KR20210133215A - 핵산 증폭 기술에서 비특이적 증폭 산물을 억제하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

소량의 출발 물질로부터 DNA의 특이적 단편을 신속하게 복사하기 위한 핵산 증폭 기술 (NAAT)의 용도는 샘플 중 그 DNA를 검출하기 위해 사용된다. 적용분야에는 임상 샘플 중 병원체의 식별이 포함된다. 임의의 투입 DNA 주형의 부재 하에서 발생되는 비특이적 DNA 증폭은 시간이 흐름에 따라, 등온 증폭의 경우에 또는 많은 증폭 사이클 이후에 빈번하게 관찰된다. 개시된 구현예는 프라이머-단독 아티팩트의 증폭이 반응에 관여되는 올리고의 분획이 DNA 중합효소에 의한 연장을 지원할 수 없는 3' 차단형 말단 염기를 함유하는 반응에서 억제된다는 놀라운 발견을 기술한다. 이들 3' 차단형 올리고의 효과는 표적화된 주형 프라이밍된 참 양성 반응과 비교하여, 프라이머-단독 반응을 불균형적으로 지연시켜서, 거짓 양성을 참 양성에서 분리시키는 윈도우를 개방시키고 반응 특이성 및 감도를 대단히 개선시킨다.

Description

핵산 증폭 기술에서 비특이적 증폭 산물을 억제하기 위한 방법

본 발명은 일반적으로 핵산 증폭, 및 보다 특히 비특이적 증폭 산물을 억제시키거나 또는 감소시키는 핵산의 증폭을 위한 방법, 조성물, 시스템, 및 기술에 관한 것이다.

관련 출원

본 출원은 발명의 명칭 "핵산 증폭 기술에서 비특이적 증폭 산물을 억제하기 위한 방법"으로, John Davidson이 2019년 1월 15일 출원한 미국 가출원 USSN 62/792,613에 대한 우선권을 청구한다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하고 그 전체를 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 상기 ASCII 사본은 2019년 10월 31일 생성되었고, 명칭은 TNG-0600-UTL_SL.txt이며 크기는 14,984 바이트이다.

하기는 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 임의의 정보가 본 명세서에 기술되거나 또는 청구된 발명에 대한 종래 기술이거나, 또는 그와 관련된다거나, 또는 특별하게 또는 은연 중에 참조된 임의의 공개물 또는 문헌이 종래 기술이라는 인정이 아니다.

핵산 뉴클레오티드 서열의 상보성을 기반으로 하는 핵산 분석 방법은 유전 형질을 직접적으로 분석할 수 있다. 따라서, 이들 방법은 유전 질환, 암, 미생물 등의 식별을 위한 매우 강력한 수단이다. 그럼에도 불구하고, 샘플에 매우 소량으로 존재하는 표적 유전자 또는 핵산의 검출은 쉽지 않고, 그러므로 표적 유전자 또는 이의 검출 신호의 증폭이 필요하다. 이와 같이, 시험관내 핵산 증폭 기술 (NAAT)은 연구 및 진단의 많은 영역에서 소량의 핵산의 검출 및 분석을 위한 귀중하고 강력한 도구이다.

NAAT 기술은 높은 감도 및 특이성으로 샘플 중 핵산의 검출 및 정량을 가능하게 한다. NAAT 기술은 특정 NAAT의 구현 이후에 증폭 산물 (즉, 앰플리콘)의 존재로 나타나는, 샘플 내 특정 주형 핵산의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다. 반대로, 임의의 증폭 산물의 부재는 샘플 내 주형 핵산의 부재를 의미한다. 이러한 기술은 예를 들어 병원체가 샘플에 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 진단 적용분야에서 상당히 중요하다. 따라서, NAAT 기술은 감염 및 유전 질환의 진단을 위한 특별한 핵산의 검출 및 정량에 유용하다.

NAAT는 절차의 온도 요건에 따라서 분류될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 시험관내에서 핵산을 증폭하는 기술로서 가장 인기있는 방법이다. 이러한 방법은 지수적 증폭의 효과를 기반으로 높은 감도 덕분에 우수한 검출 방법으로서 확고하게 확립되었다. 더 나아가서, 증폭 산물이 DNA로서 회수될 수 있으므로, 이러한 방법은 유전자 조작 기술 예컨대 유전자 클로닝 및 구조 결정을 지원하는 중요한 도구로서 광범위하게 적용된다. PCR 방법에서, 그러나, 온도 사이클링 또는 특별한 온도 제어기가 실시에 필요하고; 증폭 반응의 지수적 진행은 정량화에 문제를 초래하고; 샘플 및 반응 용액은 외부로부터 쉽게 오염되어 잘못으로 혼합된 핵산이 주형으로서 기능하게 한다 (참조: R. K. Saiki, et al. 1985. Science 230, 1350-1354). 다른 PCR-기반 증폭 기술, 예를 들어, 전사-기반 증폭 (D. Y. Kwoh, et at. 1989. Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177), 리가제 연쇄 반응 (LCR; D. Y. Wu, et al. 1989. Genomics 4, 560-569; K. Barringer, et al. 1990. Gene 89, 117-122; F. Barany. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193), 및 제한 증폭 (미국 특허 번호 제5,102,784호)은 유사하게 온도 사이클링을 요구한다.

많은 NAAT는 표적 주형 DNA 또는 RNA 분자의 등온 증폭을 가능하게 하는 가닥 치환 중합효소 (SD pol)를 사용한다. SD pol의 공통 특성은 더 높은 진행성 및 가닥 치환을 일으키는 프라이머:주형 복합체에 대한 중합효소의 더 높은 친화성이다. 가닥 치환은 다양한 등온 증폭 전략 예컨대 루프 매개 증폭 (LAMP), 가닥 치환 증폭 (SDA), 교차 프라이밍 증폭 (CPA), 롤링 써클 증폭 (RCA) 및 초분지형 RCA (HRCA), 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 및 헬리카제 의존적 증폭에서 이용된다. 많은 이들 NAAT는 진단 적용분야에서 사용을 위해 높은 감도 및 특이성으로 병원체 DNA를 검출하는데 사용된다.

광범위하게 사용되지만, LAMP는 아마도 상이한 DNA 중합효소 (전형적으로 PCR에서 처럼 Taq 중합효소보다는 Bst DNA 중합효소)의 사용에 기인하여, 복합 샘플 예컨대 혈액 중에서 억제제에 대해 PCR에 비해 덜 민감한 것으로 관찰되었다. LAMP는 주로 진단 또는 검출 기술로서 유용하지만, 클로닝 또는 PCR에 의해 가능한 수많은 다른 분자 생물학 적용분야에 유용하지 않다.

이들 및 다른 중합효소 기반 NAAT에 의한 공통 문제는 바람직하지 않은 중합효소-기반 프라이머-단독 반응이 표적 주형 유래의 관심 반응과 경쟁하는 비특이적 증폭 산물의 형성을 초래할 수 있다는 것이다. 중합효소-기반 프라이머 유래된 거짓 양성 반응의 출현을 지연시키고 경향을 감소시키기 위해 서로와의 강력하게 안정화된 상호작용을 갖는 프라이머를 배제하기 위한 노력을 프라이머의 디자인 동안 기울여왔다. 더 나아가서, 프라이머 디자인의 과정을 용이하게 하는 소프트웨어 어플리케이션이 사용되고, 이들 조치에도 불구하고, 많은 상이한 프라이머 세트를 사용하는 광범위한 스크리닝 반응은 주형에 의한 참 양성 (TTP)과 비교하여 비주형 거짓 양성 (NTFP)의 충분하게 느린 출현을 갖는 것을 찾는 것이 필요하다. 고유한 문제는 충분한 시간이 주어지면, 모든 등온성 NAAT가 NTFP를 일으킬 것이라는 것이다. 바람직하지 않은 비주형 거짓 양성 (NTFP) 증폭 산물을 감소시키는 조성물, 방법, 및 시스템에 대한 충족되지 않은 요구가 여전히 존재한다.

본 명세서에 기술된 발명은 이들 해결되지 않은 도전 및 요구를 충족시킨다. 하기 본 명세서에서 상세하게 기술되는 바와 같이, 본 명세서에 기술된 본 발명의 신규한 구현예는 상이한 접근법을 사용하여 비특이적 증폭 산물을 억제하거나 또는 감소시킨다. 본 발명은 반응 감도 및 특이성에 대한 유의한 개선을 포함하고, 더 적은 수의 프라이머 디자인을 개발하고 증폭 반응에 대해 스크리닝할 수 있게 하는, 다른 이득을 갖는다.

본 명세서에 기술되고 청구되는 발명은 제한없이, 발명의 내용에 기재되거나 또는 기술되거나 또는 참조된 것들을 포함하여 많은 속성 및 구현예를 갖는다. 본 명세서에 기술되고 청구된 발명은 제한이 아니라 오직 예시의 목적으로 포함되는, 이러한 발명의 내용에서 확인되는 특성 또는 구현예에 대해서, 또는 그에 의해서 제한되지 않는다.

본 발명의 양태는 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하고 샘플로부터 비-주형 분자의 증폭을 감소시키기 위한 조성물, 방법, 및 시스템에 관한 것이다.

따라서, 일 양태에서, 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하고 샘플로부터 비-주형 분자의 증폭을 감소시키는 방법이 본 명세서에서 기술되고 제공된다. 예시적인 구현예는 i) 주형을 포함하는 핵산 샘플; 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트(들); 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들); 중합효소; 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물을 인큐베이션시키는 단계, ii) 주형을 증폭시키는 단계를 포함하고, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 단계 i) 및/또는 단계 ii)에서 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 단계 ii)에서 비특이적 증폭 산물을 감소시킨다.

상기 예시적인 구현예의 추가 구현예는 종종 증폭된 주형의 양을 정량하는 단계를 포함한다. 주형 핵산 샘플은 전형적으로, 필수적이지는 않지만, 이들 예시적인 구현예에서 표적 핵산을 포함한다. 상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)에 비해서 길이가 더 크다. 상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 제2 프라이머 세트는 주형과 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과 2개의 미스매치된 뉴클레오티드를 갖는다. 상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)에 비해서 조성물 중 주형에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다. 상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 변형되거나 또는 비천연인 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 변형된 골격 또는 변형된 3' 말단 뉴클레오티드를 갖는다.

상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 증폭 단계 ii)에서, 변형된 3' 말단 뉴클레오티드는 하나 이상의 제1 프라이머 세트를 포함하는 산물의 증폭량에 비해서 하나 이상의 제2 프라이머 세트를 포함하는 산물의 증폭량을 감소시킨다. 상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 200%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 50%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 40%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 30%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 100%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 70%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 50%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 40%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 30%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 20% 내지 70%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 30% 내지 60%, 또는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 40% 내지 50%이다. 상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트의 총 중량%의 15% 내지 25%이다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트의 총 중량%의 5% 내지 30%이다.

상기 기술된 예시적인 구현예의 많은 변형에서, 반응 혼합물은 루프-매개 (LAMP) 반응 혼합물, 가닥 치환 반응 혼합물 (SDS), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 핵산의 등온 키메라 증폭 (ICAN), SMart 증폭 방법 (SMAP), 키메라 치환 반응 (RDC), (지수적)-롤링 써클 증폭 (지수적-RCA), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 전사 매개 증폭 (TMA), 및 헬리카제 의존적 증폭 (HAD) 및 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA)으로부터 선택되는 증폭 반응 혼합물이다. 일정 구현예에서, 중합효소는 가닥-치환 중합효소 및 열안정성 중합효소로부터 선택된다.

본 발명의 다른 양태에서, 조성물이 제공된다. 본 발명에 따른 조성물의 예시적인 구현예는 a) 주형을 포함하는 핵산 샘플; b) 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트; c) 하나 이상의 제2 프라이머 세트; d) 중합효소; 및 e) 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하고, 여기서 조성물은 i) 증폭 조건 하에 위치될 때 주형을 증폭시킬 수 있고, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 ii) 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트의 포함은 주형이 증폭될 때 비특이적 증폭 산물을 감소시킨다. 상기 구현예에서, 조성물은 필수적이지는 않지만, 전형적으로, 반응 혼합물을 포함한다. 필수적이지 않지만, 전형적으로, 주형 핵산 샘플은 표적 핵산을 포함한다. 예시적인 주형 핵산 샘플은 게놈 DNA를 포함한다.

다른 양태에서, 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위한, 장비, 시스템 등이 제공된다. 핵산 증폭을 수행하기 위한 장비 및 시스템의 예시적인 구현예는 i) 증폭 조성물 또는 반응 혼합물의 증폭 반응을 수행하기 위한 중심 챔버를 포함하고, 상기 증폭 반응 혼합물은 a) 주형을 포함하는 핵산 샘플; b) 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트(들); c) 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들); d) 중합효소; 및 e) 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하고, 시스템에서 수행되는 증폭 반응 동안, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 비특이적 증폭 산물을 감소시키며, 임의로, 중심 챔버는 하나 이상의, ii) 하나 이상의 추가 증폭 반응이 일어나는 추가 챔버; iii) 적어도 2개의 2차 반응의 증폭 속도를 실시간으로 검출하고 비교하기 위한 기구; 및 임의로 iv) 시스템에서 핵산 증폭 및 실시간 검출 방법을 수행하기 위한 반응 혼합물 및 시약과 연통한다.

다른 양태에서, 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하기 위한 키트가 본 명세서에서 기술된다. 이러한 키트는 본 명세서에 기술된 임의의 장비, 조성물, 및 시스템을 포함할 수 있고 본 명세서에 기술된 임의의 방법에서 이용될 수 있다. 따라서, 일정 구현예는 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하고 샘플로부터 비-주형 분자의 증폭을 감소시키기 위한 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 명세서에 기술되는 다른 구현예는 다중 핵산 증폭 및 실시간 검출 방법에 관한 것이다. 방법의 예시적인 2-단계 구현예는 a) 관심 영역을 갖는 주형을 포함하는 표적 핵산 샘플, 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트, 하나 이상의 제2 프라이머 세트, 중합효소, 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; b) 관심 영역을 증폭시키기 위해 제1 반응 (1-단계 반응)을 수행하여, 제1 앰플리콘을 형성시키는 단계; c) 적어도 2개의 제2 반응으로 (b)를 나누고, 반응 중 적어도 하나에, 1차 앰플리콘 내에 존재할 수 있는 부위-특이적 프라이머 결합 부위에 상보성이고 관심 영역 내 관심 부위를 한정하는 하나 이상의 부위-특이적 2차 프라이머를 포함시키는 단계; 및 d) 제2 반응 (2-단계 반응)을 수행하여, 부위-특이적 프라이머 결합 부위가 부위-특이적 프라이머에 상보성인 경우에만 관심 영역의 증폭을 가속시키는 단계; 및 e) 적어도 2개 제2 반응의 증폭 속도를 검출 및 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 제2 프라이머와의 반응에서 증폭의 증강된 상대적 속도는 제2 프라이머에 상보성인 관심 부위의 존재를 의미한다.

도 1은 등온성 LAMP 반응에 차단형 올리고의 적용을 도시한다.
도 2는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)를 표적으로 하는 LAMP 반응을 도시한다. C_alb1은 칸디다 알비칸스의 18s rRNA 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각 조건에 대한 96웰 qPCR 플레이트 상에서 참 양성 (씨. 알비칸스 DNA의 2000 게놈) 및 음성 웰의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보여주는 웰의 빈도인 % NTP 빈도를 표시한다. 비차단형 본래 프라이머 세트와 조합된 다양한 농도의 차단형 프라이머 (3' 포스페이트 차단기를 갖는 전체 길이 프라이머)를 시험하여 차단형 프라이머에 대한 비차단형의 농도 증가의 효과를 결정하였다. MS 14 (양성 LAMP 대조군, 2000 게놈 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobaterium smegmatis) 함유) 및 Bst2.0 (24 유닛)이 또한 반응에 첨가되어서, 양성 대조군으로서 제공되었다.
도 3은 칸디다 알비칸스 8mer 차단형 Cq 분포를 도시한다. C_alb1은 칸디다 알비칸스의 18s rRNA 유전자를 표적으로 하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각 조건에 대한 96웰 qPCR 플레이트 상에서 참 양성 (씨. 알비칸스 게놈 cDNA의 2000 게놈) 및 음성의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보여주는 웰의 빈도인 % NTP 빈도를 표시한다. 비차단형 본래 프라이머 세트와 조합된 다양한 농도의 차단형 프라이머 (포스페이트 3' 차단기를 갖는 8mer 프라이머, C_Albl_8merP)를 시험하여 차단형 프라이머에 대한 비차단형의 최적 농도를 결정하였다.
도 4는 칸디다 알비칸스에서 다양한 차단형 올리고뉴클레오티드 농도의 효과를 예시한다. C_Alb1은 칸디다 알비칸스의 18s rRNA 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 표준 LAMP 반응에 첨가된 추가적 C_Alb_P, 3' 차단형 올리고 (3' 포스페이트)를 비롯하여 추가적 C_Alb_P, 3' 차단형 올리고를 함유하지 않은 단지 활성 C_Alb 프라이머만 존재하는 대조군의 백분율을 표시한다. Y 축은 가장 느린 참 양성 및 가장 빠른 비-주형 거짓 양성 간 Cq 갭 (ΔCq)을 표시한다. PCR 대조군 (2000 게놈 마이코박테리움 스메그마티스를 함유하는, C_Alb1에 대한 차단형 올리고에 의해 영향받지 않는 양성 LAMP)은 또한 반응에 첨가되어, 양성 반응 대조군으로서 제공되었다.
도 5는 칸디다 알비칸스에서 가장 느린 양성 및 가장 빠른 NTP 간 Cq 갭 및 양성 속도에 대한 효과를 예시한다. C_alb1은 칸디다 알비칸스의 18s rRNA 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 C_alb_8merP가 없는 대조군 (비차단형)을 비롯하여, 시험된, C_alb_8merP (차단형)의 각 농도를 표시한다. Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시하고, 제2 Y 축은 가장 느린 참 양성 및 가장 빠른 비-주형 양성 웰 간 Cq 갭을 표시한다.
도 6은 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae)에서 차단형 전체 길이 올리고뉴클레오티드의 효과를 도시한다. KPC2f는 클렙시엘라 뉴모니아에의 KPC2 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각 조건에 대한 96웰 qPCR 플레이트 상에서 참 양성 (2000 게놈 클렙시엘라 뉴모니아에 (KPC2+)) 및 음성의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보여주는 웰의 빈도인 % NTP 빈도를 표시한다. 비차단형 본래 프라이머 세트와 조합된 다양한 농도의 차단형 프라이머 (3' 포스페이트 차단기를 갖는 전체 길이 프라이머, KPC2f_P)를 시험하여 차단형 프라이머에 대해서 비차단형의 최적 농도를 결정하였다.
도 7은 클렙시엘라 뉴모니아에에서 차단형 8mer 올리고뉴클레오티드의 효과를 도시한다. KPC2f는 클렙시엘라 뉴모니아에의 KPC2 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각 조건에 대한 96웰 qPCR 플레이트 상에서 양성 및 음성 웰의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보이는 웰의 빈도인 % NTP 빈도이다. 비차단형 본래 프라이머 세트와 조합된 다양한 농도의 차단형 프라이머 (3'포스페이트 차단기를 갖는 8mer 프라이머, KPC2f_8merP)를 시험하여 차단형 프라이머에 대한 비차단형의 최적 농도를 결정하였다.
도 8은 차단형 올리고뉴클레오티드 길이를 변화시키는 효과를 도시한다. KPC2f는 클렙시엘라 및 이. 콜라이 (E. coli)의 KPC2 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 클렙시엘라 슈도모나스의 2000 게놈 (KPC2+) DNA를 함유하는 KPC2 양성 참 양성 LAMP 반응의 Cq를 비롯하여 각 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 비주형 거짓 양성 웰 (NTP)에 대한 빈도 및 NTP Cq를 표시한다. 좌측 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 각각의 도트는 단일 웰 Cq를 나타낸다. 거짓 양성 (비-주형 양성, NTP)의 빈도는 x 기호로 표시되고 우측 Y 축은 % 빈도를 표시한다. 3' 포스페이트 차단기, 및 8 nt (KPC2_8merP), 10 nt (KPC2_10merP), 및 12 nt (KPC2_12merP)로 다양한 올리고 길이를 갖는 KPC2f 올리고들은 표시된 100% 표준 비차단형 올리고와 함께 표준 LAMP 올리고 농도의 50%로 첨가되었다.
도 9는 올리고뉴클레오티드의 3' 차단기 화학을 다양화시킨 효과를 도시한다. C2_fsl은 클렙시엘라 및 이. 콜라이의 KPC2 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 클렙시엘라 슈도모나스의 2000 게놈 (KPC2+)을 함유하는 KPC2 양성 참 양성 LAMP 반응의 Cq를 비롯하여 각 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 비주형 거짓 양성 웰 (NTP)에 대한 빈도 및 NTP Cq를 표시한다. 좌측 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 각각의 도트는 단일 웰 Cq를 나타낸다. 거짓 양성 (비주형 양성, NTP)의 빈도는 x 기호로 나타내고 우측 Y 축은 % 빈도를 표시한다. 3' 포스페이트 차단기 (KPC2_P), 3' 3 탄소 (KPC2_3C3) 또는 추가적 3' 디데옥시 C 염기 차단기 (KPC_ddp)를 갖는 전체 길이 올리고는 표시된 100% 표준 비차단형 올리고와 함께 표준 LAMP 올리고 농도의 50%로 첨가되었다.
도 10은 vanA 유전자를 표적화하는 LAMP 반응에서 차단형 올리고뉴클레오티드의 효과를 도시한다. VanA5는 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium)의 vanA 유전자 (vanA+)를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 양성 및 음성 웰의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보이는 웰의 빈도인 % NTP 빈도를 표시한다. 비차단형 본래 프라이머 세트와 조합된 다양한 농도의 차단형 프라이머 (포스페이트 차단기를 갖는 전체 길이 프라이머, VanA5_P)를 시험하여 차단형 프라이머에 대한 비차단형의 최적 농도를 결정하였다. 3' 포스페이트 차단기를 갖는 Van5_P 올리고는 100% 표준 차단형 Van5_P 프라이머와 함께 표준 LAMP 올리고 농도의 50%로 첨가되었다 (Van5_P 50%).
도 11은 vanA 유전자에서 8mer 올리고뉴클레오티드에 대한 차단의 효과를 도시한다. VanA5는 엔테로코커스 패시움의 vanA 유전자 (vanA+)를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 양성 및 음성 웰의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보이는 웰의 빈도인 % NTP 빈도를 표시한다. 비차단형 본래 프라이머 세트와 조합된 다양한 농도의 차단형 프라이머 (포스페이트 차단기를 갖는 8mer 프라이머, VanA5_8merP)를 시험하여 차단형 프라이머에 대한 비차단형의 최적 농도를 결정하였다.

본 발명의 다양한 양태는 이제 하기 섹션을 참조하여 설명될 것이며 이것이 오직 예시로 제공되고 본 발명의 범주에 대한 제한을 구성하는 것이 아님을 이해할 것이다.

"상보성"은 전통적인 왓슨-크릭 또는 다른 비전통적인 유형에 의해 다른 핵산 서열과 혼성화하거나 또는 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, "혼성화"는 그 서열이 복합 혼합물 (예를 들어, 전체 세포)에 존재할 때 DNA 또는 RNA를 포함하여, 저, 중, 고 엄격 조건 하에서 오직 특정 뉴클레오티드 서열에 대한 분자의 결합, 이중화, 또는 혼성화를 의미한다. 예를 들어, [Ausubel, et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1993]을 참조한다. 폴리뉴클레오티드의 일정 위치에서 뉴클레오티드가 역-평행 DNA 또는 RNA 가닥에 동일 위치에서 뉴클레오티드와 왓슨-크릭 쌍을 형성할 수 있다면, 폴리뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA 분자는 그 위치에서 서로에 대해 상보성이다. 폴리뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA 분자는 바람직한 과정에 영향을 미치기 위해서 서로 혼성화 또는 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드가 각 분자 내 충분한 수의 해당 위치를 차지할 때 서로에 대해 "실질적으로 상보성"이다. 상보성 서열은 상보성 사슬의 합성 기원으로서 제공되는 3'-말단을 제공하기 위해서 엄격 조건 하에서 어닐링할 수 있는 서열이다.

당분야에 공지된 바와 같은, "동일성"은 서열을 비교하여 결정되는, 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 둘 이상의 폴리펩티드 서열 간 관계성이다. 당분야에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 스트링 간 매치로 결정되는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 제한없이, 하기 문헌들에 기술된 것들을 포함하여, 공지된 방법으로 쉽게 계산할 수 있다: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo, H., and Lipman, D., Siam J. Applied Math., 48:1073 (1988). 또한, 동일성 비율에 대한 값은 Vector NTI Suite 8.0의 AlignX 성분 (Informax, Frederick, Md.)에 대한 디폴트 설정을 사용해 생성된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 정렬로부터 수득될 수 있다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험된 서열 간 최대 매치를 제공하도록 디자인된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공공으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 2개 서열 간 동일성 및 유사성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 출처로부터 공공으로 입수가능하다 (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBINLM NIH Bethesda, Md. 20894: Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). 충분히 공지된 스미스 워터만 (Smith Waterman) 알고리즘이 또한 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다.

용어 "증폭시킨다", "증폭시키는", "증폭 반응", 또는 "NAAT" 및 그들 변형은 일반적으로 핵산 분자의 적어도 일부분 (주형 핵산 분자라고 함)이 적어도 하나의 추가적 핵산 분자로 복제되거나 또는 복사되는 임의의 작용 또는 과정을 의미한다. 추가적 핵산 분자는 임의로 주형 핵산 분자의 적어도 일부 부분에 실질적으로 동일하거나 또는 실질적으로 상보성인 서열을 포함한다. 주형 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고 추가적 핵산 분자는 독립적으로 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭은 핵산 분자의 적어도 일부 부분에 상보성인 핵산 서열의 적어도 하나의 카피의 생산 또는 핵산 분자의 적어도 일부 부분의 적어도 하나의 카피의 생산을 위한 주형-의존적 시험관내 효소-촉매 반응을 포함한다. 증폭은 임의로 핵산 분자의 선형 또는 지수적 복제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 증폭은 등온 조건을 사용하여 수행되고; 다른 구현예에서, 이러한 증폭은 열순환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭은 단일 증폭 반응에서 다수의 표적 서열의 동시 증폭을 포함하는 다중 증폭이다. 표적 서열의 적어도 일부는 단일 증폭 반응에 포함되는 상이한 표적 핵산 분자 또는 동일한 핵산 분자 상에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, "증폭"은 단독으로, 또는 조합하여, DNA- 및 RNA-기반 핵산의 적어도 일부 부분의 증폭을 포함한다. 증폭 반응은 단일 또는 이중-가닥 핵산 기질을 포함할 수 있고 당업자에게 공지된 임의의 증폭 방법을 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 포함한다. 본 발명에서, 용어 핵산의 "합성" 및 "증폭"이 사용된다. 본 발명에서 핵산의 합성은 합성의 기원으로서 제공되는 올리고뉴클레오티드로부터 핵산의 연장 또는 확장을 의미한다. 이러한 합성뿐만 아니라 다른 핵산의 형성 및 이렇게 형성된 핵산의 연장 또는 확장 반응이 연속적으로 일어나면, 일련의 이들 반응은 포괄적으로 증폭이라고 한다.

용어 "표적 프라이머" 또는 "표적-특이적 프라이머" 및 이의 변형은 결합 부위 서열에 상보성인 프라이머를 의미한다. 표적 프라이머는 일반적으로 표적 핵산 서열에 적어도 부분적으로 상보성인 적어도 하나의 서열을 포함하는, 단일 가닥 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 전형적으로 올리고뉴클레오티드이다.

"전방향 프라이머 결합 부위" 및 "역방향 프라이머 결합 부위"는 전방향 및 역방향 프라이머가 결합하는 주형 DNA 및/또는 앰플리콘 상의 영역을 의미한다. 프라이머는 증폭 동안 지수적으로 증폭되는 본래 주형 폴리뉴클레오티드의 영역을 한정하도록 작용한다. 일부 구현예에서, 추가적 프라이머는 전방향 프라이머 및/또는 역방향 프라이머의 5' 영역에 결합할 수 있다. 이러한 추가적 프라이머가 사용되는 경우에, 전방향 프라이머 결합 부위 및 또는 역방향 프라이머 결합 부위는 이들 추가적 프라이머의 결합 영역을 비롯하여 프라이머 그 자체의 결합 영역을 포괄할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 방법은 전방향 및/또는 역방향 프라이머 결합 영역의 5'에 놓인 영역에 결합하는 하나 이상의 추가적 프라이머를 사용할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, "치환 프라이머" 또는 "외부 프라이머"의 사용을 개시하는, W00028082에 개시되었다.

일부 구현예에서, 증폭은 단일 증폭 반응에서 다수의 표적-특이적 프라이머쌍을 사용해 수행될 수 있고, 여기서 각각의 프라이머쌍은 전방향 표적-특이적 프라이머 및 역방향 표적-특이적 프라이머를 포함하고, 각각은 샘플 내 해당 표적 서열과 실질적으로 상보성이거나 또는 실질적으로 동일한 적어도 하나의 서열을 포함하고, 각각의 프라이머쌍은 상이한 해당 표적 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 증폭 반응에 존재하는 임의의 다른 표적-특이적 프라이머에 대해 이의 3' 말단 또는 이의 5' 말단에 실질적으로 비-상보성일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 증폭 반응에서 다른 표적-특이적 프라이머에 대해 최소의 교차 혼성화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 증폭 반응 혼합물에서 비-특이적 서열에 대해 최소의 교차-혼성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 최소의 자가-상보성을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 3' 말단에 위치된 하나 이상의 절단가능한 기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 표적-특이적 프라이머의 대략 중심 뉴클레오티드 또는 그 근처에 위치되는 하나 이상의 절단가능한 기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적-특이적 프라이머는 표적-특이적 프라이머의 5' 말단에 오직 절단불가능한 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 특이적 프라이머는 임의로 동일한 증폭 반응에서, 하나 이상의 상이한 표적-특이적 프라이머와 비교하여 프라이머의 3' 말단 또는 5' 말단에 최소 뉴클레오티드 서열 중폭을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 반응 혼합물에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의, 표적-특이적 프라이머는 하나 이상의 상기 구현예를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 반응 혼합물에서 다수의 표적-특이적 프라이머의 실질적으로 전부는 하나 이상의 상기 구현예를 포함한다.

둘 이상의 핵산 서열을 언급하여 사용될 때 본 명세서에서 사용되는 용어 "동일성" 및 "동일한" 및 그들 변형은 둘 이상의 서열 (예를 들어, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열)의 서열에서 유사성을 의미한다. 둘 이상의 상동성 서열의 상황에서, 서열 또는 이의 하위서열의 동일성 또는 상동성 비율은 동일한 모든 단량체 유닛 (예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 비율을 의미한다 (즉, 약 70% 동일성, 바람직하게 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성). 동일성 비율은 비교 윈도우 상에서 최대 상응도에 대해 비교 및 정렬될 때 특정 영역 상에서, 또는 이하 기술된 디폴트 매개변수에 의한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해서 측정되는 지정 영역 상에서 존재할 수 있다. 서열은 아미노산 수준에서 또는 뉴클레오티드 수준에서 적어도 85% 동일성이 존재할 때 "실질적으로 동일"하다고 한다. 바람직하게, 동일성은 적어도 약 25, 50, 또는 100 잔기의 길이인 영역 상에서, 또는 적어도 하나의 비교되는 서열의 전체 길이 전반에서 존재한다. 서열 동일성 및 서열 유사성의 비율을 결정하기 위한 전형적인 알고리즘은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로서, [Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)]에 기술된 것들이다. 다른 방법은 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)], 및 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)] 등의 알고리즘을 포함한다. 2개 핵산 서열이 실질적으로 동일한 다른 표시는 2개 분자 또는 그들 상보체가 엄격 혼성화 조건 하에서 서로에 혼성화한다는 것이다.

적용된 증폭 기술에 의해 생산된 폴리핵산은 "앰플리콘" 또는 "증폭 산물"로서 총칭적으로 지칭된다. 생산된 앰플리콘의 성질은 실시되는 NAAT에 의존하여 유의하게 다양하다. 예를 들어, NAAT 예컨대 PCR은 실질적으로 동일한 크기 및 서열인 앰플리콘을 생산할 수 있다. 다른 NAAT는 매우 다양한 크기의 앰플리콘을 생산하고 여기서 앰플리콘은 상이한 수의 반복된 서열로 구성되어서 앰플리콘은 상이한 길이의 콘카타머의 집합체이다. 이러한 콘카타머로부터의 반복되는 서열은 수행되는 어세이의 대상인 폴리핵산의 서열을 반영하게 될 것이다. 본 명세서에서, 단순 표현 "5'-측면" 또는 "3'-측면"은 주형으로서 제공되는 핵산 사슬의 것을 의미하고, 5' 말단은 일반적으로 포스페이트 기를 포함하고 3' 말단은 일반적으로 유리--OH 기를 포함한다.

일 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 발명은 NATT, 예컨대, 예를 들어, 통상의 증폭 기술 예컨대 등온성 증폭 기술에서 비특이적 증폭 산물의 발생을 감소시켜서 NAAT의 성능 및/또는 특이성을 증가시키는 것에 관한 것이다.

예시적인 구현예에서, 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하고 샘플로부터 비-주형 분자의 증폭을 감소시키는 방법은 i) 하기를 포함하는 핵산 샘플을 포함하는 조성물을 인큐베이션시키는 단계: 주형; 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트(들); 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들); 중합효소; 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트; ii) 주형을 증폭시키는 단계로서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물에 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 비특이적 증폭 산물을 감소시키는 것인 단계; 및 iii) 증폭된 주형의 양을 정량하는 단계를 포함한다.

일부 바람직한 구현예에서, 상기 단계 ii)의 증폭 반응은 등온성이다. 일부 구현예에서, 증가된 성능, 증가된 특이성, 및/또는 비특이성 증폭 산물의 감소된 생산을 갖는, 단일-단계 등온성 증폭 방법이 제공된다. 일정한 이들 구현예에서 사용되는 등온성 반응의 특정 유형은 본 명세서에 기술된 임의의 등온성 NAAT (iNAAT)일 수 있다. 다른 구현예에서, 증가된 성능, 증가된 특이성, 및 또는 비특이적 증폭 산물의 감소된 생산을 갖는, 단일-단계 비-등온성 NAAT (예를 들어, PCR)가 제공된다. 비-등온성 증폭 반응 예컨대 PCR에서 증폭의 개별 사이클은 증폭의 '단계'로 간주되지 않고 따라서 비-등온성 다수 사이클 증폭 반응은 본 명세서에서 다수-단계 증폭으로 간주되지 않는다.

일부 구현예에서, 1회 초과의 증폭이 수행되고 별도 증폭은 본 명세서에서 단계 또는 증폭 단계라고 지칭된다. 달리 분명하게 표현되지 않으면, 본 명세서에서 기술되는 임의의 증폭 기술 또는 NAAT는 본 명세서에 기술된 증폭 반응의 성능 및 특이성을 증가시키는 방법의 일부 구현예에서 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 등온 유형의 증폭 반응 예컨대 LAMP는 비-등온성 증폭 예컨대 PCR, 또는 다른 예로서, 다른 등온성 증폭 예컨대 헬리카제 의존적 증폭 (HAD) 반응과 조합될 수 있다. 순차적으로 첫번째로 수행되는 증폭은 1-단계 증폭 반응이고, 순차적으로 두번째로 수행되는 증폭은 2-단계 증폭 반응이라고 하고, 순차적으로 세번째로 수행되는 증폭은 3-단계 증폭 반응 등이라고 한다. 본 발명자는 NAAT의 임의의 조합을 본 명세서에 기술되고 제공되는 본 발명의 2-단계, 3-단계, 4-단계, 또는 다른 다수-단계 증폭 구현예에서 사용할 수 있다.

다수의 등온성 증폭 기술 (iNAAT)은 본 발명의 구현예에서 이용될 수 있다. 많은 이들 접근법은 상기에 언급되고, 일부는 특히 상세한 설명에 기술될 것이다. 등온성 증폭 기술은 전형적으로 가닥-치환 활성을 갖는 DNA 중합 효소를 이용하여서, PCR에 필요한 고온 용융 사이클을 제거시킨다. 이것은 등온성 기술이 PCR에 비해서 더 빠르게 더 에너지 효율적일 수 있게 하고, 또한 신속한 온도 사이클링이 요구되지 않으므로 더 단순하고 더 낮은 비용의 장비가 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 일부 방법은 통상의 iNAAT의 개선에 관한 것으로서, 예컨대 가닥 치환 증폭 (SDA; G. T. Walker, et at. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396; G. T. Walker, et al. 1992. Nuc. Acids. Res. 20, 1691-1696; 미국 특허 번호 제5,648,211호, 및 EP 0 497272로서, 모든 개시는 참조로 본 명세서에 편입됨); 자가-지속성 서열 복제 (참조로 본 명세서에 편입된, 3SR; J. C. Guatelli, et al. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878); 및 Q.beta. 레플리카제 시스템 (참조로 본 명세서에 편입된, P. M. Lizardi, et al. 1988. BioTechnology 6, 1197-1202)은 등온성 반응이다 (또한, 참조로 본 명세서에 편입된, Nucleic Acids Isothermal Amplificaiton Technologies--A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2008. v27(3):224-243).

일부 등온성 증폭 기술은 증폭 방법, 예를 들어 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA; 미국 특허 번호 제5,409,818호) 및 전사 매개 증폭 (TMA; 미국 특허 번호 제5,399,491호)의 일부로서 전사에 의존적인 한편 다른 것들은 헬리카제 또는 리콤비나제의 작용에 의존적인 것으로서 예를 들어 각각 헬리카제 의존적 증폭 (HDA; W02004027025) 및 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA; W003072805)이고, 다른 것들은 여전히 일정 DNA 중합 효소의 가닥 치환 활성에 의존적인 것으로서, 예를 들어 가닥 치환 증폭 (SDA; 미국 특허 번호 제 5,455,166), 루프-매개 등온성 증폭 (LAMP; W00028082, W00134790, W00224902), 키메라 치환 반응 (RDC; W09794126), 롤링 써클 증폭 (RCA; Lizardi, P. M. et al. Nature Genetics, (1998) 19.225-231), 핵산의 등온 키메라 증폭 (ICAN; WO0216639), SMart 증폭 방법 (SMAP; W02005063977), 선형 등온 다량체화 증폭 (LIMA; Isothermal Amplification and multimerization of DNA by Bst DNA Polymerase, Hafner G. J., Yang I. C., Wolter L. C., Stafford M. R., Giffard P. M, BioTechniques, 2001, vol. 30, no 4, pp. 852-867), 또한 미국 특허 번호 제6,743,605호 (본 명세서에서 '주형 재-프라이밍 증폭' 또는 TRA라고 함) 및 WO9601327 (본 명세서에서 '자가 확장 증폭' 또는 SEA라고 함)에 기술된 바와 같은 방법이다.

본 명세서에 기술된 방법은 비-등온성 기술을 포함한, 임의의 NAAT로 실시될 수 있다. 예를 들어, DNA 또는 RNA 증폭의 기지 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 관련 증폭 방법 (예를 들어, Mullis 등의 미국 특허 번호 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호; Tabor 등의 미국 특허 번호 제4,795,699호 및 제4,921,794호; Innis의 미국 특허 번호 제5,142,033호;Wilson 등의 미국 특허 번호 제5,122,464호; Innis의 미국 특허 번호 제5,091,310호; Gyllensten 등의 미국 특허 번호 제5,066,584호; Gelfand 등의 미국 특허 번호 제4,889,818호; Silver 등의 미국 특허 번호 제4,994,370호; Biswas의 미국 특허 번호 제4,766,067호; Ringold의 미국 특허 번호 제4,656,134호) 및 이중-가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티-센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭 (Malek 등의 미국 특허 번호 제5,130,238호로서, 상표명 NASBA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 참조의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 편입된다 (예를 들어, Ausubel, 상동; 또는 Sambrook, 상동).

예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열 및 관련 유전자를 직접적으로 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 증폭시키는데 사용될 수 있다. PCR 및 다른 시험관내 증폭 방법은 또한 예를 들어 발현시키려는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 코딩하거나, 샘플 중 바람직한 mRNA의 존재를 검출하기 위해서, 핵산 시퀀싱을 위해서, 또는 다른 목적을 위해서 프로브로서 사용하도록 핵산을 만드는데 유용할 수 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해서 당업자에게 알려주기에 충분한 기술의 예는 다음의 문헌에서 확인한다: Berger, 상동, Sambrook, 상동, 및 Ausubel, 상동을 비롯하여, Mullis 등, 미국 특허 번호 제4,683,202호 (1987); 및 [Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)]. 게놈 PCR 증폭을 위한 상업적으로 입수가능한 키트는 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Advantage-GC 게놈 PCR 키트 (Clontech)를 참조한다. 추가로, 예를 들어, T4 유전자 32 단백질 (Boehringer Mannheim)은 긴 PCR 산물의 산출을 개선시키는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 기술된 NAAT의 공통 특징은 그들이 프라이머 또는 프라이머의 세트의 작용을 통한 폴리핵산의 복사 및 역방향 프라이머 또는 프라이머의 세트에 의한 상기 복사의 재복사 둘 모두를 위해 제공된다는 것이다. 이것은 지수적 비율로 본래 폴리핵산의 카피의 생성을 가능하게 한다. 일반적으로 NAAT와 관련하여, 이러한 본래 핵산으로 만들어진 제1 카피, 이러한 본래 핵산으로 만들어진 카피의 제1 카피, 카피의 이러한 카피의 추가 카피로부터, 방법에 의해 검출되는 핵산의 물리적 조각을 구별하는데 도움이 된다. 그 기원이 그 자체로 분석되는 샘플에서 유래되는 것인 핵산은 "표적 핵산 주형"이라고 한다. 본 명세서에서 기술된 2-단계 구현예와 관련하여, 일반적으로, 항상은 아니지만, 1-단계 프라이머-의존적 증폭 반응은 2-단계 반응과 비교하여 비교적 느리다.

당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 프라이머-생성된 앰플리콘은 표적 핵산 주형의 반복된 증폭 반응을 통한 앰플리콘의 추가 생성을 비롯하여 앰플리콘 그 자체의 프라이밍을 일으킨다. 앰플리콘은 표적 주형과 조합으로 구성되는 것이 가능하다.

앰플리콘은 특정 NAAT에서 적용되는 프라이머에 의해 묘사되는 핵산의 영역을 넘어서 제1 프라이밍 부위로부터 표적 주형이 복사될 수 있으므로 매우 가변적인 길이일 수 있다. 일반적으로, 1-단계, 2-단계, 또는 다수 단계 NAAT 반응이건 무관하게, 본 명세서의 구현예에서 NAAT의 핵심 특징은 사용되는 프라이머에 의해 묘사되는 별개 길이일 수 있는 앰플리콘을 (반복된 증폭 반응 동안) 생성시키기 위해서 방법론에 의해 적용되는 다른 프라이머에 대해 앰플리콘을 이용가능하게 만들 수 있는 방법을 제공하는 것일 것이다. NAAT의 핵심 특징은 추가 카피를 생성시키기 위해서 앰플리콘이 역방향 프라이머에 의한 추가 프라이밍을 위해 이용가능한 방법이 제공되는 것이다. NAAT의 경우, 이후 생성 앰플리콘은 1세대 앰플리콘과 실질적으로 상이할 수 있고, 특히, 형성된 앰플리콘은 1세대 앰플리콘의 콘카타머일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 예시적인 표적 주형은 관심 폴리핵산의 증폭을 가능하게 하는 적합한 프라이머 결합 영역을 포함하는 임의의 폴리핵산을 포함한다. 당업자는 전방향 프라이머 결합 영역 및 역방향 프라이머 결합 영역이 각각 센스 및 안티센스 가닥 상에서 증폭시키려는 서열의 5'에 위치되는 방식으로 표적 주형 상에 위치될 필요가 있다는 것을 이해할 것이다. 표적 주형은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 표적 주형이 단일 가닥 폴리핵산인 경우에, 당업자는 표적 주형이 초기에 오직 하나의 프라이머 결합 영역을 포함할 것임을 이해할 것이다. 그러나, 제1 프라이머의 결합은 제2 프라이머 결합 영역을 함유하게 되는 상보성 가닥의 합성을 일으킬 것이다. 표적 주형은 RNA 분자로부터 유래될 수 있고, 이러한 경우에 RNA는 본 발명의 방법을 실시하기 전에 DNA로 전사될 필요가 있다. RNA를 전사하기 위해 적합한 시약은 당분야에 충분히 공지되어 있고, 역전사효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 생체중합체를 의미하고, 달리 표시하지 않으면, 변형 및 비변형 뉴클레오티드, 및 DNA 및 RNA, 및 변형된 핵산 골격을 포함한다. 예를 들어, 일정 구현예에서, 핵산은 펩티드 핵산 (PNA) 또는 잠금 핵산 (LNA)이다. 전형적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 증폭을 위한 핵산 주형으로서 DNA를 사용하여 수행된다. 그러나, 그 뉴클레오티드가 천연 DNA 또는 RNA로부터의 변형된 핵산 또는 인공 유도체로 치환된 핵산은 또한 상보성 사슬의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 한 본 발명의 핵산에 포함된다. 본 발명의 핵산은 일반적으로 생물학적 샘플에 함유된다. 생물학적 샘플은 동물, 식물, 또는 미생물 조직, 세포, 배양물, 및 분비물, 또는 그로부터의 추출물을 포함한다. 일정 양태에서, 생물학적 샘플은 세포내 기생충 게놈 DNA 또는 RNA 예컨대 바이러스 또는 마이코플라스마를 포함한다. 핵산은 상기 생물학적 샘플에 함유된 핵산으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 게놈 DNA, 또는 mRNA로부터 합성된 cDNA, 또는 생물학적 샘플로부터 유래된 핵산을 기반으로 증폭된 핵산이 바람직하게 기술된 방법에서 사용된다. 달리 표시되지 않으면, 올리고뉴클레오티드 서열이 표시될 때마다, 뉴클레오티드는 좌측에서 우측으로 5'에서 3'으로의 순서이고, "A"는 데옥시아데노신을 의미하고, "C"는 데옥시시티딘을 의미하고, "G"는 데옥시구아노신을 의미하고, "T"는 티미딘을 의미하고, "U"는 데옥시우리딘을 의미한다는 것을 이해할 것이다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 모노뉴클레오티드가 임의로 포스포디에스테르 또는 다른 적합한 연결을 통해서, 한 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 또는 균등한 기의 이의 이웃하는 뉴클레오티드의 3' 히드록실 또는 균등한 기에 부착을 통해 올리고뉴클레오티드를 형성하도록 반응하기 때문에 "5' 말단" 및 "3' 말단"을 갖는다고 한다.

예시적인 구현예에서 주형 핵산은 핵산 증폭 기술에서 상보성 사슬을 합성하기 위한 주형으로서 제공되는 핵산이다. 주형에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 상보성 사슬은 주형에 상응하는 사슬과 같은 의미를 갖지만, 2개 사이의 관련성은 단지 상대적이다. 즉, 본 명세서에 기술된 방법에 따라서, 상보성 사슬로서 합성된 사슬은 다시 주형으로서 기능할 수 있다. 즉, 상보성 사슬은 주형이 될 수 있다. 일정 구현예에서, 주형은 생물학적 샘플, 예를 들어, 식물, 동물, 바이러스, 미생물, 박테리아, 진균 등으로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 동물은 포유동물, 예를 들어 인간 환자이다.

주형 핵산은 전형적으로 하나 이상의 표적 핵산을 포함한다. 예시적인 구현예에서 표적 핵산은 샘플에 존재하는 것으로 기대되거나 또는 의심되는 임의의 핵산 서열을 포함하는, 본 개시에 따라서 증폭 또는 합성할 수 있는 임의의 단일 또는 이중-가닥 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 이중-가닥 형태로 존재하고, 표적-특이적 프라이머 또는 첨부된 어댑터의 첨가 전에, 증폭 또는 합성되는 특정 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보체의 적어도 일부분을 포함한다. 표적 서열은 증폭 또는 합성 반응에서 유용한 프라이머가 중합효소에 의한 확장 전에 혼성화할 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 용어는 그 서열 동일성, 뉴클레오티드의 순서 또는 위치가 본 개시의 하나 이상의 방법에 의해 결정되는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명의 일부 구현예에서, 핵산 주형을 포함하는 핵산 샘플을 갖는 조성물 (예를 들어, 반응 혼합물)은 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)와 인큐베이션된다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고 조성물 내 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 본 발명에 따라서 수행되는 NAAT에서 비특이적 증폭 산물을 감소시킨다. 길이, 상보성 정도, 및 당분야에 충분히 공지된 다른 인자 간 편차는 특정 프라이머가 특정 표적 핵산 또는 표적 주형에 대해 갖는 친화성을 비롯하여, 조성물 또는 반응 혼합물 중 다른 프라이머와 주형 핵산에 대한 결합에 대해 경쟁하는 특정 프라이머의 능력에 영향을 미칠 수 있다.

제1 프라이머 쌍 또는 세트 및 제2 프라이머 쌍 또는 세트 둘 모두는 전형적으로 적어도 샘플 중 핵산 주형에 상보성인 영역을 갖는다. 본 명세서에 기술된 조성물, 방법, 및 다른 발명에서 사용되는 NAAT 프라이머는 전형적으로 표적 서열을 포함하는 핵산 분자의 적어도 일부분과 적어도 75% 상보성 또는 적어도 85% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 90% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 95% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 98% 또는 적어도 99% 상보성이거나, 또는 동일하다. 이러한 예에서, 표적 프라이머 또는 표적-특이적 프라이머 및 표적 서열은 서로에 대해 "해당하는"으로 기술된다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 이러한 해당 표적 서열의 적어도 일부분 (또는 표적 서열의 상보체)에 혼성화할 수 있고; 이러한 혼성화는 임의로 표준 혼성화 조건 하에서 또는 엄격 혼성화 조건 하에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 표적 서열, 또는 이의 상보체에 혼성화할 수 없지만, 표적 서열을 포함하는 핵산 가닥의 일부, 또는 이의 상보체에 혼성화할 수 있다.

일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 표적 서열 그 자체의 적어도 일부분과 적어도 75% 상보성, 전형적으로 적어도 85% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 90% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 95% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 98% 상보성, 또는 보다 전형적으로 적어도 99% 상보성인 적어도 하나의 서열을 포함하고; 다른 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 표적 서열 이외의 핵산 분자의 적어도 일부분과 적어도 75% 상보성, 전형적으로 적어도 85% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 90% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 95% 상보성, 보다 전형적으로 적어도 98% 상보성, 또는 보다 전형적으로 적어도 99% 상보성인 적어도 하나의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 샘플에 존재하는 다른 표적 서열에 실질적으로 비상보성이고; 임의로, 표적-특이적 프라이머는 샘플에 존재하는 다른 핵산 분자에 실질적으로 비-상보성이다. 일부 구현예에서, 표적 서열 (또는 표적 서열의 상보체)을 포함하지 않거나 또는 그에 해당하지 않는 샘플에 존재하는 핵산 분자는 "비특이적" 서열 또는 "비특이적 핵산"이라고 한다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 이의 해당 표적 서열의 적어도 일부에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 디자인된다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 이의 해당 표적 서열을 포함하는 핵산 분자의 적어도 일부에 대해서 이의 전체 길이에 걸쳐서, 적어도 95% 상보성, 또는 적어도 99% 상보성이거나, 또는 동일하다. 일부 구현예에서, 표적-특이적 프라이머는 이의 해당 표적 서열의 적어도 일부에 대해서 이의 전체 길이에 걸쳐, 적어도 90%, 적어도 95% 상보성, 적어도 98% 상보성 또는 적어도 99% 상보성일 수 있거나, 또는 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 전방향 표적-특이적 프라이머 및 역방향 표적-특이적 프라이머는 주형-의존적 프라이머 확장을 통해서 표적 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있는 표적-특이적 프라이머 쌍을 정의한다.

다른 구현예에서, 프라이머는 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드 (즉, 결합 부위에 상보성이 아닌 염기)를 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, 프라이머는 프라이머가 어닐링되는 폴리핵산의 역가닥에 상보성이거나 또는 폴리핵산에 어닐링하지 않는 절편을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 프라이머는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직한 구현예에서, 프라이머는 2 내지 100 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 프라이머 길이는 약 10 내지 약 60 뉴클레오티드, 약 12 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 18 내지 50 뉴클레오티드 길이, 약 6 내지 50 뉴클레오티드 길이, 약 10 내지 약 40 뉴클레오티드 길이, 약 15 내지 약 40 뉴클레오티드 길이, 약 18 내지 40 뉴클레오티드 길이, 또는 상이한 길이의 범위이다. 전형적으로, 프라이머는 dNTP 및 중합효소의 존재 하에서 증폭 조건에 노출될 때 해당 표적 서열에 혼성화하여서 프라이머 확장을 겪을 수 있다. 일부 예에서, 특정 뉴클레오티드 서열 또는 프라이머의 일부분은 증폭 반응의 착수 시 알려지거나 또는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 방법으로 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머는 프라이머 내 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 절단가능한 기를 포함한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 제1 프라이머 쌍 또는 세트의 양은 제2 프라이머 쌍 또는 세트의 양에 비해 크다. 대표적인 구현예에서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 100%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 80%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 60%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 30%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 80%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 50%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 40%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 30%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 20% 내지 70%, 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 30% 내지 60%, 또는 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 40% 내지 50% (중량, 또는 몰농도)이다.

대안적인 구현에에서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 또는 반응물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체 (전체 프라이머)의 약 3%, 전체 프라이머의 약 4%, 전체 프라이머의 약 5%, 전체 프라이머의 약 6%, 전체 프라이머의 약 7%, 전체 프라이머의 약 8%, 전체 프라이머의 약 9%, 전체 프라이머의 약 10%, 전체 프라이머의 약 11%, 전체 프라이머의 약 12%, 전체 프라이머의 약 13%, 전체 프라이머의 약 14%, 전체 프라이머의 약 15%, 전체 프라이머의 약 17%, 전체 프라이머의 약 20%, 전체 프라이머의 약 25%, 전체 프라이머의 약 30%, 전체 프라이머의 약 35%, 전체 프라이머의 약 40%, 전체 프라이머의 약 45%, 전체 프라이머의 약 50%, 전체 프라이머의 약 55%, 전체 프라이머의 약 60%, 전체 프라이머의 약 65%, 전체 프라이머의 약 70%, 전체 프라이머의 약 75%, 전체 프라이머의 약 80%, 전체 프라이머의 약 90%, 또는 전체 프라이머의 약 95%이다.

일정 구현예에서 이용되는 프라이머의 특정한 수 및 유형은 비특이적 증폭 산물을 억제 또는 감소시키는 특정 구현예에서 이용되는 특정 NAAT에 의존적일 것이다. 특정 구현예는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 25, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 제1 증폭 프라이머 쌍 또는 세트를 갖는 반응 혼합물 또는 방법을 포함한다. 특정 구현예는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 25, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 제2 증폭 프라이머 쌍 또는 세트를 갖는 반응 혼합물 또는 방법을 포함한다.

여기서 사용되는 LAMP의 한 양상은 총 6개 프라이머를 요구한다: 2개 루프-생성 프라이머, 2개 치환 프라이머 및 2개 "루프 프라이머" (L_B 및 L_F). 따라서, 최적화된 NAAT로서 LAMP를 이용하거나 또는 적용하는 비특이적 증폭 산물을 억제 또는 감소시키는 구현예는 전형적으로 하나 초과의 프라이머 쌍 세트 및 종종 몇개의 프라이머 쌍 세트를 사용하게 될 것이다. 따라서 LAMP 어세이를 위한 프라이머 디자인은 표적 핵산 서열의 8개 별도 영역의 선택 (FIP 및 BIP 프라이머는 각각 2개 프라이머 결합 부위를 포괄)을 요구하고, BIP/FIP 및 루프 프라이머는 서로에 대한 그들 위치에 상당한 제한을 갖는다. "루프 프라이머"는 각각 B2 및 B1 부위 사이, 및 F2 및 F1 부위 사이에서 엄격하게 위치되어야만 하고, 하나의 특정한 방향으로 배향되어야 한다. 더 나아가서, 필요한 6개 프라이머 간에 프라이머-이량체를 피하기 위해서 프라이머 디자인에 상당한 주의를 기울여야만 한다 (FIP 및 BIP 프라이머는 일반적으로 40 뉴클레오티드 초과의 길이이므로 특히 어려움).

본 명세서의 구현예에서 사용되는 프라이머 및 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드는 제한없이, 중합효소에 선택적으로 결합될 수 있거나, 또는 그에 의해 중합될 수 있는, 임의의 천연 발생 뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 포함하여, 임의의 화합물을 포함한다. 필수적이지 않지만, 전형적으로, 중합효소에 대한 뉴클레오티드의 선택적 결합은 중합효소에 의한 핵산 가닥으로의 뉴클레오티드의 중합화가 후속되지만; 가끔, 뉴클레오티드는 본 명세서에서 "비-생산적" 사건이라고 지칭하는 사건인, 핵산 가닥으로의 도입없이, 중합효소로부터 해리될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드는 그들 구조와 무관하게, 중합효소에 선택적으로 결합할 수 있거나, 또는 그에 의해 중합될 수 있는, 비천연 뉴클레오티드분만 아니라 또한 임의의 유사체를 포함한다. 천연 발생 뉴클레오티드는 전형적으로 염기, 당, 및 포스페이트 모이어티를 포함하지만, 본 개시의 뉴클레오티드는 이러한 모이어티 중 어느 하나, 일부, 또는 전부가 결여된 화합물을 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 뉴클레오티드는 임의로 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 인 워자를 포함하는 인 원자의 사슬을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인 사슬은 당 고리의 임의의 탄소, 예컨대 5' 탄소에 부착될 수 있다. 인 사슬은 O 또는 S가 개재된 당에 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 사슬의 하나 이상의 인 원자는 P 및 O를 갖는 포스페이트 기의 일부일 수 있다. 다른 구현예에서, 사슬의 인 원자는 개재 O, NH, S, 메틸렌, 치환된 메틸렌, 에틸렌, 치환된 에틸렌, CNH₂, C(O), C(CH₂), CH₂CH₂, 또는 C(OH)CH₂R (여기서 R은 4-피리딘 또는 1-이미다졸일 수 있음)과 함께 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 사슬의 인 원자는 O, BH₃, 또는 S를 갖는 측면 기를 가질 수 있다. 인 사슬에서, O 이외의 측면 기를 갖는 인 원자는 치환된 포스페이트 기일 수 있다. 인 사슬에서, O 이외의 개재 원자를 갖는 인 원자는 치환된 포스페이트 기일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 일부 예는 Xu, 미국 특허 번호 제7,405,281호에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드는 표지를 포함하고 본 명세서에서 "표지된 뉴클레오티드"로서 지칭되고; 표지된 뉴클레오티드의 표지는 본 명세서에서 "뉴클레오티드 표지"라고 한다. 일부 구현예에서, 표지는 말단 포스페이트 기, 즉 당으로부터 가장 먼 포스페이트 기에 부착된 형광 모이어티 (예를 들어, 염료), 발광 모이어티 등의 형태일 수 있다. 개시된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 뉴클레오티드의 일부 예는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 폴리포스페이트, 데옥시리보뉴클레오티드 폴리포스페이트, 변형된 리보뉴클레오티드 폴리포스페이트, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 폴리포스페이트, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 메탈로뉴클레오시드, 포스포네이트 뉴클레오시드, 및 변형된 포스페이트-당 골격 뉴클레오티드, 전술한 화합물의 유사체, 유도체 또는 변이체 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드는 비-산소 모이어티 예컨대, 예를 들어, 티오- 또는 보라노-모이어티를, 뉴클레오티드의 알파 포스페이트 및 당, 또는 뉴클레오티드의 알파 및 베타 포스페이트, 또는 뉴클레오티드의 베타 및 감마 포스페이트를 가교하는 산소 모이어티의 위치에, 또는 뉴클레오티드의 임의의 다른 2개 포스페이트 사이, 또는 이의 임의의 조합에, 포함할 수 있다. "뉴클레오티드 5'-트리포스페이트"는 5' 위치에 트리포스페이트 에스테르 기를 갖는 뉴클레오티드를 의미하고, 때때로 리보스 당의 구조적 특징을 특별히 지정하기 위해서 "NTP", 또는 "dNTP" 및 "ddNTP"로 표시된다. 트리포스페이트 에스테르 기는 다양한 산소에 대한 황 치환, 예를 들어, α-티오-뉴클레오티드 5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 핵산 화학의 고찰을 위해, 다음의 문헌을 참조한다: Shabarova, Z. and Bogdanov, A. Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, VCH, New York, 1994.

다수의 핵산 중합효소는 핵산 가닥으로 뉴클레오티드 (이의 유사체 포함)의 중합을 촉매할 수 있는 임의의 효소를 포함하는, 본 명세서에 제공되는 일정 구현예에서 이용되는 NAAT에서 사용될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 중합은 주형-의존적 방식으로 일어날 수 있다. 이러한 중합효소는 제한없이 천연 발생 중합효소 및 이의 임의의 서브유닛 및 절두형, 돌연변이체 중합효소, 변이 중합효소, 재조합, 융합, 또는 달리 조작된 중합효소, 화학적으로 변형된 중합효소, 합성 분자 또는 조립체, 및 이러한 중합을 촉매하는 능력을 보유하는 이의 임의의 유사체, 유도체 또는 단편을 포함할 수 있다. 임의로, 중합효소는 다른 아미노산으로 하나 이상의 아미노산의 치환, 중합효소로부터 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 결실, 또는 둘 이상의 중합효소의 일부분의 연결을 포함한 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 중합효소일 수 있다. 전형적으로, 중합효소는 뉴클레오티드 결합 및/또는 뉴클레오티드 중합의 촉매가 일어날 수 있는 하나 이상의 활성 부위를 포함한다. 일부 예시적인 중합효소는 제한없이 DNA 중합효소 및 RNA 중합효소를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "중합효소" 및 이의 변이체는 또한 서로 연결된 적어도 2개 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 여기서 제1 부분은 핵산 가닥으로 뉴클레오티드의 중합을 촉매할 수 있는 펩티드를 포함하고 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 부분에 연결된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 리포터 효소 또는 지속성-증강 도메인을 포함할 수 있다. 임의로, 중합효소는 5' 엑소뉴클레아제 활성 또는 말단 트랜스퍼라제 활성을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합효소는 예를 들어 열, 화학물의 사용 또는 반응 혼합물로 중합효소의 새로운 양의 재첨가를 통해서, 임의로 재활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 중합효소는 임의로 재활성화될 수 있는 압타머-기반 중합효소 또는 핫-스타트 중합효소를 포함할 수 있다.

본 발명의 일정 구현예에서, 다중 핵산 증폭 및 실시간 검출 방법이 제공된다. 이러한 방법의 예시적인 구현예는 i) 관심 영역을 갖는 주형을 포함하는 표적 핵산 샘플, 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트, 하나 이상의 제2 프라이머 세트, 중합효소, 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; ii) 제1 반응을 수행하여 관심 영역을 증폭시켜서, 제1 앰플리콘을 형성시키는 단계; iii) (ii)를 적어도 2개의 제2 반응으로 나누고, 반응 중 적어도 하나에 제1 앰플리콘 내에 존재할 수 있고 관심 영역 내 관심 부위를 한정하는 부위-특이적 프라이머 결합 부위에 상보성인 하나 이상의 부위-특이적 제2 프라이머를 포함시키는 것인 단계; iv) 제2 반응 (2-단계 반응)을 수행하여 오직 부위-특이적 프라이머 결합 부위가 부위-특이적 프라이머에 상보성이면 관심 영역의 증폭을 가속시키는 단계; 및 v) 적어도 2개의 제2 반응의 증폭 속도를 검출 및 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 제1 프라이머 세트 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트의 포함은 주형이 증폭될 때 비특이적 증폭 산물을 감소시키고, 제2 프라이머에 의한 반응에서 증폭의 증강된 상대적 속도는 제2 프라이머에 상보성인 관심 부위의 존재를 의미한다. 여전히 추가 구현예는 다중 핵산 증폭 및 또는 실시간 검출 방법 예컨대 상기 방법의 변형과 함께 사용되는 본 명세서에 기술된 상기 및 다른 방법을 수행하기 위해 조정된 장비 및 시스템을 포함한다.

본 명세서에 기술되거나 또는 달리 당분야에 공지된 장비는 본 발명의 방법을 수행하도록 디자인된 것을 포함하여, 시스템의 조립을 위한 성분으로서 사용될 수 있다. 핵산 증폭을 수행하기 위한 시스템의 비제한적인 일 구현예는 i) 증폭 조성물 또는 반응 혼합물의 증폭 반응을 수행하기 위한 중심 챔버를 포함하고, 상기 증폭 반응 혼합물은 a) 주형을 포함하는 핵산 샘플; b) 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트(들); c) 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들); d) 중합효소; 및 e) 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하고, 시스템에서 수행되는 증폭 반응 동안, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 비특이적 증폭 산물을 감소시키고, 임의로, 중심 챔버는 하나 이상의, ii) 하나 이상의 추가적 증폭 반응이 일어나는 추가적 챔버; iii) 적어도 2개의 제2 반응의 증폭 속도를 실시간으로 검출 및 비교하기 위한 장비; 및 임의로 iv) 시스템에서 핵산 증폭 및 실시간 검출 방법을 수행하기 위한 시약을 포함하는 반응 혼합물과 연통한다.

본 발명의 다른 양태는 하기 예시적인 구현예에서 기술될 수 있다:

1. a) 주형을 포함하는 핵산 샘플; b) 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트; c) 하나 이상의 제2 프라이머 세트; d) 중합효소; 및 e) 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물로서, 조성물은 증폭 조건 하에 놓일 때 주형을 증폭시킬 수 있고, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트의 포함은 주형이 증폭될 때 비특이적 증폭 산물을 감소시킨다.

2. 구현예 1의 조성물에 있어서, 조성물은 반응 혼합물이다.

3. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 주형 핵산 샘플은 표적 핵산을 포함한다.

4. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 주형 핵산 샘플은 게놈 DNA이다.

5. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 약 10 내지 약 60 뉴클레오티드의 길이이다.

6. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 약 18 내지 약 50 뉴클레오티드의 길이이다.

7. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 약 6 내지 약 50 뉴클레오티드의 길이이다.

8. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 약 6 내지 약 12 뉴클레오티드의 길이이다.

9. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)에 비해 길이가 더 크다.

10. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 적어도 하나의 제2 프라이머 세트는 주형과 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 갖는다.

11. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과 2개의 미스매치된 뉴클레오티드를 갖는다.

12. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)에 비해서 조성물 중 주형에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다.

13. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 변형 또는 비천연 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.

14. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 뉴클레아제 내성을 증가시키는 비변형 핵산에 비해 하나 이상의 변형을 포함한다.

15. 구현예 14에 따른 조성물에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 프라이머 세트는 DNA 중합효소의 3' 프루프 리딩 활성에 내성이다.

16. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 변형된 3' 말단 뉴클레오티드를 갖는다.

17. 구현예 16의 조성물에 있어서, 증폭 시 상기 변형된 3' 말단 뉴클레오티드는 하나 이상의 제1 프라이머 세트를 포함하는 산물의 증폭량에 비해서 하나 이상의 제2 프라이머 세트를 포함하는 산물의 증폭량을 감소시킨다.

18. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 100%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 80%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 60%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 30%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 80%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 50%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 40%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 30%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 20% 내지 70%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 30% 내지 60%, 또는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 40% 내지 50%이다.

19. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트의 몰농도에 따른 총 백분율의 15% 내지 100%이다.

20. 구현예 1 또는 2의 조성물에 있어서, 중합효소는 가닥-치환 중합효소, BstL, BstX, phi29, Bsu, Taq, Klentaq, KOD, KOD exo(-), 및 Phusion으로부터 선택된다.

21. 구현예 2의 조성물에 있어서, 반응 혼합물은 루프-매개 (LAMP) 반응 혼합물, 가닥 치환 반응 혼합물 (SDS), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 핵산의 등온 키메라 증폭 (ICAN), SMart 증폭 방법 (SMAP), 키메라 치환 반응 (RDC), (지수적)-롤링 써클 증폭 (지수적-RCA), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 전사 매개 증폭 (TMA), 헬리카제 의존적 증폭 (HDA) 및 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA), 및 교차 프라이밍된 증폭 (CPA)으로부터 선택되는 증폭 반응 혼합물이다.

22. 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하기 위한 키트로서, 키트는 구현예 1-20 중 어느 하나에 따른 조성물 및 사용 설명서를 포함한다.

23. 다중 핵산 증폭 및 실시간 검출 방법으로서,

a. 관심 영역을 갖는 주형을 포함하는 표적 핵산 샘플, 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트, 하나 이상의 제2 프라이머 세트, 중합효소, 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; b. 제1 반응을 수행하여 관심 영역을 증폭시켜서, 제1 앰플리콘을 형성시키는 단계; c. (b)를 적어도 2개 제2 반응으로 나누고, 반응 중 적어도 하나에, 제1 앰플리콘 내에 존재할 수 있고 관심 영역 내 관심 부위를 한정하는 부위-특이적 프라이머 결합 부위에 상보성인 하나 이상의 부위-특이적 제2 프라이머를 포함시키는 단계; d. 제2 반응 (2-단계 반응)을 수행하여서 오직 부위-특이적 프라이머 결합 부위가 부위-특이적 프라이머에 상보성이면 관심 영역의 증폭을 가속시키는 단계; 및 e. 적어도 2개의 제2 반응의 증폭 속도를 검출 및 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 제2 프라이머에 의한 반응에서 증폭의 증강된 상대적 속도는 제2 프라이머에 상보성인 관심 부위의 존재를 의미하고,

하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 단계 b) 및/또는 단계 d)에서 주형과의 결합에 대해 경쟁하고,

조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 비특이적 증폭 산물을 감소시킨다.

24. 구현예 23에 따른 방법에 있어서, 증폭 조건은 등온 증폭 조건이다.

25. 구현예 23에 따른 방법에 있어서, 증폭 조건은 열순환을 포함한다.

26. 구현예 23에 따른 방법에 있어서, 방법은 증폭된 주형의 양을 정량하는 단계를 더 포함한다.

27. 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하고 샘플로부터 비-주형 분자의 증폭을 감소시키는 방법으로서, 방법은 i) 주형을 포함하는 핵산 샘플; 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트(들); 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들); 중합효소; 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물을 인큐베이션시키는 단계, ii) 등온성 NAAT에 의해 주형을 증폭시키는 단계로서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 단계 i) 및/또는 단계 ii)에서 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 단계 ii)에서 비특이적 증폭 산물을 감소시키는 것인 단계; 및 iii) 증폭된 주형의 양을 정량하는 단계를 포함한다.

28. 증폭 반응을 수행하기 위한 시스템으로서,

i) 증폭 조성물 또는 반응 혼합물의 증폭 반응을 수행하기 위한 중심 챔버를 포함하고, 상기 증폭 반응 혼합물은 a) 주형을 포함하는 핵산 샘플; b) 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트(들); c) 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들); d) 중합효소; 및 e) 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하고, 시스템에서 수행되는 증폭 반응 동안, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 비특이적 증폭 산물을 감소시키고, 임의로, 중심 챔버는 하나 이상의, ii) 하나 이상의 추가적 증폭 반응을 일으키는, 추가적 챔버; iii) 적어도 2개 제2 반응의 증폭 속도를 실시간으로 검출 및 비교하기 위한 장비; 및 임의로 iv) 시스템에서 핵산 증폭 및 실시간 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 반응 혼합물과 연통한다.

하기 실시예는 제한이 아니라 예시를 위해 포함된다.

실시예 1:

F3, B3, FIP, BIP 및 STEM 프라이머로 이루어진 LAMP 프라이머 반응은 표적 게놈 DNA의 600 카피 (주형 참 양성)를 사용하거나 또는 게놈 표적의 카피 없이 (비-주형 거짓 양성) TangenDx 장비에서 사용되었다. F3, B3, BIP, FIP 및 STEM 프라이머와 동일한 서열을 갖는 차단형 올리고는 3' 말단을 차단하는 3-탄소 스페이서와 함께 합성되었고 (Integrated DNA technologies) 전체 차단형 올리고의 양은 비차단형 프라이머와 비교하여 15% 내지 25%로 다양하였다. 기록된 Cq 데이터는 TangenDx 장비로부터의 출력이고 양성 반응을 정량하기 전에 사이클 수로서 정의된다. 각 사이클은 15 초 (40 사이클은 10분임)이다.

도 1에서, 느린 참 양성과 빠른 거짓 양성의 출현의 시기 중복이 존재하였다. 추가적 >15% 차단형 올리고 (차단형 LAMP 올리고는 3' 3-탄소 스페이서를 함유)를 함유하는 반응은 NTFP의 출현의 시기를 이동시켜서 비차단형 조건과 비교하여 TTP의 출현 시기에 영향을 미치지 않고 가장 빠른 NTFP 및 TTP 간 갭은 >130 Cq (∼30분) 였다.

실시예 1I:

LAMP 반응 조건: C_alb에 대한 LAMP 프라이머는 칸디다 알비칸스 (ATCC 90028)의 18s rRNA 유전자의 ITS2 영역, 클렙시엘라 뉴모니아에의 KPC2 유전자 (ATCC BAA-1705), 및 엔테로코커스 패시움의 vanA 유전자 (ATCC® 700221DQ)를 표적화하게 디자인되었다. 기본 LAMP 반응은 프라이머 C_albl, KPC2f, 또는 VanA5를 함유하였다 (서열 및 LAMP 반응 농도에 대해서는 표 2 참조). 전체 길이 3' 포스페이트 차단형 프라이머, C_alb1_P, KPC2f_P, VanAS_P (서열은 표 2 참조)는 비차단형 프라이머의 현재 농도 이외에도 표시된 기본 LAMP 반응 프라이머 세트에 다양한 농도로 첨가되었다. 프라이머 서열의 3' 말단의 처음 8 뉴클레오티드의 3' 포스페이트 8mer로 이루어진, 절두형 프라이머, C_alb1_8merP, KPC2fs1_8merP, VanA5_8rnerP는 비차단형 프라이머의 현재 농도이외에도 다양한 농도로 표시된 기본 LAMP 반응 프라이머 세트에 첨가되었다 (서열은 표 2를 참조함). LAMP 프리-믹스는 얼음 상에서 100 mM dNTP 믹스, 267x EVA Green™qPCR 염료, 1 M MgSO₄, 1% TritonX 세제, 및 하기 성분을 함유하는 TIB3 완충액 (Tangen Isothermal Buffer 3)으로 제조되었다; KCl, Tris-HCl pH8.8, (NH₄)₂S0₄-, Brij-35, 및 글리세롤. 프리믹스는 -20℃에 저장되었고 사용 전에 실온에서 해동되었다. LAMP 반응은 프리믹스, LAMP 프라이머 (비차단형 또는 비차단형과 차단형 프라이머의 블렌드, 및 양성 대조군, 2000 게놈의 마이코박테리움 스메그마티스 DNA를 함유하는 MS14), BST2.0 (New England Biolabs) (각 성분의 최종 농도는 표 1을 참조), 및 씨. 알비칸스 DNA (25 ㎕ 반응 당 2000 게놈) 또는 각각 양성 대조군 또는 음성 대조군용 완충액을 배합하여 조립하였다. 혼합물은 96-웰 플레이트 (Bio-Sad Hard Shell® PCS 플레이트 흰색/투명 96웰, HSP9601)에 다중-채널 파이펫터를 사용해 파이펫팅되었고, 하기 형식으로, Thermaseal RT™ 밀봉 필름 (TS-RT2-100 비멸균)으로 밀봉되었다: 4개 웰은 LAMP 반응에 대한 양성 대조군, MS 14를 함유한다. C_alb1에 대한 4 양성 대조군은 2000 씨. 알비칸스 게놈을 함유한다. C_alb1 음성 대조군에 대한 나머지 88개 웰은 주형 DNA를 함유하지 않는다. 플레이트는 Bio-Rad CFX Connect 실시간 시스템 (SN:788BR02205)에 놓았다. 하기 단계를 실시하였다. 4.0℃에서 60초 동안 시작한 다음, 66℃로 상승시켰다. 전체 플레이트는 총 300 사이클 동안 15초 마다 판독되었다. 실행 종료 시에, 5초 당 0.5℃ 상승으로 66.0℃에서 95.0℃로의 프로파일로 용용 그래프를 생성시켰다.

연구된 모든 3개 LAMP 반응 (C_alb1, vanA5 및 KPC2f)에 대해서, 활성 LAMP 프라이머에 동일한 서열을 함유하는 비확장성 3' 차단형 프라이머의 첨가는 농도 의존적 방식으로 주형 양성 반응 (TP)와 비교하여 그들 빈도 및 비-주형 산물 (NTP)의 형성의 시기를 불균형적으로 억제하는 효과를 가졌다. 전체-길이 차단형 프라이머는 또한 올바른 주형 참 양성 반응의 속도에 영향을 미친다 (도 2-5). 예를 들어, C. alb 비차단형 반응은 106의 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초)에서, 가장 빠른 NTP로 25% (n=88웰)의 NTP 빈도를 가졌다. 가장 느린 C. alb TP는 65의 Cq에서 관찰되었다. C. alb 비차단형 실행의 가장 빠른 NTP 및 가장 느린 TP 간 윈도우는 41이었다. 25% 전체 길이 차단형 프라이머, C_Alb1_P의 첨가로, NTP 빈도는 25%에서 1.1%로 감소되었다. Cq 윈도우는 166으로 증가되었고, 가장 빠른 NTP는 256이었고, 가장 느린 TP는 90이었다. 전체 길이 차단형 프라이머의 농도의 50% 까지의 추가 증가는 300 사이클에서 0% 까지 NTP 빈도를 감소시켰다. 50% 전체 길이 차단형 프라이머, C_Alb1_P의 50% 농도에서, C. alb 참 양성은 평균 105.6±0.7% 까지 느려졌고 가장 느린 것은 106이었다 (도 2). 전체적으로, 전체 길이 차단기는 TP 반응을 늦추는 대가로 NTP 빈도 및 NTP 형성 속도를 상당히 감소시켰다.

전체 길이 활성 LAMP 프라이머의 8 말단 3' 뉴클레오티드에 동일한 서열을 함유하고 DNA 중합효소에 의해 확장될 수 없는 3' 말단을 함유하는 절두된 차단형 프라이머 (8merP)는 NTP 빈도 및 속도를 또한 억제시킬 수 있었지만, 이들 8mer 3' 차단형 올리고는 TP 반응을 억제시키지 않았다 (도 3).

일반적으로, 전체 길이 차단형 프라이머는 8merP 대응물과 비교하여 NTP의 형성 시기 및 그들 빈도를 억제하는데 더 큰 효능을 보였다. NTP의 억제 규모는 가장 느린 TP LAMP 반응 (표적 게놈의 2000 카피 투입) 및 가장 빠른 NTP 산물 Cq 간 편차로 표시되고 3개 LAMP 반응 프라이머 세트 C_alb1, vanA5 및 KPC2f에 대해 표시된다 (표 3 및 도 2 및 4 및 도 범례).

각 경우에 0 내지 50%의 범위에서 전체 길이 3' 차단형 프라이머의 증가된 농도는 TP 및 NTP 간 갭을 더 넓혔고, 한편 8-merP 차단형 프라이머는 3개 프라이머 세트 간 다양한 정도의 효능을 나타내는 감소된 효과를 보였다. C_alb1 LAMP 프라이머 반응의 경우에, 범위 0, 25%, 50%, 75%를 통해서 8merP 차단%의 증가는 NTP의 소분획이 8merP 올리고의 억제 작용에 내성임을 의미하는 NTP의 형성 및 시기의 억제의 평탄역을 보였다. 8merP 올리고는 활성 프라이머의 3' 말단과 경쟁하고, 활성 프라이머의 5' 말단을 차단시키지 않으므로, 비차단형 프라이머 서열의 5' 말단에 혼성화하는 영역에서 발생된 활성 프라이밍 사건은 NTP의 형성에 참여할 수 있고 8merP 차단형 서열과 더 이상 경쟁하지 않는 3' 말단에 새로운 서열을 갖는 확장된 프라이머를 생성시키는 것이 가능하다. 형성된 특이적 NTP 종이 전체로 서열 의존적이므로, 상이한 LAMP 프라이머 세트는 절두된 8merP 차단형 올리고에 대해 상이한 반응을 보인다. 전체 길이 3' 차단형 올리고는 그들 서열 스페이스의 전체 길이에 걸쳐서 NTP의 형성을 억제할 수 있었다. 다른 차단기는 3' 말단에 3' 말단 디데옥시 염기 및 3 탄소 스페이서를 포함하여, 3' 포스페이트에 대해 유사한 효과를 갖는 것으로 확인되었다 (하기 도 9 참조).

도 4에 도시된 실험에서, 차단형 올리고 (3' 포스페이트)는 증폭 동안 비 주형 거짓 양성의 형성을 감소시키는 그들 능력을 시험하기 위해서 표준 LAMP 반응에 첨가되었다. Y 축은 가장 느린 참 양성 및 가장 바른 비-주형 거짓 양성 간 Cq 갭 (ΔCq)을 보여준다. 표 3의 데이터에서 확인할 수 있듯이, Cq 갭은 전체 길이 프라이머의 25%가 차단된 반응에서 약 41에서 약 166으로 증가되고, 다시 양성 및 음성 간 Cq 갭, 또는 편차는 전체 길이 프라이머의 50%가 차단된 반응에서 약 193 까지 증가된다.

표 3 및 도 5에 제시된 데이터를 보여주는 실험에서, 칸디다 알비칸스에서 다양한 차단형 올리고뉴클레오티드 농도의 효과를 보여준다. C_alb1은 칸디다 알비칸스의 18s rRNA 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된, C_alb_8merP (차단형)를 비롯하여, C_alb_8merP 없는 (비차단형) 대조군의 각각의 농도를 표시한다. Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시하고, 제2 Y 축은 가장 느린 참 양성 및 가장 빠른 비-주형 양성 웰 간 Cq 갭을 표시한다. 표 3에서 확인할 수 있듯이, Cq 갭은 비차단형의 약 41에서, 8mer 프라이머의 25%가 차단된 반응에서 약 63 까지 증가되고, 다시 Cq 갭은 8mer 프라이머의 50%가 차단된 반응에서 약 69 까지 증가된다. 그러나, 이러한 실험에서, Cq 갭은 8mer 프라이머의 75%가 차단된 반응에서 약 61이었고, 이것은 50% 반응에 비해 낮다.

도 6에 도시된 실험에서, KPC2f는 클렙시엘라 뉴모니아에의 KPC2 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 참 양성 (2000 게놈 클렙시엘라 뉴모니아에 (KPC2+)) 및 음성 웰의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보여주는 웰의 빈도는 % NTP 빈도를 표시한다. 차단형 프라이머 (3' 포스페이트 차단기를 갖는 전체 길이 프라이머, KPC2f_P)가 100% 표준 비차단형 올리고 농도 이외에도 50%로 첨가된 농도에서, 차단형 프라이머의 첨가는 15%에서 대략 1%로 NTP의 감소를 일으켰다. 양성 대조군 주형 양성 반응은 72에서 90의 Cq로 둔화시켰고, 한편 TP 및 NTP 간 Cq 편차는 21에서 67로 증가되었다.

도 7에 도시된 실험에서, KPC2f는 클렙시엘라 뉴모니아에의 KPC2 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험관 각 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 양성 및 음성 웰의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보이는 웰의 빈도인 % NTP 빈도를 표시한다. 차단형 프라이머 (3' 포스페이트 차단기를 갖는 8-mer 올리고, KPC2fsl_8mer_P)가 100% 표준 비차단형 올리고 농도이외에도 50%로 첨가된 농도에서, 8-mer 차단형 프라이머의 첨가는 15%에서 대략 1%로 NTP의 감소를 일으켰다. 양성 대조군 주형 양성 반응은 72의 Cq에서 변화되지 않은 채로 남았지만, TP 및 NTP 간 Cq 편차는 18에서 108로 증가되었다.

도 8에 도시된 실험에서, KPC2f는 클렙시엘라 및 이. 콜라이의 KPC2 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 각 조건에 대한 96웰 qPCR 플레이트 상에서 비 주형 거짓 양성 웰 (NTP에 대한 빈도 및 NTP Cq를 비롯하여 클렙시엘라 슈도모나스 DNA의 2000 게놈 (KPC2+)을 함유하는 KPC2 양성 참 양성 LAMP 반응의 Cq를 표시한다. 좌측 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 각각의 도트는 단일 웰 Cq를 나타낸다. 거짓 양성 (비주형 양성, NTP)의 빈도는 x 기호로 표시되고 우측 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보이는 웰의 빈도는 % 빈도를 나타낸다. 3' 포스페이트 차단기, 및 8 nt (KPC2_8merP), 10 nt (KPC2_10merP), 및 12 nt (KPC2_12merP)로 다양한 올리고 길이를 갖는 KPC2f 올리고는 표시된 100% 표준 비차단형 올리고와 함께 표준 LAMP 올리고 농도의 50%에서 첨가되었다. 양성 대조군 주형 양성 반응에 대한 Cq는 모든 절두된 차단형 올리고 (8mer, 10mer, 및 12mer)에 대해 대략 65의 Cq였다. 전체 길이 차단형 올리고는 주형 양성 반응을 65에서 90의 Cq로 감소시켰다. NTP 웰의 백분율은 비차단형 대조군의 15%에서, 8mer 차단형 반응의 경우 대략 2%로, 10mer 차단형 반응의 경우 1%가 되었고, 12mer 차단형 반응에서는 NTP가 없었다. 전체 길이 차단형 반응은 대략 1%의 NTP 빈도를 가졌다. TP 및 NTP 간 Cq 편차는 비차단형 반응의 40에서, 8mer의 경우 50, 10mer의 경우 60, 12mer이 경우 >185, 및 전체 길이 차단형 반응의 경우 67로 증가되었다.

도 9에 도시된 실험에서, C2_fs1은 클렙시엘라 및 이. 콜라이의 KPC2 유전자를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 각 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 비주형 거짓 양성 웰 (NTP)에 대한 빈도 및 NTP Cq를 비롯하여 클렙시엘라 슈도모나스의 2000 게놈 (KPC2+)을 함유하는 KPC2 양성 참 양성 LAMP 반응의 Cq를 표시한다. 좌측 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 각각의 도트는 단일 웰 Cq를 나타낸다. 거짓 양성 (비주형 양성, NTP)의 빈도는 x 기호로 표시되고 우측 Y 축은 200회 스캔 이내에 NTP를 보이는 웰의 빈도는 % 빈도를 나타낸다. 3' 포스페이트 차단기 (KPC2_P), 3' 3 탄소 (KPC2_3C3) 또는 추가적 3' 디데옥시 C 염기 차단기 (KPC_ddp)를 갖는 전체 길이 올리고는 표시된 100% 표준 비차단형 올리고와 함께 표준 LAMP 올리고 농도의 50%에서 첨가되었다. 상이한 3' 차단형 화학을 갖는 모든 올리고는 Integrated DNA Technologies에서 구매하였다. 3' 포스페이트를 갖는 차단형 올리고의 첨가는 NTP 웰의 백분율을 10%에서 대략 1%로 감소시켰다. 3' 3 탄소 스페이서 차단형 올리고는 88웰에서 임의의 NTA를 갖지 않거나 또는 3' 디데옥시 C 염기 함유 올리고를 갖지 않았다.

도 10. VanA5는 엔테로코커스 패시움의 vanA 유전자 (vanA+)를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각각의 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 양성 및 음성 웰의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에서 NTP를 보이는 웰의 빈도인 % NTP 빈도를 표시한다. 차단형 프라이머 (3' 포스페이트 차단기를 갖는 전체 길이 프라이머, VanA5_P)가 100% 표준 비차단형 올리고 농도 이외에도 50%로 첨가된 농도에서, 차단형 프라이머의 첨가는 25%에서 대략 2%로 NTP의 감소를 일으켰다. 양성 대조군 주형 양성 반응은 74에서 87의 Cq로 둔화되었고, 한편 TP 및 NTP 간 Cq 편차는 32에서 190으로 증가되었다.

도 11. VanA5는 엔테로코커스 패시움의 vanA 유전자 (vanA+)를 표적화하는 LAMP 프라이머 세트이다. X 축은 시험된 각 조건에 대해 96웰 qPCR 플레이트 상에서 양성 및 음성 웰의 분포를 표시하는 한편 Y 축은 Cq (정량화 사이클, 1 사이클 = 15 초) 또는 반응의 속도를 표시한다. 제2 Y 축은 300회 스캔 이내에 NTP를 보이는 웰의 빈도인 % NTP 빈도를 나타낸다. 차단형 프라이머 (3' 포스페이트 차단기를 갖는 8-mer 올리고, VanA5_8mer_P)가 100% 표준 비차단형 올리고 농도이외에도 50%로 첨가된 농도에서, 8-mer 차단형 프라이머의 첨가는 24%에서 대략 13%로 NTP의 감소를 일으켰다. 양성 대조군 주형 양성 반응은 대략 74의 Cq에서 변화되지 않은 채로 남아있었고, 한편 TP 및 NTP 간 Cq 편차는 32에서 51로 증가되었다.

본 명세서에서 참조하거나 또는 언급되는 모든 특허, 공개물, 과학 논문, 웹 사이트, 및 다른 문헌 및 재료는 본 발명이 속하는 당업자의 수준을 의미하고, 각각의 이러한 참조된 문헌 및 재료는 이의 전체로 본 명세서에 개시되거나 또는 개별적으로 이의 전문이 참조로 편입된 것과 동일한 정도로 참조로 본 명세서에 편입된다. 출원인은 임의의 이러한 특허, 공개물, 과학 논문, 웹 사이트, 전자적으로 이용가능한 정보, 및 다른 참조된 재료 또는 문헌으로부터의 임의의 모든 재료 및 정보를 이 명세서에 물리적으로 편입시킬 권리를 보유한다.

본 명세서에 기술된 특별한 방법 및 조성물은 바람직한 구현예를 대표하고 예시적이며 본 발명의 범주에 대한 제한을 의도하지 않는다. 다른 목적, 양태, 및 구현예는 본 명세서를 고려시 당업자에게 떠오를 것이고, 청구항의 범주로 정의된 본 발명의 사조 내에 포괄된다. 본 발명의 범주 및 사조를 벗어나지 않고 본 명세서에 개시된 본 발명에 다양한 대체 및 변형이 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. 본 명세서에 예시적으로 기술된 방법은 적합하게, 필수로서 본 명세서에 특별히 개시하지 않은, 임의의 구성요소 또는 구성요소들, 또는 제한 또는 제한들의 부재 하에서도 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 각 예에서, 본 발명의 구현예 또는 예에서, 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어지는", 및 "이루어지는"은 본 명세서의 다른 2개 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 또한, 용어 "포함하는", "포괄하는", "함유하는" 등은 확장적으로 제한없이 읽혀질 것이다. 본 명세서에 예시적으로 기술된 방법 및 과정은 적합하게 상이한 순서의 단계로 실시될 수 있고, 그들은 본 명세서 또는 청구항에 표시된 단계의 순서에 반드시 제한되는 것은 아니다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "한", "하나", 및 "그"는 문맥에서 명확하게 달리 표시하지 않으면 다수 참조를 포함한다. 어떠한 경우에도 특허가 본 명세서에 특별히 개시된 특별한 예 또는 구현예 또는 방법에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 어떠한 경우에도 특허는 특허청의 임의의 심사관 또는 임의의 다른 공무원 또는 직원이 작성한 임의의 진술에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고 이러한 진술이 특별하게 출원인이 작성한 답변서에서 명백하게 채택한 자격 또는 유보가 없는 경우는 예외로 한다.

적용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용에서, 도시되고 기술된 특성의 임의의 균등물 또는 이의 일부를 배제시키려는 의도가 없지만, 청구된 바와 같은 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식한다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예 및 선택적 특성을 통해 특별히 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 개념의 변형 및 변이는 당업자가 재분류할 수 있고, 이러한 변형 및 변이는 첨부된 청구항에 의해 정의되는 바와 같이 본 발명의 범주 내로 간주된다는 것을 이해할 것이다.

본 발명은 본 명세서에서 폭넓게 유전적으로 기술되었다. 또한 일반 개시 내에 속하는 각각의 더 협소한 종 및 아속 그룹은 본 발명의 일부를 형성한다. 이것은 절단된 재료가 특별히 본 명세서에 열거되었는지 여부와 무관하게, 속에서 임의의 대상 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한이 존재하는 본 발명의 일반 설명을 포함한다.

다른 구현예는 하기 청구항 내에 속한다. 또한, 본 발명의 특성 또는 양태가 마쿠시 그룹으로 기술되는 경우, 당업자는 본 발명이 또한 마쿠시 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 아군에 대해 기술된다는 것을 인식할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> TANGEN BIOSCIENCES INC. <120> A METHOD FOR SUPPRESSING NON-SPECIFIC AMPLIFICATION PRODUCTS IN NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES <130> TNG-0600-PCT <140> <141> <150> 62/792,613 <151> 2019-01-15 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 ggcggagttc agctccag 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 ccgttacggc aaaaatgcg 19 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 ctgaaggagt tgggcggccc gtccagacgg aacgtggta 39 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 4 tgtattgcac ggcggccggt ggtcacccat ctcggaa 37 <210> 5 <211> 18 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Claims (20)

1. 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하고 샘플로부터 비-주형 분자의 증폭을 감소시키는 방법으로서, 방법은
   i) 주형을 포함하는 핵산 샘플; 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트(들); 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들); 중합효소; 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물을 인큐베이션시키는 단계;
   ii) 주형을 증폭시키는 단계; 및
   iii) 증폭된 주형의 양을 검출 또는 정량하는 단계
   를 포함하고;
   하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 비특이적 증폭 산물을 감소시키는 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 증폭된 주형은 실시간으로 검출 또는 정량되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 증폭은 등온성인 방법.
4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 약 15 내지 약 50 뉴클레오티드의 길이인 방법.
5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 약 6 내지 약 50 뉴클레오티드의 길이인 방법.
6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)에 비해 길이가 큰 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 제2 프라이머 세트는 주형과 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 갖는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과 2개의 미스매치된 뉴클레오티드를 갖는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 제2 프라이머 세트는 제2 프라이머 세트의 3' 말단에서 주형과 하나 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 갖는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들)는 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)에 비해서 조성물 중 주형에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 변형 또는 비천연 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 변형된 3' 말단 뉴클레오티드를 갖는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 변형된 3' 말단 뉴클레오티드는 3' 포스페이트 차단기, 3' 탄소 스페이서, 또는 3' 디데옥시 C 염기 차단기로부터 선택되는 것인 방법.
14. 제10항에 있어서, 증폭 단계 ii)에서, 변형된 3' 말단 뉴클레오티드는 하나 이상의 제1 프라이머 세트를 포함하는 산물의 증폭량에 비해서 하나 이상의 제2 프라이머 세트를 포함하는 산물의 증폭량을 감소시키는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 90%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 50%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 40%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 5% 내지 30%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 80%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 50%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 40%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 10% 내지 30%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 20% 내지 70%, 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 30% 내지 60%, 또는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트 전체의 40% 내지 50%인 방법.
16. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 조성물 중 제1 및 제2 프라이머 세트의 총 중량%의 5% 내지 30%인 방법.
17. 제1항에 있어서, 중합효소는 가닥-치환 중합효소 및 열안정성 중합효소로부터 선택되는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 반응 혼합물은 루프-매개 (LAMP) 반응, 가닥 치환 반응 (SDS), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 핵산의 등온 키메라 증폭 (ICAN), SMart 증폭 방법 (SMAP), 키메라 치환 반응 (RDC), (지수적)-롤링 써클 증폭 (지수적-RCA), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 전사 매개 증폭 (TMA), 및 헬리카제 의존적 증폭 (HAD) 및 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA)에 의한 증폭에 적합한 증폭 반응 혼합물인 방법.
19. 핵산 샘플에서 표적 핵산을 검출 또는 정량하고 샘플로부터 비-주형 분자의 증폭을 감소시키는 방법으로서, 방법은
    i) 주형을 포함하는 핵산 샘플; 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트(들); 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들); 중합효소; 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물을 인큐베이션시키는 단계;
    ii) 주형을 증폭시키는 단계; 및
    iii) 증폭된 주형의 양을 검출 또는 정량하는 단계
    를 포함하고;
    하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 3' 포스페이트 차단기, 3' 탄소 스페이서, 또는 3' 디데옥시 C 염기 차단기로부터 선택되는 변형된 3' 말단 뉴클레오티드를 갖고,
    하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)의 포함은 비특이적 증폭 산물을 감소시키는 것인 방법.
20. 핵산 샘플 중 표적 핵산을 검출 또는 정량하기 위한 키트로서, i) a) 주형을 포함하는 핵산 샘플; b) 하나 이상의 제1 증폭 프라이머 세트; c) 하나 이상의 제2 프라이머 세트; d) 중합효소; 및 e) 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 조성물로서, 증폭 동안 하나 이상의 제1 프라이머 세트(들) 및 하나 이상의 제2 프라이머 세트(들)는 주형과의 결합에 대해 경쟁하고, 조성물 중 하나 이상의 제2 프라이머 세트의 포함은 주형이 증폭될 때 비특이적 증폭 산물을 감소시키는 것인, 조성물, 및 ii) 제1항에 따른 방법의 사용을 위한 설명서를 포함하는 것인 키트.

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