JP2017515484A - 重複する非対立遺伝子特異的プライマー及び対立遺伝子特異的ブロッカーオリゴヌクレオチドの組成物を用いる対立遺伝子特異的な増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年5月19日に出願の米国仮出願第62/000,114号に対する優先権を請求するものであり、これの開示は、本明細書中に参照によってその全体が組み込まれる。
配列表は、電子的な形態でのみ本出願とともに提出され、本明細書中に参照によって組み込まれる。配列表テキストファイル「14-21013-WO(260947.00251)_SL.txt」は、2015年5月18日に作成され、13,144バイトのサイズである。
他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
+2kcal/mol≧ΔG°PT−ΔG°BT≧−8kcal/mol
を満たす。
−4kcal/mol≧ΔG°3≧−12kcal/mol
を満たす。
+2kcal/mol≧ΔG°PT2−ΔG°BT2≧−8kcal/mol
を満たす。
−4kcal/mol≧ΔG°6≧−12kcal/mol
を満たす。
+2kcal/mol≧ΔG°PT−ΔG°BT≧−8kcal/mol
を満たす。
−4kcal/mol≧ΔG°3≧−12kcal/mol
を満たす。
+2kcal/mol≧ΔG°PT2−ΔG°BT2≧−8kcal/mol
を満たす。
−4kcal/mol≧ΔG°6≧−12kcal/mol
を満たす。
+2kcal/mol≧ΔG°PT−ΔG°BT≧−8kcal/mol
Tfn+1=Tfn+Pn・[Pn/(Pn+Bn)+Y(ΔG°rxn1)・Bn/(Pn+Bn)]・Trn
Trn+1=Trn+Rn・Tfn
Vfn+1=Vfn+Pn・[Pn/(Pn+Bn)+Y(ΔG°rxn2)・Bn/(Pn+Bn)]・Vrn
Vrn+1=Vrn+Rn・Vfn
式中、Tfnはサイクルnでの標的のフォワード鎖の標準化濃度であり、Trnはサイクルnでの標的のリバース鎖の標準化濃度であり、Vfnはサイクルnでのバリアントのフォワード鎖の標準化濃度であり、Vrnはサイクルnでのバリアントのフォワード鎖の標準化濃度であり、Pnはサイクルnでのフォワードプライマーの標準化濃度であり、Bnはサイクルnでのブロッカーの標準化濃度であり、Rnはサイクルnでのリバースプライマーの標準化濃度であり、及びY(ΔG°)は、所与のΔG°反応標準自由エネルギーでの、置き換え反応のハイブリダイゼーション収率である。シミュレーション結果は、図7Aに示される。
[実施例]
Claims (45)
- 酵素による伸長を防止する官能基又は非相補的配列領域を、3’末端又はその付近に含むブロッカーオリゴヌクレオチドであって、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的中立性サブ配列及びブロッカー可変性サブ配列を含む第1の配列を含み、前記ブロッカー可変性サブ配列は、その3’及び5’末端に前記標的中立性サブ配列が隣接し、前記標的中立性サブ配列と連続する、前記ブロッカーオリゴヌクレオチド;並びに
酵素による伸長を誘導するのに十分である第1のプライマーオリゴヌクレオチドであって、前記第1のプライマーオリゴヌクレオチドは第2の配列を含み、前記第2の配列は、前記第2の配列が重複サブ配列及び非重複サブ配列を含むように、前記標的中立性サブ配列と少なくとも5ヌクレオチド重複し、前記第2の配列は前記ブロッカー可変性サブ配列を含まない、前記第1のプライマーオリゴヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチド組成物。 - 官能基が、3−炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチドを含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 重複サブ配列が、標的中立性サブ配列の5’末端の部分を含み、前記部分が、約5ヌクレオチド〜約40ヌクレオチドである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 重複サブ配列が、標的中立性サブ配列の5’末端の部分を含み、前記部分が、約7ヌクレオチド〜約30ヌクレオチドである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 第2の配列が、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°PT)を生じさせ、第1の配列がハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°BT)を生じさせ、以下の条件:
+2kcal/mol≧ΔG°PT−ΔG°BT≧−8kcal/mol
を満たす、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド組成物。 - 非重複サブ配列がハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°3)を生じさせ、以下の条件:
−4kcal/mol≧ΔG°3≧−12kcal/mol
を満たす、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド組成物。 - ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度が第1のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約2〜約10,000倍高い、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- ブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度が第1のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約5〜約1,000倍高い、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 酵素による伸長を誘導するのに十分である、第2のプライマーオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第2のプライマーオリゴヌクレオチドは第3の配列を含み、前記第3の配列は第1の配列又は第2の配列と重複せず、前記第3の配列は標的中立性であり、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて核酸の領域を増幅するために、第1のプライマーオリゴヌクレオチドとともに使用するのに十分である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 酵素による伸長を防止する第2の官能基又は第2の非相補的配列領域を、3’末端又はその付近に含む第2のブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記第2のブロッカーオリゴヌクレオチドは、第2の標的中立性サブ配列及び第2のブロッカー可変性サブ配列を含む第4の配列を含み、前記第2のブロッカー可変性サブ配列は、ブロッカー可変性サブ配列に対して相補的な配列であり、前記第2のブロッカー可変性サブ配列は、その3’及び5’末端に前記第2の標的中立性サブ配列が隣接し、前記第2の標的中立性サブ配列と連続し、第3の配列は、前記第3の配列が第2の重複サブ配列及び第2の非重複サブ配列を含むように、前記第2の標的中立性サブ配列と少なくとも5ヌクレオチド重複し、前記第3の配列は、前記第2のブロッカー可変性サブ配列を含まない、請求項9に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 第2の官能基が3−炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチドを含む、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 第2の重複サブ配列が第2の標的中立性サブ配列の5’末端の部分を含み、前記部分が約5ヌクレオチド〜約40ヌクレオチドである、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 第2の重複サブ配列が第2の標的中立性サブ配列の5’末端の部分を含み、前記部分が約7ヌクレオチド〜約30ヌクレオチドである、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 第3の配列がハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°PT2)を生じさせ、第4の配列がハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°BT2)を生じさせ、以下の条件:
+2kcal/mol≧ΔG°PT2−ΔG°BT2≧−8kcal/mol
を満たす、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド組成物。 - 第2の非重複サブ配列がハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°6)を生じさせ、以下の条件:
−4kcal/mol≧ΔG°3≧−12kcal/mol
を満たす、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド組成物。 - 第2のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度が第2のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約2〜約10,000倍高い、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 第2のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度が第2のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約5〜約1,000倍高い、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- ポリメラーゼ連鎖反応法に必要な試薬をさらに含む、請求項1〜17のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 複数のヌクレオシド三リン酸をさらに含む、請求項1〜17のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項1〜17のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- ポリメラーゼ連鎖反応法に必要な試薬、複数のヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項1〜17のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- ブロッカー可変性サブ配列が単一ヌクレオチドである、請求項1〜17のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
- 以下のステップを含む、標的配列の増幅のための方法。
a.バリアント配列を含む1又は2コピー以上の第1の核酸を含有し、前記標的配列を含む少なくとも1コピーの第2の核酸を含有し得る試料を得るステップであって、前記標的配列及びバリアント配列はそれぞれ、相同性サブ配列及び可変性サブ配列を含み、前記可変性サブ配列は少なくとも1つのヌクレオチドを含み、前記標的配列の可変性サブ配列は標的特異的サブ配列であり、前記バリアント配列の可変性サブ配列は非標的特異的サブ配列である、ステップ;
b.ブロッカーオリゴヌクレオチドを前記試料に導入するステップであって、前記ブロッカーオリゴヌクレオチドは、標的中立性サブ配列及びブロッカー可変性サブ配列を含む第1の配列を含み、前記標的中立性サブ配列は前記相同性サブ配列の部分に対して相補的であり、前記ブロッカー可変性サブ配列は前記非標的特異的サブ配列に対して相補的であり、前記ブロッカー可変性サブ配列は、その3’及び5’末端に前記標的中立性サブ配列が隣接し、前記標的中立性サブ配列と連続する、ステップ;並びに
c.第1のプライマーオリゴヌクレオチドを前記試料に導入するステップであって、前記第1のプライマーオリゴヌクレオチドは酵素による伸長を誘導するのに十分であり、前記第1のプライマーオリゴヌクレオチドは第2の配列を含み、前記第2の配列は前記相同性サブ配列の第2の部分に対して相補的であり、前記第2の配列は、前記第2の配列が重複サブ配列及び非重複サブ配列を含むように、前記標的中立性サブ配列と少なくとも5ヌクレオチド重複し、前記第2の配列は、前記可変性サブ配列に対して相補的ないかなる配列も含まない、ステップ;
d.DNAポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及びポリメラーゼに基づく核酸増幅に必要な1又は2以上の試薬を前記試料に導入するステップ;並びに
e.前記試料を、核酸増幅を達成するのに十分な条件下で反応させるステップ; - ブロッカーオリゴヌクレオチドが、酵素による伸長を防止する官能基又は非相補的配列領域を、3’末端又はその付近に含む、請求項23に記載の方法。
- 官能基が、3−炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチドを含む、請求項24に記載の方法。
- DNAポリメラーゼが耐熱性DNAポリメラーゼである、請求項23に記載の方法。
- 核酸増幅を達成するのに十分な条件が、試料を少なくとも10サイクルにかけるステップを含み、各サイクルが、少なくとも2つの異なる温度曝露を含み、1つの温度曝露が少なくとも85℃であり、1つの温度曝露が75℃以下である、請求項26に記載の方法。
- 試料にニッキング酵素、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、RNAse、逆転写酵素又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される酵素を導入するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 重複サブ配列が、標的中立性サブ配列の5’末端の部分を含み、前記部分が、約5ヌクレオチド〜約40ヌクレオチドである、請求項23に記載の方法。
- 重複サブ配列が、標的中立性サブ配列の5’末端の部分を含み、前記部分が、約7ヌクレオチド〜約30ヌクレオチドである、請求項23に記載の方法。
- 第2の配列が、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°PT)を生じさせ、第1の配列が、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°BT)を生じさせ、以下の条件:
+2kcal/mol≧ΔG°PT−ΔG°BT≧−8kcal/mol
を満たす、請求項23に記載の方法。 - 非重複サブ配列が、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°3)を生じさせ、以下の条件:
−4kcal/mol≧ΔG°3≧−12kcal/mol
を満たす、請求項23に記載の方法。 - 試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度が、試料に導入される第1のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約2〜約10,000倍高い、請求項23に記載の方法。
- 試料に導入されるブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度が、試料に導入される第1のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約5〜約1,000倍高い、請求項23に記載の方法。
- 第2のプライマーオリゴヌクレオチドを試料に導入するステップであって、前記第2のプライマーオリゴヌクレオチドは第3の配列を含み、前記第3の配列は可変性サブ配列と重複せず、前記第3の配列は、標的中立性であり、標的配列を含む核酸の領域を増幅するために、第1のプライマーオリゴヌクレオチドとともに使用するのに十分である、ステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 第2のブロッカーオリゴヌクレオチドを試料に導入するステップであって、前記第2のブロッカーオリゴヌクレオチドは、第2の標的中立性サブ配列及び第2のブロッカー可変性サブ配列を含む第4の配列を含み、前記第2のブロッカー可変性サブ配列は、ブロッカー可変性サブ配列に対して相補的な配列であり、前記第2のブロッカー可変性サブ配列は、その3’及び5’末端に前記第2の標的中立性サブ配列が隣接し、前記第2の標的中立性サブ配列と連続し、第3の配列は、前記第3の配列が第2の重複サブ配列及び第2の非重複サブ配列を含むように、前記第2の標的中立性サブ配列と少なくとも5ヌクレオチド重複する、ステップをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 第2のブロッカーオリゴヌクレオチドが、酵素による伸長を防止する第2の官能基又は第2の非相補的配列領域を、3’末端又はその付近に含む、請求項36に記載の方法。
- 第2の官能基が、3−炭素スペーサー又はジデオキシヌクレオチドからなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 第2の重複サブ配列が、第2の標的中立性サブ配列の5’末端の部分を含み、前記部分が、約5ヌクレオチド〜約40ヌクレオチドである、請求項36に記載の方法。
- 第2の重複サブ配列が、第2の標的中立性サブ配列の5’末端の部分を含み、前記部分が、約7ヌクレオチド〜約30ヌクレオチドである、請求項36に記載の方法。
- 第3の配列が、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°PT2)を生じさせ、第4の配列が、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°BT2)を生じさせ、以下の条件:
+2kcal/mol≧ΔG°PT2−ΔG°BT2≧−8kcal/mol
を満たす、請求項36に記載の方法。 - 第2の非重複サブ配列が、ハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー(ΔG°6)を生じさせ、以下の条件:
−4kcal/mol≧ΔG°3≧−12kcal/mol
を満たす、請求項36に記載の方法。 - 試料に導入される第2のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度が、試料に導入される第2のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約2〜約10,000倍高い、請求項36に記載の方法。
- 試料に導入される第2のブロッカーオリゴヌクレオチドの濃度が、試料に導入される第2のプライマーオリゴヌクレオチドの濃度より約5〜約1,000倍高い、請求項36に記載の方法。
- ステップ(e)の後、試料からアリコートを除去するステップ及びステップ(b)〜(e)を繰り返すステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
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