 공급원, 예컨대 비-인간 영장류, 설치류 및 기타 포유류, 기타 동물, 식물, 균류, 박테리아, 및 바이러스를 또한 포함할 수 있다.

뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에 사용된 경우에, "실질적으로 알려진"은 이의 증폭을 포함하는, 핵산 분자의 제조를 허락하기 위해 충분한 서열 정보 가짐을 지칭한다. 일부 구현예에서 어댑터 서열의 일부 부분이 무작위 또는 축퇴이어도, 이것은 전형적으로 약 100%일 것이다. 그래서, 특정 구현예에서, 실질적으로 알려진은 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 약 97% 내지 약 100%, 약 98% 내지 약 100%, 또는 약 99% 내지 약 100%를 지칭한다.

본원에 사용된 경우에, 특정된 구성요소의 측면에서, "본질적으로 없는"은 특정된 구성요소의 어느 것도 조성물로 의도적으로 제형화되지 않았고/거나 단지 오염 물질로서 또는 미량으로 존재함을 의미하는데 본원에 사용된다. 조성물의 임의의 미의도된 오염에서 비롯하는 특정된 구성요소의 총량은 그러므로 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만에서 양호하다. 특정된 구성요소의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.

본 명세서에 사용된 경우에, "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에서 본원에 사용된 경우에, 단어 "포함하는"과 공동으로 사용된 때, 단어 "한" 또는 "하나"는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.

청구항에서 용어 "또는"의 사용은, 본 개시내용이 단지 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하여도, 대안만을 지칭하도록 명시적으로 지시되거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용된다. 본원에 사용된 경우에 "또다른"은 적어도 두번째 이상을 의미할 수 있다.

본 출원 내내, 용어 "약"은 한 값이 장치에 대하여 고유한 오차 변동, 값을 결정하는데 이용되고 있는 방법, 연구 대상체 중에서 실재하는 변동, 또는 언급된 값의 10% 이내인 값을 포함함을 나타내는데 사용된다.

II. 정량적 PCR에서의 ACE

ACE는 qPCR 환경에서 사용될 수 있다. 이 구현예에서, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 억압인자 올리고뉴클레오티드, 보조 올리고뉴클레오티드, DNA 폴리머라제, dNTP, 및 PCR에 필요한 완충액은 야생형 DNA 템플레이트 분자를 아마 포함하는 그리고 돌연변이체 DNA 템플레이트 분자를 아마 포함하는 샘플과 혼합된다. 일부 구현예에서, 혼합물은 Taqman 프로브를 추가로 포함한다. 도 4는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 유전자좌 rs1443486에서 A 대립유전자 이외 대립유전자를 풍부화하기 위한 ACE 시스템의 특정 구현예를 실례한다. NA18562 인간 게놈성 DNA는 A 대립유전자에 동형접합적이고, NA18537 인간 게놈성 DNA는 DNA의 (-) 가닥 상에서 C 대립유전자에 동형접합적이다. 억압인자 올리고뉴클레오티드의 다운스트림을 결합시키는 Taqman 프로브는 생성된 앰플리콘에 대하여 특정 형광 신호를 생산하도록 포함될 수 있다. 이 예에서, 억압인자 올리고뉴클레오티드는 NA18562 A 대립유전자를 완벽하게 매칭하도록 설계된다.

이 ACE-qPCR 설정은 rs1443486에서 비-A 대립유전자를 풍부화 및 검출하는데 사용되었다. NA18562 인간 게놈성 DNA가 A 대립유전자에 동형접합적이기 때문에, 이 반응에 대하여 야생형 템플레이트 분자로 간주된다. NA18537 인간 게놈성 DNA는 C 대립유전자에 동형접합적이고 돌연변이체 템플레이트 분자이다. qPCR 반응은 100% NA18537, 5% NA18537 / 95% NA18562, 1% NA18537 / 99% NA18562, 및 100% NA18562 사이를 명확하게 구별할 수 있었다 (도 5). 심지어 99% NA18562내 1% NA18537은 100% NA18562와 명확하게 구별되어, A 대립유전자보다 C 대립유전자의 100-배 초과 풍부화를 의미할 수 있다. 억압인자 올리고뉴클레오티드의 더 높은 농도는 모든 DNA 샘플에 대하여 지연된 Ct 값을 초래하였다. 보조 올리고뉴클레오티드 대 억압인자 올리고뉴클레오티드의 또는 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 대 억압인자 올리고뉴클레오티드의 화학양론 (즉, 몰) 비는 0.8 내지 100, 0.9 내지 100, 1 내지 100, 2 내지 100, 3 내지 100, 4 내지 100, 5 내지 100, 10 내지 100, 15 내지 100, 20 내지 100, 25 내지 100, 30 내지 100, 40 내지 100, 50 내지 100, 0.8 내지 50, 0.8 내지 45, 0.8 내지 40, 0.8 내지 35, 0.8 내지 30, 0.8 내지 25, 0.8 내지 20, 1 내지 50, 1 내지 45, 1 내지 40, 1 내지 35, 1 내지 30, 1 내지 25, 또는 1 내지 20일 수 있다. 보조 올리고뉴클레오티드 대 억압인자 올리고뉴클레오티드의 또는 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 대 억압인자 올리고뉴클레오티드의 화학양론 (즉, 몰) 비는 적어도 또는 약 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100일 수 있다.

NA18562의 A 대립유전자보다 NA18537의 C 대립유전자의 풍부화는 어느 한쪽 억압인자 올리고뉴클레오티드 또는 보조 올리고뉴클레오티드가 부재하는 경우 달성되지 않는다 (도 6). 양쪽이 부재하는 경우, 사이클 임계 (Ct) 값은 유사하여, 입력 DNA 정량이 유사하고 PCR 증폭 효율이 유사함을 시사한다. 단지 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하는 경우, 양쪽 NA18537 및 NA18562에 대하여 Ct 값은 변화되지 않아, 템플레이트 분자의 역 상보체에 보조 올리고뉴클레오티드의 결합이 PCR 반응을 억제시키지 않음을 시사한다. 단지 억압인자 올리고뉴클레오티드가 존재하는 경우, 증폭이 관찰되지 않아, 보조 올리고뉴클레오티드의 부재 하에서, 템플레이트 분자에 결합하는 억압인자 올리고뉴클레오티드가 비가역적이고 양쪽 돌연변이체 템플레이트 분자 및 야생형 템플레이트 분자가 증폭할 수 없음을 시사한다. 단지 양쪽 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하는 경우 돌연변이체 및 야생형 템플레이트 분자의 차별적 증폭이 있다. 다시 말해서, 양쪽 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하는 경우, NA18537의 우선적 증폭이 관찰되는 것은, 이의 템플레이트 분자가 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대해 미스매칭되기 때문이다.

ACE가 표적 하위서열 내에서 서열 변동을 가진 모든 템플레이트 분자를 풍부화함을 입증하기 위해, ACE 시스템은 인간 TP53 유전자를 표적하도록 설계되었다 (도 7). 이 ACE 시스템은 50nt 표적 하위서열에 걸쳐 있는 상이한 유전자좌에서 15개 별도 TP53 돌연변이를 사용하는 qPCR을 사용하여 검사되었다. 이 실험은 돌연변이체 템플레이트 분자로서 합성 gBlock 올리고뉴클레오티드 템플레이트 (606nt 길이 각각)를 사용하여 수행되었다. 돌연변이체 템플레이트 분자 없이 7.5 ng NA18537의 관찰된 Ct 값은 선으로서 플롯팅되었고 약 40의 값을 갖는다. 돌연변이체 템플레이트 샘플의 Ct 값은 모두 27 내지 31 사이로, 대충 9 내지 13 사이클 더 낮았다 (도 7). ACE 기전의 설계에 기반하여, 모든 돌연변이는 억압인자 올리고뉴클레오티드의 돌연변이의 위치에 관계없이 동일한 ACE 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드에 의해 선택적으로 풍부화되었다.

마지막으로, 표적 하위서열의 길이가 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드의 합리적 설계를 통해서 확장될 수 있음을 입증하기 위해, 64nt (51+1+12), 81nt, 및 126nt의 상이한 표적 하위서열 길이를 가진 동일한 인간 SNP (rs1443486)를 표적하는 3개 별도 ACE 세트는 작제되었다 (도 8). SNP 위치는 템플레이트-결합 영역의 단부로부터 일관되게 13번째 뉴클레오티드이도록 설계되었다. 모두 3개 ACE 시스템은 NA18537 변이체 템플레이트와 NA18562 야생형 템플레이트 사이 상당한 Ct 값 차이를 보여주었다. 상당한 지연은 가장 긴 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대하여 관찰되어, 더 긴 길이가 가닥 변위를 허용하기 위해 더 긴 어닐 사이클 시간을 필요로 함, 또는 더 긴 길이가 더 긴 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드의 더 낮은 순도로 인해 보조 올리고뉴클레오티드 순도를 떨어트려, 변위를 덜 효율적으로 만들게 야기시킴 어느 한쪽을 시사하였다.

III. 차세대 시컨싱 (NGS) 라이브러리 제조에서의 ACE

일부 구현예에서, ACE는 고-처리량 시컨싱 절차의 라이브러리 제조 과정 동안 변이체 풍부화에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 고-처리량 시컨싱은 합성에 의한 시컨싱 (NGS) 방법이다. 다른 구현예에서, 고-처리량 시컨싱은 나노포어와 공동으로 전류 측정을 통해 수행된다.

여러 ACE 시스템은 라이브러리에서 관심의 상이한 유전적 영역에서 변이체를 풍부화하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, ACE 시스템은 표준-길이 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 멀티플렉스 PCR에 적용되고, 이어서 어댑터 PCR 또는 어댑터 결찰되어 시컨싱-특이적 어댑터 서열을 첨부할 수 있다. 추가의 서열을 부가하기 위해 어댑터 결찰을 사용하는 방법은, 예를 들면, 이 전체가 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 7,803,550에서 기재된다. 다른 구현예에서, ACE 시스템은 ACE 풍부화의 부분으로서 5' 단부에서 어댑터 서열을 가진 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드를 활용할 수 있다 (도 9). 어댑터 서열은 차세대 시컨싱 (NGS) 라이브러리 제조를 위하여 후속 어댑터 PCR을 허용한다. 다양한 구현예에서, 멀티플렉스 ACE 패널은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개 ACE 시스템을 포함할 수 있다.

예로서, NA18537 및 NA18562가 상이한 대립유전자에 동형접합적이었던 18개 상이한 SNP 유전자좌를 표적하는 18-플렉스 ACE 패널이 작제되었다. 이 18-플렉스 ACE 패널은 NA18562 샘플의 동형접합적 SNP 대립유전자를 억압하도록 설계되었다. 모두 18개 억압인자 올리고뉴클레오티드는 NA18562 대립유전자에 대해 완벽하게 매칭되도록 설계되었다. 18-플렉스 ACE는 1% NA18537 / 99% NA18562의 샘플 상에서 검사되었고; 각 라이브러리는 25 ng의 이 혼합물을 입력으로서 사용하였다. Illumina MiSeq는 NGS를 수행하는데 사용되었다. ACE 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드 없이, NA18562 대립유전자에 맵핑하는 NGS 판독의 수는 예상된 대로 모든 유전자좌에서 NA18537 대립유전자에 맵핑하는 NGS 판독의 수보다 대충 100-배 더 높았다 (도 10). ACE 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하는 라이브러리에서, NA18537 변이체 대립유전자에 맵핑하는 판독의 상대 분획은 모든 유전자좌에 대하여 상당히 증가되었다. 전반적으로, NA18537 유전자좌에 맵핑된 NGS 판독의 분획은 1.22%에서 최대 33.8% 증가되어, 24-배 초과의 가중 평균 풍부화되었다. 이들 단일-플렉스 qPCR ACE 결과에 기반하여, ACE 폴드-풍부화는 서열, 농도, 반응 시간, 및 기타 실험적 프로토콜 세목의 최적화를 통해서 상당히 추가로 개선될 수 있다.

IV. 타일링된 ACE

일부 구현예에서, ACE 방법은 연속 DNA 영역을 타일링하거나 대부분 타일링하는 여러 억압인자 올리고뉴클레오티드와 사용될 수 있다. 이것은 긴 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대하여 고 순도 긴 DNA 올리고뉴클레오티드 합성에서 문제를 피할 것이다. 도 11은 2개 상이한 억압인자 올리고뉴클레오티드가 템플레이트 분자 상에서 인접한 서열을 결합시키는 상이한 상응하는 보조 올리고뉴클레오티드 및 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드와 짝짓기되는 PCR내 ACE의 구현예를 도시한다. 다양한 구현예에서, 이의 자체 보조 올리고뉴클레오티드와 각각 짝짓기된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상 억압인자 올리고뉴클레오티드는 연속 DNA 영역을 타일링하거나 대부분 타일링하는데 사용될 수 있다.

V. PCR을 이용한 유전자 융합 풍부화

일부 구현예에서, ACE 방법은 관심의 유전자의 한 부분이 또다른 유전자의 부분에, 예컨대 염색체 전좌를 통해서 옆에 있도록 재배열된 유전자 융합을 풍부화하는데 사용될 수 있다. 이 상황에서, 다운스트림 또는 업스트림 유전자 융합 파트너는 선험적으로 알려지지 않을 수 있다. 도 12는 유전자 융합을 잠재적으로 함유하는 DNA 템플레이트 분자가 어댑터에 먼저 결찰되는 구현예를 도시한다. 추가의 서열을 부가하기 위해 어댑터 결찰을 사용하는 방법은, 예를 들면, 이 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 7,803,550에서 기재된다. ACE-PCR은 어댑터 서열에 역 상보적인 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행된다. 이 도 및 구현예에 대한 어댑터가 반드시 시컨싱 어댑터가 아니고 원칙적으로 임의의 설계된 DNA 서열일 수 있음을 유의한다.

VI. 회전 환 증폭 (RCA)에서의 ACE

일부 구현예에서, ACE 방법은 역방향 프라이머를 요구하지 않는다. 도 13은 ACE가 RCA에 적용되는 구현예를 도시한다. 환형 DNA 템플레이트 분자는 환형 생물학적 DNA 서열일 수 있거나, 효소적 방법을 통해서 환화된 선형 DNA 서열로부터 작제될 수 있다. ACE 억압인자 올리고뉴클레오티드는 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 결합을 방지하고, 확장에 의해 야생형 템플레이트 분자 상에서 RCA를 방지한다.

VII. 폴드-풍부화 분석 및 VAF 정량화

변이체 템플레이트 분자에 대한 폴드-풍부화 (EF)는 상응하는 야생형 템플레이트 분자에 대한 변이체 템플레이트 분자의 상대 증폭으로서 정의된다. 일반적으로, ACE를 이용한 더 큰 수의 PCR 사이클은 더 큰 EF 값을 초래한다. NGS 라이브러리 환경에서, VRF, EF, 및 변이체 대립유전자 빈도 (VAF)의 값은 하기 방정식을 만족시킨다:

VRF = (VAF * EF) / (VAF * EF + (1-VAF))

VAF = (VRF) / (VRF * (1-EF) + EF)

EF = (VRF * (VAF-1)) / (VAF * (VRF-1))

3개 변수 중 어느 2개의 알려진 값이 주어지면, 마지막 변수는 계산될 수 있다. 그래서, 초기 보정 실험 동안, 알려진 샘플로부터 VRF 및 VAF는 EF를 계산하는데 사용될 수 있다. 그후, 알려지지 않은 VAF를 가진 샘플 상에서 NGS를 실행하는 경우, VRF 및 EF는 VAF의 값을 계산하는데 사용될 수 있다.

VIII. UMI 설계

UMI의 개념은 모든 원래 DNA 분자에 상이한 DNA 서열을 "바코드"로서 주어서, 각 NGS 판독의 기원이 바코드 서열에 기반하여 추적될 수 있도록 하는 것이다. 충분한 NGS 판독이 주어지면, NGS 출력에서 발견된 고유 UMI의 수는 원래 DNA 분자의 수를 반영할 수 있다. 각 원래 분자를 고유하게 표지하는 것은 다수의 상이한 UMI 서열을 사용함으로써 달성되고; 예를 들어, 100,000개 원래 분자에 대하여 10⁹ 상이한 UMI 서열을 사용하는 것은 반복된 UMI를 운반하는 <0.006% 분자를 생성할 것이다.

축퇴 염기, 예컨대 폴리(N) (즉, 각 위치에 A, T, C, 또는 G의 믹스)을 함유하는 DNA 서열은 UMI 서열로서 종종 사용된다. QBDA에서, (즉, 각 위치에 A, T, 또는 C의 믹스로서) 폴리(H)가 UMI로서 사용되는 것은 폴리(N) 또는 S (C 또는 G) 및 W (A 또는 T) 염기의 믹스와 비교하여 더 약한 교차-결합 에너지를 갖기 때문이다. (H)₂₀은 입력으로서 100,000개 분자에 충분한 3.5 × 10⁹개 상이한 서열을 함유하고; (H)₁₅는 입력으로서 6,000개 분자에 충분한 1.4 × 10⁷개 상이한 서열을 함유한다.

오류 정정의 방법의 역할을 하는 특정 DNA-기반 바코드가 개발되었다. 임의의 검정처럼, NGS는 오독을 생산할 수 있다. 이 DNA-기반 바코드, 7개 뉴클레오티드 해밍 바코드는 오독의 식별 및 이들 오류의 정정을 허용한다.

바코드 서열의 나이브 설계는 NGS 고유 오류에 취약한 바코드 서열을 초래할 수 있다. 신호 처리의 분야에서, 결함 채널 (예를 들면, 인터넷)을 통해 메시지를 전하는 것은 오류 정정 및 오류 검출 코드의 개발로 이어졌다. 이들 아이디어는 바코드 설계에서 직접적으로 적용될 수 있다. Illumina 시컨싱 오류가 (삽입 또는 결실과 대조적으로) 주로 염기 대체이기 때문에, 해밍 인코딩은 바코드 서열에 잘-적합하다.

검토하기 위해, 가장 단순한 (7,4) 해밍 코드는 모든 4-비트 메시지에 대하여 3개의 오류-정정 비트를 삽입한다 (더 긴 메시지는 4-비트 단어로 먼저 나뉜다). 해밍 코드의 모두 7-비트 사례는 이들이 임의의 다른 사례로부터 적어도 해밍 거리 3인 특성을 갖는다 -- 즉, 하나의 해밍 코드 사례를 또다른 것으로 변환하기 위해 적어도 3 비트를 변화시킬 필요가 있을 것이다. 이 특성은 (7,4) 해밍 코드가 최대 1개 오류에 대하여 정정 중이고, 최대 2개 오류에 대하여 용인함을 의미한다: 원래 서열은 하나의 염기에 의해 돌연변이된 임의의 서열로부터 복원될 수 있고; 더욱 보수적으로, 2개 돌연변이가 있는 임의의 서열은 임의의 다른 코드를 매칭하지 않을 것이고 배제될 수 있다.

예를 들어, (7,4) DNA 바코드는 사용될 수 있다. 수치 값에 A, T, C, 및 G의 할당 그리고 오류 체크 방정식의 설계는 긴 동종중합체 및 극단적인 G/C 함량이 드물도록 선택된다. 256개 가능한 (7,4) 해밍 코드의 수동 전정은 (바코드의 시작 또는 끝에 길이 3의 동종중합체를 가짐을 통해) 5 nt 초과의 동종중합체에 기여할 수 있거나 >75% 또는 <25%의 G/C 함량을 가져, 216개 양호 (7,4) nt 바코드 세그먼트를 초래할 수 있는 40개 서열을 제거한다.

입증 목적으로, 1,000만 넘는 별개 바코드를 열거할 수 있는, 3개 (7,4) 바코드 세그먼트에 상응하는, 21 nt 바코드가 사용되었다. 이들 바코드는 7 nt마다 1 nt 오류를 정정할 수 있거나, 7 nt마다 2 nt 오류를 용인할 수 있다. 1% 고유 오류율에서, 제안된 바코드는 임의의 설계된 바코드에 매칭되지 않은 NGS 판독이 정정되는 경우 대충 0.6% 오류율, 그리고 매칭되지 않은 NGS 판독이 폐기되는 경우 0.01% 오류율을 나타낸다. 이들은 오류 정정이 없는 나이브 바코드보다 대충 20-배 및 1000-배 더 양호하다. 7 nt의 블록에서 3개 이상의 오류가 있을 확률은 0.0034%이고, 위치-특이적 프라이머 출혈로 인해 SNP 유전자형의 해석에 상당히 영향을 미치지 않을 것 같다.

임의의 설계된 바코드를 매칭시키지 않는 NGS 판독의 정정은 오류-체크 방정식 만족시키기의 수준에서 이루어지고, 설계된 바코드 서열의 지식을 요구하지 않는다. 이 작업의 시간 복잡도는 O(M)이고, 식중 M은 바코드의 길이이다 (여기에서 M = 21). 임의의 설계된 바코드를 정확하게 매칭시키지 않는 NGS 판독 정정 또는 폐기 후, 접미사 트리 알고리즘은 설계된 바코드 상에서 정확한 스트링 매칭을 수행하는데 사용될 수 있다. 접미사 트리는 O(M)의 런타임 복잡도로 극히 신속하고; 중요하게 설계된 바코드의 수에 의존하지 않고, 그래서 고도로 멀티플렉스이도록 잘 척도화한다.

IX. 열역학적 계산

서열로부터 ΔG°값을 계산하는 방법은 당업계에 알려진다. 상이한 영역 상호작용의 ΔG°를 계산하기 위하여 상이한 관례가 실재한다. 이 전체가 참고로 본원에 포함되는 WO2015/179339는 가장 접근한 이웃 모델에 기반된 예시적 에너지 계산을 제공한다. 프라이머 서열, 억압인자 올리고뉴클레오티드 서열, 보조 올리고뉴클레오티드 서열, 표적 분자 서열, 변이체 서열, 작동 온도, 및 작동 완충액 조건으로부터 ΔG°₁, ΔG°₂, ΔG°₃, 및 ΔG°₄의 계산은 당업자에 알려진다. 작동 온도는 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃일 수 있다. 작동 완충액 조건은 PCR에 적합한 완충액 조건일 수 있다.

X. 표적 핵산의 추가 처리

A. DNA의 증폭

다수의 템플레이트-의존적 과정은 주어진 템플레이트 샘플에서 존재하는 핵산을 증폭시키기 위해 이용가능하다. 가장 잘 알려진 증폭 방법들 중 하나는, 이들의 각각이 그들 전체가 참고로 본원에 포함되는, 미국 특허 번호 4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159에서 그리고 Innis 등, 1990에서 상세히 기재되는 (PCR^TM으로서 지칭된) 폴리머라제 연쇄 반응이다. 간략히, 증폭되어야 하는 템플레이트 DNA (각 가닥에 대하여 하나)의 2개 영역에 상보적인 2개 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 과량의 데옥시뉴클레오티드 (dNTP) 및 열안정성 폴리머라제, 예컨대, 예를 들어, Taq (더무스 아쿠아티스(Thermus aquaticus)) DNA 폴리머라제의 존재 하에서 (순수할 필요가 없는) 템플레이트 DNA에 부가된다. 일련의 (전형적으로 30-35) 온도 사이클에서, 표적 DNA는 반복적으로 변성되고 (대략 90℃), (전형적으로 50-60℃에서) 프라이머에 어닐링되고 딸 가닥은 프라이머로부터 확장된다 (72℃). 딸 가닥이 창출됨에 따라 이들은 후속 사이클에서 템플레이트로서 작용한다. 그래서, 2개 프라이머 사이 템플레이트 영역은 선형으로 보다는 기하급수적으로 증폭된다.

B. DNA의 시컨싱

어댑터-연결된 단편의 라이브러리의 시컨싱을 위한 방법이 또한 제공된다. 당업자에 알려진 핵산을 시컨싱하기 위한 임의의 기법은 본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있다. DNA 시컨싱 기법은 표지된 종결인자 또는 프라이머 및 슬라브 또는 모세관에서 겔 분리를 사용하는 전통적 디데옥시 시컨싱 반응 (생어 방법), 가역적으로 종결된 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 합성에 의한 시컨싱, 파이로시컨싱, 454 시컨싱, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화, 결찰이 뒤따르는 표지된 클론의 라이브러리에 대립유전자 특이적 혼성화를 사용하는 합성에 의한 시컨싱, 중합 단계 동안 표지된 뉴클레오티드의 통합의 실시간 모니터링, 및 SOLiD 시컨싱을 포함한다.

핵산 라이브러리는 Illumina 시컨싱 예컨대 Nextera™ DNA 샘플 준비 키트와 상용가능한 접근법으로 생성될 수 있고, Illumina 차세대 시컨싱 라이브러리 제조물을 생성하기 위한 추가의 접근법은, 예를 들면, Oyola 등 (2012)에서 기재된다. 다른 구현예에서, 핵산 라이브러리는 SOLiD^TM 또는 Ion Torrent 시컨싱 방법 (예를 들면, SOLiD® Fragment Library Construction Kit, SOLiD® Mate-Paired Library Construction Kit, SOLiD® ChIP-Seq Kit, SOLiD® Total RNA-Seq Kit, SOLiD® SAGE™ Kit, Ambion® RNA-Seq Library Construction Kit, 등)과 상용가능한 방법으로 생성된다. 본 발명의 구현예와 사용될 수 있는 라이브러리 작제를 위한 다양한 방법을 포함하는, 차세대 시컨싱 방법을 위한 추가의 방법은, 예를 들면, Pareek (2011) 및 Thudi (2012)에서 기재된다.

특정한 양태에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 시컨싱 기술은 Illumina, Inc.로부터 HiSeq™ 시스템 (예를 들면, HiSeq™ 2000 및 HiSeq™ 1000), NextSeq™ 500, 및 MiSeq™ 시스템을 포함한다. HiSeq™ 시스템은, 제곱 cm당 약 1,000 카피의 템플레이트를 각각 함유하는, 수백만의 클러스터가 있는 고 밀도 시컨싱 유동 세포를 창출하기 위해 고체상 증폭 그리고 평면, 광학적으로 투명한 표면에 무작위로 단편화된 게놈성 DNA의 부착을 사용하여 수백만의 단편의 대규모 병렬 시컨싱에 기반된다. 이들 템플레이트는 4-색상 DNA 합성에 의한 시컨싱 기술을 사용하여 시컨싱된다. MiSeq™ 시스템은 TruSeq™, Illumina의 가역적 종결인자-기반 합성에 의한 시컨싱을 사용한다.

본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있는 DNA 시컨싱 기법의 또다른 예는 454 시컨싱 (Roche) (Margulies 등, 2005)이다. 454 시컨싱은 2개 단계를 포함한다. 제1 단계에서, DNA는 대략 300-800개 염기 쌍의 단편으로 전단되고, 단편은 끝이 뭉툭하다. 올리고뉴클레오티드 어댑터는 그 다음 단편의 단부에 결찰된다. 어댑터는 단편의 증폭 및 시컨싱을 위한 프라이머의 역할을 한다. 단편은, 예를 들면, 5'-비오틴 태그를 함유하는, 어댑터 B를 사용하여 DNA 포착 비드, 예를 들면, 스트렙타비딘-코팅된 비드에 부착될 수 있다. 비드에 부착된 단편은 유-수 에멀젼의 액적 내에서 PCR 증폭된다. 결과는 각 비드 상에서 클론적으로 증폭된 DNA 단편의 여러 카피이다. 제2 단계에서, 비드는 (피코-리터 크기조정된) 웰에서 포착된다. 파이로시컨싱은 각 DNA 단편 상에서 병렬로 수행된다. 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가는 시컨싱 기구에서 CCD 카메라에 의해 기록되는 광 신호를 생성한다. 신호 강도는 포함된 뉴클레오티드의 수에 비례한다.

본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있는 DNA 시컨싱 기법의 또다른 예는 SOLiD 기술 (Life Technologies, Inc.)이다. SOLiD 시컨싱에서, 게놈성 DNA는 단편으로 전단되고, 어댑터는 단편의 5' 및 3' 단부에 부착되어 단편 라이브러리를 생성한다. 대안적으로, 내부 어댑터는 단편의 5' 및 3' 단부에 어댑터를 결찰시킴, 단편을 환화시킴, 내부 어댑터를 생성하기 위해 환화된 단편을 소화시킴, 그리고 짝-짓기된 라이브러리를 생성하기 위해 생성된 단편의 5' 및 3' 단부에 어댑터를 부착시킴으로써 도입될 수 있다. 다음에, 클론성 비드 집단은 비드, 프라이머, 템플레이트, 및 PCR 구성요소를 함유하는 마이크로반응기에서 제조된다. PCR 이후, 템플레이트는 변성되고 비드는 풍부화되어 확장된 템플레이트를 가진 비드를 분리시킨다. 선택된 비드 상에서 템플레이트는 유리 슬라이드에 결합을 허용하는 3' 변형에 적용된다.

본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있는 DNA 시컨싱 기법의 또다른 예는 Ion Torrent 시스템 (Life Technologies, Inc.)이다. Ion Torrent는 대규모 병렬 식으로 이 생화학 과정을 수행하기 위해 마이크로-기계화된 웰들의 고-밀도 어레이를 사용한다. 각 웰은 상이한 DNA 템플레이트를 보유한다. 웰 아래에는 이온-민감성 층이 있고 그 아래에는 독점 이온 센서가 있다. 뉴클레오티드, 예를 들어 C가 DNA 템플레이트에 부가되고 그 다음 DNA의 가닥에 통합되면, 수소 이온은 방출될 것이다. 그 이온으로부터 전하는, 독점 이온 센서에 의해 검출될 수 있는, 용액의 pH를 변화시킬 것이다. 시컨서는 염기를 호출하여, 화학 정보에서 디지털 정보로 직접 이동할 것이다. Ion Personal Genome Machine (PGM™) 시컨서는 그 다음 순차적으로 하나의 뉴클레오티드 후 또다른 것으로 칩을 넘치게 한다. 칩을 넘치게 하는 다음 뉴클레오티드가 매치가 아니면, 전압 변화는 기록되지 않을 것이고 염기는 호출되지 않을 것이다. DNA 가닥 상에서 2개 동일한 염기가 있다면, 전압은 2배일 것이고, 칩은 호출된 2개 동일한 염기를 기록할 것이다. 이것이 직접 검출 - 스캐닝 없음, 카메라 없음, 광 없음 - 이기 때문에 각 뉴클레오티드 통합은 몇 초 안에 기록된다.

본 개시내용의 방법에서 사용될 수 있는 시컨싱 기술의 또다른 예는 Pacific Biosciences의 단일 분자, 실시간 (SMRT™) 기술을 포함한다. SMRT™에서, 4개 DNA 염기의 각각은 4개 상이한 형광성 염료 중 하나에 부착된다. 이들 염료는 포스포결합된다. 단일 DNA 폴리머라제는 제로-모드 도파관 (ZMW)의 하단에서 템플레이트 단일 가닥 DNA의 단일 분자로 부동화된다. ZMW는 (마이크로초로) ZMW의 안팎으로 신속하게 확산하는 형광성 뉴클레오티드의 배경에 대해 DNA 폴리머라제에 의한 단일 뉴클레오티드의 통합을 관찰할 수 있는 감금 구조이다. 뉴클레오티드를 성장하는 가닥에 통합하는데 몇 밀리초가 걸린다. 이 시간 동안, 형광성 수준은 여기되고 형광성 신호를 생산하고, 형광성 태그는 절단 제거된다. 염료의 상응하는 형광의 검출은 어떤 염기가 통합되었는지를 나타낸다. 과정은 반복된다.

추가 시컨싱 플랫폼은 CGA 플랫폼 (Complete Genomics)을 포함한다. CGA 기술은 고체 지지체 상에서 어레이되는 DNA 나노볼을 생성하기 위해 원형 DNA 라이브러리의 제조 및 회전 환 증폭 (RCA)에 기반된다 (Drmanac 등. 2009). Complete genomics' CGA 플랫폼은 시컨싱을 위한 결합형 프로브 앵커 결찰 (cPAL)로 불리는 신규한 전략을 사용한다. 과정은 앵커 분자와 고유 어댑터들 중 하나 사이 혼성화에 의해 시작한다. 4개 축퇴 9-mer 올리고뉴클레오티드는 프로브의 제1 위치에서 특정 뉴클레오티드 (A, C, G, 또는 T)에 상응하는 특정 형광단으로 표지된다. 서열 결정은 올바른 매칭 프로브가 템플레이트에 혼성화되고 T4 DNA 리가제를 사용하여 앵커에 결찰되는 반응에서 발생한다. 결찰된 생성물의 이미징후, 결찰된 앵커-프로브 분자는 변성된다. 혼성화, 결찰, 이미징, 및 변성의 과정은 n + 1, n + 2, n + 3, 및 n + 4 위치에서 알려진 염기를 함유하는 형광적으로 표지된 9-mer 프로브의 새로운 세트를 사용하여 5회 반복된다.

추가 시컨싱 플랫폼은 나노포어 시컨싱 (Oxford Nanopore)을 포함한다. 나노포어 검출 어레이는 US2011/0177498; US2011/0229877; US2012/0133354; WO2012/042226; WO2012/107778에서 기재되고, 이들 모두가 이로써 참고로 포함되는 US2012/0058468; US2012/0064599; US2012/0322679 및 WO2012/164270에서 기재된 대로 핵산 시컨싱에 사용되었다. DNA의 단일 분자는 간섭 PCR 증폭 단계 또는 화학적 표지화 단계에 대한 필요 또는 화학적 표지를 식별하기 위한 광학적 기구사용의 필요 없이 나노포어를 사용하여 직접적으로 시컨싱될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 나노포어 핵산 시컨싱 단위는 Oxford Nanopore (Oxford, 영국)에 의해 개발된다. GridION™ 시스템 및 소형화된 MinION™ 장치는 분자성 센싱 예컨대 실시간 데이터 스트리밍, 개선된 단순성, 워크플로의 효율 및 확장성 그리고 관심 분자의 직접 분석에서 새로운 품질을 제공하도록 설계된다. Oxford Nanopore 나노포어 시컨싱 플랫폼을 사용하여, 이온성 전류는 이 막에 걸쳐 전압을 설정함으로써 나노포어를 통과된다. 분석물이 기공을 또는 이의 개구부 근처를 통과하면, 이 이벤트는 전류에서의 특징적 붕괴를 창출한다. 그 전류의 측정은 당해 분자를 식별하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 이 시스템은 4개 표준 DNA 염기 G, A, T 및 C, 및 또한 변형된 염기 사이 구별하는데 사용될 수 있다. 표적 단백질, 작은 분자를 식별하는데, 또는 풍부한 분자성 정보를 얻는데, 예를 들어 이부프로펜의 거울상이성질체를 구별하거나 분자성 결합 역학을 연구하는데 사용될 수 있다. 이들 나노포어 어레이는 각 분석물 유형에 특정한 과학적 적용에 유용하고; 예를 들어, DNA를 시컨싱하는 때, 기술은 재시컨싱, 드노보 시컨싱, 및 후생유전학에 사용될 수 있다.

XI. 키트

본원에 기재된 기술은 본원에 개시된 대로 억압인자 올리고뉴클레오티드, 보조 올리고뉴클레오티드, 및 프라이머를 포함하는 키트를 포함한다. 예시적 키트는 qPCR 키트, 생어 키트, NGS 패널, 및 나노포어 시컨싱 패널을 포함한다. 이러한 패널은 종양 억압인자 유전자, 예컨대, 예를 들어, TP53, PTEN, BRCA1, 및/또는 BRCA2에서 돌연변이를 고 감도로 검출하는데 필요한 시약을 제공할 수 있다. "키트"는 물리적 요소들의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 키트는, 예를 들어, 하나 이상의 구성요소 예컨대 핵산 프라이머, 억압인자 올리고뉴클레오티드, 보조 올리고뉴클레오티드, 효소, 반응 완충액, 지침 시트, 및 본원에 기재된 기술을 실시하는데 유용한 기타 요소를 포함할 수 있다. 이들 물리적 요소는 본 발명을 실시하는데 적합한 임의의 식으로 정렬될 수 있다.

키트의 구성요소는 어느 한쪽 수성 매질에서 또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 컨테이너 수단은, 구성요소가 배치될 수 있는, 그리고 바람직하게는, 적합하게 분취 (예를 들면, 마이크로타이터의 웰에 분취)될 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 컨테이너 수단을 일반적으로 포함할 것이다. 키트에서 하나 초과의 구성요소가 있는 경우, 키트는 또한 추가의 구성요소가 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 기타 추가의 컨테이너를 일반적으로 함유할 것이다. 하지만, 구성요소들의 다양한 조합은 단일 바이알에서 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 핵산을 함유하기 위한 수단, 및 상업적 판매를 위하여 폐쇄 감금된 임의의 기타 시약 컨테이너를 전형적으로 포함할 것이다. 이러한 컨테이너는 원하는 바이알이 보관되는 사출 또는 취입 성형된 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다. 키트는 키트 구성요소를 또한, 키트에서 포함되지 않은 임의의 기타 시약의 사용을 이용하기 위한 지침을 또한 포함할 것이다. 지침은 이행될 수 있는 변동을 포함할 수 있다.

XII. 실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 후술하는 실시예에서 개시된 기법이 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타내고, 그래서 이의 실시를 위하여 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 하지만, 당업자는, 본 개시내용에 비추어, 많은 변화가 개시되는 특정 구현예에서 이루어질 수 있고 여전히 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인식해야 한다.

실시예 1 - 정량적 PCR (qPCR) 반응 프로토콜 및 조건

순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 전형적으로 15 μL의 반응 혼합물에서 100 nM이었지만; 이것으로부터 변동은 도에서 기록된다. 억압인자 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 250 nM 내지 500 nM 가변하였고 도에서 기록된다. 보조 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 500 nM 내지 1000 nM 가변하였고 도에서 기록된다. Taqman 프로브의 최종 농도는 전형적으로 50 nM이다. PowerUP SybrGreen DNA Polymerase MasterMix (Thermo Fisher)는 모든 qPCR 실험에 사용되었다. 열 사이클링 및 형광 측정은 Bio-Rad CFX96 qPCR 기구를 사용하여 수행되었다. 열 사이클링 프로토콜은 다음과 같았다:

1. 95℃ 3 분;

2. (15 초 동안 95℃, 90 초 동안 60℃)의 60 사이클

실시예 2 - 정량적 PCR에서의 ACE

예로서, ACE 시스템은 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 유전자좌 rs1443486에서 A 대립유전자 이외 대립유전자를 풍부화하기 위하여 설계되었다. NA18562 인간 게놈성 DNA는 A 대립유전자에 동형접합적이고, NA18537 인간 게놈성 DNA는 DNA의 (-) 가닥 상에서 C 대립유전자에 동형접합적이다. 억압인자 올리고뉴클레오티드는 NA18562 A 대립유전자를 완벽하게 매칭하도록 설계되었고 서열:

ttcctgcagggaaacagcatcgattgttttctttaaaagatcccctactccTttttggctaactGAACCCTGACTT /3SpC3/ (서열번호: 35; 도 4)를 가졌다. 보조 올리고뉴클레오티드는 서열:

GTCAGGGTTC agttagccaaaaAggagtaggggatcttttaaagaaaacaatcgatgct /3SpC3/ (서열번호: 36)을 가졌다. NA18562 인간 게놈성 DNA가 A 대립유전자에 동형접합적이기 때문에, 이 반응에 대하여 야생형 템플레이트로 간주되었다. NA18537 인간 게놈성 DNA가 C 대립유전자에 동형접합적이기 때문에, 이 반응에 대하여 돌연변이체 템플레이트로 간주되었다. 억압인자 올리고뉴클레오티드의 다운스트림을 결합시키는 Taqman 프로브 (/5Cy5/ggtaaagaaactaaagcaatcagaaagga/3IAbRQSp/; 서열번호: 37)는 생성된 앰플리콘에 대하여 특정 형광 신호를 생산하는데 사용되었다.

rs1443486에서 비-A 대립유전자의 풍부화 및 검출에 ACE-qPCR 적용 후, qPCR 반응의 사이클 임계 (Ct) 값은 100% NA18537, 5% NA18537 / 95% NA18562, 1% NA18537 / 99% NA18562, 및 100% NA18562 사이 명확하게 구별될 수 있다 (도 5). 심지어 99% NA18562내 1% NA18537은 100% NA18562로부터 명확하게 구별되어, A 대립유전자보다 C 대립유전자의 100-배 초과 풍부화를 의미할 수 있다. 억압인자 올리고뉴클레오티드의 더 높은 농도는 모든 DNA 샘플에 대하여 지연된 Ct 값을 초래하였다 (도 5).

NA18562의 A 대립유전자보다 NA18537의 C 대립유전자의 풍부화는 어느 한쪽 억압인자 올리고뉴클레오티드 또는 보조 올리고뉴클레오티드가 부재하는 경우 달성되지 않았다 (도 6). 양쪽이 부재하는 경우, 사이클 임계 (Ct) 값은 유사하여, 입력 DNA 정량이 유사하였고 PCR 증폭 효율이 유사하였음을 시사하였다. 단지 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하였던 경우, 양쪽 NA18537 및 NA18562에 대하여 Ct 값은 변화되지 않아, 템플레이트 분자의 역 상보체에 보조 올리고뉴클레오티드의 결합이 PCR 반응을 억제시키지 않았음을 시사하였다. 단지 억압인자 올리고뉴클레오티드가 존재하였던 경우, 어느 한쪽 템플레이트 분자의 증폭은 관찰되지 않아, 보조 올리고뉴클레오티드의 부재 하에서, 템플레이트 분자에 결합하는 억압인자 올리고뉴클레오티드가 비가역적이었고 양쪽 돌연변이체 템플레이트 분자 및 야생형 템플레이트 분자가 증폭할 수 없었음을 시사하였다. 단지 양쪽 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하였던 경우 돌연변이체 및 야생형 템플레이트 분자의 차별적 증폭이 있었다. 다시 말해서, 양쪽 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하였던 경우, NA18537의 우선적 증폭이 관찰된 것은, 이의 템플레이트 분자가 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대해 미스매칭되었기 때문이다.

ACE가 표적 하위서열 내에서 서열 변동을 가진 모든 템플레이트 분자를 풍부화함을 입증하기 위해, ACE 시스템은 인간 TP53 유전자를 표적하도록 설계되었다 (도 7). ACE 세트에 대하여 억압인자 올리고뉴클레오티드는 서열:

GGGTCACTGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCCGCAACG /3SpC3/ (서열번호: 38)을 가졌다. ACE 세트에 대하여 보조 올리고뉴클레오티드는 서열:

CGTTGCGGGTCTGAAAATGTTTCCTGACTCAGAGGGGGCTCGACGCTAGGATCTGACTGCGGCTCCTC /3SpC3/ (서열번호: 39)를 가졌다. 이 ACE 시스템은 50nt 표적 하위서열에 걸쳐 있는 상이한 유전자좌에서 15개 별도 TP53 돌연변이를 사용하는 qPCR을 사용하여 검사되었다. 이 실험은 합성 gBlock 올리고뉴클레오티드 템플레이트 (606nt의 길이 각각)를 사용하여 수행되었다. 각 qPCR 반응의 경우, 관심의 돌연변이가 있는 각 gBlock의 2500개 분자는 100% VAF 샘플로서 사용되었다. 억압인자 올리고뉴클레오티드의 다운스트림을 결합시키는 Taqman 프로브 (/5Cy5/AATGGATCCACTCACAGTTTCCATA/3IAbRQSp/; 서열번호: 40)는 생성된 앰플리콘에 대하여 특정 형광 신호를 생산하는데 사용되었다. 돌연변이체 템플레이트 급상승이 없는 7.5 ng NA18537의 관찰된 Ct 값은 선으로서 플롯팅되었고 약 40의 값을 갖는다. 급상승 샘플의 Ct 값은 모두 27 내지 31에서 대충 9 내지 13 사이클 더 낮았다 (도 7). ACE 기전의 설계에 기반하여, 모든 돌연변이는 억압인자 올리고뉴클레오티드 상에서 돌연변이의 위치에 관계없이 동일한 ACE 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드에 의해 선택적으로 풍부화되었다.

표적 하위서열의 길이가 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드의 합리적 설계를 통해서 확장될 수 있음을 입증하기 위해, 64nt (51+1+12), 81nt, 및 126nt의 상이한 표적 하위서열 길이를 가진 동일한 인간 SNP (rs1443486)를 표적하는 3개 별도 ACE 세트는 작제되었다 (도 8). 126nt ACE 세트에 대하여 억압인자 올리고뉴클레오티드는 서열:

gccactagcaccatttacagccagagcctctgcttcgggagatggtctctcttgggggcgctttcctgcagggaaacagcatcgattgttttctttaaaagatcccctactccTttttggctaactGAACCCTGAC /3SpC3/ (서열번호: 41)을 가졌다. 126nt ACE 세트에 대하여 보조 올리고뉴클레오티드는 서열:

GTCAGGGTTCagttagccaaaaAggagtaggggatcttttaaagaaaacaatcgatgctgtttccctgcaggaaagcgcccccaagagagaccatctcccgaagcagaggctctggctgta /3SpC3/ (서열번호: 42)을 가졌다. 81nt ACE 세트에 대하여 억압인자 올리고뉴클레오티드는 서열:

tctctcttgggggcgctttcctgcagggaaacagcatcgattgttttctttaaaagatcccctactccTttttggctaactGAACCCTGAC /3SpC3/ (서열번호: 43)을 가졌다. 81nt ACE 세트에 대하여 보조 올리고뉴클레오티드는 서열:

GTCAGGGTTCagttagccaaaaAggagtaggggatcttttaaagaaaacaatcgatgctgtttccctgcaggaaagc /3SpC3/ (서열번호: 44)을 가졌다. 64nt ACE 세트에 대하여 억압인자 올리고뉴클레오티드는 서열:

ttcctgcagggaaacagcatcgattgttttctttaaaagatcccctactccTttttggctaactGAACCCTGACTT /3SpC3/ (서열번호: 35)을 가졌다. 64nt ACE 세트에 대하여 보조 올리고뉴클레오티드는 서열: GTCAGGGTTC agttagccaaaaAggagtaggggatcttttaaagaaaacaatcgatgct /3SpC3/ (서열번호: 36)을 가졌다.

SNP 위치는 템플레이트-결합 영역의 단부로부터 일관되게 13번째 뉴클레오티드이도록 설계되었다. 모두 3개 ACE 시스템은 NA18537 변이체 템플레이트와 NA18562 야생형 템플레이트 사이 상당한 Ct 값 차이를 보여주었다. 상당한 지연은 가장 긴 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대하여 관찰되어, 더 긴 길이가 가닥 변위를 허용하기 위해 더 긴 어닐 사이클 시간을 필요로 함, 또는 더 긴 길이가 더 긴 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드의 더 낮은 순도로 인해 보조 올리고뉴클레오티드 순도를 떨어트려, 변위를 덜 효율적으로 만들게 야기시킴 어느 한쪽을 시사하였다.

실시예 3 - 차세대 시컨싱 (NGS) 라이브러리 제조 프로토콜

도 10에 요약된 NGS 실험에 대한 데이터는 Illumina MiSeq 기구 및 MiSeq v3 단일-단부 150 사이클 키트를 사용하여 수집되었다. 각 라이브러리는 50 μL 반응 혼합물에서 25 ng 입력 DNA를 사용하였다. 라이브러리 제조 과정은 아래 간략히 요약된다:

1. 도 10에 열거된 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 억압인자 올리고뉴클레오티드, 및 보조 올리고뉴클레오티드 농도를 사용하여, PowerUP 마스터믹스 (Thermo Fisher)를 사용하는 ACE-PCR의 33 사이클 (30 초 동안 95℃, 6 분 동안 60℃)을 수행한다.

2. 1.7x SPRI 비드를 사용하여 DNA 정제를 수행한다.

3. 플렉스당 15 nM 프라이머를 사용하여, iTaq 마스터믹스 (Bio-Rad)를 사용하는 어댑터 PCR의 2 사이클 (10 초 동안 95℃, 6 분 동안 60℃)을 수행한다.

4. 1.4x SPRI 비드를 사용하여 DNA 정제를 수행한다.

5a. 억압인자 올리고뉴클레오티드 없는 라이브러리의 경우, 500 nM 지수 프라이머를 사용하여, iTaq 마스터믹스 (Bio-Rad)를 사용하는 8 사이클 지수 PCR (10 초 동안 95℃, 30 초 동안 60℃)을 수행한다.

5b. 억압인자 올리고뉴클레오티드가 있는 라이브러리의 경우, 500 nM 지수 프라이머를 사용하여, 지수 PCR (10 초 동안 95℃, 30 초 동안 60℃) iTaq 마스터믹스 (Bio-Rad)에 대하여 10 사이클을 수행한다.

6. 1.1x SPRI 비드를 사용하여 DNA 정제를 수행한다.

실시예 4 - NGS 생물정보학적 분석 방법

NGS FASTQ 파일로부터 NGS 판독을 분석하는 방법은 아래 요약된다:

1. 각 판독으로부터 어댑터 서열을 트리밍한다.

2. 야생형 앰플리콘 (WT 판독) 또는 변이체 앰플리콘 (Var 판독)을 완벽하게 매칭하는 삽입 판독의 수를 계수한다. 판독, 예컨대 N에서 임의의 축퇴 뉴클레오티드는 미스매칭된 것으로 간주되고 WT 판독 또는 Var 판독에 기여하지 않는다. 임의의 유전자좌에 대하여 WT 판독 또는 Var 판독으로서 계수될 수 있는 라이브러리에서 모든 NGS 판독의 분획은 정-조준 비율로서 여기에서 정의된다.

3. 앰플리콘의 변이체 판독 빈도 (VRF)는 다음과 같이 계산된다:

VRF = (Var 판독) / (Var 판독 + WT 판독)

실시예 5 - 차세대 시컨싱 (NGS) 라이브러리 제조에서의 ACE

ACE는 고-처리량 시컨싱 절차의 라이브러리 제조 과정, 예컨대, 예를 들어, 합성에 의한 시컨싱 (NGS) 방법 동안 변이체 풍부화에 사용될 수 있다. 대안적으로, 고-처리량 시컨싱은 나노포어와 공동으로 전류 측정을 통해 수행될 수 있다.

NA18537 및 NA18562이 상이한 대립유전자에 동형접합적이었던 18개 상이한 SNP 유전자좌를 표적하는 18-플렉스 ACE 패널 (표 1)은 작제되었다. 이 18-플렉스 ACE 패널은 NA18562 샘플의 동형접합적 SNP 대립유전자를 억압하도록 설계되었다. 모두 18개 억압인자 올리고뉴클레오티드는 NA18562 대립유전자에 대해 완벽하게 매칭되도록 설계되었다. 18-플렉스 ACE는 1% NA18537 / 99% NA18562의 샘플 상에서 검사되었고; 각 라이브러리는 25 ng의 이 혼합물을 입력으로서 사용하였다. Illumina MiSeq는 NGS를 수행하는데 사용되었다. ACE 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드 없이, NA18562 대립유전자에 맵핑하는 NGS 판독의 수는 예상된 대로 모든 유전자좌에서 NA18537 대립유전자에 맵핑하는 NGS 판독의 수보다 대충 100-배 더 높았다 (도 10). ACE 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 보조 올리고뉴클레오티드가 존재하는 라이브러리에서, NA18537 변이체 대립유전자에 맵핑하는 판독의 상대 분획은 모든 유전자좌에 대하여 상당히 증가되었다. 전반적으로, NA18537 유전자좌에 맵핑된 NGS 판독의 분획은 1.22%에서 최대 33.8%로 증가되되어, 24-배 초과의 가중된 평균 풍부화되었다. 이들 단일-플렉스 qPCR ACE 결과에 기반하여, ACE 폴드-풍부화는 서열, 농도, 반응 시간, 및 기타 실험적 프로토콜 세목의 최적화를 통해서 상당히 추가로 개선될 수 있다.

* * *

본원에 개시되고 청구된 방법들의 모두는 본 개시내용에 비추어 과도한 실험작업 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 측면에서 기재된 동안, 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 이탈 없이 본원에 기재된 방법에 그리고 방법의 단계에서 또는 단계의 순서에서 변동이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 동안 양쪽 화학적으로 및 생리학적으로 관련되는 특정 제제가 본원에 기재된 제제에 대하여 치환될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체 및 수정은 첨부된 청구항에 의해 정의된 대로 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

<110> William Marsh Rice University <120> AMPLICON COMPREHENSIVE ENRICHMENT <130> RICE.P0077WO <140> not yet known <141> 2021-06-25 <150> US 63/044,634 <151> 2020-06-26 <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 taacacattg atgcagaaaa acagcatacc atgagaggca gagtgtggaa gtcagagaaa 60 ccc 63 <210> 2 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 tctcctcctc caggagggtt tctctgactt ccacactctg cctctcatgg tatgctgttt 60 ttctgcatca atgtgttaac 80 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 cgtcaaggca aacatgccat ctccttctcc tgattatttt acatggaatc tcacctggat 60 60 <210> 4 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 gggaaggagt ctttcattat ccaggtgaga ttccatgtaa aataatcagg agaaggagat 60 ggcatgtttg ccttgacgc 79 <210> 5 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims

(a) 보조 올리고뉴클레오티드,
(b) 억압인자 올리고뉴클레오티드로서, 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이고 상기 보조 올리고뉴클레오티드의 하위서열에 역 상보적인 보호된 하위서열을 포함하고, 적어도 7개 뉴클레오티드 길이이고 상기 보조 올리고뉴클레오티드에 역 상보적이지 않은 미보호된 하위서열을 포함하는, 억압인자 올리고뉴클레오티드,
(c) 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드로서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드의 하위서열과 동일한 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 하위서열을 포함하는, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및
(d) 템플레이트-의존적 폴리머라제
를 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 DNA를 포함하는, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 DNA로 이루어지는, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 DNA를 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 DNA로 이루어지는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 비-천연 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 비-천연 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 DNA를 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 DNA로 이루어지는, 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트-의존적 폴리머라제가 DNA 폴리머라제인, 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트-의존적 폴리머라제가 역 전사효소인, 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 RNA를 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제7항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 RNA로 이루어지는, 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 템플레이트-의존적 폴리머라제가 RNA 폴리머라제인, 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 30 내지 500개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드의 상기 미보호된 하위서열이 상기 보조 올리고뉴클레오티드의 임의의 부분에 역 상보적이지 않은, 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 30 내지 500개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 6 내지 70개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 템플레이트-의존적 폴리머라제 확장을 방지하는 3' 화학적 변형 또는 DNA 서열을 갖는, 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 템플레이트-의존적 폴리머라제 확장을 방지하는 3' 화학적 변형 또는 DNA 서열을 갖는, 조성물.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 변형이 디데옥시뉴클레오티드, 역전된 DNA 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트-치환된 백본, 및 알칸 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서를 포함하는, 조성물.
제19항 또는 제20항에 있어서, 3' 단부에 상기 DNA 서열이 적어도 하나의 헤어핀 구조를 형성하는, 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 복수의 억압인자 올리고뉴클레오티드 종, 복수의 보조 올리고뉴클레오티드 종, 및 복수의 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 종을 포함하는, 조성물.
제23항에 있어서, 각 억압인자 올리고뉴클레오티드 종이 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이고 적어도 하나의 상응하는 보조 올리고뉴클레오티드 종의 하위서열에 역 상보적인 보호된 하위서열을 포함하는, 조성물.
제23항 또는 제24항에 있어서, 각 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 종이 적어도 하나의 상응하는 억압인자 올리고뉴클레오티드 종의 하위서열과 동일한 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 하위서열을 포함하는, 조성물.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 종이 각각 5' 단부에서 또는 이의 근처에서 범용 순방향 어댑터 하위서열을 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 템플레이트 분자를 추가로 포함하되, 상기 템플레이트 분자가 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 상기 3' 하위서열의 역 상보체에 90% 초과 상동인 하위서열을 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하되, 상기 템플레이트 분자가 상기 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 하위서열에 90% 초과 상동인 하위서열을 포함하는, 조성물.
제28항에 있어서, 상기 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 10 내지 70개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 조성물.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 5' 단부에서 또는 이의 근처에서 범용 역 어댑터 하위서열을 포함하는, 조성물.
제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 생물학적 DNA 또는 RNA 분자인, 조성물.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 세포의 샘플로부터 수득되는, 조성물.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 생체유체로부터 수득되는, 조성물.
제33항에 있어서, 상기 생체유체가 혈액, 소변, 타액, 뇌척수액, 간질액, 또는 활액인, 조성물.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 조직으로부터 수득되는, 조성물.
제35항에 있어서, 상기 조직이 생검 조직 또는 외과적으로 절제된 조직인, 조성물.
제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 RNA 분자의 역 전사를 통해서 생성된 상보적 DNA 분자인, 조성물.
제37항에 있어서, 상기 RNA 분자가 인간, 동물, 식물, 또는 환경적 표본으로부터 유래된 생물학적 RNA 샘플로부터 수득되는, 조성물.
제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 단일-가닥 DNA 템플레이트에서 작용하는 DNA 폴리머라제를 통해서 생성된 앰플리콘 DNA 분자인, 조성물.
제39항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 단일 세포 DNA의 다중 변위 증폭으로부터 생성된 앰플리콘 DNA 분자인, 조성물.
제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 생물학적 DNA 분자의 물리적으로, 화학적으로, 또는 효소적으로 생성된 생성물인, 조성물.
제41항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 단편화 과정의 생성물인, 조성물.
제42항에 있어서, 상기 단편화 과정이 초음파처리 또는 효소적 단편화인, 조성물.
제41항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 비술파이트 전환 반응, APOBEC 반응, TAPS 반응, 또는 시토신 뉴클레오티드가 이의 메틸화 상태에 기반된 우라실 뉴클레오티드로 선택적으로 전환되는 기타 화학적 또는 효소적 반응의 생성물인, 조성물.
제27항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 템플레이트 분자가 순방향 프라이머-결합 하위서열과 역방향 프라이머-상동 하위서열 사이에 위치된 표적 하위서열을 포함하는, 조성물.
제45항에 있어서, 상기 표적 하위서열이 개시 하위서열을 포함하지 않는 억압인자 올리고뉴클레오티드 보호된 하위서열 부분의 역 상보체와 적어도 70% 동일한, 조성물.
제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드의 3'에서 또는 이의 근처에서 개시 하위서열을 갖는, 조성물.
제47항에 있어서, 상기 개시 하위서열이 4 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 조성물.
제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 개시 하위서열이 상기 표적 하위서열의 3' 바로 옆에 있는 상기 템플레이트 분자 하위서열의 역 상보체와 30% 미만 동일한, 조성물.
제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 상기 보조 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 또는 이의 근처에서 개시 상보체 하위서열을 갖는, 조성물.
제50항에 있어서, 상기 개시 상보체 하위서열이 4 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 조성물.
제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 개시 상보체 하위서열이 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드의 개시 하위서열의 역 상보체와 적어도 90% 동일한, 조성물.
제27항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 상기 역 상보체 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드와 30% 초과 동일한 하위서열을 갖지 않는, 조성물.
제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 형광단-기능화된 DNA 프로브를 추가로 포함하는, 조성물.
제54항에 있어서, 상기 형광단-기능화된 DNA 프로브가 Taqman 프로브 또는 분자성 비콘인, 조성물.
제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 인터칼레이팅 염료를 추가로 포함하는, 조성물.
제56항에 있어서, 상기 DNA 인터칼레이팅 염료가 SybrGreen, EvaGreen, 또는 Syto인, 조성물.
제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대한 상기 보조 올리고뉴클레오티드의 화학양론 비가 0.8 내지 100인, 조성물.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 상기 템플레이트 분자가 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -7 kcal/mol 내지 -20 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₁)를 갖는, 조성물.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 상기 템플레이트 분자가 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -16 kcal/mol 내지 -200 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₂)를 갖는, 조성물.
제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -15 kcal/mol 내지 -200 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₃)를 갖는, 조성물.
제60항 및 제61항에 있어서, (ΔG°₂ - ΔG°₃)의 값이 -5 kcal/mol 내지 +5 kcal/mol인, 조성물.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 기능에 필요한 시약 및 완충액을 추가로 포함하는, 조성물.
폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 DNA 서열 변이체를 선택적으로 증폭시키는 방법으로서,
(a) 변이체 DNA 템플레이트 분자를 포함할 가능성이 있고 야생형 DNA 템플레이트 분자를 포함할 가능성이 있는 샘플을,
(i) 보조 올리고뉴클레오티드,
(ii) 억압인자 올리고뉴클레오티드로서, 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이고 상기 보조 올리고뉴클레오티드의 하위서열에 역 상보적인 보호된 하위서열을 포함하고, 적어도 7개 뉴클레오티드 길이이고 상기 보조 올리고뉴클레오티드에 역 상보적이지 않은 미보호된 하위서열을 포함하고, 상기 보호된 하위서열이 표적-결합 하위서열 및 개시 하위서열을 포함하고, 상기 표적-결합 하위서열이 야생형 DNA 템플레이트 분자의 역 상보체와 적어도 70% 동일한, 억압인자 올리고뉴클레오티드,
(iii) 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드로서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드의 상기 미보호된 하위서열의 적어도 한 부분과 동일한 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 하위서열을 포함하고, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 하위서열의 역 상보체가 야생형 DNA 템플레이트와 적어도 90% 동일한, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드,
(iv) 상기 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 3' 하위서열이 야생형 DNA 템플레이트의 하위서열과 적어도 90% 동일한, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및
(v) DNA 폴리머라제 기능에 필요한 템플레이트-의존적 DNA 폴리머라제, dNTP, 및 완충액 시약
과 혼합하는 단계, 및
(b) 혼합물을 적어도 7 라운드의 열 사이클링에 적용하는 단계
를 포함하는, 방법.
제64항에 있어서, 열 사이클링의 각 라운드가 혼합물을 80 ℃ 내지 105 ℃의 변성 온도에서 1 초 내지 1 시간 동안 유지하는 단계 및 그 다음 혼합물을 50 ℃ 내지 75 ℃의 어닐링 온도에서 1 초 내지 2 시간 동안 유지하는 단계를 포함하는, 방법.
제64항 또는 제65항에 있어서, 복수의 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 억압인자 올리고뉴클레오티드, 및 보조 올리고뉴클레오티드가 상기 샘플과 혼합되고, 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드, 억압인자 올리고뉴클레오티드, 및 보조 올리고뉴클레오티드의 각 세트가 상이한 변이체 템플레이트 분자 및 야생형 템플레이트 분자 서열에 상응하는, 방법.
제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 5' 단부에서 또는 이의 근처에서 범용 순방향 어댑터 하위서열을 포함하고, 모든 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 5' 단부에서 또는 이의 근처에서 범용 역 어댑터 하위서열을 포함하는, 방법.
제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 각 억압인자 올리고뉴클레오티드 종이 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이고 적어도 하나의 상응하는 보조 올리고뉴클레오티드 종의 하위서열에 역 상보적인 보호된 하위서열을 포함하는, 방법.
제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 각 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 종이 적어도 하나의 상응하는 억압인자 올리고뉴클레오티드 종의 하위서열과 동일한 적어도 6개 뉴클레오티드 길이의 하위서열을 포함하는, 방법.
제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 상기 변이체 템플레이트 분자가 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -7 kcal/mol 내지 -20 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₁)를 갖는, 방법.
제 64 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 상기 야생형 템플레이트 분자가 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -16 kcal/mol 내지 -200 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₂)를 갖는, 방법.
제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드 및 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -15 kcal/mol 내지 -200 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₃)를 갖는, 방법.
제71항 및 제72항 중 어느 한 항에 있어서, (ΔG°₂ - ΔG°₃)의 값이 -5 kcal/mol 내지 +5 kcal/mol인, 방법.
제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 상기 변이체 템플레이트 분자가 60℃의 온도 및 0.2 M 나트륨의 염도에서 -7 kcal/mol 내지 -20 kcal/mol의 혼성화의 표준 자유 에너지 (ΔG°₄)를 갖는, 방법.
제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물에서 각 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도가 100 pM 내지 5 μM인, 방법.
제64항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물에서 각 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도가 100 pM 내지 5 μM인, 방법.
제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물에서 각 억압인자 올리고뉴클레오티드의 농도가 100 pM 내지 5 μM인, 방법.
제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 각 보조 올리고뉴클레오티드의 농도가 100 pM 내지 5 μM인, 방법.
제64항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대한 각 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 화학양론 비가 0.8 내지 100인, 방법.
제64항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 억압인자 올리고뉴클레오티드에 대한 각 보조 올리고뉴클레오티드의 화학양론 비가 0.8 내지 100인, 방법.
제64항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 DNA를 포함하는, 방법.
제64항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 DNA로 이루어지는, 방법.
제64항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 DNA를 포함하는, 방법.
제64항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 DNA로 이루어지는, 방법.
제64항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 30 내지 500개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 방법.
제64항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드의 상기 미보호된 하위서열이 상기 보조 올리고뉴클레오티드의 임의의 부분에 역 상보적이지 않은, 방법.
제64항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 30 내지 500개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 방법.
제64항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 6 내지 70개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 방법.
제64항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 10 내지 70개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 방법.
제64항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 DNA 폴리머라제 확장을 방지하는 3' 화학적 변형 또는 DNA 서열을 갖는, 방법.
제64항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 DNA 폴리머라제 확장을 방지하는 3' 화학적 변형 또는 DNA 서열을 갖는, 방법.
제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 변형이 디데옥시뉴클레오티드, 역전된 DNA 뉴클레오티드, 포스포노티오에이트-치환된 백본, 및 알칸 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서를 포함하는, 방법.
제90항 또는 제91항에 있어서, 3' 단부에서 상기 DNA 서열이 적어도 하나의 헤어핀 구조를 형성하는, 방법.
제64항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드가 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드의 3'에서 또는 이의 근처에서 개시 하위서열을 갖는, 방법.
제64항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시 하위서열이 4 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 방법.
제64항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시 하위서열이 상기 표적 하위서열의 3' 바로 옆에 있는 상기 변이체 템플레이트 분자 하위서열의 역 상보체와 30% 미만 동일한, 방법.
제64항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 상기 보조 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에서 또는 이의 근처에서 개시 상보체 하위서열을 갖는, 방법.
제97항에 있어서, 상기 개시 상보체 하위서열이 4 내지 25개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 방법.
제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 개시 상보체 하위서열이 상기 억압인자 올리고뉴클레오티드의 상기 개시 하위서열의 역 상보체와 적어도 90% 동일한, 방법.
제64항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조 올리고뉴클레오티드가 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드의 역 상보체와 30% 초과 동일한 하위서열을 갖지 않는, 방법.
제64항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물이 형광단-기능화된 DNA 프로브를 추가로 포함하는, 방법.
제101항에 있어서, 상기 형광단-기능화된 DNA 프로브가 Taqman 프로브 또는 분자성 비콘인, 방법.
제64항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물이 DNA 인터칼레이팅 염료를 추가로 포함하는, 방법.
제103항에 있어서, 상기 DNA 인터칼레이팅 염료가 SybrGreen, EvaGreen, 또는 Syto인, 방법.
정량적 PCR (qPCR)을 사용하여 DNA 서열 변이체를 선택적으로 검출 및 정량화하는 방법으로서,
(a) 제64항 내지 제104항 중 어느 한 항의 방법에 따라 샘플의 제1 분취량으로 야생형 DNA 템플레이트에 비해 변이체 DNA 템플레이트에 선택적인 PCR 증폭을 수행하는 단계;
(b) 용액 형광의 시간-기반 측정을 수행하는 단계;
(c) 상기 용액 형광이 임계값을 초과하는 사이클에 기반된 사이클 임계 (Ct) 값을 계산하는 단계; 및
(d) 상기 Ct 값에 기반된 상기 샘플에서 상기 변이체 DNA 템플레이트의 존재/부재 또는 정량을 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
제105항에 있어서, 상기 qPCR 혼합물이 Taqman 프로브를 포함하는, 방법.
제105항 또는 제106항에 있어서,
(e) 억압인자 올리고뉴클레오티드의 부재 하에서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 상기 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 샘플의 제2 분취량으로 제2 qPCR 반응을 수행하는 단계;
(f) 이 제2 반응의 사이클 임계 (Ct2)를 계산하는 단계; 및
(g) Ct와 Ct2 사이 값에서의 차이에 기반된 야생형 DNA 템플레이트에 대한 변이체 DNA 템플레이트의 상대 정량에 대해 결정하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
고-처리량 시컨싱을 사용하여 DNA 서열 변이체를 선택적으로 검출 및 정량화하는 방법으로서,
(a) 제64항 내지 제104항 중 어느 한 항의 방법에 따라 샘플의 제1 분취량으로 야생형 DNA 템플레이트에 비해 변이체 DNA 템플레이트에 선택적인 PCR 증폭을 수행하는 단계;
(b) 상기 앰플리콘의 어느 한쪽 또는 양쪽 단부에 시컨싱 어댑터를 첨부하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 생성물에서 고-처리량 시컨싱을 수행하는 단계; 및
(d) 상기 고-처리량 시컨싱 판독에 기반된 상기 샘플의 돌연변이 VAF를 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
제108항에 있어서, 상기 순방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 이의 5' 단부에 순방향 시컨싱 어댑터를 포함하고, 상기 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드가 이의 5' 단부에 역방향 시컨싱 어댑터를 포함하는, 방법.
제109항에 있어서, 상기 시컨싱 어댑터 중 하나 또는 둘 모두가 고유 분자성 식별자 (UMI) 서열을 포함하는, 방법.
제108항에 있어서, PCR을 사용하여 시컨싱 어댑터 및/또는 시컨싱 지수를 첨부하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제111항에 있어서, 상기 시컨싱 어댑터가 고유 분자성 식별자 (UMI) 서열을 포함하는, 방법.
제108항에 있어서, 고-처리량 시컨싱을 수행하는 단계 전에 단계 (a)의 상기 PCR 생성물에 시컨싱 어댑터 및/또는 시컨싱 지수를 결찰시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제113항에 있어서, 결찰을 통해 첨부된 상기 시컨싱 어댑터가 고유 분자성 식별자 (UMI) 서열을 포함하는, 방법.
제110항, 제112항, 또는 제114항에 있어서, 상기 UMI 서열이 사전-설계된 서열의 한 세트를 포함하며, UMI 서열의 모든 쌍이 상기 UMI 길이의 30% 이상인 최소 해밍 거리를 나타내는, 방법.
제110항, 제112항, 제114항, 또는 제115항에 있어서, 상기 UMI 서열이 N (A, C, G, 및 T의 혼합물), B (C, G, 및 T의 혼합물), D (A, G, 및 T의 혼합물), H (C, A, 및 T의 혼합물), V (A, C, 및 G의 혼합물), S (C 및 G의 혼합물), W (A 및 T의 혼합물), R (A 및 G의 혼합물), Y (T 및 C의 혼합물), K (G 및 T의 혼합물), 및 M (A 및 C의 혼합물)로부터 선택된, 축퇴 뉴클레오티드를 포함하는 서열의 한 세트를 포함하는, 방법.
제108항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플의 돌연변이 VAF가 모든 템플레이트 분자에서 변이체 템플레이트 분자의 분획인, 방법.
제117항에 있어서, 돌연변이 VAF의 결정이 변이체 판독 빈도 (VRF) 및 폴드-풍부화 (EF)에 기반되는, 방법.
제117항에 있어서, 돌연변이 VAF의 결정이 UMI 클러스터링에 기반되는, 방법.
제108항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고-처리량 시컨싱이 합성에 의한 시컨싱을 통해 수행되는, 방법.
제108항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고-처리량 시컨싱이 나노포어와 함께 전류 측정을 통해 수행되는, 방법.